NL8101860A - Werkwijze voor het immunologisch aantonen respectievelijk bepalen van stoffen. - Google Patents
Werkwijze voor het immunologisch aantonen respectievelijk bepalen van stoffen. Download PDFInfo
- Publication number
- NL8101860A NL8101860A NL8101860A NL8101860A NL8101860A NL 8101860 A NL8101860 A NL 8101860A NL 8101860 A NL8101860 A NL 8101860A NL 8101860 A NL8101860 A NL 8101860A NL 8101860 A NL8101860 A NL 8101860A
- Authority
- NL
- Netherlands
- Prior art keywords
- immunologically active
- substance
- cea
- active reaction
- determined
- Prior art date
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
- G01N33/76—Human chorionic gonadotropin including luteinising hormone, follicle stimulating hormone, thyroid stimulating hormone or their receptors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
«
, * V
• 1Γ.0. 50.017 -1-
Werkwijze voor het immunologisch aantonen respectievelijk bepalen van stoffen.
De onderhavige uitvinding betreft een enzym-immuunmethode volgens het zogenaamde "sandwich-principe". Volgens dit principe wordt de te bepalen stof, die een antigeen, een antilichaam of een hapteen kan zijn, met twee immunologisch actieve reactiepartners omge-5 zet. Als regel is één van deze immunologisch actieve reactiepartners aan een in water onoplosbare drager gebonden, terwijl de andere van een geschikt enzym is voorzien. In de praktijk wordt de te bepalen stof eerst met de aan een drager gebonden reactiepartner omgezet, waarna na fasenscheiding en wassen de intussen aan de drager immu-10 nologisch gebonden stof met de tweede, met enzym gemarkeerde reactiepartner wordt omgezet. Wa hernieuwde fasenscheiding heeft de enzymatische reactie plaats voor de kwantitatieve aantoning van de te bepalen stof hetzij in de vaste hetzij in de vloeibare fase.
Men was tot dusverre van mening, dat bij enzym-immuunmethoden 15 de immunologische reactie van de te bepalen stof met de beide geschikte immunologisch actieve reactiepartners na elkaar in een eerste en in een tweede reactietrap diende plaats te hebben.
In het kader van de onderhavige uitvinding werd nu verrassender-wijze gevonden, dat men in tegenstelling tot de huidige mening kwasi 20 in een "éentrapswerkwijze" te werk kan gaan, waarbij de te bepalen stof gelijktijdig met beide immunologisch actieve reactiepartners gedurende een enkele inkubatie wordt omgezet.
De onderhavige uitvinding betreft derhalve een enzym-immuunme-thode voor het aantonen respectievelijk bepalen van een stof met een 25 immunologisch actieve reactiepartner, die van een enzym is voorzien, alsmede een immunologisch actieve reactiepartner, die aan een in water onoplosbare drager is gebonden of wordt, door inkuberen van de te bepalen stof met de immunologisch actieve reactiepartners, aansluitende scheiding van vaste en vloeibare fase en meten van de 30 grootte van de enzymmarkering hetzij in de vaste hetzij in de vloeibare fase als grootte voor de hoeveelheid van te bepalen stof, die gekenmerkt is, doordat voor de immunologische reactie de te bepalen stof alsmede de immunologisch actieve reactiepartners vanaf het begin en gemeenschappelijk en slechts eenmaal gelnkubeerd worden.· 35 Als te bepalen stof kunnen al die bestanddelen in fysiologische vloeistoffen, cel- of weefselextrakten genoemd worden, waarvoor immunologische reactiepartners aanwezig zijn of gevormd kunnen worden, 8101860 2 % * -2- en die twee of meer immunologisch actieve plaatsen bezitten. Daartoe behoren peptiden, proteïnen, lipoprotelnen, glycoprotelnen, ste-rinen, sterolden, lipolden, nuclelnezuren, enzymen, hormonen, poly-sacchariden en alkaloïden. Immunologisch actieve stoffen, die de 5 voorkeur verdienen, zijn de natuurlijke antigenen, zoals hormonen,' enzymen, orgaan-specifieke antigenen, bindweefselcomponenten, bloed-celantigenen, plasmaproteïnen en pathologische globuline. Stoffen, die in het bijzonder de voorkeur verdienen, zijn het careino-embryo-nale antigeen (CEA) alsmede het menselijke choriongonadotropine 10 (HCG).
Bij de methode volgens de uitvinding dient de immunologisch actieve reactiepartner, die van een enzym is voorzien, als indikator van de immunologische reactie. Enzymen, die de voorkeur verdienen, zijn het alkalische fosfatase, het malaat-dehydrogenase, het gluco-15 se-6-fosfaat-dehydrogenase, het glucose-oxidase, het glucoamylase, het galactosidase en het acetylcholine-esterase. Een enzym-label, dat bijzonder de voorkeur verdient, is het peroxidase uit mierikwortel.
Eet enzym als indikator van de immunologische reactie wordt in 20 de vloeibare, bij voorkeur echter in de vaste fase volgens bekende methoden gemeten en is een maat voor de hoeveelheid van de te bepalen stof. Bij het peroxide uit mierikwortel als label wordt bij voorkeur de enzymhoeveelheid op grond van de aanwezige katalytische activiteit gemeten, die met behulp van HgOg en o-fenyleendiamine als 25 redoxindikator bepaald wordt. Daarbij wordt na een 50 minuten durende katalytische reactie de kleurintensiteit van de geoxydeerd redoxindikator fotometrisch gemeten.
De tweede immunologisch actieve reactiepartner dient voor de afscheiding van de te bepalen stof uit het analysemonster. Voor de-50 ze scheidingstrap kan de tweede immunologisch actieve reactiepartner vanaf het begin aan een in water onoplosbare drager gebonden zijn ofwel gedurende of na de immunologische reactie aan een geschikte drager gebonden worden.
Als in water°oplosbare dragers voor de tweede immunologisch ac-35 tieve reactiepartner zijn geschikt: organische en anorganische polymeren (amylasen, dextranen, natuurlijke of gemodificeerde cellulose, polyacrylamide, agarose, magnetiet, poreus glaspoeder, polyvinyli-deenfluoride (Kynar) en latex), de binnenwand van proefreservoirs (proefbuisjes, titreerplaten of cuvetten uit glas of kunststof) als-40 mede de oppervlakken van vaste lichamen (glas- en kunststofstaaf, 8101860 -3- r staaf met eindstandige verdikking, staaf met eindstandige vleugels of lamellen). Bijzonder geschikte dragers voor de methode volgens de uitvinding zijn glas- en kunststofkogels.
Be tweede immunologisch actieve reactiepartner kan aan de in 5 water oplosbare drager fysisch (adsorptief) of chemisch gebonden zijn of met behulp van een andere reactiepartner, die op zijn beurt aan een drager is gebonden, tijdens of na de reactie gebonden worden.
Wezenlijk voor de methode volgens de uitvinding is, dat de te 10 bepalen stof ten minste twee immunologisch actieve plaatsen (epito-pen) bezit, die door de beide immunologisch actieve reactiepartners, die aan een drager gebonden en die van een enzym voorziene reactiepartner, herkend en tot reactie kan worden gebracht. Als immunologisch actieve reactiepartners worden bij voorkeur twee verschillen-15 de componenten gebruikt, die weliswaar beide met de te bepalen stof reageren, echter elk op verschillende immunologisch actieve plaatsen gericht zijn. Yoor de bepaling van antigenen zeer bijzonder geschikt zijn twee antilichamen voor dit antigeen, die in twee verschillende diersoorten geproduceerd werden en die tegen verschillende epitopen 20 van dit antigeen gericht zijn. Bij voorkeur geschikt is de combinatie van antilichamen van verschillende klonen en van monoklonale antilichamen en antilichamen uit een andere diersoort.
Yoor de immunologische reactie kan het monster met de te bepalen stof direkt of vooraf verdund of op een geschikte wijze voorbe-25 handeld gebruikt worden. Yoor de voorbehandeling kan de te bepalen stof geïsoleerd, verrijkt of van storende bestanddelen bevrijd worden.
Yolgens de werkwijze van de uitvinding wordt de te bepalen stof gelijktijdig met de met het enzym gemarkeerde alsmede de aan de 30 drager gebonden immunologisch actieve reactiepartner tot omzetting gebracht. Be volgorde van *de toevoeging van reagentia is gericht op de aard van het gekozen dragersysteem. Bij het werken met een gesensibiliseerde kunststofkogel wordt eerst in een geschikt proef-buisje de met enzym gemarkeerde reactiepartner met de te bepalen 35 stof samengebracht en aansluitend wordt de met de andere reactiepartner gesensibiliseerde kogel toegevoegd.
Be immunolgische reactie wordt door het aanhouden van een optimale pH-waarde, die tussen 4 en 9 kan liggen, in een geschikt buf-fersysteem uitgevoerd. Buffers, die de voorkeur verdienen, zijn bij-40 voorbeeld acetaatbuffer, citraatbuffer, fosfaatbuffer, tris-buffer, 81 01860 -4- triëthaholaminebuffer, Ta o raat buff er of glycinebuffer. Ook kunnen buffermengsels gebruikt worden.
De immunologische reactie heeft bij voorkeur plaats bij een temperatuur tussen 0 en 55°C. Gewoonlijk neemt de immunologische re-5 actiesnelheid met hogere temperaturen toe, waardoor onder overigens gelijke proefomstandigheden, het evenwicht sneller bereikt wordt.
De inkubatie van de te bepalen stof met de met enzym gemarkeerde reactiepartner en de aan drager gebonden reactiepartner kan tot het bereiken van het evenwicht plaats hebben. De immunologische re-10 actie kan echter ook op een vroeger tijdstip worden gestopt, doordat na een bepaalde inkubatieduur de vaste en de vloeibare fase gescheiden worden en de mate van enzymmarkering hetzij in de vloeibare of in de vaste fase bepaald wordt.
Bij de immunologische reactie kunnen maatregelen voor het sta- 15 biliseren van de immunologische activiteit van de reactiepartners en de te bepalen stof alsmede het enzym getroffen worden. Toorts aan/ kunnen de inkubatie-oplossing bestanddelen, zoals proteïnen en reinigingsmiddelen, voor het uitschakelen van niet-specifieke reacties, voor het verminderen van remmende invloeden of voor de activering 20 worden toegevoegd.
De nieuwe methode volgens de onderhavige uitvinding is buitengewoon gevoelig en onderscheidt zich door haar eenvoud bij de hantering.
De hierna volgende voorbeelden lichten de uitvinding toe.
25 Toorbeeld I.
* Kwantitatieve benaling van CÉA in patiëntenplasma's met een monoklonaal CEA-antiliohaam en een gebruikelijk CEA-antilichaam (geiten).
In het vereiste aantal proefbuisjes (10 x 75 mm) worden telkens 50 0,2 mol proefoplossing (0,2 mol/l NaHgPO^/NagHPO^, pH 6,5 met 2 g/l runderserumalbumine, 20^ normaal geitenserum en 0,2 yug/ml geiten-anti-CEA-peroxidase-conjugaat) gepipetteerd, 0,050 ml van de te analyseren patiëntenplasma's respectievelijk de CEA-standaards (0 ng/ml GEA, 2,5 ng/ml CEA, 10 ng/ml OEA en 20 ng/ml CEA) en het CEA-contro-55 leserums (5>0 ng/ml CEA + 1,0 ng/ml) onder mengen toegevoegd, telkens een met monoklonale muis anti CEA-gesensibiliseerde polysty-reenkogel* (0 6,3 mm) toegevoegd en bij 37°C gedurende 16 uren ge-inkubeerd. Aansluitend worden de polystyreenkogels driemaal met telkens 2 - 5 ml gedestilleerd water gewassen, in telkens 0,5 ml sub-40 straatbuffer voor de activiteitsbepaling van het peroxidase (0,1 81 01860 ' * -5- mol/l kaliumcitraatbuffer met een pH van 5,0 met 6 mmol/l ïï„0_ en C* & 20 mol/l o-fenyleendiamine) overgebracht en gedurende 50 minuten bij kamertemperatuur (22°c) geïnkubeerd. Voor het stoppen van de peroxidase-activiteit alsmede voor het intensiveren van de kleurin-5 tensiteit worden 2,0 ml 1N HCl onder mengen toegevoegd en wordt binnen 50 minuten de extinktie bij de golflengte 492 nm fotometrisch gemeten. In tabel A zijn de waarden van een CEA-bepaling vermeld en met de waarden vergeleken, zoals deze met de radio-immunobepaling van ROCHE verkregen werden.
10 35 33e bereiding van monoklonaal muis anti-CEA heeft plaats in analogie aan de in Journal of Immunological Methods, 52 (1980) 297-504 beschreven methode, waarbij als uitgangscellijn voor de fusie de myelomlijn Sp 2/01-AG wordt toegepast, die onder nr. CRI 8006 bij ATCC is gedeponeerd. De fusie heeft plaats met miltcellen van mui-15 zen, die met CEA geïmmuniseerd werden. De immunisering van de muizen had plaats in analogie met tabel 1 van de vermelde publikatie, waarbij de eerste beide immuniseringen met telkens 50 ^ug CEA plaats hadden, de immuniseringen 5 en 4 werden weggelaten, immunisering 5 met 50 ^ug CEA en de immuniseringen 6-8 met telkens 200 ^ug CEA 20 plaats hadden.
label A.
Monstermateriaal Δε^., ^/gj/jg ain.
CEA-standaard 0 ng/ml CEA 0,105 25 2,5 ng/ml CEA 0,550 10.0 ng/ml CEA 0,978 20.0 ng/ml CEA 1,850 CEA-controleserum 5.0 ng/ml CEA 0,540 50 patiëntenplasma’s ROCHE-RIA-proef Werkwijze volgens de uitvinding nr. 7212 0,6 ng/ml 1,2 ng/ml nr. 7188 2,2 ng/ml 1,0 ng/ml nr. 7220 1,2 ng/ml 1,4 ng/ml 35 nr. 7218 1,2 ng/ml 1,5 ng/ml nr. 7254 2,5 ng/ml 2,7 ng/ml nr. 7249 2,4 ng/ml 2,0 ng/ml nr. 7205 2,5 ng/ml 2,0 ng/ml 8101860 -6-
Yervolg tabel A.
Patiëntenplasma’s ROCHE-RIA-proef Werkwijze volgens de tiit vinding nr. 7223 3,0 ng/ml 3>3 ng/ml 5 nr. 7247 3»1 ng/ml 2,8 ng/ml nr, 7258 4»6 ng/ml 4>3 ng/ml nr. 7215 4>9 ng/ml 5>5 ng/ml nr. 7219 5,0 ng/ml 5>9 ng/ml nr. '8180 '8,6 ng/ml ‘ 8,5 ng/ml 10 nr. 7248 11,2 ng/ml 10,7 ng/ml nr. 7262 14,2 ng/ml 14,3 ng/ml nr. 7201 15>6 ng/ml 15>3 ng/ml
Waarden beneden 2,5 ng/ml CEA liggen in het normale trajekt, terwijl waarden boven 2,5 ng/ml in het pathologische gebied liggen. Yoorbeeld II.
Kwantitatieve bepaling van CEA in patiëntenplasma’s met CEA-antilichamen van twee verschillende diersoorten (geiten en bruinvissen) .
In het vereiste aantal proefbuisjes (10 x 75 mm) worden telkens 20 0,2 ml proefoplossing (0,2 mol/l WaHgPO^/WagHPO^, pH 6,5 met 2 g/l runderserumalbumine, 20% normaal geitenserum en 0,2 yug/ml geiten-anti-CEA-peroxidase-conjugaat) gepipetteerd, 0,050 ml van de te analyseren patiëntenplasma's respectievelijk de CEA-standaards (O ng/ml CEA, 2,5 ng/ml CEA, 10 ng/ml CEA en 20 ng/ml CEA) en de CEA-contro-25 leserums (5,0 ng/ml CEA. + 1 ,Ó ng/ml) onder mengen toegevoegd, telkens een met bruinvis-anti-CEA gesensibiliseerde polystyreenkogel (/ 6,5 mm) toegevoegd en bij 37°C gedurende 16 uren geïnkubeerd. Aansluitend worden de polystyreenkogels driemaal met telkens 2 - 5 ml gedestilleerd water gewassen, in telkens 0,5 ml substraatbuffer voor 30 de activiteitsbepaling van het peroxidase (0,1 mol/l kaliumcitraat-buffer met een pH van 5>0 met 6 mmol/l HgOg en ^ ^1101^ o-fenyleen-diamine) overgebracht en gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (22°C) geïnkubeerd. Yoor het stoppen van de peroxidase-activiteit alsmede voor het intensiveren van de kleurintensiteit worden 2,0 ml 35 1N HC1 onder mengen toegevoegd en wordt binnen 30 minuten de extink-tie bij de golflengte 492 nm fotometrisch gemeten. In tabel B zijn de waarden van een CEA-bepaling vermeld en met de waarden vergeleken, zoals deze met de radio-immunobepaling van R0CHE verkregen werden.
8101860 * # -7- label B.
Monstermateriaal Δ*492 m/ST/30 min.
CM-standaard 0 ng/ml CM 0,098 5 2,5 ng/ml CM 0,270 10.0 ng/ml CM 0,830 20.0 ng/ml CM 1,5^5 CEA-controleserum. ' 5,0 ng/ml CM 0,470 10 Patiëntenplasma’s ROCHE-RIA-proef Werkwijze volgens de uitvinding nr. 7220 1,2 ng/ml 1,3 ng/ml nr. 7218 1,2 ng/ml 1,3 ng/ml ! nr. 7234 2,5 ng/ml 2,4 ng/ml 15 ; nr. 7249 2,4 ng/ml 2,2 ng/ml nr. 7203 2,3 ng/ml 2,2 ng/ml nr. 7223 3,0 ng/ml 3,0 ng/ml , nr. 7247 3,1 ng/ml 3,2 ng/ml 1 nr. 7258 4,6 ng/ml 4,5 ng/ml 20 [ nr. 7215 4,9 ng/ml 5,3 ng/ml | nr. 7219 5,0 ng/ml 5,6 ng/ml nr. 8180 8,6 ng/ml 8,5 ng/ml > nr. 7248 11,2 ng/ml 10,9 ng/ml nr.' 7262 14,2 ng/ml 14,2 ng/ml 25 nr. 7201 15,6 ng/ml 15,0 ng/ml
Waarden beneden 2,5 ng/ml CM liggen in het normale trajekt, terwijl waarden boven 2,5 ng/ml in het pathologische gebied liggen. Voorbeeld III.
Kwantitatieve -bepaling van CM in natiëntennlasma’s met mono-50 klonale CM-antilichamen van twee verschillende klonen.
In het vereiste aantal proefbuisjes (10 x 75 ran) worden telkens 0,2 ml proefoplossing (0,2 mol/l Wal^O^/NagHPO^, pH 6,5 met 2 g/l runderserumalbumine, 20% normaal geitenserum en 0,15 yug/ml monoklonaal muis-anti-CM-peroxidase-conjugaat*) gepipetteerd, 35 0,050 ml van de te analyseren patiëntenplasma's respectievelijk de CEA-standaards (0 ng/ml CEA, 2,5 ng/ml CM, 10 ng/ml CM en 20 ng/ml CM ) en het CM-controleserum (5,0 ng/ml CEA +1,0 ng/ml) onder mengen toegevoegd, telkens een met monoklonaal muis anti-CEA gesen- 8101860
Np -8- sibiliseercl!5 polystyreenkogel (doorsnede 6,5 mm) toegevoegd en bij 37°C gedurende 16 uren geïnkubeerd. Aansluitend worden de polysty-reenkogels 3 maal met telkens 2 - 5 nil gedestilleerd water gewassen, in telkens 0,5 ml substraatbuffer voor de activiteitsbepaling van 5 het peroxidase (0,1 mol/l kaliumcitraatbuffer met een pH van 5,0 met 6 mmol/l HgOg en 20 mmol/l o-fenyleendiamine) overgebracht en gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (22°0) gelnkubeerd. Toor het stoppen van de peroxidase-activiteit alsmede voor het intensiveren . .· van de kleurintensiteit. worden 2,.0 ml 1N.HC1 onder mengen toege- .
10 voegd én wordt in 30 minuten de extinktie bij de golflengte 492 nm fotometrisch gemeten. In tabel C zijn de waarden van een CEA-bepa-ling vermeld en met de waarden vergeleken, zoals deze met de radio-immunobepaling van R0CHE verkregen werden.
* De bereiding van het monoklonale muis anti-CEA heeft plaats 15 in analogie aan de in Journal of Immunological Methods, 32 (1980) 297-304 beschreven methode, waarbij als uitgangslijn voor de fusie de myelomlijn Sp 2/01-Ag wordt toegepast, die onder nr. CRL 8006 bij ATCC gedeponeerd is. De fusie heeft plaats met miltcellen van muizen, die met CEA geïmmuniseerd werden. De immunisering van de muis 20 had plaats in analogie aan tabel 1 van de vermelde publikatie, waarbij de eerste beide immuniseringen met telkens 50 yug CEA plaats hadden, de immuniseringen 3 en 4 werden weggelaten, immunisering 5 met 50 yug CEA en de immuniseringen 6-8 met telkens 200 mg CEA plaats hadden. Er werden twee verschillende, geschikte monoklonale 25 antilichamen toegepast,, die tegen verschillende epitopen van het CEA-antigeen gericht zijn.
Tabel 0.
Monstermateriaal ΔΕ.ηο /-nm/^ 492 nm/RT/30 min, OEA-standaard 30 0 ng/ml CEA 0,390 2,5 ng/ml CEA 0,440 10.0 ng/ml CEA 0,620 20.0 ng/ml CEA 0,860 CEA-controleserum 35 5,0 ng/ml CEA 0,510 patiëntenplasma's ROCHE-RIA-proef Werkwijze volgens de uitvinding J nr. 7220 1,2 ng/ml 0,8 ng/ml * 81 01 860 -9-
Vervolg tabel C.
Patiëntenplasma’s ROCEE-RIA-proef Werkwijze volgens de uitvinding nr. 7234 2,5 ng/ml 3,0 ng/ml 5 nr. 7223 3»0 ng/ml 3,5 ng/ml nr. 7247 3,1 ng/ml 3,2 ng/ml nr. 7258 4,6 ng/ml 4,4 ng/ml nr. 7215 4,9 ng/ml 5,0 ng/ml nr·. 7219 5,0 ng/ml 5,4 ng/ml 10 nr. 8180 8,6 ng/ml 8,6 ng/ml nr. 7248 11,2 ng/ml 11,0 ng/ml nr. 7262 14,2 ng/ml 14,0 ng/ml nr. 7201 15,6 ng/ml 16,0 ng/ml
Waarden "beneden 2,5 ng/ml CEA liggen in het normale trajekt, 15 terwijl waarden "boven 2,5 ng/ml in het pathologische gebied liggen. Voorbeeld 17.
Kwantitatieve bepaling van HCG in serum/nlasma/urine.
In het vereiste aantal proefbuisjes (10 x 75 2®) worden telkens 0,2 ml proefoplossing (0,1 mol/l NaHgPO^/WagHPO^, pH 7,0 met 2 g/l 20 runderserumalbumine en 1,0 yug/ml monoklonaal muis-anti-HCG-peroxi-dase-conjugaat*) gepipetteerd, 0,050 ml van de te analyseren patiëntenplasma's respectievelijk de HCG-standaards (0, 25, 50, 100 en 250 mlïï/ml HCG) onder mengen toegevoegd, telkens een met konijnen-anti-HCG gesensibiliseerde polystyreenkogel (/ 6,5 mm) toegevoegd en 25 bij kamertemperatuur gedurende 16 uren in een met water verzadigde atmosfeer gelnkubeerd. Aansluitend worden de polystyreenkogels driemaal met telkens 2 - 5 ml gedestilleerd water gewassen, in telkens 0,5 ml substraatbuffer voor de activiteitsbepaling van het peroxidase (0,1 mol/l kaliumcitraatbuffer met een pH van 5,0 met 6 mmol/l 30 ^jOg en 20 mmol/l o-fenyleendiamine) overgebracht en gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (16 - 30°C) gelnkubeerd. Voor het stoppen van de peroxidase-activiteit alsmede voor de intensivering van de kleurintensiteit worden 2,0 ml 1N HCl onder mengen toegevoegd en wordt binnen 30 minuten de extinktie bij de golflengte 492 nm foto-55 metrisch gemeten. In de tabel zijn de waarden van een HCG-bepaling in serum en in urine vermeld.
* De bereiding van het monoklonale anti-HCG kan volgens een in Journal of Immunological Methods 32 (1980) 297 - 304 beschreven methode plaats hebben.
61 018 6ö
» * V
-10- HCG-bepaling in serum en in urine.
1. Standaardkrommen.
ώΒ492 na/50 τηΤΤΤ HCG/ml serum urine 5 0 0,185 0,385 25 0,385 0,525 50 , 0,530 0,720 100 0,830 1,05 . ” v ’250'..... ’ ‘ . 0,185 ’ ’ . 1,59 10 2. Patiëntenmonsters.
Monstemr. ^E492 nm^° min./ST = mlTJ HCG/ml monster urine F-1032 E 0,375 0 " 58-418 0,575 (x 50) * 1500 " 58414 0,775 (x 100% 2 5500 15 " 58417 0,81.0 (x 500) * 32000 serum 2559 0,155 0 " 2560 0,125 0 " 1543 0,195 1,5 ” 2673 0,505 44 20 " 1167 1,085 181 " 1492 0,98 (x 10) 2 1370 - v··.·,,-·, -.-279.3.. .·: ...-0,.77- (x· , 20).2 . . r;.. t-740 " 924 0,69 (x 100) 2 7300 2 Verdunning van het monster 25 Omrekening: 1 ng zuiver HCG komt overeen met ongeveer 10 mlU HCG. Voorbeeld V.
Kwantitatieve bepaling van HOG in serum met monoklonale HCG- antiliohamen van twee verschillende klonen.
In het vereiste aantal proefbuisjes (10 x 75 mm) worden telkens 50 0,2 ml proefoplossing (0,1 mol/l HaHgPO^/ïïagHPO^, pH 7,0 met 2 g/l runderserumalbumine en 1,0 /ug/ml monoklonaal muis-anti-HCG-peroxi-ï\ dase-conjugaat ) gepipetteerd, 0,050 ml van de te analyseren patiëntenplasma's respectievelijk de HGG-standaard (O, 25, 50, 100 en 200 mlïï/ml HCG) onder mengen toegevoegd, telkens een met monoklonaal 35 muis-anti-HCG gesensibiliseerde polystyreenkogel2) (0 6,5 mm) toe- 8101860 * -11- gevoegd en bijvoorbeeld bij 37°C gedurende 2 uren geïnkubeerd. Aansluitend worden de polystyreenkogels driemaal met telkens 2 - 5 ml gedestilleerd water gewassen, in telkens 0,5 ml substraatbuffer voor de activiteitsbepaling van het peroxidase (0,1 mol/l kaliumcitraat-5 buffer met een pH van 5>0 met 6 mmol/l HgOg en 20 mmol/l o-fenyleen-diamine) overgebracht en gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (16 - 30°C) geïnkubeerd. Voor het stoppen van de peroxidase-activi-teit alsmede voor de intensivering van de kleurintensiteit wordt 1,0 ml 2N HCl onder mengen toegevoegd en binnen 30 minuten wordt de 10 extinktie bij de golflengte 492 nm fotometrisch bepaald. In de tabel zijn de waarden van HCG-bepalingen in serum vermeld.
* De bereiding van de monoklonale muis-HCG-antilichamen heeft plaats volgens de in Journal of Immunological Methods, 32 (1980) 297 - 304 beschreven methode. Er worden twee verschillende, geschik-15 te monoklonale antilichamen toegepast, die tegen verschillende epi-topen van het HCG-antigeen gericht zijn.
HCG-benaling in menseli.ik serum (gemiddelde waarde uit duplobepa- lingen).
1♦ Standaardkrommen.
20 &E 492 nm/30 min./RT
mlïï/ml HCG 1) serum 2) plasma 3) urine 4) buffer 0 0,038 0,054 0,158 0,180 25 0,226 - - -50 0,475 0,544 0,557 0,716 25 100 0,905 . 0,955 0,970 1,40 200 1,75 1,55 1 >90 2,44 i -| ][ _
De HCG-waarden van de hierna vermelde voorbeelden van patiëntensera werden uit de standaardkromme 1) afgelezen. De standaardkrommen 2), 3) en 4) werden op een andere dag met nieuwe HCG-standaards be-30 paald.
2. Patiëntensera.
Serum &E 492/30 min./Rï mlïï/ml HCG
gemeten uit kromme 1) pool 091080 0,041 0 35 nr. 2801 0,025 0 nr. 3881 0,450 47 nr. 2673 1,13 127 nr. 1167 2,12 (1:2) 470 nr. 4891 0,975 (1:50) 5'450 81 01 860 r ^ * -v -12- %
Vervolg tabel.
Serum ΔΕ 492/30 min./M mlïï/ml HCG
gemeten uit kromme 1) nr. 3240 1,06 (1:20 2'280 nr. 4418 1,475 (1:1000) 167'000 8101860
Claims (13)
1. Immunologische werkwijze voor het aantonen respectievelijk "bepalen van een stof met een immunologisch actieve reactiepartner, die van een enzym voorzien is, alsmede een immunologisch actieve re- 5 actiepartner, die aan een in water onoplosbare drager gebonden is of wordt, door inkuberen van de te bepalen stof met de immunologisch actieve reactiepartners, aansluitende scheiding van vaste en vloeibare fase en meten van de mate van de enzymmarkering hetzij in de vaste hetzij in .de.vloeibare fase.als.maat voor de hoeveelheid van 10 de te bepalen stof, met het kenmerk, dat men voor de immunologische reactie de te bepalen stof alsmede de immunologisch actieve reactiepartners vanaf het begin en gemeenschappelijk en slechts eenmaal inkubeert.
2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, 15 dat de te bepalen stof een antigeen is.
3. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat de immunologisch actieve reactiepartners verschillende antilichamen zijn, die tegen hetzelfde antigeen evenwel tegen verschillende epitopen van dit antigeen gericht zijn. 20 4· Werkwijze volgens conclusie 3> met het kenmerk, dat het om twee verschillende monoklonale antilichamen gaat.
5. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat de te bepalen stof CEA is.
6. Werkwijze volgens conclusie 5> met het kenmerk, 25 dat de immunologisch actieve reactiepartner, die aan een in water onoplosbare drager gebonden is, monoklonaal muis-anti-CEA is.
7. Werkwijze volgens conclusie 5 of 6, met het kenmerk, dat de immunologisch actieve reactiepartner, die van een markering is voorzien, een met enzym gemarkeerd, ander monoklonaal 30 muis-anti-CEA is.
8. Werkwijze volgens conclusie 5 of 6, met het kenmerk, dat de immunologisch actieve reactiepartner, die van een markering is voorzien, een met enzym gemarkeerd geiten-anti-CEA is.
9. Werkwijze volgens conclusie 6 of 7> met het ken-35 m e r k , dat het enzym peroxidase is.
10. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat het antigeen HCG is.
11. Werkwijze volgens conclusie 10, met het kenmerk dat de immunologisch actieve reactiepartner, die aan een in water 40 onoplosbare drager gebonden is, konijnen-anti-HCG is. 81 01 8 60 -14- V- i·
12. Werkwijze volgens conclusie 10 of 11, met het kenmerk, dat de immunologisch actieve reactiepartner, die van een markering is voorzien, een met enzym gemarkeerd monoklonaal muis-anti-HCG is.
15. Werkwijze volgens conclusie 12, met het ken merk, dat het enzym peroxidase is.
14· Immunologische werkwijze voor het aantonen en bepalen van een stof met een immunologisch actieve reactiepartner, die van een . markering is voorzien,....alsmede .een..immunologisch actieve, reactiepart-, 10 ner, die aan een in water onoplosbare drager gebonden is of wordt, door inkuberen van de te bepalen stof met de immunologisch actieve reactiepartners, aansluitende scheiding van vaste en vloeibare fase en meten van de mate van de markering hetzij in de vaste hetzij in de vloeibare fase als maat voor de hoeveelheid van te bepalen stof, 15. 1 e t het kenmerk, dat voor de immunologische reactie de te bepalen stof alsmede de immunologisch actieve reactiepartners vanaf het begin en gemeenschappelijk en slechts eenmaal gelnkubeerd worden en dat de te bepalen stof een antigeen is en de immunologisch actieve reactiepartners antilichamen van verschillende klonen zijn, 20 die tegen verschillende epitopen van dit antigeen gericht zijn. 8101860
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CH320980 | 1980-04-25 | ||
| CH320980A CH642458A5 (en) | 1980-04-25 | 1980-04-25 | Immunological method |
| CH589880A CH651396A5 (en) | 1980-08-04 | 1980-08-04 | Immunological method for detecting and determining carcinoembryonic antigen |
| CH589880 | 1980-08-04 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NL8101860A true NL8101860A (nl) | 1981-11-16 |
| NL187545B NL187545B (nl) | 1991-06-03 |
Family
ID=25692464
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NLAANVRAGE8101860,A NL187545B (nl) | 1980-04-25 | 1981-04-15 | Werkwijze voor het immunologisch aantonen respectievelijk bepalen van een stof. |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| AT (1) | AT373398B (nl) |
| AU (1) | AU542563B2 (nl) |
| CA (1) | CA1160566A (nl) |
| DE (1) | DE3115115C2 (nl) |
| DK (1) | DK151399C (nl) |
| FR (1) | FR2481318A1 (nl) |
| GB (1) | GB2074727B (nl) |
| IT (1) | IT1137344B (nl) |
| NL (1) | NL187545B (nl) |
| NO (1) | NO159620C (nl) |
| SE (1) | SE460930B (nl) |
Families Citing this family (35)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0111762B1 (en) * | 1980-06-20 | 1987-11-19 | Unilever Plc | Processes and apparatus for carrying out specific binding assays |
| US6406920B1 (en) | 1980-06-20 | 2002-06-18 | Inverness Medical Switzerland Gmbh | Processes and apparatus for carrying out specific binding assays |
| JPS57501147A (nl) * | 1980-07-16 | 1982-07-01 | ||
| US4486530A (en) * | 1980-08-04 | 1984-12-04 | Hybritech Incorporated | Immunometric assays using monoclonal antibodies |
| US4879219A (en) * | 1980-09-19 | 1989-11-07 | General Hospital Corporation | Immunoassay utilizing monoclonal high affinity IgM antibodies |
| EP0049898B2 (en) * | 1980-10-15 | 1991-08-14 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Method for immunochemical assay and kit therefor |
| US4837167A (en) * | 1981-01-30 | 1989-06-06 | Centocor, Inc. | Immunoassay for multi-determinant antigens using high-affinity |
| GB2118300B (en) * | 1982-02-12 | 1985-06-19 | Corning Glass Works | Method of immunoassay |
| DK76983A (da) * | 1982-03-05 | 1983-09-06 | Takeda Chemical Industries Ltd | Fremgangsmaade og reagens til immunkemisk bestemmelse af humant choriogonadotropin |
| DE3225027A1 (de) * | 1982-07-05 | 1984-01-05 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Immunchemisches messverfahren |
| IL73938A (en) * | 1984-01-02 | 1989-09-28 | Boehringer Mannheim Gmbh | Process and reagent for the determination of polyvalent antigen by incubation with three different receptors |
| US4690890A (en) * | 1984-04-04 | 1987-09-01 | Cetus Corporation | Process for simultaneously detecting multiple antigens using dual sandwich immunometric assay |
| US5011771A (en) * | 1984-04-12 | 1991-04-30 | The General Hospital Corporation | Multiepitopic immunometric assay |
| US4935339A (en) * | 1985-05-07 | 1990-06-19 | Nichols Institute Diagnostics | Delayed solid phase immunologic assay |
| US5770459A (en) * | 1986-04-30 | 1998-06-23 | Igen International, Inc. | Methods and apparatus for improved luminescence assays using particle concentration, electrochemical generation of chemiluminescence detection |
| DE3638767A1 (de) * | 1986-11-13 | 1988-05-26 | Behringwerke Ag | Laktoferrin enthaltendes inkubationsmedium fuer festphasenimmunometrisches verfahren und seine verwendung |
| US5935779A (en) * | 1988-11-03 | 1999-08-10 | Igen International Inc. | Methods for improved particle electrochemiluminescence assay |
| US6881589B1 (en) | 1987-04-30 | 2005-04-19 | Bioveris Corporation | Electrochemiluminescent localizable complexes for assay compositions |
| US5190861A (en) * | 1987-08-25 | 1993-03-02 | Fuji Yakuhin Kogyo Kabushiki Kaisha | Method for the diagnosis of rheumatoid arthritis |
| WO1989003997A1 (en) * | 1987-10-30 | 1989-05-05 | Fuji Yakuhin Kogyo Kabushiki Kaisha | Method for diagnosis of liver cancer |
| DE3807440A1 (de) * | 1988-03-07 | 1989-09-21 | Progen Biotechnik Gmbh | Verfahren zum immunologischen nachweis von substanzen sowie eine derartige zusammensetzung und ein testkit |
| US5962218A (en) * | 1988-11-03 | 1999-10-05 | Igen International Inc. | Methods and apparatus for improved luminescence assays |
| US5705402A (en) * | 1988-11-03 | 1998-01-06 | Igen International, Inc. | Method and apparatus for magnetic microparticulate based luminescence assay including plurality of magnets |
| US5798083A (en) * | 1988-11-03 | 1998-08-25 | Igen International, Inc. | Apparatus for improved luminescence assays using particle concentration and chemiluminescence detection |
| US5779976A (en) * | 1988-11-03 | 1998-07-14 | Igen International, Inc. | Apparatus for improved luminescence assays |
| US5746974A (en) * | 1988-11-03 | 1998-05-05 | Igen International, Inc. | Apparatus for improved luminescence assays using particle concentration, electrochemical generation of chemiluminescence and chemiluminescence detection |
| NZ231727A (en) * | 1988-12-12 | 1992-01-29 | Commw Serum Lab Commission | Specific binding type assay (e.g. immunoassay) involving binding compound coupled or adsorbed on inner surface of reaction vessel and lyophilised conjugate |
| US5176999A (en) * | 1989-12-07 | 1993-01-05 | Eastman Kodak Company | Buffered wash composition, insolubilizing composition, test kits and method of use |
| ZA92804B (en) | 1991-02-06 | 1992-12-30 | Igen Inc | Methods and apparatus for improved luminescence assays |
| US6201109B1 (en) | 1993-01-13 | 2001-03-13 | Dade Behring Marburg Gmbh | Assay for bone alkaline phosphatase |
| FR2710410B1 (fr) * | 1993-09-20 | 1995-10-20 | Bio Merieux | Procédé et dispositif pour la détermination d'un analyte dans un échantillon . |
| JP3694894B2 (ja) * | 1994-02-19 | 2005-09-14 | 生化学工業株式会社 | 正常アグリカンの測定法および測定用キット |
| US6569634B1 (en) | 1998-09-01 | 2003-05-27 | Taiho Pharmaceutical Co., Ltd. | Method for assaying human thymidylate synthase and assay kit |
| EP1169647B1 (en) | 1999-04-12 | 2007-06-20 | Sumitomo Chemical Company, Limited | Method for analyzing the amount of intraabdominal adipose tissue |
| CA2609379C (en) | 2005-06-03 | 2016-11-29 | Allen J. Bard | Electrochemistry and electrogenerated chemiluminescence with a single faradaic electrode |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1572220A (en) * | 1976-10-07 | 1980-07-30 | Mochida Pharm Co Ltd | Immunochemical process of measuring physiologically active substances |
| GB1549069A (en) * | 1976-12-10 | 1979-08-01 | Erba Farmitalia | Enzyme linked immunoassay |
| US4244940A (en) * | 1978-09-05 | 1981-01-13 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Single-incubation two-site immunoassay |
| GB2107053A (en) * | 1980-06-20 | 1983-04-20 | Unilever Plc | Processes and apparatus for carrying out specific binding assays |
-
1981
- 1981-03-23 CA CA000373607A patent/CA1160566A/en not_active Expired
- 1981-04-06 DK DK155881A patent/DK151399C/da not_active IP Right Cessation
- 1981-04-13 IT IT21122/81A patent/IT1137344B/it active
- 1981-04-14 DE DE3115115A patent/DE3115115C2/de not_active Expired
- 1981-04-15 NL NLAANVRAGE8101860,A patent/NL187545B/nl not_active Application Discontinuation
- 1981-04-22 SE SE8102558A patent/SE460930B/sv not_active IP Right Cessation
- 1981-04-23 FR FR8108105A patent/FR2481318A1/fr active Granted
- 1981-04-24 AT AT0186481A patent/AT373398B/de not_active IP Right Cessation
- 1981-04-24 GB GB8112730A patent/GB2074727B/en not_active Expired
- 1981-04-24 NO NO811407A patent/NO159620C/no not_active IP Right Cessation
- 1981-04-24 AU AU69811/81A patent/AU542563B2/en not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AT373398B (de) | 1984-01-10 |
| DK155881A (da) | 1981-10-26 |
| DK151399C (da) | 1988-09-05 |
| CA1160566A (en) | 1984-01-17 |
| DE3115115C2 (de) | 1987-02-12 |
| NO811407L (no) | 1981-10-26 |
| IT1137344B (it) | 1986-09-10 |
| GB2074727B (en) | 1983-11-30 |
| DE3115115A1 (de) | 1982-02-04 |
| GB2074727A (en) | 1981-11-04 |
| NO159620C (no) | 1989-01-18 |
| FR2481318B1 (nl) | 1984-10-19 |
| DK151399B (da) | 1987-11-30 |
| SE8102558L (sv) | 1981-10-26 |
| NL187545B (nl) | 1991-06-03 |
| ATA186481A (de) | 1983-05-15 |
| AU542563B2 (en) | 1985-02-28 |
| AU6981181A (en) | 1981-10-29 |
| SE460930B (sv) | 1989-12-04 |
| NO159620B (no) | 1988-10-10 |
| FR2481318A1 (fr) | 1981-10-30 |
| IT8121122A0 (it) | 1981-04-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| NL8101860A (nl) | Werkwijze voor het immunologisch aantonen respectievelijk bepalen van stoffen. | |
| EP1618383B1 (en) | Membrane strip biosensor system for point-of-care testing | |
| CA1336675C (en) | Assay for antigens | |
| EP0398913B1 (en) | Test method and reagent kit therefor | |
| JPH0239747B2 (nl) | ||
| US20040171092A1 (en) | Compensation for variability in specific binding in quantitative assays | |
| JPH01123149A (ja) | 金属ゾル捕捉イムノアッセイ法、それの使用のためのキットおよび捕捉される金属含有複合材料 | |
| EP2458378B1 (en) | Insulin measurement method | |
| US7125517B2 (en) | Systems and methods for detection of analytes in biological fluids | |
| JPS598779B2 (ja) | 抗体、抗原または抗体：抗原複合体の分析法 | |
| JP3055789B2 (ja) | 骨由来アルカリホスファターゼの検定法 | |
| Clarke et al. | Immunoassays | |
| JPH07325083A (ja) | 糖タンパク質の特定糖鎖割合の測定方法 | |
| JP2579972B2 (ja) | 膜親和濃縮免疫測定方法 | |
| JPH03170058A (ja) | イムノアッセイ用試薬複合体 | |
| Clarke | Immunoassays for therapeutic drug monitoring and clinical toxicology | |
| WO1987002779A1 (en) | Idiotypic-antigenic conjunction binding assay | |
| JPH01295165A (ja) | 免疫学的検定法 | |
| JP5137880B2 (ja) | 結合性物質を固定化した乾燥粒子の製造方法 | |
| WO1987006006A1 (en) | Anti-enzyme antibody immunoassay | |
| JPH08509064A (ja) | 化学的に架橋したタンパクの固相支持体上の固定化 | |
| JPS62238463A (ja) | プラスミン―α２プラスミンインヒビター複合体の測定方法 | |
| Kricka et al. | 15 Immunochemical Techniques | |
| JPH04258766A (ja) | 多数検体処理可能な簡易免疫診断方法 | |
| JPH07114716B2 (ja) | 酵素標識測定法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A85 | Still pending on 85-01-01 | ||
| BA | A request for search or an international-type search has been filed | ||
| BT | A notification was added to the application dossier and made available to the public | ||
| BB | A search report has been drawn up | ||
| BC | A request for examination has been filed | ||
| CNR | Transfer of rights (patent application after its laying open for public inspection) |
Free format text: HOFFMANN-LA ROCHE AG. F. - |
|
| R1B | Notice of opposition during period of laying open | ||
| R2C | Refused after opposition |