JPH0219766A - 免疫測定方法及びそれに用いる試薬キット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ａ、産業上の利用分野 本発明は、溶液中での抗原抗体反応を利用して免疫学的
に物質の量を測定するに際し、特異的反応を低下させる
ことなく、非特異的反応を低下させる免疫測定方法とそ
れに用いる試薬キットに関するものである。

ｂ、従来の技術 抗体を用いた免疫測定法は、その特異性の高さや感度の
高さから広く用いられている方法であり、１９７５年モ
ノクローナル抗体の発見とともに、ますます発展が期待
される。

この免疫測定法の検出手段に関してら、従来数耐性物質
（１）が用いられていたが、近年、酸素、螢光物質など
が用いられるようになり、放射性物質の使用のための使
用者の特殊な訓練が不要になったことも、この免疫測定
法の発展に拍車がかかった要因の１つであろう。

さて、この免疫測定法が高感度であるためには、抗原−
抗体反応のみに由来する特異的な反応は高く、それ以外
の非特異的反応は極力低いことが、必須条件である。

この非特異的反応をおさえることが高感度免疫測定法を
完成するための重要な技術的ポイントである。それゆえ
に従来から種々の試みが行われている、その手段として
最も広く行われている手段は、非特異的反応を抑えるた
めの添加剤（ブロッキング剤）の工夫である。

従来これらの非特異的反応を抑える手段として、さまざ
まな対策が講じられている。従来のこれらの対策は大き
く２つに分かれる。第１の方法は非タンパク性の物質で
ある界面活性刑等を用いるものであり、第２の方法は、
体液ないしはタンパク溶液を用いるものである。第１の
方法の例として、特開昭５７−１８２１６９号公報にお
いて、免疫反応を行なう反応媒体に可溶なポリアニオン
を用い、また特開昭５８−１８７８６２号公報において
は、非イオン界面活性剤を用いて非特異的吸着除去を工
夫している。一方、第２の方法として、特開昭５９−２
５１８４号公報では疎水性蛋白の０．１％以上を塩類の
存在下に用いることを特徴とするものや、特開昭６１−
６５１６２号公報のようなマウス腹水等を用いることに
より、非特異的吸着の低減を見ている。

Ｃ１発明が解決しようとする課題 しかしながら、従来の方法はそれぞれ欠点を有しており
決定的な非特異的吸着除去法にはなりえないのが現状で
ある。

すなわち第１の方法はしばしば特異的な反応も妨げてし
まい、結果として、低感度の測定系を導くことになる。

また第２の方法として、疎水タンパクの使用をあげてい
るが、本発明者らの検討によれば疎水性は非特異的吸着
除去にほとんど全く影響を及ぼさなかった。

また第２の方法としてマウスの腹水を用いた場合には、
腹水の成分の再現性に問題があることや、この成分によ
って特異的反応が低減し、免疫測定法本来の目的に反す
るところとなる。

４０課題を解決するための手段 本発明者は、かかる状況に鑑みて、非特異的反応を抑え
るためのタンパクの添加剤を種々検討し、そのタンパク
の分子量、電点等を考慮しながら、免疫反応条件を特異
反応と非特異反応の両面から鋭意研究した結果、分子量
１．６〜５．０万１等電点１．０〜５．０の条件を同時
に満足するタンパクを用い、免疫反応溶液中におけるそ
の轟終濃度が０．０２〜０．９重量％に調整することに
より特異的反応を低下させることなく、非特異的反応を
著しく低下させ、結果として、免疫反応を高感度にしう
ろことを確認し、本発明に到達した。

すなわち、本発明は溶液中における抗原−抗体反応を利
用した免疫測定を行なうに際し、免疫反応溶液に分子量
が１．６〜５．０万で等電点が１．０〜５．０であるタ
ンパクを存在せしめ、該タンパクの免疫反応溶液におけ
る最終濃度を０．０２〜０．９重量％に調整することを
特徴とする免疫測定方法である。

さらに、本発明は分子量が１．６〜５，０万で等電点が
１，０〜５．０であるタンパクの０．０２〜０゜９重量
％の溶液を、その構成要素の一部とする免疫測定に用い
る試薬キットである。

本発明のタンパクは分子量が１．６〜５．０万で等電点
が１．０〜５．０の範囲にあるものをいう。

本発明におけるかかるタンパクとしては、ペプシン、オ
ボグリコプロテイン、オロソムコイド等があげられる０
分子ｊ１１．６万以下のタンパクを用いた場合には、非
特異的吸着が上昇してしまう結果を得ており、また５、
０以上の分子量では免疫非特異的反応の低減が不充分か
つ特異的免疫反応の低下が見られることにより、本発明
に使用する分子量を１，６万〜５．０万と決めた。

また等電点に関しても等電点５．０以上のタンパクを添
加した場合、非特異的吸着が上昇し、また等電点１．０
より下では特異的反応がおさえられるために本発明に使
用するタンパクの等電点の範囲を１．０〜５．０と決め
た。

本発明におけるかかるタンパク溶液は次のように調製さ
れる。すなわち、リン酸緩衝生理食塩水に適度な濃度の
タンパクを加えて約１時間撹拌する０次いで超音波をか
けて溶解させ、０．４５μミリボア通過溶液として用い
る６種々の濃度のタンパク溶液を用いて、免疫測定方法
を行なったところ、０．０２重量％以下のタンパク溶液
を用いると、抗原が０であるにもかかわらず非特異的反
応が著しく増加したため、タンパクの濃度を０．０２重
量％以上と定めた。またＯ・、９重量％を越える濃度で
は特異的免疫反応の低下が見られるため、タンパクの濃
度を０．９重量％以下と定めた６以上の２つの事実を考
慮し、試薬の安定性を満足し、かつ非特異的反応を効果
的に減するタンパク濃度は、０．０２〜０．９重量％の
範囲が適当である。

本発明の免疫測定に用いる試薬キットとは、例えは２つ
の抗体を用いるサンドイツチ法による免疫測定に用いる
試薬キットであって、（ａ）酵素標識抗体、（ｂ）抗体
固定ビーズ、（Ｃ）アッセイ緩衝液、（ｄ）基質液、（
ｅ）発色剤、（ｆ）発色停止液。

（ａ）スタンダード、（ｈ）洗浄液等から構成されるも
のであり、好ましくはこれらのいずれかに、前記タンパ
クの溶液を含有ぜしめたものである。なかでも（ａ）酵
素標識抗体又は（Ｃ）アッセイ緩衝液に含有せしめるの
が、特に（Ｃ）アッセイ緩衝液に含有せしめるのが好ま
しい。

０１作用 発明の条件を満足するタンパクを免疫測定系に添加する
ことにより特異的反応をほとんど低下させる事なしに、
充分非特異的反応を低下させる作用を有する事が確認さ
れ、高感度な免疫測定法が可能になった。

本発明の方法を用いることにより、種々の抗原を測定す
ることができる。そのような抗原としては例えばα２プ
ラスミン・インヒビター（αｚＰＩ）、α２ＰＩ−プラ
スミン複合体、プロティンＣ，プロティンＳ等の凝固線
溶系因芋、＃−サーファクタント・アポ蛋白及びＡＦＰ
、ＣＥＡ等の腫瘍マーカー等が挙げられる。

本発明を、以下実施例によって説明するが、これによっ
て限定されるものではない。特にことわらない限り、実
施例中の％は重量基準である。

ヒトプラスミノーゲンに対するポリクローナル抗体を固
定したポリスチレン製ボール（直径６止）と、抗ヒトα
２ＰＩ−モノクローナル抗体のペルオキシダーゼ標識体
とを用いて、ウレアーゼ、ゼラチン、牛血清アルブミン
、卵アルブミン、ペプシン、α−カゼイン、β−カゼイ
ン、カセインスキムミルク、ＲＦＣ（ＩＣＩＧの部分Ｆ
Ｃ）、ＮＺＣａｓｅｆカゼインのペプシン分解物）、ゼ
ラチンハイドロリゼート　エンザイマティックアシッド
（Ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ　Ｅｎｚｙｎａｔｉｃ−＾ｃ
ｉｄ）　、オロソムコイド、オボグリコプロテインの各
種タンパク０．２５％を含有する０、０１Ｍリン酸Ｍ衝
生理食塩水（ｐｌ＋　７．４）中において、ヒトα２Ｐ
Ｉ−プラスミン複合体濃度０　、１１００ｎ／　［０１
の各水準について、３７℃の温度で６０分反応を行なっ
た後、ボールと反応液とを分離し、ボールを生理食塩水
でよく洗浄した０次に、これをテトラメチルベンジジン
−８２０□の発色系を含有する水溶液中において反応さ
せた後、反応停止剤を加えて酸素反応を停止させて、６
５０ｎｎの波長の吸収強度を測定した。

以下の計算式を用いて、非特異反応率を算出し、分子量
は等電点との相関を各々第１図及び第２図に示した。

ＯＤ６５０　　（Ｏｎａ／［１１１） 非特異反応率＝　　　　　　　　　　　　ｘｌｏｏＯＤ
　６５０（１００ｎｆＪ　　／ｍｌ　）第１図より分子
量１．６万〜５．０万、第２図より等電点１．０〜５．
０の範囲のタンパクの添加が非特異的反応の著しい低下
を導くことは明白である。

また第２図より、等電点１．０〜５．０のタンパクの添
加が非特異的反応を低減する効果が良好であることがわ
かる。

ヒトプラスミノーゲンに対するポリクローナル抗体を固
定したポリスチレンボールと、抗ヒトα２ＰＩモノクロ
一ナル抗体のペルオキシダーゼ標識体とを用いてオロソ
ムコイド、ペプシンの各種濃度を含有する０、１Ｍ！Ｊ
ン酸ＩＩＩＩｆｍ液（ＰＨ７，２）中Ｇ：おいて、ヒト
α２ＰＩ−プラスミン複合体濃度０゜５０、１１００ｎ
／ｍｌの各水準について３７℃の温度で６０分反応を行
なった後、ボールと反応液とを分離し、ボールを生理食
塩水でよく洗浄した０次に、これをテトラメチルベンジ
ジン−Ｈ２Ｏ２の発色系を含有する水溶液中において反
応させた後、反応停止剤を加えて酵素反応を停止させて
、８５０ｎｉの波長の吸収強度を測定しな。

結果をそれぞれ第３図（オロソムコイド）と第４図（ペ
プシン）に示した。第３および第４図から、低タンパク
濃度では非特異的反応が著しく増加すること、高タンパ
ク濃度では特異的反応が低下していることが明らかであ
る。

【図面の簡単な説明】

第１図は非特異反応率と各種タンパクの分子量の相関を
示す。 第１図中のＡ〜Ｎは各々、Ａ：ウレアーゼ、Ｂ：ゼラチ
ン、Ｃ：牛血清アルブミン、Ｄ二卵アルブミン、Ｅ：ペ
プシン、Ｆ：β−カゼイン、Ｇ：α−カゼイン、Ｈ：カ
ゼイン、■：スキムミルク。 Ｊ：ＰＦＣ，に：Ｎｚ　Ｃａ５ｅ　、Ｌ：ゼラチン　ハ
イドロリゼート　エンザイマティック　アシッド。 Ｍ：オロソムコイド、Ｎ：オボグリコプロテインを示す
。 第２図は、非特異反応率と各種タンパクの等電点との相
関を示す、第２図中の８〜ｇは各々、ａ：リゾチーム、
ｂ：アビジン、Ｃ：ストレプト、ｄ：カゼイン、ｅ：ペ
プシン、ｆ：オロソムコイド。 ｇ：オボグリコプロテインを示す。 第３図は、オロソムコイドの添加゛濃度による免疫反応
の影響を、第４図はペプシンの添加濃度による免疫反応
への影響を示す、第３図及び第４図中、−〇−９−・−
１−ム−は各々、α２ＰＩ−プラスミン複合体濃度１０
０　ｎｇ／　ｍｌ　、　５０■／ｍｌ、０■／ｍ鳳を示
す。 キ＊賜７ｄ七〜 ４：ｃ京−メ心←も ト要岳

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、溶液中における抗原−抗体反応を利用した免疫測定
   を行なうに際し、免疫反応溶液に分子量が１．６〜５．
   ０万で等電点が１．０〜５．０であるタンパクを存在せ
   しめ、該タンパクの免疫反応溶液における最終濃度を０
   ．０２〜０．９重量％に調整することを特徴とする免疫
   測定方法。 ２、分子量が１．５〜５．０万で等電点が１．０〜５．
   ０であるタンパクの０．０２〜０．９重量％の溶液を、
   その構成要素の一部とする免疫測定に用いる試薬キット
   。