CN117801110A - 抗犬红细胞抗原dea1的单克隆抗体、检测试剂及其应用 - Google Patents

抗犬红细胞抗原dea1的单克隆抗体、检测试剂及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抗犬红细胞抗原DEA1的单克隆抗体、检测试剂及其应用。其中，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明通过分离提取DEA1阳性血红细胞抗原，免疫小鼠利用杂交瘤细胞技术筛选灵敏度高、特异性高的单克隆抗体，能够特异性的结合犬DEA1阳性红细胞，而与DEA1阴性红细胞不发生结合。该单克隆抗体应用于犬血型鉴定试纸条或凝集卡，均可在2~10min内验证犬DEA1血型，结果特异性强、检测时间短，避免犬输血时导致的输血无效或急性溶血性输血反应，为国内兽医临床的犬输血治疗提供了便利。

Description

抗犬红细胞抗原DEA1的单克隆抗体、检测试剂及其应用
技术领域
本发明涉及宠物快速生物检测技术领域，具体涉及一种抗犬红细胞抗原DEA1的单克隆抗体、检测试剂及其应用。
背景技术
犬的血型在1910年第一次被发现。犬和人一样有很多种血型，现在国际上公认的有8种血型，这些血型分别命名为犬红细胞抗原1（DEA1）、DEA3、DEA4等。其中DEA1有4个亚型：1.1、1.2、1.3和阴性。DEA1犬不含DEA1血型的天然抗体，首次输血不会因血型不符发生严重的输血反应，但再次输血时，犬因血型错配会发生输血反应，严重时甚至致命，其中DEA1的输血反应最迅速也最剧烈。因此，在输血时应特别注意DEA1血型是否相配，DEA1阳性受血犬可接受DEA1阳性或阴性血液，DEA1阴性受血犬可接受DEA1阴性血液。
美国、澳大利亚等发达国家已有动物血库，是以中央血库的形式建立，并且有相应完善的血型检测程序。国内没有相应的动物血库，在兽医临床上输血也很少测血型，只是临时找供血犬，输血前进行简单的交叉配血试验，少数测血型也是依靠国外进口检测试纸或者抗体，但进口试纸与抗体价值不菲，给国内兽医临床的输血治疗造成了巨大的阻力。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种抗犬红细胞抗原DEA1的单克隆抗体、检测试剂及其应用。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
根据本发明实施例的第一方面，提供一种抗犬红细胞抗原DEA1的单克隆抗体，所述单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区；
所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；
所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID No.1的第72-78位、103-118位、148-158位所示；
所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID No.2的第55-65位、81-87位、119-128位所示。
进一步地，所述抗犬红细胞抗原DEA1的单克隆抗体是通过分离提取DEA1阳性血红细胞抗原作为免疫原并经筛选得到的鼠源单克隆抗体。
根据本发明实施例的第二方面，提供一种抗犬红细胞抗原DEA1的单克隆抗体在检测试剂中的应用。
进一步地，将所述抗犬红细胞抗原DEA1的单克隆抗体包被于犬血型鉴定试纸条检测线T线。
进一步地，将所述抗犬红细胞抗原DEA1的单克隆抗体包被于犬血型鉴定凝集卡。
本发明具有如下优点：
本发明采集EDTA抗凝的DEA1阳性血红细胞，生理盐水洗涤三次，再使用与红细胞等比例无菌阿氏液重悬获得红细胞悬液作为抗红细胞抗原DEA1的单克隆抗体制备的免疫原。免疫小鼠后通过有限稀释法、泪滴凝集测试法筛选灵敏度高、特异性高的单克隆抗体，能够特异性的结合犬DEA1阳性红细胞，而与DEA1阴性红细胞不发生结合。该单克隆抗体与发明人研制的结合犬红细胞的特异性抗体分别作为检测线与质控线制备犬血型鉴定试纸条，也可用于制备犬血型鉴定凝集卡，均可在2~10min内验证犬DEA1血型，结果特异性强、检测时间短，避免犬输血过程中不匹配的血液致敏后产生的同种异体抗体，再次输血时导致的输血无效或急性溶血性输血反应，为国内兽医临床的犬输血治疗提供了便利。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
图1为本发明实施例提供的采用泪滴凝集测试法针对不同小鼠血清与DEA1阳性血凝集结果图；
图2为本发明实施例提供的采用泪滴凝集测试法筛选抗犬红细胞抗原DEA1的单克隆抗体过程示意图；
图3为本发明实施例提供的纯化后的抗犬红细胞抗原DEA1的单克隆抗体纯度测定图；
图4为本发明实施例提供的纯化后的犬红细胞抗原DEA1的单克隆抗体纸片凝集法特异性鉴定图；
图5为本发明实施例提供的犬血型鉴定试剂盒样本检测结果图。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1 犬红细胞抗原的制备
采集EDTA抗凝的DEA1阳性血红细胞，生理盐水洗涤三次，再使用与红细胞等比例无菌阿氏液重悬获得红细胞悬液作为抗红细胞抗原DEA1的单克隆抗体制备的免疫原。
实施例2 抗犬红细胞抗原DEA1的单克隆抗体制备与筛选
1、小鼠免疫
取3只6-8周龄的雌性Balb/c小鼠，将实施例1中制备的红细胞悬液作为免疫原。首次免疫剂量为每只Balb/c小鼠200μl，后续以同样的方法皮下多点免疫，每只小鼠200μl。每次免疫间隔1~2周。第5次免疫后第7天进行小鼠尾尖采血泪滴凝集测试法分别测试与犬DEA1阳性血和DEA阴性血凝集效价，小鼠尾血采集后放入4℃静置30min，析出血清，取血清用PBS（0.01mol/L，pH值7.4）进行倍比稀释，与DEA1阳性血凝集的血清最大稀释倍数即小鼠血清抗DEA1阳性血的效价。
其中，泪滴凝集测试法步骤为：
（1）红细胞悬液制备：
A、取新鲜的EDTA抗凝全血2500 rpm离心10分钟，移液器吸走上清；
B、加入与红细胞等体积的生理盐水，上下颠倒混匀后再次2500 rpm离心10分钟；
C、重复步骤B 2次；
D、再次加入等体积的生理盐水，颠倒混匀，制备成红细胞悬液备用。
（2）实验步骤：
A、取待测抗体/血清25μl加入反应孔中；
B、上述制备的红细胞悬液用PBS（0.01mol/L，pH值7.4）稀释100倍制备成1%红细胞悬液；
C、取步骤B中制备的1%红细胞悬液25μl加入反应孔中；
D、摇晃反应板混匀，室温静置30分钟；
E、计时结束后，拿起反应板，倾斜45度后观察。
（3）结果判读：红细胞呈泪滴状流淌，表示没有凝集，如果不流下来或者呈弥散状铺匀孔底的，表示凝集了红细胞。
结果如图1所示，每行分别为1号小鼠、2号小鼠、3号小鼠；每列分别为每只小鼠倍比稀释结果。
选取与DEA1阳性犬血凝集效价高，同时优于DEA1阴性犬血凝集效价的3号小鼠，通过腹膜内注射200μl抗原来加强免疫。3天后将小鼠处死，进行细胞融合。
2、细胞融合
将完成加强免疫的小鼠眼球采血，分离血清作为阳性对照。小鼠断颈处死后放入75%乙醇中浸泡10min，在超净台内将小鼠固定于解剖台上。用消毒后的小镊子提起腹部皮肤，使用无菌剪刀从腹部下方向上剪开小块皮肤，分离皮肤和腹膜，小心拨开其他内脏，分离脾脏，将其轻轻取出，放入含有20ml不完全DMEM培养液的培养皿中。使用吸满20ml不完全DMEM培养液的注射器从脾脏顶端刺入，贯穿脾脏，轻推注射器，吹出脾细胞于培养皿中，反复几次直到脾脏不再变色，用过滤网过滤脾细胞。对SP2/0和脾细胞计数，按照8∶1的细胞数比例将脾细胞与SP2/0混合，颠倒混匀后1000rpm离心4min；在37℃水浴的状态下，拍打沉淀的细胞使其均匀分布于管底，静置1min，在1min内向离心管中加入1ml PEG1450，并静置1min，30s内沿着管壁加完1ml 37℃预热的不完全DMEM培养液，以终止细胞融合反应；将枪头伸入液面下，1min加完1ml不完全DMEM，重复该步骤，直到加完20ml不完全DMEM培养液；缓慢加入30ml不完全DMEM培养基后800rpm离心4min，弃掉上清，再加入50ml不完全DMEM培养基，800rpm离心4min，弃掉上清，加入HAT培养基，轻柔地吹起细胞并加入96孔细胞培养板（200μl/孔），做好标记；7天后用泪滴凝集测试法测试红细胞凝集情况。
3、阳性杂交瘤细胞的筛选
取杂交瘤细胞上清，用泪滴凝集测试法筛选杂交瘤细胞。选取与DEA1阳性犬血凝集效价高、与DEA1阴性犬血不凝集，且只有单个细胞团块的孔，弃掉培养基，加入200μl HT培养基，吹打细胞并计数，取大约200个细胞铺半块96孔板，剩余细胞传代至48孔板继续扩大培养，并冻存。7d后对单克隆的细胞进行凝集鉴定，采用上述方法再次进行亚克隆，经过3次亚克隆后，选出与DEA1阳性犬血凝集效价高、与DEA1阴性犬血不凝集的单个细胞团块，按上述方法再进行克隆。
如图2所示，为采用泪滴凝集测试法筛选抗犬红细胞抗原DEA1的单克隆抗体过程示意图。
4、腹水制备与纯化
将上述所得到的细胞株注射至小鼠腹腔，对小鼠进行培养，从小鼠腹腔抽取腹水进行纯化。具体操作步骤如下：
向小鼠腹腔注射500μl弗氏不完全佐剂，24h后，取大约1×107个杂交瘤细胞注入小鼠腹腔，7d后，采集腹水。利用商品化抗体纯化试剂盒纯化抗体，具体操作如下：将腹水10000rpm离心10min，收集上清，取20μl制成样品；向离心管中加入60μl 1M Tris-HCl（pH=9.0）；用0.45μm的过滤器将Binding buffer和Elution buffer过滤备用；用Bindingbuffer两倍稀释的腹水；用注射器吸满10ml Binding buffer，将其连在纯化柱上，排除气泡后缓慢推动活塞，除去贮存液；吸取10ml Binding buffer，流速为1ml/min，平衡柱子；注射器吸取稀释后的腹水，流速为0.2ml/min，使抗体与柱子结合；吸满10ml Bindingbuffer，洗掉未结合的抗体，直到流出的液体为无色即可；吸取5ml Elution buffer，洗脱结合在柱子上的抗体，滴加至上述加有Tris-HCl的离心管中，8滴/管。每管取样20μl制成样品备用，对纯化后的单克隆抗体进行鉴定。
实施例3 抗犬红细胞抗原DEA1的单克隆抗体的鉴定
1、浓度测定
采用核酸蛋白浓度测定仪对纯化后的单克隆抗体进行浓度测定，结果抗犬红细胞抗原DEA1的单克隆抗体浓度为6.58mg/ml。
2、纯度测定
对纯化后的抗犬红细胞抗原DEA1的单克隆抗体进行SDS-PAGE电泳分析。如图3所示，在~25kDa和~65kDa附近出现2条清晰条带，~25kDa处为抗体轻链，~65kDa处为抗体重链，几乎没有其他杂带，纯度达到预期要求。
3、特异性鉴定
利用纸片凝集法进行特异性鉴定。具体步骤为：将纯化后的单克隆抗体梯度倍比稀释后取5μl点至纸板上，37℃烘箱放置20-30min烘干。将新鲜的DEA1阳性和DEA1阴性的EDTA抗凝全血用滴管和移液器吸取50μl加入到800μl稀释液中颠倒混匀制备成红细胞悬液，在抗体试剂上分别悬空滴加1滴（30~50μl）红细胞悬液。用搅拌棒用力搅拌试剂包被的位置混合15秒，至包被位置试剂与血液完全混匀。静置2分钟后拿起卡片前后摇匀，判读有无颗粒状凝集。
结果如图4所示，从左至右依次为DEA1阳性样本、DEA1阴性样本检测结果图，显示与DEA1阳性犬血凝集、与DEA1阴性犬血不凝集，说明抗犬红细胞抗原DEA1的单克隆抗体特异性良好。
实施例4 抗犬红细胞抗原DEA1的单克隆抗体的重链和轻链可变区基因克隆
1、杂交瘤细胞培养及总RNA提取
用RPMI 1640完全培养基在37℃、5%二氧化碳条件下培养分泌抗犬红细胞抗原DEA1的单克隆抗体的杂交瘤细胞，使细胞数量达到1×107时用总RNA提取试剂盒（购自天根）提取细胞中的总RNA。
2、PCR扩增
设计鼠源重链抗体基因和轻链抗体基因特异性上下游通用引物。
重链上游引物（SEQ ID No.5）：TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCC，
重链下游引物（SEQ ID No.6）：AGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG；
轻链上游引物1（SEQ ID No.7）：CCGTTTGATTTCCAGCTTGGTGCC，
轻链上游引物2（SEQ ID No.8）：CCGTTTTATTTCCAGCTTGGTCCC，
轻链上游引物3（SEQ ID No.9）：CCGTTTTATTTCCAACTTTGTCCC，
轻链上游引物4（SEQ ID No.10）：CCGTTTCAGCTCCAGCTTGGTCCC，
轻链下游引物5（SEQ ID No.11）：GACATTGAGCTCACCCAGTCTCCA。
3、测序载体克隆与测序
应用RT-PCR试剂盒扩增出重链和轻链，将其连接在PLB克隆载体上，进行基因测序。
编码重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示：
AGACTGCATAGTGAAGGGTGGGACCAGTTAGTCATTAGGCCCCATAGTGCCAATGTCTTAGACTGCATGGATTGGTGGTGGAACGTTCTACTTCTGTGGGCATGCGCCCAAGTATTCAATGCACAGGTGCAGTTGAGTCAGTGGGGACCTACACTGTGGAAGCCTAGTGAGTCACAGAAGATCGGTTGCAAGTGCTCTGGAAGTACCTTCACACAATATGGAATGGGAATGCATTTCTCGAAAGGTGGATGCAACGTTCAGGTGAAGGTCGCTCCACTTGAGGGTCTGAAGATGTGGATGCTGGGCTGGATAAACACCGTTGGAGAGCCAACATATACTGAAGAGTTCGTTGGACGATTTGCCTTCTCTTTGGAAACCTCTGCCACTGCCTATTTGCAGATCAACAACCTCAAAGAAGACACGGCTTATTTCTGTGCAAGAGTAGACGGTTGCTGGCCATACGTGTTTTGGTACTGGGGCCAAGGCACCCCTCTCACAGTCTCCTCTGCCACGACACCCCCATCAGTCTATCCTCTGGCCGGATATGCTTCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGA。
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示：
RLHSEGWDQLVIRPHSANVLDCMDWWWNVLLLWACAQVFNAQVQLSQWGPTLWKPSESQKIGCKCSGSTFTQYGMGMHFSKGGCNVQVKVAPLEGLKMWMLGWINTVGEPTYTEEFVGRFAFSLETSATAYLQINNLKEDTAYFCARVDGCWPYVFWYWGQGTPLTVSSATTPPSVYPLAGYASQTNSMVTLG。
编码轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示：
ACATCGGGGACCAATATTGAAAAGAATAGACCTGGTTTGAGTATTATGGCCTGGATTCTTATACTCTCTCTCGCTCTCAGCTCAGGGGCCATTTCCCAGGCTGTTGTGACTCAGGAATCTGCACTCACCACATCACCTGGTGAAACAGTCACACTCACTTGTCGCTCAAGTACTGGGACAAGTAATTATGCCAACTGGGTCCAAGAAAAGCCAGATCGTTTATTGGCTGGTCTAATAGGTGGTTTTAACGCTCGAGCTCCAGGTGTTCCTGCCAGATTCTCAGGCTCCCTGATTGGAGACAAGGCTCTCACCATCACAGGGGCACAGACTGAGGATGAGGCAATATATTTCTGTGCTCTATGGTACCATAGCAACATCTTGGTTTTCGGTGGAAGGACCAAATCGACTGTCTCAGGCCCCAAGCTCTCGCCATCATGGCTGAAGCAC。
轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示：
TSGTNIEKNRPGLSIMAWILILSLALSSGAISQAVVTQESALTTSPGETVTLTCRSSTGTSNYANWVQEKPDRLLAGLIGGFNARAPGVPARFSGSLIGDKALTITGAQTEDEAIYFCALWYHSNILVFGGRTKSTVSGPKLSPSWLKH。
将重链可变区和轻链可变区序列进行分析，得出其CDR区。
其中，重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID No.1的72-78位、103-118位、148-158位，如SEQ ID No.12—SEQ ID No.13所示，分别为QYGMGMH（SEQ IDNo.12）、WINTVGEPTYTEEFVG（SEQ ID No.13）、VDGCWPYVFWY（SEQ ID No.14）；
所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID No.2的55-65位、81-87位、119-128位，如SEQ ID No.15—SEQ ID No.17所示，分别为RSSTGTSNYAN（SEQ IDNo.15）、GFNARAP（SEQ ID No.16）、ALWYHSNILV（SEQ ID No.17）。
应用实施例1 犬血型鉴定试剂盒的制备
1、试剂盒组成：
（1）质控线C线包被犬红细胞的特异性抗体、检测线T线包被抗犬红细胞抗原DEA1的单克隆抗体的犬血型鉴定试纸条；
（2）装有稀释液的滴管；
（3）定量双耳滴管。
2、试剂盒组分的制备方法：
（1）犬血型鉴定试纸条：
A、将纯化后的犬红细胞的特异性抗体、抗犬红细胞抗原DEA1的单克隆抗体分别划NC膜。其中质控线C线：将犬红细胞的特异性抗体稀释1000倍，划膜量1μl/cm；检测线T线：将抗犬红细胞抗原DEA1的单克隆抗体稀释1500倍，划膜量1μl/cm；
B、烘干：将NC膜放置37℃烘箱烘干4小时；
C、裁条：将NC膜裁剪成3mm宽的试纸条；
D、组装：外购商品化的卡壳与裁剪好的试纸条组装成试纸条。
（2）稀释液：含有0.05%吐温-20的PBS（0.01mol/L，pH值7.4）溶液。
（3）定量双耳滴管：商品化的滴管。
应用实施例2 犬血型鉴定试剂盒的特异性鉴定
1、对犬血型的检测结果的准确性：检测107例犬血液样本，其中包括58例DEA1阳性犬血、49例DEA1阴性犬血均正确。
2、与其它物种血交叉测试：如图5所示，从左至右依次为犬DEA1阳性样本、犬DEA1阴性样本、猫、猪、牛EDTA全血样本，与猫、牛、猪血无非特异性条带。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (5)

1.抗犬红细胞抗原DEA1的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区；
所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；
所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID No.1的第72-78位、103-118位、148-158位所示；
所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID No.2的第55-65位、81-87位、119-128位所示。
2.根据权利要求1所述的抗犬红细胞抗原DEA1的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体是通过分离提取DEA1阳性血红细胞抗原作为免疫原并经筛选得到的鼠源单克隆抗体。
3.一种如权利要求1或2所述的抗犬红细胞抗原DEA1的单克隆抗体在检测试剂中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，将所述抗犬红细胞抗原DEA1的单克隆抗体包被于犬血型鉴定试纸条检测线T线。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，将所述抗犬红细胞抗原DEA1的单克隆抗体包被于犬血型鉴定凝集卡。
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