JPH0325360A - ホモジニアスアンペロメトリックイムノアッセイ - Google Patents
ホモジニアスアンペロメトリックイムノアッセイInfo
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
(産業上の利用分野)
本発明は、ジゴキシン,テオフィリンクレアチンキナー
ゼ(CKMB) 、およびヒトじゅうもう性ゴナドトロ
ビン(H C G)のような分析物の存在を検出するた
めに使われ得る電気化学的イムノアッセイに関する。本
発明の改良点は、ホモジニアスイムノアッセイにおける
、電気活性分子,キャリア分子および対象となる分析物
を含む錯体の使用を包含する。
ゼ(CKMB) 、およびヒトじゅうもう性ゴナドトロ
ビン(H C G)のような分析物の存在を検出するた
めに使われ得る電気化学的イムノアッセイに関する。本
発明の改良点は、ホモジニアスイムノアッセイにおける
、電気活性分子,キャリア分子および対象となる分析物
を含む錯体の使用を包含する。
(従来の技術)
電気化学的検出方法は、臨床診断のマーケットで広く採
用されている。と言うのは、それらの方法が比較的安価
で使用しやすいためである。ヘテロジニアスな電気化学
的イムノアッセイシステムは、10e−6Mより大きい
感度が必要な場合、広範な洗浄ステップおよび複合的な
試薬付加のために、高度のオペ1ノータ関与をしばしば
必要とする。このレベルの高度でさえも、ジゴキシンの
ような臨床上重要な小さい分析物の検出′およびCKM
BやHCGのようなもっと大きい分析物の検出にとって
不十分である。虚血性心不全および他の急性心臓状態を
処置するために広く使用される強心グリコシドであるジ
ゴキシンは、小さい治療指数を伴う1 n mol/L
ほどの濃度で治療効果を有する強力な薬品である。しか
しながらジゴキシンは、治療効果を生じるのに必要な投
与量による低い濃度でも有害であり、毒性に対する感度
は処置されている特定の患者に依存する。ナノモル範囲
におけるジゴキシンの迅速な検出は、心臓の患者を扱う
ために必要とされ、そして、ジゴキシンのためのあらゆ
る有益な検出方法は、速い応答時間によってナノモル濃
度を測定することが可能でなければならない。これらの
問題は、さらに高い感度の多相システムを採用すること
によって解決されるであろうが今までのところ、そのよ
うなシステムの開発は、わかりにくかった。電気化学的
イムノアッセイのための非酵素電気活性標識化に基づく
そのようなシステムの開発における困難について、Me
thods of’ Biochemical^nal
ysis , 32巻, P345−393(1988
年)でW.R.He1neman等が述べている。
用されている。と言うのは、それらの方法が比較的安価
で使用しやすいためである。ヘテロジニアスな電気化学
的イムノアッセイシステムは、10e−6Mより大きい
感度が必要な場合、広範な洗浄ステップおよび複合的な
試薬付加のために、高度のオペ1ノータ関与をしばしば
必要とする。このレベルの高度でさえも、ジゴキシンの
ような臨床上重要な小さい分析物の検出′およびCKM
BやHCGのようなもっと大きい分析物の検出にとって
不十分である。虚血性心不全および他の急性心臓状態を
処置するために広く使用される強心グリコシドであるジ
ゴキシンは、小さい治療指数を伴う1 n mol/L
ほどの濃度で治療効果を有する強力な薬品である。しか
しながらジゴキシンは、治療効果を生じるのに必要な投
与量による低い濃度でも有害であり、毒性に対する感度
は処置されている特定の患者に依存する。ナノモル範囲
におけるジゴキシンの迅速な検出は、心臓の患者を扱う
ために必要とされ、そして、ジゴキシンのためのあらゆ
る有益な検出方法は、速い応答時間によってナノモル濃
度を測定することが可能でなければならない。これらの
問題は、さらに高い感度の多相システムを採用すること
によって解決されるであろうが今までのところ、そのよ
うなシステムの開発は、わかりにくかった。電気化学的
イムノアッセイのための非酵素電気活性標識化に基づく
そのようなシステムの開発における困難について、Me
thods of’ Biochemical^nal
ysis , 32巻, P345−393(1988
年)でW.R.He1neman等が述べている。
テオフィリンの存在を検出するためのホモジニアス電気
化学的イムノアッセイの使用が、その活性がリポソーム
のリーシスに直接比例しかつ試料中の自由抗原の濃度に
反比例するエントラップト酵素を含むリポソームを利用
したリポソームイムノアッセイを用いたものとして、A
nalytical BIochemistry 11
6巻,ページ28B−293(1981年)においてM
.llaga等によって報告された。電流のパルスがサ
ンプルに導入されるときが、酵素電極および登録された
電流により検出される酵素の消耗を触媒する。リポソー
ム内の電気活性分子の取込みについて、Analyti
cal Che*1stry.80巻.Pl42−14
7(1988年〉でR.M.Kannuck等が報告し
ており、信号増幅のためリポソーム内のカリウムフェロ
シアン化物の封入を記載している。リポソームは、試料
中に存在する抗体と結合し、カプセルに入れられたチャ
ージを電極表面に伝える封入されたカリウムフェロシア
ン化物を解放する。実際上、理論的興味のある電気活性
リポソーム技術は、利用するのが難しく、そして、その
ようなシステムに使用されたリポソームの不安定性のた
め、誤読を生じることがあり得る。
化学的イムノアッセイの使用が、その活性がリポソーム
のリーシスに直接比例しかつ試料中の自由抗原の濃度に
反比例するエントラップト酵素を含むリポソームを利用
したリポソームイムノアッセイを用いたものとして、A
nalytical BIochemistry 11
6巻,ページ28B−293(1981年)においてM
.llaga等によって報告された。電流のパルスがサ
ンプルに導入されるときが、酵素電極および登録された
電流により検出される酵素の消耗を触媒する。リポソー
ム内の電気活性分子の取込みについて、Analyti
cal Che*1stry.80巻.Pl42−14
7(1988年〉でR.M.Kannuck等が報告し
ており、信号増幅のためリポソーム内のカリウムフェロ
シアン化物の封入を記載している。リポソームは、試料
中に存在する抗体と結合し、カプセルに入れられたチャ
ージを電極表面に伝える封入されたカリウムフェロシア
ン化物を解放する。実際上、理論的興味のある電気活性
リポソーム技術は、利用するのが難しく、そして、その
ようなシステムに使用されたリポソームの不安定性のた
め、誤読を生じることがあり得る。
電気活性酵素錯体を包含するヘモロジニアスおよびホモ
ジニアスのイムノアッセイシステムの使用は、Jour
nal of’ Immunoassay, 7巻,
1−15べ−ジ( 1988年).G.^.Robi
nson等、および欧州特許第85303387.8号
に記載されている。この技術は、チロキシンおよびフェ
ロセンモノカルボン酸の複合体を使用することによるチ
ロキシンの検出に関する。この複合体は、グルコースオ
キシダーゼのようなオキシド・レダクターゼ酵素と電極
との間の電子移動メディエイタとして機能する。電子移
動メディエイタとして機能するための複合体の能力は、
複合体に結合する抗チロキシン抗体の存在によって損な
われ電極への電流の流れを減じさせる。ホモジニアスモ
ードにおいて、複合体,抗体、チロキシン,グリコース
オキシy−ゼおよびグルコースを含むシステムの必要な
成分の全ては、初めに存在するかく或いは、試料に加え
られる。代りに、ヘテロジニアスモードは1,電極上で
共同固定される酵素および抗体を含む。このシステムは
、システムに存在し、システムから除去されていない酵
素からの干渉のような干渉を受けること、および副反応
生戊物としての過酸化水素の生戒などの欠点を持つ。さ
らに、酵素反応および拡散の付加的要求は、このシステ
ムに増大された応答時間を必要とすると同様、基線活動
性および試料添加後の活動レベルを測定することを必要
とする。
ジニアスのイムノアッセイシステムの使用は、Jour
nal of’ Immunoassay, 7巻,
1−15べ−ジ( 1988年).G.^.Robi
nson等、および欧州特許第85303387.8号
に記載されている。この技術は、チロキシンおよびフェ
ロセンモノカルボン酸の複合体を使用することによるチ
ロキシンの検出に関する。この複合体は、グルコースオ
キシダーゼのようなオキシド・レダクターゼ酵素と電極
との間の電子移動メディエイタとして機能する。電子移
動メディエイタとして機能するための複合体の能力は、
複合体に結合する抗チロキシン抗体の存在によって損な
われ電極への電流の流れを減じさせる。ホモジニアスモ
ードにおいて、複合体,抗体、チロキシン,グリコース
オキシy−ゼおよびグルコースを含むシステムの必要な
成分の全ては、初めに存在するかく或いは、試料に加え
られる。代りに、ヘテロジニアスモードは1,電極上で
共同固定される酵素および抗体を含む。このシステムは
、システムに存在し、システムから除去されていない酵
素からの干渉のような干渉を受けること、および副反応
生戊物としての過酸化水素の生戒などの欠点を持つ。さ
らに、酵素反応および拡散の付加的要求は、このシステ
ムに増大された応答時間を必要とすると同様、基線活動
性および試料添加後の活動レベルを測定することを必要
とする。
同様にM.H.Eggers等、CI1n1cal C
heilstry.28巻.184B−1851ページ
(1982年)、およびT.T.Ngo等、Appli
ed Biochemistry and Biote
chnology .11巻,83−70ページ(19
84年)は、それぞれNADHおよびDNP−7ミノカ
ブロン酸の試料中の存在を検出する電気化学的イムノア
ッセイ技術を記載している。これらの方法の双方共、前
述した方法と同じ多数の欠点を持ち、そして、さらに、
lOe−13Mのみの感度しか、これらのアプローチを
用いて可能ではないと考えられる。
heilstry.28巻.184B−1851ページ
(1982年)、およびT.T.Ngo等、Appli
ed Biochemistry and Biote
chnology .11巻,83−70ページ(19
84年)は、それぞれNADHおよびDNP−7ミノカ
ブロン酸の試料中の存在を検出する電気化学的イムノア
ッセイ技術を記載している。これらの方法の双方共、前
述した方法と同じ多数の欠点を持ち、そして、さらに、
lOe−13Mのみの感度しか、これらのアプローチを
用いて可能ではないと考えられる。
酸化/還元反応に直接参加できる化学的に変性された酵
素が、The Jurnal of’ Phys1ca
l Chemistry.91巻,P1285−128
9(1!388年) 、Journal of the
American Chemical Soclety
.110 巻,P2615−2620(1988年)
、Y.Deganl and A.Heller,およ
び欧州特許出願第88300814.8に記載されてい
る。これらの刊行物に示された技術は、1ノドックスセ
ンターを含む錯体を形戊するためのフェロセンカルボン
酸とグルコースオキシダーゼおよびD−アミノ酸オキシ
ダーゼのような酵素の反応を包含する。この錯体は、電
極との直接的な電気的相互作用が可能である。代りに、
グルコースオキシダーゼのチロシン基は、DOPA基の
ような電気化学的な活性基に変換でき、同じ相互作用が
可能である。試料におけるグルコースの存在は、グルコ
ースと変性された酵素の反応によって電極で電流を直接
測定することにより決定される。
素が、The Jurnal of’ Phys1ca
l Chemistry.91巻,P1285−128
9(1!388年) 、Journal of the
American Chemical Soclety
.110 巻,P2615−2620(1988年)
、Y.Deganl and A.Heller,およ
び欧州特許出願第88300814.8に記載されてい
る。これらの刊行物に示された技術は、1ノドックスセ
ンターを含む錯体を形戊するためのフェロセンカルボン
酸とグルコースオキシダーゼおよびD−アミノ酸オキシ
ダーゼのような酵素の反応を包含する。この錯体は、電
極との直接的な電気的相互作用が可能である。代りに、
グルコースオキシダーゼのチロシン基は、DOPA基の
ような電気化学的な活性基に変換でき、同じ相互作用が
可能である。試料におけるグルコースの存在は、グルコ
ースと変性された酵素の反応によって電極で電流を直接
測定することにより決定される。
欧州特許第8830[)g14.8号において指摘され
るように、レドックスセンターまたはカップルを組み込
むための酵素の電解性は、理論的に望ましいが2達成す
るのが通常難しい。酵素の試みられた変性は、ウシ力ル
ポキシベプチターゼA中のカルボキシル基をN一エチル
−5−フエニルイソキサゾリウム−3′−スルホネート
によって変性するように、容易に不活性化をもたらす。
るように、レドックスセンターまたはカップルを組み込
むための酵素の電解性は、理論的に望ましいが2達成す
るのが通常難しい。酵素の試みられた変性は、ウシ力ル
ポキシベプチターゼA中のカルボキシル基をN一エチル
−5−フエニルイソキサゾリウム−3′−スルホネート
によって変性するように、容易に不活性化をもたらす。
欧州特許出願に示されるように、レドックスセンターは
電子移動を可能にするように、十分に電極に近くなけれ
ばならない(一方、酵素の不活性化を防ぐために化学中
心から十分に隔って)ので、変性された酵素におけるレ
ドックスセンターの存在は重大である。
電子移動を可能にするように、十分に電極に近くなけれ
ばならない(一方、酵素の不活性化を防ぐために化学中
心から十分に隔って)ので、変性された酵素におけるレ
ドックスセンターの存在は重大である。
実際上これが達成るための難しい条件であるということ
が認識されるであろう。
が認識されるであろう。
(発明の横!i!)
本発明によれば、少くとも1つの電気活性分子に共有接
合されたキャリア分子に共有に接合された少くとも1つ
の抗原的分析物を含む電気活性錯体が供給される。好ま
しくは、分析物はジゴキシンであり、キャリア分子はウ
シの血清アルブミンであり、そして電気活性分子はフェ
ロセンカルボン酸である。電気活性錯体は、分析物に対
する所定量の抗体を同様に含む電解セル中の血液のよう
な生物体液の試料と組合わされる。試料体液中の錯体に
よって生じるピーク電流を所定するために、差異パルス
ボルタメトリーが利用される。この電流は、既知量の分
析物,抗体および電気活性錯体を用いて作った標準曲線
と比較され、試料中に存在する抗体の濃度が決定される
。
合されたキャリア分子に共有に接合された少くとも1つ
の抗原的分析物を含む電気活性錯体が供給される。好ま
しくは、分析物はジゴキシンであり、キャリア分子はウ
シの血清アルブミンであり、そして電気活性分子はフェ
ロセンカルボン酸である。電気活性錯体は、分析物に対
する所定量の抗体を同様に含む電解セル中の血液のよう
な生物体液の試料と組合わされる。試料体液中の錯体に
よって生じるピーク電流を所定するために、差異パルス
ボルタメトリーが利用される。この電流は、既知量の分
析物,抗体および電気活性錯体を用いて作った標準曲線
と比較され、試料中に存在する抗体の濃度が決定される
。
本発明によるホモジニアスアンベロメトリックイムノア
ッセイは、抗原に特異的な抗体と結合するため、試料中
の自由抗原を有する戊分として抗原または分析物を含む
電気活性複合体または錯体の競合的結合を含む競合イム
ノアッセイである。
ッセイは、抗原に特異的な抗体と結合するため、試料中
の自由抗原を有する戊分として抗原または分析物を含む
電気活性複合体または錯体の競合的結合を含む競合イム
ノアッセイである。
電気活性錯体は、これも電気活性錯体を含むヒト血液ま
たは血清などの生物液体試料に挿入される電極へ電子を
移動させることが可能である。しかしながら、試料中の
分析物または抗原に特異的な抗体の導入に際し、電気活
性錯体は結合され、それによって電極への電子移動が妨
げられ、あるいは抑制される。試料中の自由分析物の導
入、あるいは試料中の自由分析物の存在が、抗体に対し
て錯体結合抗原と競合するので、この反応は競合的結合
環境中で可逆的である。抗体により、錯体のステアリン
酸ヒンダランス(516aric111nderanc
e)のために錯体が不活性化されるか、抗体結合錯体の
サイズ増大のために電極への拡散が遅《なると考えられ
ている。この点において本発明のシステムが都合よく電
解測定技術に適用できるということを除けば、本発明に
おけるイムノアッセイ技術は、従来の競合結合アッセイ
と同様である。
たは血清などの生物液体試料に挿入される電極へ電子を
移動させることが可能である。しかしながら、試料中の
分析物または抗原に特異的な抗体の導入に際し、電気活
性錯体は結合され、それによって電極への電子移動が妨
げられ、あるいは抑制される。試料中の自由分析物の導
入、あるいは試料中の自由分析物の存在が、抗体に対し
て錯体結合抗原と競合するので、この反応は競合的結合
環境中で可逆的である。抗体により、錯体のステアリン
酸ヒンダランス(516aric111nderanc
e)のために錯体が不活性化されるか、抗体結合錯体の
サイズ増大のために電極への拡散が遅《なると考えられ
ている。この点において本発明のシステムが都合よく電
解測定技術に適用できるということを除けば、本発明に
おけるイムノアッセイ技術は、従来の競合結合アッセイ
と同様である。
本発明を実施に際し、3つの電極が適当な容器中の生物
体液の試料と接触させられる。物理的接触は、概して電
極を試料に浸すことによって行われる。作業電極および
対抗電極は、概して、金または白金から形威された金属
電極、またはグラファイト電極である。便利な参照電極
には、塩化物イオン含有溶液中のHg /Hg z C
JzおよびAg/AgCJ!が含まれる。
体液の試料と接触させられる。物理的接触は、概して電
極を試料に浸すことによって行われる。作業電極および
対抗電極は、概して、金または白金から形威された金属
電極、またはグラファイト電極である。便利な参照電極
には、塩化物イオン含有溶液中のHg /Hg z C
JzおよびAg/AgCJ!が含まれる。
試料は、概して、本発明の検出技術を用いて決定される
べき分析物の未知量を含む。所定量の電気活性錯体およ
び抗原への抗体が固定された量の試料に加えられる。電
圧が電極を横切って加えられ、そして試料溶液中を流れ
る電流が測定される。
べき分析物の未知量を含む。所定量の電気活性錯体およ
び抗原への抗体が固定された量の試料に加えられる。電
圧が電極を横切って加えられ、そして試料溶液中を流れ
る電流が測定される。
電圧は、差異パルスボルタメトリーを利用して加えられ
、それによって電圧の小さい振幅パルスがある電圧範囲
に亘って加えられる。電流はパルスのちょうど前と後の
両方でサンプリングされ、出力信号は電流の差異である
。このデータから、電圧範囲に亘って得られたピーク電
流が決定され得る。このピーク電流は、既知量の抗原と
適当なマトリックス中の同所定量の電気活性錯体および
抗体を用いて作られた標準曲線または基準曲線と比較さ
れる。次に、オリジナルの試料に存在する抗原の量は、
標準曲線から都合よく決定される。
、それによって電圧の小さい振幅パルスがある電圧範囲
に亘って加えられる。電流はパルスのちょうど前と後の
両方でサンプリングされ、出力信号は電流の差異である
。このデータから、電圧範囲に亘って得られたピーク電
流が決定され得る。このピーク電流は、既知量の抗原と
適当なマトリックス中の同所定量の電気活性錯体および
抗体を用いて作られた標準曲線または基準曲線と比較さ
れる。次に、オリジナルの試料に存在する抗原の量は、
標準曲線から都合よく決定される。
本発明において、電気活性錯体を調製するため有益であ
りかつ試料液中の測定に適した典型的分析物は、ジゴキ
シン,チオフィリン、HCGおよびCKMBを含むこれ
らの分析物は、全てフェロセンカルボン酸などの電気活
性分子に結合されたウシ血清抗体(BSA)などの適当
なキャリア分子に共有結合できる。フェロセン/BSA
複合物へのジゴキシン分子の共有結合について実施例1
で詳述する。実施例1は特定の反応物質についてのもの
であるが、この技術は共有結合できる全ての分析物に適
用できるここは理解されよう。所望ならば、1つ以上の
分析物を、キャリア分子に結合させることができ、それ
によって抗体のための多数の結合部位と電気活性錯体の
向上された抑制および不活性化が得られる。
りかつ試料液中の測定に適した典型的分析物は、ジゴキ
シン,チオフィリン、HCGおよびCKMBを含むこれ
らの分析物は、全てフェロセンカルボン酸などの電気活
性分子に結合されたウシ血清抗体(BSA)などの適当
なキャリア分子に共有結合できる。フェロセン/BSA
複合物へのジゴキシン分子の共有結合について実施例1
で詳述する。実施例1は特定の反応物質についてのもの
であるが、この技術は共有結合できる全ての分析物に適
用できるここは理解されよう。所望ならば、1つ以上の
分析物を、キャリア分子に結合させることができ、それ
によって抗体のための多数の結合部位と電気活性錯体の
向上された抑制および不活性化が得られる。
臨床環境に広く使われ、そしてジゴキシン分子の還元に
続くシック塩基の形成によってキャリア分子への共有結
合ために化学的に変性できるため、ジゴキシンは、好ま
しい分析物である。ジゴキシンは水溶液に大きくは溶解
しないので、1つ以上のジゴキシンの分子を取り込んだ
電気活性錯体がジゴキシンのみと少くとも同程度に可溶
であり、好ましくはジゴキシンのみより可溶であること
が望ましい。以下の実施例においてはジゴキシンが特定
的に使用されているが、分析物がアミノまたはカルボキ
シル基を含むように化学変性でき、よってキャリア分子
と共有結合でき、この分析物から形威される電気活性錯
体が試料媒体に可溶ならば臨床的に関心のある広範な分
析物に本発明が適用できることは留意されたい。分析物
が、分析物および電気活性錯体の分析或分に結合できる
対応する抗体を有することも必要である。電気活性錯体
の分析物部分への結合に際し、錯体から電極への電子の
移動が実質的に妨げられるように、錯体は電気的に付活
性化されなければならない。ジゴキシンに選択的な抗体
は、高い親和力定数を持ち、従って自由ジゴキシンおよ
び電気活性錯体を含む競合アッセイにおいて有益である
。試料に存在し得る分析物の量は、治療の目的に使われ
る分析物の正常な投与量範囲に応じて変化する。高度に
強力な薬品であるジゴキシンは、通常、試料1一当り約
0.5ナノグラムから試料1ai!当り約2.0ナノグ
ラムの量で存在する。
続くシック塩基の形成によってキャリア分子への共有結
合ために化学的に変性できるため、ジゴキシンは、好ま
しい分析物である。ジゴキシンは水溶液に大きくは溶解
しないので、1つ以上のジゴキシンの分子を取り込んだ
電気活性錯体がジゴキシンのみと少くとも同程度に可溶
であり、好ましくはジゴキシンのみより可溶であること
が望ましい。以下の実施例においてはジゴキシンが特定
的に使用されているが、分析物がアミノまたはカルボキ
シル基を含むように化学変性でき、よってキャリア分子
と共有結合でき、この分析物から形威される電気活性錯
体が試料媒体に可溶ならば臨床的に関心のある広範な分
析物に本発明が適用できることは留意されたい。分析物
が、分析物および電気活性錯体の分析或分に結合できる
対応する抗体を有することも必要である。電気活性錯体
の分析物部分への結合に際し、錯体から電極への電子の
移動が実質的に妨げられるように、錯体は電気的に付活
性化されなければならない。ジゴキシンに選択的な抗体
は、高い親和力定数を持ち、従って自由ジゴキシンおよ
び電気活性錯体を含む競合アッセイにおいて有益である
。試料に存在し得る分析物の量は、治療の目的に使われ
る分析物の正常な投与量範囲に応じて変化する。高度に
強力な薬品であるジゴキシンは、通常、試料1一当り約
0.5ナノグラムから試料1ai!当り約2.0ナノグ
ラムの量で存在する。
電気活性分子は、レドックスセンターを含み、そして電
子を電極へ移動させることが可能な分子である。典型的
な電気活性分子は、フェロセンカルボン酸およびフェロ
セン酢酸などのフェロセン誘導体を含む。電気活性分子
もまた、それによって電荷を電極へ移動させる能力を失
うことなく適当なキャリア分子に共有結合できなければ
ならない。フェロセンカルボン酸は、特に好ましい電気
活性分子である。所望ならば単一の電気活性分子で得ら
れるより高い電流滴定応答となる増幅効果を生じさせる
ため、1つ以上の電気活性分子をキャリア分子に共有結
合させることができる。広い潜在的範囲に亘るレドック
ス活性,可逆性,pH独立性,非自動酸化,還元形での
低い溶解性および酸化形での高い溶解性を含む、優れた
電気化学的特性を有するので、フェロセン誘導体は、好
ましい電気活性分子である。
子を電極へ移動させることが可能な分子である。典型的
な電気活性分子は、フェロセンカルボン酸およびフェロ
セン酢酸などのフェロセン誘導体を含む。電気活性分子
もまた、それによって電荷を電極へ移動させる能力を失
うことなく適当なキャリア分子に共有結合できなければ
ならない。フェロセンカルボン酸は、特に好ましい電気
活性分子である。所望ならば単一の電気活性分子で得ら
れるより高い電流滴定応答となる増幅効果を生じさせる
ため、1つ以上の電気活性分子をキャリア分子に共有結
合させることができる。広い潜在的範囲に亘るレドック
ス活性,可逆性,pH独立性,非自動酸化,還元形での
低い溶解性および酸化形での高い溶解性を含む、優れた
電気化学的特性を有するので、フェロセン誘導体は、好
ましい電気活性分子である。
電気活性錯体は、電気活性分子、キャリア分子および抗
原分析物の共有結合を与えるあらゆる適当な手段によっ
て調製され得る。実施例2は、単一のBSA分子によっ
て連結された多数のフふロセンおよびジゴキシン分子を
含むフェロセンーBSA−ジゴキシン錯体の調製を示し
ている。この実施例において開示された手順において、
フェロセン基を最初に、フェロセンカルボン酸を反応物
として使用してBSAの分子に結合させて複合体を形成
し、そして多数のジゴキシン基を次に複合体のBSA部
分に結合させる。
原分析物の共有結合を与えるあらゆる適当な手段によっ
て調製され得る。実施例2は、単一のBSA分子によっ
て連結された多数のフふロセンおよびジゴキシン分子を
含むフェロセンーBSA−ジゴキシン錯体の調製を示し
ている。この実施例において開示された手順において、
フェロセン基を最初に、フェロセンカルボン酸を反応物
として使用してBSAの分子に結合させて複合体を形成
し、そして多数のジゴキシン基を次に複合体のBSA部
分に結合させる。
電気活性錯体を形成するためのBSAのようなキャリア
分子の使用は、本発明の実施において必須であることが
わかった。中間キャリアまたは連結分子の省略は、フェ
ロセンジゴキシン分子合成の間に試みられたが、この合
戊の間、試料に不溶解性であることがわかったフェロセ
ン誘導体が生じた。血液の浸透圧を調製する血しょう蛋
白質であるBSAの使用は、固有の緩衝作用を有し、単
一のBSA分子への1つ以上のフェロセンおよびジゴキ
シン分子の共有結合形の改質および共有結合を可能にす
る多数の親水性アミノ基残留体を含む水溶液中に高度に
可溶であるという利点を有する。BSAは好ましいキャ
リア分子であるが、シトクロム4Cまたはリボヌクレア
ーゼなどの、関心のある試料に容易に可溶な池のキャリ
アも同様に使用し得る。
分子の使用は、本発明の実施において必須であることが
わかった。中間キャリアまたは連結分子の省略は、フェ
ロセンジゴキシン分子合成の間に試みられたが、この合
戊の間、試料に不溶解性であることがわかったフェロセ
ン誘導体が生じた。血液の浸透圧を調製する血しょう蛋
白質であるBSAの使用は、固有の緩衝作用を有し、単
一のBSA分子への1つ以上のフェロセンおよびジゴキ
シン分子の共有結合形の改質および共有結合を可能にす
る多数の親水性アミノ基残留体を含む水溶液中に高度に
可溶であるという利点を有する。BSAは好ましいキャ
リア分子であるが、シトクロム4Cまたはリボヌクレア
ーゼなどの、関心のある試料に容易に可溶な池のキャリ
アも同様に使用し得る。
電気活性手錯体および抗体、または緩衝剤および安定剤
のような試料に加えられる付加的或分と相容性がなけれ
ばならない。典型的に、試料液体は、実施すべき個々の
試験に応じて、8.5〜7.5の範囲の州まで緩衝され
る。
のような試料に加えられる付加的或分と相容性がなけれ
ばならない。典型的に、試料液体は、実施すべき個々の
試験に応じて、8.5〜7.5の範囲の州まで緩衝され
る。
本発明のホモジニアスアンベロメトリックイムノアツセ
イ(hosogeneous asperometr1
c Igmunoassay)は、今までは低い感度の
イムノアッセイに限定されていた低レベルのオベレート
関与によって、少量の分析物の測定に有用な高レベルの
感度を有することがわかった。
イ(hosogeneous asperometr1
c Igmunoassay)は、今までは低い感度の
イムノアッセイに限定されていた低レベルのオベレート
関与によって、少量の分析物の測定に有用な高レベルの
感度を有することがわかった。
(実 施 例)
本発明を以下の実施例に基づいてさらに詳細に説明する
。実施例からの変更および離脱は、本発明の精神および
範囲からかい離することなく行われ得ることは容易に理
解されよう。
。実施例からの変更および離脱は、本発明の精神および
範囲からかい離することなく行われ得ることは容易に理
解されよう。
実施例1
フェロセンBSA複合体を、BSAによってグルコース
オキダーゼを代用したということを除けば、Journ
al of’ Phys1cal Chemistry
(1987年)におけるY.DeganiおよびA.H
ellerによって示された一般的な手順を用いて調製
した。フェロセンカルボン酸80#vを乳鉢および乳棒
で細かい粉末に粉砕した。次にそれを、最少量の0.l
5M Na −1epes緩衝液を一度に数滴加えるこ
とによって溶解した。
オキダーゼを代用したということを除けば、Journ
al of’ Phys1cal Chemistry
(1987年)におけるY.DeganiおよびA.H
ellerによって示された一般的な手順を用いて調製
した。フェロセンカルボン酸80#vを乳鉢および乳棒
で細かい粉末に粉砕した。次にそれを、最少量の0.l
5M Na −1epes緩衝液を一度に数滴加えるこ
とによって溶解した。
粉末が細かく粉砕されていれば、2ミリリットルで、通
常、十分であった。Hepes緩衝液は、粉末が溶解さ
れるまで、ベーハー調節されない状態におかれた。フェ
ロセンカルボン酸の溶液を、磁気撹拌バーを含む25ミ
リリットルサンプルボトルへ移し、そして全ての容器を
全体容量が約4ミリリットルになるまで新鮮な緩衝液で
すすいだ。サンプルボトルを撹拌と共にベーハーモニタ
ーしながら水浴に浸し、そして、ペーハーを、0.1M
HCぶを滴下して加えることによって7.3に調製した
。
常、十分であった。Hepes緩衝液は、粉末が溶解さ
れるまで、ベーハー調節されない状態におかれた。フェ
ロセンカルボン酸の溶液を、磁気撹拌バーを含む25ミ
リリットルサンプルボトルへ移し、そして全ての容器を
全体容量が約4ミリリットルになるまで新鮮な緩衝液で
すすいだ。サンプルボトルを撹拌と共にベーハーモニタ
ーしながら水浴に浸し、そして、ペーハーを、0.1M
HCぶを滴下して加えることによって7.3に調製した
。
残りの工程の全ての間、ベーハーは、0.IM HC
1か0.l5M Na−Hopesのいずれかを滴下し
て加えることによって7.2−7.3の間に維持された
。
1か0.l5M Na−Hopesのいずれかを滴下し
て加えることによって7.2−7.3の間に維持された
。
〔1 (3−ジメチルアミノプロビル)−3−エチル力
ルポジイミドハイドロクロリド] 100 Rgを加え
、そして溶液を30分の間撹拌した。次に、尿素の81
0 #Fを15分間の付加的撹拌と共に加えた。撹拌ス
ピードは、250■のBSAを徐々に加えると共に、可
視の渦を造るよう増加され、各加えられた量が凝集を回
避するために、次の付加の前に完全に溶解することを可
能にした。溶液は、比較的同質で、粘性のある状態にな
った。BSAの全てが溶解された後で、撹拌を30分間
続けた。サンプルボトルをバラフィンでカバーし、冷凍
されたDewarフラスコ4℃で18時間置いた。あま
りにも長い間置かれると、反応は続き、そして凝固塊が
生じる。混合物を遠心機管に移動の後、低速で15分間
遠心分離された。濁った上漬を、0.2ミクロン孔フィ
ルタを通してわずかな圧力( 2 ate)の下でろ過
した。
ルポジイミドハイドロクロリド] 100 Rgを加え
、そして溶液を30分の間撹拌した。次に、尿素の81
0 #Fを15分間の付加的撹拌と共に加えた。撹拌ス
ピードは、250■のBSAを徐々に加えると共に、可
視の渦を造るよう増加され、各加えられた量が凝集を回
避するために、次の付加の前に完全に溶解することを可
能にした。溶液は、比較的同質で、粘性のある状態にな
った。BSAの全てが溶解された後で、撹拌を30分間
続けた。サンプルボトルをバラフィンでカバーし、冷凍
されたDewarフラスコ4℃で18時間置いた。あま
りにも長い間置かれると、反応は続き、そして凝固塊が
生じる。混合物を遠心機管に移動の後、低速で15分間
遠心分離された。濁った上漬を、0.2ミクロン孔フィ
ルタを通してわずかな圧力( 2 ate)の下でろ過
した。
複合物を、1,5 an X 20lJsephase
x G−1!)ゲルクロマトグラフィ力ラムを通過させ
ることによって出発反応物から純化した。ゲル力ラムを
ナトリウム酸塩緩衝液p}17.0によって平衡し、溶
離した。
x G−1!)ゲルクロマトグラフィ力ラムを通過させ
ることによって出発反応物から純化した。ゲル力ラムを
ナトリウム酸塩緩衝液p}17.0によって平衡し、溶
離した。
2ミリリットル容量の画分を集め、そして、オレンジ複
合体を集められた25画分の13番目付近で溶離した。
合体を集められた25画分の13番目付近で溶離した。
複合体の識別は、吸光度の極大によって示された。つま
り、BSAは280niであり、フェロセンカルボン酸
は450nsであった。複合物の電気活性は、白金対抗
電極および作業電極そしてボテンシオスタットと共にA
g /Ag 01基準電極を用いた標準3i1!極シス
テム上で得られた周期的そして差異的パルスボルタモグ
ラムによって確認された。
り、BSAは280niであり、フェロセンカルボン酸
は450nsであった。複合物の電気活性は、白金対抗
電極および作業電極そしてボテンシオスタットと共にA
g /Ag 01基準電極を用いた標準3i1!極シス
テム上で得られた周期的そして差異的パルスボルタモグ
ラムによって確認された。
実施例2
フェロセンーBSA−ジゴキシン錯体をV.P.But
ler et al. Methods in Euz
ysology(1982年)において示された一般的
な手順を用いて調製した。
ler et al. Methods in Euz
ysology(1982年)において示された一般的
な手順を用いて調製した。
ジゴキシン50I!gを乳鉢および乳棒を用いて細かい
粉末に粉砕した。次に、この粉末を、最小量の95%エ
タノール(IIdl未満)と混合した。付加的エタノー
ル(1−)による乳鉢および乳棒のすすぎと共に25j
ul7サンプルボトルに移した後混合物はマグネシアコ
ンシステンシの乳状液を有していた。
粉末に粉砕した。次に、この粉末を、最小量の95%エ
タノール(IIdl未満)と混合した。付加的エタノー
ル(1−)による乳鉢および乳棒のすすぎと共に25j
ul7サンプルボトルに移した後混合物はマグネシアコ
ンシステンシの乳状液を有していた。
新たに調製したO.lM Na 10. 、2mi!
を、継続的撹拌と共に、5分間に亘って滴下するように
渇合物に加えた。次に撹拌をさらに30分間続けた。
を、継続的撹拌と共に、5分間に亘って滴下するように
渇合物に加えた。次に撹拌をさらに30分間続けた。
エチレングリコール0.1−を加えて反応を止め、そし
て過剰の未反応Nal04を不活性化し、さらに撹拌を
5分間続けた。次に混合物のベーハーを、5%K,co
3の滴下添加によって9.1−9.5に調製し、そして
純化さたフェロセンBSA複合体を一度に全て加えた。
て過剰の未反応Nal04を不活性化し、さらに撹拌を
5分間続けた。次に混合物のベーハーを、5%K,co
3の滴下添加によって9.1−9.5に調製し、そして
純化さたフェロセンBSA複合体を一度に全て加えた。
5%K,CO3の添加によって9J−9.5にベーハー
を維持しながら撹拌を45−60分間、或いはペーハー
が20分間安定しつづけるまで続けた。2IIdlの脱
イオン中に新たに溶解されたN A B H a 30
jllIFを混合物に加え、ボトルを箔でゆるくカバー
して、ガスの放出を可能にし、室温でl8時間放置した
。この時の終りに、ベーハーが6.5になるまでIMの
蟻酸を加え、次に混合物を室温に1時間放置した。撹拌
を再開し、モしてペーハーが865になるまでIM N
H4 0Hを滴下添加した。
を維持しながら撹拌を45−60分間、或いはペーハー
が20分間安定しつづけるまで続けた。2IIdlの脱
イオン中に新たに溶解されたN A B H a 30
jllIFを混合物に加え、ボトルを箔でゆるくカバー
して、ガスの放出を可能にし、室温でl8時間放置した
。この時の終りに、ベーハーが6.5になるまでIMの
蟻酸を加え、次に混合物を室温に1時間放置した。撹拌
を再開し、モしてペーハーが865になるまでIM N
H4 0Hを滴下添加した。
フェロセンーBSA−ジゴキシン錯体を、フェロセンー
BSA複合体の純化に用いたのと同じタイプのカラムを
通過させて、出発反応物から純化した。各2一の少なく
とも35画分を集めた。画分を含むジゴキシンは、II
IdlのH2SO.に加えた時に各画分の200マイク
ロリットルの色変化によって識別された。ジゴキシンは
、濃縮HzSO&中で赤みがかった茶色に変色し、画分
21−26はジゴキシンを含むことがわかった。前に行
ったように、錯体の電気活性をこれらの画分で決定した
。
BSA複合体の純化に用いたのと同じタイプのカラムを
通過させて、出発反応物から純化した。各2一の少なく
とも35画分を集めた。画分を含むジゴキシンは、II
IdlのH2SO.に加えた時に各画分の200マイク
ロリットルの色変化によって識別された。ジゴキシンは
、濃縮HzSO&中で赤みがかった茶色に変色し、画分
21−26はジゴキシンを含むことがわかった。前に行
ったように、錯体の電気活性をこれらの画分で決定した
。
表 1
E l/2 カソードビーク アノードビー
クフ.oセノ−カルポン1 330mV
29hV 37hV7AIセン
−BSA一複合体 480iV 4
3f)+*V 530s+V7sO*74S
A−ジゴキシ7 480d 380sV
580d錯体 実施例3 ポリクロナール抗ジゴキシン抗体を、ロ.085MNa
HPOa緩衝液中<pH7.0)のフェロセンーBSA
−ジゴキシンに加え、37℃で20分間インキユベート
した。加えられた抗体は、カソード電流における40%
減少を引き起こした。自由ジゴキシンの添加によりカソ
ード電流は元の値に戻った。
クフ.oセノ−カルポン1 330mV
29hV 37hV7AIセン
−BSA一複合体 480iV 4
3f)+*V 530s+V7sO*74S
A−ジゴキシ7 480d 380sV
580d錯体 実施例3 ポリクロナール抗ジゴキシン抗体を、ロ.085MNa
HPOa緩衝液中<pH7.0)のフェロセンーBSA
−ジゴキシンに加え、37℃で20分間インキユベート
した。加えられた抗体は、カソード電流における40%
減少を引き起こした。自由ジゴキシンの添加によりカソ
ード電流は元の値に戻った。
実施例4
1−リン酸塩緩衝液試料容量におけるフェロセンーBS
A−ジゴキシン複合体10e−8Mのピーク酸化電流を
差異パルスボルタメトリーによって測定した。ポリクロ
ナール抗ジゴキシン抗体のlodアリコートを錯体に加
え、そして20分間混合した。
A−ジゴキシン複合体10e−8Mのピーク酸化電流を
差異パルスボルタメトリーによって測定した。ポリクロ
ナール抗ジゴキシン抗体のlodアリコートを錯体に加
え、そして20分間混合した。
ピーク酸化電流を再び測定した。次に、ジゴキシン基準
の様々な濃度の50u1を20分間混合しながら加え、
その後で再びピーク酸化電流を測定した。
の様々な濃度の50u1を20分間混合しながら加え、
その後で再びピーク酸化電流を測定した。
加えられた抗体のみによる電流と比較した、加えられた
自由ジゴキシン濃度によって引き起こされたピーク電流
の増加として実験の結果をプロットした。このように行
われた実験は、I X 10e−7Mジゴキシンから4
X LOe−7Mジゴキシンに相当する100−30
0 ng/一のジゴキシン濃度の動的範囲を示す。
自由ジゴキシン濃度によって引き起こされたピーク電流
の増加として実験の結果をプロットした。このように行
われた実験は、I X 10e−7Mジゴキシンから4
X LOe−7Mジゴキシンに相当する100−30
0 ng/一のジゴキシン濃度の動的範囲を示す。
さらなる実験は、利用可能な電気活性錯体の量によって
制限されたが、更に薄い錯体試料の使用は、50ng/
d ( 6 X lOe−8M)ジゴキシン基準を検
出するのを可能にした。
制限されたが、更に薄い錯体試料の使用は、50ng/
d ( 6 X lOe−8M)ジゴキシン基準を検
出するのを可能にした。
前述の実験は、約6ケ月古さであり、かつその間4℃で
緩衝液に蓄えられていた錯体を用いて行った。第2a図
は、14:1のBSAに対するフェロセンの比を有する
ことがわかったこの錯体によって違威された検出限界と
その錯体を用いて測定された電流を示す。第2b図は、
1:1のBSAに対するフェロセンの比を有する新たに
作られた錯体によって違或された検出限界を示す。l4
:1の錯体で得られた電流は1:1の錯体で得られた電
流とほぼ同じであり、また1:1の錯体での検出限界は
100倍低いことがわかる。14:1の錯体は1:1錯
体のそれと比べるとさらに低い検出限界を持つと予測さ
れるであろうが、検出限界における現実の実験的差異は
、各試料の新鮮さにおける差異、そして14:1錯体の
時間外のその後の活性損失に起因する。実施例において
示された電流の検出限界は、多くの治療薬品がこの技術
を用いて分析され得ることを論証している(表2参照)
。5×10e−8Mの濃度範囲を超える全ての化合物は
、この方法によって検出できる。さらに、測定されてい
る試料におけるジゴキシンの現実の濃度は試料71・リ
ックスへの基準液50ul添加の希釈ファクターにより
、投与量応答曲線で示されるより20倍薄くなっている
。これは、実際の検出限界が5 X 10e−9Mであ
ることを意味する。50ulより多い試料が使用できる
か、あるいは分析が非希釈試料について行われることが
好ましい。
緩衝液に蓄えられていた錯体を用いて行った。第2a図
は、14:1のBSAに対するフェロセンの比を有する
ことがわかったこの錯体によって違威された検出限界と
その錯体を用いて測定された電流を示す。第2b図は、
1:1のBSAに対するフェロセンの比を有する新たに
作られた錯体によって違或された検出限界を示す。l4
:1の錯体で得られた電流は1:1の錯体で得られた電
流とほぼ同じであり、また1:1の錯体での検出限界は
100倍低いことがわかる。14:1の錯体は1:1錯
体のそれと比べるとさらに低い検出限界を持つと予測さ
れるであろうが、検出限界における現実の実験的差異は
、各試料の新鮮さにおける差異、そして14:1錯体の
時間外のその後の活性損失に起因する。実施例において
示された電流の検出限界は、多くの治療薬品がこの技術
を用いて分析され得ることを論証している(表2参照)
。5×10e−8Mの濃度範囲を超える全ての化合物は
、この方法によって検出できる。さらに、測定されてい
る試料におけるジゴキシンの現実の濃度は試料71・リ
ックスへの基準液50ul添加の希釈ファクターにより
、投与量応答曲線で示されるより20倍薄くなっている
。これは、実際の検出限界が5 X 10e−9Mであ
ることを意味する。50ulより多い試料が使用できる
か、あるいは分析が非希釈試料について行われることが
好ましい。
表 2
治癒上のml(ug/di) Mola
rityテオ7イダン 1000−2000
5,6xl04 −1.1x 10”’
ジランチ7 1000−2000
4xlG′! − 8x 104ジゴヰ
シン 0.08−0.2
1xlG’ −2.8x 10゜ラトブラミシン
50G−1000 1.lxl
O4 −2.1K 1G4ゲンタマイシン
500−1000 1,lx404 −2
.lx 10″5フs/パルビタール 150G
−4000 6.5x104 −14x
to゜4リFカイ7 150−500
6.4xlO’ −2.1x 104キ
ニジン 200−500
6.21IO−’ −1.5)L 104実施例5 実施例1および2は適切な官能基を有する分子を結合さ
せる周知の方法を示す。アミノ基かカルボキシル基のい
ずれかを持つキャリア分子は、実施例1に示されたカル
ボジイミド工程を用いてアミノまたはカルボキシル基を
持つ分析物または対応する電気活性分子に結合できる。
rityテオ7イダン 1000−2000
5,6xl04 −1.1x 10”’
ジランチ7 1000−2000
4xlG′! − 8x 104ジゴヰ
シン 0.08−0.2
1xlG’ −2.8x 10゜ラトブラミシン
50G−1000 1.lxl
O4 −2.1K 1G4ゲンタマイシン
500−1000 1,lx404 −2
.lx 10″5フs/パルビタール 150G
−4000 6.5x104 −14x
to゜4リFカイ7 150−500
6.4xlO’ −2.1x 104キ
ニジン 200−500
6.21IO−’ −1.5)L 104実施例5 実施例1および2は適切な官能基を有する分子を結合さ
せる周知の方法を示す。アミノ基かカルボキシル基のい
ずれかを持つキャリア分子は、実施例1に示されたカル
ボジイミド工程を用いてアミノまたはカルボキシル基を
持つ分析物または対応する電気活性分子に結合できる。
錯体成分工程の一般的アブリケーションを示すため、前
記実施例に開示されたBSA錯体に類似した特性を示す
以下の錯体を作った。
記実施例に開示されたBSA錯体に類似した特性を示す
以下の錯体を作った。
表 3
カソードビーク アノードビーク
フェロセンカルボン酸 290mV 350
mVフェロセンーBGG−ジゴキシン’ 28f)s
V 33hVフェロセンーBSA−ジゴキシン 3
8hV 43hVフェロセンーRNase−ジゴキシ
ンゝHhV 430+++va BGiOはウシガン
マグロプリンであるb RNaseはリボヌクレアーゼ
である実施例に使用した87.000の分子量のBSA
よりキャリア分子が小さい場合、キャリア分子への電気
活性分子の取込みに関するより多くのコントロールが得
られる。従って、シトクロムC.インスリン,リボヌク
レアーゼまたは合或ベブチドなどの分子がキャリア分子
のために使用できる(表4)。
mVフェロセンーBGG−ジゴキシン’ 28f)s
V 33hVフェロセンーBSA−ジゴキシン 3
8hV 43hVフェロセンーRNase−ジゴキシ
ンゝHhV 430+++va BGiOはウシガン
マグロプリンであるb RNaseはリボヌクレアーゼ
である実施例に使用した87.000の分子量のBSA
よりキャリア分子が小さい場合、キャリア分子への電気
活性分子の取込みに関するより多くのコントロールが得
られる。従って、シトクロムC.インスリン,リボヌク
レアーゼまたは合或ベブチドなどの分子がキャリア分子
のために使用できる(表4)。
表 4
蛋 白 MVx 10’ Nh M
COOH基BSA 6B.5 リボヌクレアーゼ 14.0 11 1
1シトクロム 13.0 20
13インスリン 5.7 2
5表4における分子の全ては生理的溶液に溶解するこ
とが知られた小さい蛋白質である。さらに、更に小さい
分子量のキャリア分子を用いることは、抗体分子(分子
m−150.000)が錯体の電気活性に大きく作用す
ることを可能にする。HCGのような蛋白抗原もこれら
のアミノおよびカルボキシル基を含むことができ、従っ
てカルボジイミドプロトコルをへてキャリア分子と結合
され得る。抗原による抗体結合能の維持は、抗原/抗体
複合物の解離が続く結合された特異的抗体の存在下での
結合の実行によって高められ得る。
COOH基BSA 6B.5 リボヌクレアーゼ 14.0 11 1
1シトクロム 13.0 20
13インスリン 5.7 2
5表4における分子の全ては生理的溶液に溶解するこ
とが知られた小さい蛋白質である。さらに、更に小さい
分子量のキャリア分子を用いることは、抗体分子(分子
m−150.000)が錯体の電気活性に大きく作用す
ることを可能にする。HCGのような蛋白抗原もこれら
のアミノおよびカルボキシル基を含むことができ、従っ
てカルボジイミドプロトコルをへてキャリア分子と結合
され得る。抗原による抗体結合能の維持は、抗原/抗体
複合物の解離が続く結合された特異的抗体の存在下での
結合の実行によって高められ得る。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1)一組の電極を備えた電気化学的セル内に入れられた
生物体液の試料中に存在する分析物の濃度を決定する方
法であって、 a)電極に電荷を伝達することのできる電気活性分子に
化学的に結合されたキャリア分子に化学的に結合された
抗原性分析物を含む電気活性錯体を形成し、 b)生物体液、予定量の電気活性錯体、および分析物に
対する抗体を前記セルに加え、 c)前記電極間に電圧を加え、異なる電圧レベルにおい
て前記生物体液内の電流を測定して試料体液についての
電圧/電流の関係を導き、 d)その試料体液についての電圧/電流の関係を既知量
の分析物を用いて導き出した基準的電圧/電流の関係と
比較して試料中に存在する分析物の濃度を決定する、 各工程から成ることを特徴とする方法。 2)前記分析物がチオフィリン、チロキシン、ジゴキシ
ン、およびHCGから成る群より選択されることを特徴
とする請求項1記載の方法。 3)前記キャリア分子がウシ血清アルブミンであること
を特徴とする請求項1記載の方法。 4)前記電気活性分子がフェロセン誘導体であることを
特徴とする請求項1記載の方法。 5)前記フェロセン誘導体がフェロセンカルボン酸およ
びフェロセニル酢酸から成る群より選択されることを特
徴とする請求項4記載の方法。 6)前記フェロセン誘導体がフェロセンカルボン酸であ
ることを特徴とする請求項5記載の方法。 7)前記分析物がジゴキシンであり、前記抗体が抗−ジ
ゴキシン抗体であり、前記キャリア分子がウシ血清アル
ブミンであり、そして前記電気活性分子がフェロセンカ
ルボン酸であることを特徴とする請求項1記載の方法。 8)作業電極および対抗電極を白金またはグラファイト
から作ることを特徴とする請求項1記載の方法。 9)前記生物体液が全血、血しょう、血清、または尿で
あることを特徴とする請求項1記載の方法。 10)緩衝液を生物体液試料に加えることを特徴とする
請求項1記載の方法。 11)キャリア分子に化学的に結合された少くとも1つ
の抗原性分析物を含む電気活性錯体であって、前記キャ
リア分子もまた少くとも1つの電気活性分子に化学的に
結合されていることを特徴とする電気活性錯体。 12)前記分析物がチオフィリン、チロキシン、ジゴキ
シンおよびHCGから成る群より選択されることを特徴
とする請求項11記載の電気活性錯体。 13)前記キャリア分子がウシ血清アルブミンであるこ
とを特徴とする請求項11記載の電気活性錯体。 14)前記電気活性分子がフェロセルカルボン酸である
ことを特徴とする請求項11記載の電気活性錯体。 15)ジゴキシン、ウシ血清アルブミンおよびフェロセ
ンカルボン酸の錯体であることを特徴とする請求項11
記載の電気活性錯体。 16)まずフェロセンカルボン酸をウシ血清アルブミン
に共有結合させ、次にジゴキシンをウシ血清アルブミン
に共有結合させることによって調製されることを特徴と
する請求項15記載の電気活性錯体。 17)前記化学結合が共有結合であることを特徴とする
請求項11記載の電気活性錯体。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US364731 | 1982-04-02 | ||
US07/364,731 US5198367A (en) | 1989-06-09 | 1989-06-09 | Homogeneous amperometric immunoassay |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0325360A true JPH0325360A (ja) | 1991-02-04 |
JP2550428B2 JP2550428B2 (ja) | 1996-11-06 |
Family
ID=23435822
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2149705A Expired - Lifetime JP2550428B2 (ja) | 1989-06-09 | 1990-06-07 | ホモジニアスアンペロメトリックイムノアッセイ |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
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EP (1) | EP0402126B1 (ja) |
JP (1) | JP2550428B2 (ja) |
AU (1) | AU641395B2 (ja) |
CA (1) | CA2017525A1 (ja) |
DE (1) | DE69026309T2 (ja) |
MX (1) | MX174477B (ja) |
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