NL8101860A - METHOD FOR IMMUNOLOGICAL DETECTION RESPECTIVE DETERMINATION OF SUBSTANCES - Google Patents
METHOD FOR IMMUNOLOGICAL DETECTION RESPECTIVE DETERMINATION OF SUBSTANCES Download PDFInfo
- Publication number
- NL8101860A NL8101860A NL8101860A NL8101860A NL8101860A NL 8101860 A NL8101860 A NL 8101860A NL 8101860 A NL8101860 A NL 8101860A NL 8101860 A NL8101860 A NL 8101860A NL 8101860 A NL8101860 A NL 8101860A
- Authority
- NL
- Netherlands
- Prior art keywords
- immunologically active
- substance
- cea
- active reaction
- determined
- Prior art date
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
- G01N33/76—Human chorionic gonadotropin including luteinising hormone, follicle stimulating hormone, thyroid stimulating hormone or their receptors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
««
, * V, * V
• 1Γ.0. 50.017 -1-• 1Γ.0. 50,017 -1-
Werkwijze voor het immunologisch aantonen respectievelijk bepalen van stoffen.Method for the immunological detection or determination of substances.
De onderhavige uitvinding betreft een enzym-immuunmethode volgens het zogenaamde "sandwich-principe". Volgens dit principe wordt de te bepalen stof, die een antigeen, een antilichaam of een hapteen kan zijn, met twee immunologisch actieve reactiepartners omge-5 zet. Als regel is één van deze immunologisch actieve reactiepartners aan een in water onoplosbare drager gebonden, terwijl de andere van een geschikt enzym is voorzien. In de praktijk wordt de te bepalen stof eerst met de aan een drager gebonden reactiepartner omgezet, waarna na fasenscheiding en wassen de intussen aan de drager immu-10 nologisch gebonden stof met de tweede, met enzym gemarkeerde reactiepartner wordt omgezet. Wa hernieuwde fasenscheiding heeft de enzymatische reactie plaats voor de kwantitatieve aantoning van de te bepalen stof hetzij in de vaste hetzij in de vloeibare fase.The present invention relates to an enzyme immune method according to the so-called "sandwich principle". According to this principle, the substance to be determined, which may be an antigen, an antibody or a hapten, is reacted with two immunologically active reaction partners. As a rule, one of these immunologically active reaction partners is bound to a water-insoluble carrier, while the other is provided with a suitable enzyme. In practice, the substance to be determined is first reacted with the reaction partner bound to a support, after which, after phase separation and washing, the substance which has been immunologically bound to the support is reacted with the second enzyme-marked reaction partner. When phase separation is repeated, the enzymatic reaction takes place for the quantitative detection of the substance to be determined, either in the solid or in the liquid phase.
Men was tot dusverre van mening, dat bij enzym-immuunmethoden 15 de immunologische reactie van de te bepalen stof met de beide geschikte immunologisch actieve reactiepartners na elkaar in een eerste en in een tweede reactietrap diende plaats te hebben.It has hitherto been believed that in enzyme immune methods the immunological reaction of the substance to be determined with the two suitable immunologically active reaction partners should take place sequentially in a first and in a second reaction step.
In het kader van de onderhavige uitvinding werd nu verrassender-wijze gevonden, dat men in tegenstelling tot de huidige mening kwasi 20 in een "éentrapswerkwijze" te werk kan gaan, waarbij de te bepalen stof gelijktijdig met beide immunologisch actieve reactiepartners gedurende een enkele inkubatie wordt omgezet.In the context of the present invention, it has now been surprisingly found that, contrary to the current opinion, one can operate in a "one-step process", whereby the substance to be determined is simultaneously treated with both immunologically active reaction partners during a single incubation. converted.
De onderhavige uitvinding betreft derhalve een enzym-immuunme-thode voor het aantonen respectievelijk bepalen van een stof met een 25 immunologisch actieve reactiepartner, die van een enzym is voorzien, alsmede een immunologisch actieve reactiepartner, die aan een in water onoplosbare drager is gebonden of wordt, door inkuberen van de te bepalen stof met de immunologisch actieve reactiepartners, aansluitende scheiding van vaste en vloeibare fase en meten van de 30 grootte van de enzymmarkering hetzij in de vaste hetzij in de vloeibare fase als grootte voor de hoeveelheid van te bepalen stof, die gekenmerkt is, doordat voor de immunologische reactie de te bepalen stof alsmede de immunologisch actieve reactiepartners vanaf het begin en gemeenschappelijk en slechts eenmaal gelnkubeerd worden.· 35 Als te bepalen stof kunnen al die bestanddelen in fysiologische vloeistoffen, cel- of weefselextrakten genoemd worden, waarvoor immunologische reactiepartners aanwezig zijn of gevormd kunnen worden, 8101860 2 % * -2- en die twee of meer immunologisch actieve plaatsen bezitten. Daartoe behoren peptiden, proteïnen, lipoprotelnen, glycoprotelnen, ste-rinen, sterolden, lipolden, nuclelnezuren, enzymen, hormonen, poly-sacchariden en alkaloïden. Immunologisch actieve stoffen, die de 5 voorkeur verdienen, zijn de natuurlijke antigenen, zoals hormonen,' enzymen, orgaan-specifieke antigenen, bindweefselcomponenten, bloed-celantigenen, plasmaproteïnen en pathologische globuline. Stoffen, die in het bijzonder de voorkeur verdienen, zijn het careino-embryo-nale antigeen (CEA) alsmede het menselijke choriongonadotropine 10 (HCG).The present invention therefore relates to an enzyme-immune method for detecting or determining a substance with an immunologically active reaction partner, which is provided with an enzyme, as well as an immunologically active reaction partner, which is bound or is bound to a water-insoluble carrier. , by incubating the substance to be determined with the immunologically active reaction partners, subsequently separating the solid and liquid phase and measuring the size of the enzyme marker either in the solid or liquid phase as a size for the amount of substance to be determined, which characterized in that for the immunological response the substance to be determined and the immunologically active reaction partners are incubated from the beginning and jointly and only once. · 35 As the substance to be determined, all those components can be mentioned in physiological fluids, cell or tissue extracts, for which immunological response partners are present or can be formed and, 8101860 2% * -2- and which have two or more immunologically active sites. These include peptides, proteins, lipoproteins, glycoproteins, sterins, sterol, lipol, nucleic acids, enzymes, hormones, polysaccharides and alkaloids. Preferred immunologically active substances are the natural antigens, such as hormones, enzymes, organ specific antigens, connective tissue components, blood cell antigens, plasma proteins and pathological globulin. Particularly preferred substances are the careinoembryonic antigen (CEA) as well as the human chorionic gonadotropin (HCG).
Bij de methode volgens de uitvinding dient de immunologisch actieve reactiepartner, die van een enzym is voorzien, als indikator van de immunologische reactie. Enzymen, die de voorkeur verdienen, zijn het alkalische fosfatase, het malaat-dehydrogenase, het gluco-15 se-6-fosfaat-dehydrogenase, het glucose-oxidase, het glucoamylase, het galactosidase en het acetylcholine-esterase. Een enzym-label, dat bijzonder de voorkeur verdient, is het peroxidase uit mierikwortel.In the method of the invention, the immunologically active reaction partner, which is provided with an enzyme, serves as an indicator of the immunological response. Preferred enzymes are the alkaline phosphatase, the malate dehydrogenase, the gluco-15-s-6-phosphate dehydrogenase, the glucose oxidase, the glucoamylase, the galactosidase and the acetylcholine esterase. A particularly preferred enzyme label is the horseradish peroxidase.
Eet enzym als indikator van de immunologische reactie wordt in 20 de vloeibare, bij voorkeur echter in de vaste fase volgens bekende methoden gemeten en is een maat voor de hoeveelheid van de te bepalen stof. Bij het peroxide uit mierikwortel als label wordt bij voorkeur de enzymhoeveelheid op grond van de aanwezige katalytische activiteit gemeten, die met behulp van HgOg en o-fenyleendiamine als 25 redoxindikator bepaald wordt. Daarbij wordt na een 50 minuten durende katalytische reactie de kleurintensiteit van de geoxydeerd redoxindikator fotometrisch gemeten.The enzyme as an indicator of the immunological response is measured in the liquid, preferably in the solid phase, according to known methods and is a measure of the amount of the substance to be determined. For the horseradish label peroxide, the enzyme quantity is preferably measured on the basis of the catalytic activity present, which is determined using HgOg and o-phenylenediamine as a redox indicator. The color intensity of the oxidized redox indicator is measured photometrically after a 50-minute catalytic reaction.
De tweede immunologisch actieve reactiepartner dient voor de afscheiding van de te bepalen stof uit het analysemonster. Voor de-50 ze scheidingstrap kan de tweede immunologisch actieve reactiepartner vanaf het begin aan een in water onoplosbare drager gebonden zijn ofwel gedurende of na de immunologische reactie aan een geschikte drager gebonden worden.The second immunologically active reaction partner serves to separate the substance to be determined from the analysis sample. For this separation step, the second immunologically active reaction partner may be bound from the outset to a water-insoluble support or bound to a suitable support during or after the immunological response.
Als in water°oplosbare dragers voor de tweede immunologisch ac-35 tieve reactiepartner zijn geschikt: organische en anorganische polymeren (amylasen, dextranen, natuurlijke of gemodificeerde cellulose, polyacrylamide, agarose, magnetiet, poreus glaspoeder, polyvinyli-deenfluoride (Kynar) en latex), de binnenwand van proefreservoirs (proefbuisjes, titreerplaten of cuvetten uit glas of kunststof) als-40 mede de oppervlakken van vaste lichamen (glas- en kunststofstaaf, 8101860 -3- r staaf met eindstandige verdikking, staaf met eindstandige vleugels of lamellen). Bijzonder geschikte dragers voor de methode volgens de uitvinding zijn glas- en kunststofkogels.Suitable water-soluble carriers for the second immunologically active reaction partner are: organic and inorganic polymers (amylases, dextrans, natural or modified cellulose, polyacrylamide, agarose, magnetite, porous glass powder, polyvinylidene fluoride (Kynar) and latex) , the inner wall of test reservoirs (test tubes, titrating plates or glass or plastic cuvettes) as well as -40 the surfaces of solids (glass and plastic rod, 8101860 -3-r rod with terminal thickening, rod with terminal wings or fins). Glass and plastic balls are particularly suitable carriers for the method according to the invention.
Be tweede immunologisch actieve reactiepartner kan aan de in 5 water oplosbare drager fysisch (adsorptief) of chemisch gebonden zijn of met behulp van een andere reactiepartner, die op zijn beurt aan een drager is gebonden, tijdens of na de reactie gebonden worden.The second immunologically active reaction partner may be physically (adsorptively) or chemically bound to the water-soluble support, or may be bound during or after the reaction by means of another reaction partner, which in turn is attached to a support.
Wezenlijk voor de methode volgens de uitvinding is, dat de te 10 bepalen stof ten minste twee immunologisch actieve plaatsen (epito-pen) bezit, die door de beide immunologisch actieve reactiepartners, die aan een drager gebonden en die van een enzym voorziene reactiepartner, herkend en tot reactie kan worden gebracht. Als immunologisch actieve reactiepartners worden bij voorkeur twee verschillen-15 de componenten gebruikt, die weliswaar beide met de te bepalen stof reageren, echter elk op verschillende immunologisch actieve plaatsen gericht zijn. Yoor de bepaling van antigenen zeer bijzonder geschikt zijn twee antilichamen voor dit antigeen, die in twee verschillende diersoorten geproduceerd werden en die tegen verschillende epitopen 20 van dit antigeen gericht zijn. Bij voorkeur geschikt is de combinatie van antilichamen van verschillende klonen en van monoklonale antilichamen en antilichamen uit een andere diersoort.It is essential for the method according to the invention that the substance to be determined has at least two immunologically active sites (epitopes) which are recognized by the two immunologically active reaction partners, which are bound to a carrier and which are enzyme-reacted reaction partners. and can be reacted. As immunologically active reaction partners, preferably two different components are used, which, although both react with the substance to be determined, each target different immunologically active sites. Two antibodies to this antigen, which were produced in two different animal species, and which target different epitopes of this antigen, are particularly suitable for the determination of antigens. Preferably suitable is the combination of antibodies from different clones and from monoclonal antibodies and antibodies from a different animal species.
Yoor de immunologische reactie kan het monster met de te bepalen stof direkt of vooraf verdund of op een geschikte wijze voorbe-25 handeld gebruikt worden. Yoor de voorbehandeling kan de te bepalen stof geïsoleerd, verrijkt of van storende bestanddelen bevrijd worden.For the immunological response, the sample can be used directly or pre-diluted or suitably pretreated with the analyte. For the pre-treatment, the substance to be determined can be isolated, enriched or freed from interfering components.
Yolgens de werkwijze van de uitvinding wordt de te bepalen stof gelijktijdig met de met het enzym gemarkeerde alsmede de aan de 30 drager gebonden immunologisch actieve reactiepartner tot omzetting gebracht. Be volgorde van *de toevoeging van reagentia is gericht op de aard van het gekozen dragersysteem. Bij het werken met een gesensibiliseerde kunststofkogel wordt eerst in een geschikt proef-buisje de met enzym gemarkeerde reactiepartner met de te bepalen 35 stof samengebracht en aansluitend wordt de met de andere reactiepartner gesensibiliseerde kogel toegevoegd.According to the method of the invention, the substance to be determined is reacted simultaneously with the enzyme-labeled and the immunologically active reaction partner bound to the carrier. The order of * addition of reagents is oriented to the nature of the chosen carrier system. When working with a sensitized plastic ball, the enzyme-labeled reaction partner is first combined with the substance to be determined in a suitable test tube and the ball sensitized with the other reaction partner is then added.
Be immunolgische reactie wordt door het aanhouden van een optimale pH-waarde, die tussen 4 en 9 kan liggen, in een geschikt buf-fersysteem uitgevoerd. Buffers, die de voorkeur verdienen, zijn bij-40 voorbeeld acetaatbuffer, citraatbuffer, fosfaatbuffer, tris-buffer, 81 01860 -4- triëthaholaminebuffer, Ta o raat buff er of glycinebuffer. Ook kunnen buffermengsels gebruikt worden.The immunolytic reaction is carried out in a suitable buffer system by maintaining an optimum pH value, which may range from 4 to 9. Preferred buffers are, for example, acetate buffer, citrate buffer, phosphate buffer, tris buffer, 81 01 860 -4-triaholamine buffer, Taate buffer or glycine buffer. Buffer mixtures can also be used.
De immunologische reactie heeft bij voorkeur plaats bij een temperatuur tussen 0 en 55°C. Gewoonlijk neemt de immunologische re-5 actiesnelheid met hogere temperaturen toe, waardoor onder overigens gelijke proefomstandigheden, het evenwicht sneller bereikt wordt.The immunological response preferably takes place at a temperature between 0 and 55 ° C. Usually, the immunological response rate increases with higher temperatures, whereby the equilibrium is reached more quickly under otherwise equal test conditions.
De inkubatie van de te bepalen stof met de met enzym gemarkeerde reactiepartner en de aan drager gebonden reactiepartner kan tot het bereiken van het evenwicht plaats hebben. De immunologische re-10 actie kan echter ook op een vroeger tijdstip worden gestopt, doordat na een bepaalde inkubatieduur de vaste en de vloeibare fase gescheiden worden en de mate van enzymmarkering hetzij in de vloeibare of in de vaste fase bepaald wordt.Incubation of the analyte with the enzyme-labeled reaction partner and the support-bound reaction partner can take place until equilibrium is reached. However, the immunological reaction can also be stopped at an earlier time by separating the solid and the liquid phase after a certain incubation period and determining the degree of enzyme marking in either the liquid or the solid phase.
Bij de immunologische reactie kunnen maatregelen voor het sta- 15 biliseren van de immunologische activiteit van de reactiepartners en de te bepalen stof alsmede het enzym getroffen worden. Toorts aan/ kunnen de inkubatie-oplossing bestanddelen, zoals proteïnen en reinigingsmiddelen, voor het uitschakelen van niet-specifieke reacties, voor het verminderen van remmende invloeden of voor de activering 20 worden toegevoegd.In the immunological response, measures to stabilize the immunological activity of the reaction partners and the substance to be determined as well as the enzyme can be taken. Torch to, the incubation solution components, such as proteins and detergents, can be added to eliminate nonspecific reactions, to reduce inhibitory influences or to activate.
De nieuwe methode volgens de onderhavige uitvinding is buitengewoon gevoelig en onderscheidt zich door haar eenvoud bij de hantering.The new method of the present invention is extremely sensitive and is distinguished by its simplicity in handling.
De hierna volgende voorbeelden lichten de uitvinding toe.The following examples illustrate the invention.
25 Toorbeeld I.25 Example I.
* Kwantitatieve benaling van CÉA in patiëntenplasma's met een monoklonaal CEA-antiliohaam en een gebruikelijk CEA-antilichaam (geiten).* Quantitative assessment of CÉA in patient plasmas with a monoclonal CEA antibody and a conventional CEA antibody (goats).
In het vereiste aantal proefbuisjes (10 x 75 mm) worden telkens 50 0,2 mol proefoplossing (0,2 mol/l NaHgPO^/NagHPO^, pH 6,5 met 2 g/l runderserumalbumine, 20^ normaal geitenserum en 0,2 yug/ml geiten-anti-CEA-peroxidase-conjugaat) gepipetteerd, 0,050 ml van de te analyseren patiëntenplasma's respectievelijk de CEA-standaards (0 ng/ml GEA, 2,5 ng/ml CEA, 10 ng/ml OEA en 20 ng/ml CEA) en het CEA-contro-55 leserums (5>0 ng/ml CEA + 1,0 ng/ml) onder mengen toegevoegd, telkens een met monoklonale muis anti CEA-gesensibiliseerde polysty-reenkogel* (0 6,3 mm) toegevoegd en bij 37°C gedurende 16 uren ge-inkubeerd. Aansluitend worden de polystyreenkogels driemaal met telkens 2 - 5 ml gedestilleerd water gewassen, in telkens 0,5 ml sub-40 straatbuffer voor de activiteitsbepaling van het peroxidase (0,1 81 01860 ' * -5- mol/l kaliumcitraatbuffer met een pH van 5,0 met 6 mmol/l ïï„0_ en C* & 20 mol/l o-fenyleendiamine) overgebracht en gedurende 50 minuten bij kamertemperatuur (22°c) geïnkubeerd. Voor het stoppen van de peroxidase-activiteit alsmede voor het intensiveren van de kleurin-5 tensiteit worden 2,0 ml 1N HCl onder mengen toegevoegd en wordt binnen 50 minuten de extinktie bij de golflengte 492 nm fotometrisch gemeten. In tabel A zijn de waarden van een CEA-bepaling vermeld en met de waarden vergeleken, zoals deze met de radio-immunobepaling van ROCHE verkregen werden.In the required number of test tubes (10 x 75 mm), 50 0.2 mol test solution (0.2 mol / l NaHgPO 2 / NagHPO 2, pH 6.5 with 2 g / l bovine serum albumin, 20 normal goat serum and 0, 2 yug / ml goat anti-CEA-peroxidase conjugate) pipetted, 0.050 ml of the patient plasmas to be analyzed, respectively the CEA standards (0 ng / ml GEA, 2.5 ng / ml CEA, 10 ng / ml OEA and 20 ng / ml CEA) and the CEA control 55 lesums (5> 0 ng / ml CEA + 1.0 ng / ml) are added with mixing, each with a monoclonal mouse anti CEA-sensitized polystyrene ball * (0 6, 3 mm) and incubated at 37 ° C for 16 hours. The polystyrene balls are then washed three times with 2 - 5 ml of distilled water each time, in each time 0.5 ml of sub-40 street buffer for determining the activity of the peroxidase (0.1 81.01860 * -5-mol / l potassium citrate buffer with a pH of 5.0 with 6 mmol / l (0-0 and C * & 20 mol / l o-phenylenediamine) and incubated for 50 minutes at room temperature (22 ° C). To stop the peroxidase activity as well as to intensify the color intensity, 2.0 ml 1N HCl are added with mixing and the extinction at the wavelength 492 nm is measured photometrically within 50 minutes. Table A lists the values of a CEA assay and compares it with the values obtained with the ROCHE radioimmunoassay.
10 35 33e bereiding van monoklonaal muis anti-CEA heeft plaats in analogie aan de in Journal of Immunological Methods, 52 (1980) 297-504 beschreven methode, waarbij als uitgangscellijn voor de fusie de myelomlijn Sp 2/01-AG wordt toegepast, die onder nr. CRI 8006 bij ATCC is gedeponeerd. De fusie heeft plaats met miltcellen van mui-15 zen, die met CEA geïmmuniseerd werden. De immunisering van de muizen had plaats in analogie met tabel 1 van de vermelde publikatie, waarbij de eerste beide immuniseringen met telkens 50 ^ug CEA plaats hadden, de immuniseringen 5 en 4 werden weggelaten, immunisering 5 met 50 ^ug CEA en de immuniseringen 6-8 met telkens 200 ^ug CEA 20 plaats hadden.The 33rd preparation of monoclonal mouse anti-CEA takes place analogously to the method described in Journal of Immunological Methods, 52 (1980) 297-504, using the myelom line Sp 2/01-AG as the starting cell line for the fusion. has been deposited with ATCC under No. CRI 8006. The fusion takes place with spleen cells from mice immunized with CEA. The immunization of the mice was carried out in analogy to Table 1 of the aforementioned publication, the first two immunizations taking place at 50 µg CEA each, the immunizations 5 and 4 being omitted, immunization 5 at 50 µg CEA and the immunizations 6 -8 with 200 µg CEA 20 each.
label A.label A.
Monstermateriaal Δε^., ^/gj/jg ain.Sample material Δε ^., ^ / Gj / jg ain.
CEA-standaard 0 ng/ml CEA 0,105 25 2,5 ng/ml CEA 0,550 10.0 ng/ml CEA 0,978 20.0 ng/ml CEA 1,850 CEA-controleserum 5.0 ng/ml CEA 0,540 50 patiëntenplasma’s ROCHE-RIA-proef Werkwijze volgens de uitvinding nr. 7212 0,6 ng/ml 1,2 ng/ml nr. 7188 2,2 ng/ml 1,0 ng/ml nr. 7220 1,2 ng/ml 1,4 ng/ml 35 nr. 7218 1,2 ng/ml 1,5 ng/ml nr. 7254 2,5 ng/ml 2,7 ng/ml nr. 7249 2,4 ng/ml 2,0 ng/ml nr. 7205 2,5 ng/ml 2,0 ng/ml 8101860 -6-CEA standard 0 ng / ml CEA 0.105 25 2.5 ng / ml CEA 0.550 10.0 ng / ml CEA 0.978 20.0 ng / ml CEA 1.850 CEA control serum 5.0 ng / ml CEA 0.540 50 patient plasmas ROCHE-RIA test Method according to the invention No. 7212 0.6 ng / ml 1.2 ng / ml No. 7188 2.2 ng / ml 1.0 ng / ml No. 7220 1.2 ng / ml 1.4 ng / ml 35 No. 7218 1 , 2 ng / ml 1.5 ng / ml No. 7254 2.5 ng / ml 2.7 ng / ml No. 7249 2.4 ng / ml 2.0 ng / ml No. 7205 2.5 ng / ml 2.0 ng / ml 8101860 -6-
Yervolg tabel A.Follow table A.
Patiëntenplasma’s ROCHE-RIA-proef Werkwijze volgens de tiit vinding nr. 7223 3,0 ng/ml 3>3 ng/ml 5 nr. 7247 3»1 ng/ml 2,8 ng/ml nr, 7258 4»6 ng/ml 4>3 ng/ml nr. 7215 4>9 ng/ml 5>5 ng/ml nr. 7219 5,0 ng/ml 5>9 ng/ml nr. '8180 '8,6 ng/ml ‘ 8,5 ng/ml 10 nr. 7248 11,2 ng/ml 10,7 ng/ml nr. 7262 14,2 ng/ml 14,3 ng/ml nr. 7201 15>6 ng/ml 15>3 ng/mlPatient plasmas ROCHE-RIA test Method according to the invention no. 7223 3.0 ng / ml 3> 3 ng / ml 5 no. 7247 3 »1 ng / ml 2.8 ng / ml no, 7258 4» 6 ng / ml 4> 3 ng / ml No. 7215 4> 9 ng / ml 5> 5 ng / ml No. 7219 5.0 ng / ml 5> 9 ng / ml No. '8180' 8.6 ng / ml '8 .5 ng / ml 10 No. 7248 11.2 ng / ml 10.7 ng / ml No. 7262 14.2 ng / ml 14.3 ng / ml No. 7201 15> 6 ng / ml 15> 3 ng / ml
Waarden beneden 2,5 ng/ml CEA liggen in het normale trajekt, terwijl waarden boven 2,5 ng/ml in het pathologische gebied liggen. Yoorbeeld II.Values below 2.5 ng / ml CEA are in the normal range, while values above 2.5 ng / ml are in the pathological range. Image II.
Kwantitatieve bepaling van CEA in patiëntenplasma’s met CEA-antilichamen van twee verschillende diersoorten (geiten en bruinvissen) .Quantitative determination of CEA in patient plasmas with CEA antibodies from two different animal species (goats and porpoises).
In het vereiste aantal proefbuisjes (10 x 75 mm) worden telkens 20 0,2 ml proefoplossing (0,2 mol/l WaHgPO^/WagHPO^, pH 6,5 met 2 g/l runderserumalbumine, 20% normaal geitenserum en 0,2 yug/ml geiten-anti-CEA-peroxidase-conjugaat) gepipetteerd, 0,050 ml van de te analyseren patiëntenplasma's respectievelijk de CEA-standaards (O ng/ml CEA, 2,5 ng/ml CEA, 10 ng/ml CEA en 20 ng/ml CEA) en de CEA-contro-25 leserums (5,0 ng/ml CEA. + 1 ,Ó ng/ml) onder mengen toegevoegd, telkens een met bruinvis-anti-CEA gesensibiliseerde polystyreenkogel (/ 6,5 mm) toegevoegd en bij 37°C gedurende 16 uren geïnkubeerd. Aansluitend worden de polystyreenkogels driemaal met telkens 2 - 5 ml gedestilleerd water gewassen, in telkens 0,5 ml substraatbuffer voor 30 de activiteitsbepaling van het peroxidase (0,1 mol/l kaliumcitraat-buffer met een pH van 5>0 met 6 mmol/l HgOg en ^ ^1101^ o-fenyleen-diamine) overgebracht en gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (22°C) geïnkubeerd. Yoor het stoppen van de peroxidase-activiteit alsmede voor het intensiveren van de kleurintensiteit worden 2,0 ml 35 1N HC1 onder mengen toegevoegd en wordt binnen 30 minuten de extink-tie bij de golflengte 492 nm fotometrisch gemeten. In tabel B zijn de waarden van een CEA-bepaling vermeld en met de waarden vergeleken, zoals deze met de radio-immunobepaling van R0CHE verkregen werden.In the required number of test tubes (10 x 75 mm) 20 0.2 ml test solution (0.2 mol / l WaHgPO ^ / WagHPO ^, pH 6.5 with 2 g / l bovine serum albumin, 20% normal goat serum and 0, 2 yug / ml goat anti-CEA-peroxidase conjugate) pipetted, 0.050 ml of the patient plasmas to be analyzed respectively the CEA standards (O ng / ml CEA, 2.5 ng / ml CEA, 10 ng / ml CEA and 20 ng / ml CEA) and the CEA control serums (5.0 ng / ml CEA. + 1, ng / ml) are added with mixing, each time a polystyrene ball (/ 6.5 mm) sensitized with porpoise anti-CEA ) and incubated at 37 ° C for 16 hours. The polystyrene balls are then washed three times with 2 - 5 ml of distilled water each time, in 0.5 ml of substrate buffer each for determining the activity of the peroxidase (0.1 mol / l potassium citrate buffer with a pH of 5> 0 with 6 mmol / l). 1 HgOg and (^ 1101-o-phenylene-diamine)) and incubated at room temperature (22 ° C) for 30 minutes. To stop the peroxidase activity as well as to intensify the color intensity, 2.0 ml of 35 1N HCl are added with mixing and the extinction at the wavelength 492 nm is measured photometrically within 30 minutes. Table B lists the values of a CEA assay and compared them to the values obtained with the radioimmunoassay of R0CHE.
8101860 * # -7- label B.8101860 * # -7- label B.
Monstermateriaal Δ*492 m/ST/30 min.Sample material Δ * 492 m / ST / 30 min.
CM-standaard 0 ng/ml CM 0,098 5 2,5 ng/ml CM 0,270 10.0 ng/ml CM 0,830 20.0 ng/ml CM 1,5^5 CEA-controleserum. ' 5,0 ng/ml CM 0,470 10 Patiëntenplasma’s ROCHE-RIA-proef Werkwijze volgens de uitvinding nr. 7220 1,2 ng/ml 1,3 ng/ml nr. 7218 1,2 ng/ml 1,3 ng/ml ! nr. 7234 2,5 ng/ml 2,4 ng/ml 15 ; nr. 7249 2,4 ng/ml 2,2 ng/ml nr. 7203 2,3 ng/ml 2,2 ng/ml nr. 7223 3,0 ng/ml 3,0 ng/ml , nr. 7247 3,1 ng/ml 3,2 ng/ml 1 nr. 7258 4,6 ng/ml 4,5 ng/ml 20 [ nr. 7215 4,9 ng/ml 5,3 ng/ml | nr. 7219 5,0 ng/ml 5,6 ng/ml nr. 8180 8,6 ng/ml 8,5 ng/ml > nr. 7248 11,2 ng/ml 10,9 ng/ml nr.' 7262 14,2 ng/ml 14,2 ng/ml 25 nr. 7201 15,6 ng/ml 15,0 ng/mlCM standard 0 ng / ml CM 0.098 5 2.5 ng / ml CM 0.270 10.0 ng / ml CM 0.830 20.0 ng / ml CM 1.5 ^ 5 CEA control serum. 5.0 ng / ml CM 0.470 Patient Plasmas ROCHE-RIA Test Method of the Invention No. 7220 1.2 ng / mL 1.3 ng / mL No. 7218 1.2 ng / mL 1.3 ng / mL ! No. 7234 2.5 ng / ml 2.4 ng / ml 15; No. 7249 2.4 ng / ml 2.2 ng / ml No. 7203 2.3 ng / ml 2.2 ng / ml No. 7223 3.0 ng / ml 3.0 ng / ml, No. 7247 3 , 1 ng / ml 3.2 ng / ml 1 No 7258 4.6 ng / ml 4.5 ng / ml 20 [No 7215 4.9 ng / ml 5.3 ng / ml | No. 7219 5.0 ng / mL 5.6 ng / mL No. 8180 8.6 ng / mL 8.5 ng / mL> No. 7248 11.2 ng / mL 10.9 ng / mL No. 7262 14.2 ng / ml 14.2 ng / ml 25 No. 7201 15.6 ng / ml 15.0 ng / ml
Waarden beneden 2,5 ng/ml CM liggen in het normale trajekt, terwijl waarden boven 2,5 ng/ml in het pathologische gebied liggen. Voorbeeld III.Values below 2.5 ng / ml CM are in the normal range, while values above 2.5 ng / ml are in the pathological range. Example III.
Kwantitatieve -bepaling van CM in natiëntennlasma’s met mono-50 klonale CM-antilichamen van twee verschillende klonen.Quantitative determination of CM in natal nlasmas with mono-50 clonal CM antibodies from two different clones.
In het vereiste aantal proefbuisjes (10 x 75 ran) worden telkens 0,2 ml proefoplossing (0,2 mol/l Wal^O^/NagHPO^, pH 6,5 met 2 g/l runderserumalbumine, 20% normaal geitenserum en 0,15 yug/ml monoklonaal muis-anti-CM-peroxidase-conjugaat*) gepipetteerd, 35 0,050 ml van de te analyseren patiëntenplasma's respectievelijk de CEA-standaards (0 ng/ml CEA, 2,5 ng/ml CM, 10 ng/ml CM en 20 ng/ml CM ) en het CM-controleserum (5,0 ng/ml CEA +1,0 ng/ml) onder mengen toegevoegd, telkens een met monoklonaal muis anti-CEA gesen- 8101860In the required number of test tubes (10 x 75 ran) 0.2 ml test solution (0.2 mol / l Wal ^ O ^ / NagHPO ^, pH 6.5 with 2 g / l bovine serum albumin, 20% normal goat serum and 0 , 15 yug / ml mouse monoclonal anti-CM-peroxidase conjugate *) pipetted, 35 0.050 ml of the patient plasmas to be analyzed, respectively the CEA standards (0 ng / ml CEA, 2.5 ng / ml CM, 10 ng / ml CM and 20 ng / ml CM) and the CM control serum (5.0 ng / ml CEA +1.0 ng / ml) added with mixing, each time one with monoclonal mouse anti-CEA-8101860
Np -8- sibiliseercl!5 polystyreenkogel (doorsnede 6,5 mm) toegevoegd en bij 37°C gedurende 16 uren geïnkubeerd. Aansluitend worden de polysty-reenkogels 3 maal met telkens 2 - 5 nil gedestilleerd water gewassen, in telkens 0,5 ml substraatbuffer voor de activiteitsbepaling van 5 het peroxidase (0,1 mol/l kaliumcitraatbuffer met een pH van 5,0 met 6 mmol/l HgOg en 20 mmol/l o-fenyleendiamine) overgebracht en gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (22°0) gelnkubeerd. Toor het stoppen van de peroxidase-activiteit alsmede voor het intensiveren . .· van de kleurintensiteit. worden 2,.0 ml 1N.HC1 onder mengen toege- .Np -8- sibilizing polystyrene ball (diameter 6.5 mm) was added and incubated at 37 ° C for 16 hours. The polystyrene balls are then washed 3 times with 2 - 5 nil each of distilled water, in 0.5 ml of substrate buffer for determining the activity of the peroxidase (0.1 mol / l potassium citrate buffer with a pH of 5.0 with 6 mmol). / l HgOg and 20 mmol / l o-phenylenediamine) and incubated at room temperature (22 ° 0) for 30 minutes. To stop peroxidase activity as well as to intensify. · Of the color intensity. 2.0 ml of 1N.HCl are added with mixing.
10 voegd én wordt in 30 minuten de extinktie bij de golflengte 492 nm fotometrisch gemeten. In tabel C zijn de waarden van een CEA-bepa-ling vermeld en met de waarden vergeleken, zoals deze met de radio-immunobepaling van R0CHE verkregen werden.10 and the extinction at the wavelength 492 nm is measured photometrically in 30 minutes. Table C lists the values of a CEA assay and compares them with the values obtained with the radioimmunoassay of ROCHE.
* De bereiding van het monoklonale muis anti-CEA heeft plaats 15 in analogie aan de in Journal of Immunological Methods, 32 (1980) 297-304 beschreven methode, waarbij als uitgangslijn voor de fusie de myelomlijn Sp 2/01-Ag wordt toegepast, die onder nr. CRL 8006 bij ATCC gedeponeerd is. De fusie heeft plaats met miltcellen van muizen, die met CEA geïmmuniseerd werden. De immunisering van de muis 20 had plaats in analogie aan tabel 1 van de vermelde publikatie, waarbij de eerste beide immuniseringen met telkens 50 yug CEA plaats hadden, de immuniseringen 3 en 4 werden weggelaten, immunisering 5 met 50 yug CEA en de immuniseringen 6-8 met telkens 200 mg CEA plaats hadden. Er werden twee verschillende, geschikte monoklonale 25 antilichamen toegepast,, die tegen verschillende epitopen van het CEA-antigeen gericht zijn.* The preparation of the monoclonal mouse anti-CEA takes place in analogy to the method described in Journal of Immunological Methods, 32 (1980) 297-304, using the myelom line Sp 2/01-Ag as the starting line for the fusion, which is deposited with ATCC under No. CRL 8006. The fusion takes place with murine spleen cells immunized with CEA. The immunization of the mouse 20 took place in analogy to table 1 of the mentioned publication, the first two immunizations each taking 50 yug CEA, the immunizations 3 and 4 omitted, immunization 5 with 50 yug CEA and the immunizations 6- 8 with 200 mg CEA each. Two different suitable monoclonal antibodies were directed against different epitopes of the CEA antigen.
Tabel 0.Table 0.
Monstermateriaal ΔΕ.ηο /-nm/^ 492 nm/RT/30 min, OEA-standaard 30 0 ng/ml CEA 0,390 2,5 ng/ml CEA 0,440 10.0 ng/ml CEA 0,620 20.0 ng/ml CEA 0,860 CEA-controleserum 35 5,0 ng/ml CEA 0,510 patiëntenplasma's ROCHE-RIA-proef Werkwijze volgens de uitvinding J nr. 7220 1,2 ng/ml 0,8 ng/ml * 81 01 860 -9-Sample material ΔΕ.ηο / -nm / ^ 492 nm / RT / 30 min, OEA standard 30 0 ng / ml CEA 0.390 2.5 ng / ml CEA 0.440 10.0 ng / ml CEA 0.620 20.0 ng / ml CEA 0.860 CEA Control Serum 35 5.0 ng / ml CEA 0.510 patient plasmas ROCHE-RIA test Method according to the invention J No. 7220 1.2 ng / ml 0.8 ng / ml * 81 01 860 -9-
Vervolg tabel C.Table C continued.
Patiëntenplasma’s ROCEE-RIA-proef Werkwijze volgens de uitvinding nr. 7234 2,5 ng/ml 3,0 ng/ml 5 nr. 7223 3»0 ng/ml 3,5 ng/ml nr. 7247 3,1 ng/ml 3,2 ng/ml nr. 7258 4,6 ng/ml 4,4 ng/ml nr. 7215 4,9 ng/ml 5,0 ng/ml nr·. 7219 5,0 ng/ml 5,4 ng/ml 10 nr. 8180 8,6 ng/ml 8,6 ng/ml nr. 7248 11,2 ng/ml 11,0 ng/ml nr. 7262 14,2 ng/ml 14,0 ng/ml nr. 7201 15,6 ng/ml 16,0 ng/mlPatient Plasmas ROCEE-RIA Test Method of the Invention No. 7234 2.5 ng / mL 3.0 ng / mL 5 No. 7223 300 ng / mL 3.5 ng / mL No. 7247 3.1 ng / mL 3.2 ng / mL No. 7258 4.6 ng / mL 4.4 ng / mL No. 7215 4.9 ng / mL 5.0 ng / mL No. 7219 5.0 ng / ml 5.4 ng / ml 10 No. 8180 8.6 ng / ml 8.6 ng / ml No. 7248 11.2 ng / ml 11.0 ng / ml No. 7262 14.2 ng / ml 14.0 ng / ml No. 7201 15.6 ng / ml 16.0 ng / ml
Waarden "beneden 2,5 ng/ml CEA liggen in het normale trajekt, 15 terwijl waarden "boven 2,5 ng/ml in het pathologische gebied liggen. Voorbeeld 17.Values "below 2.5 ng / ml CEA are in the normal range, while values" above 2.5 ng / ml are in the pathological range. Example 17.
Kwantitatieve bepaling van HCG in serum/nlasma/urine.Quantitative determination of HCG in serum / nlasma / urine.
In het vereiste aantal proefbuisjes (10 x 75 2®) worden telkens 0,2 ml proefoplossing (0,1 mol/l NaHgPO^/WagHPO^, pH 7,0 met 2 g/l 20 runderserumalbumine en 1,0 yug/ml monoklonaal muis-anti-HCG-peroxi-dase-conjugaat*) gepipetteerd, 0,050 ml van de te analyseren patiëntenplasma's respectievelijk de HCG-standaards (0, 25, 50, 100 en 250 mlïï/ml HCG) onder mengen toegevoegd, telkens een met konijnen-anti-HCG gesensibiliseerde polystyreenkogel (/ 6,5 mm) toegevoegd en 25 bij kamertemperatuur gedurende 16 uren in een met water verzadigde atmosfeer gelnkubeerd. Aansluitend worden de polystyreenkogels driemaal met telkens 2 - 5 ml gedestilleerd water gewassen, in telkens 0,5 ml substraatbuffer voor de activiteitsbepaling van het peroxidase (0,1 mol/l kaliumcitraatbuffer met een pH van 5,0 met 6 mmol/l 30 ^jOg en 20 mmol/l o-fenyleendiamine) overgebracht en gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (16 - 30°C) gelnkubeerd. Voor het stoppen van de peroxidase-activiteit alsmede voor de intensivering van de kleurintensiteit worden 2,0 ml 1N HCl onder mengen toegevoegd en wordt binnen 30 minuten de extinktie bij de golflengte 492 nm foto-55 metrisch gemeten. In de tabel zijn de waarden van een HCG-bepaling in serum en in urine vermeld.In the required number of test tubes (10 x 75 2®), 0.2 ml test solution (0.1 mol / l NaHgPO ^ / WagHPO ^, pH 7.0 with 2 g / l 20 bovine serum albumin and 1.0 yug / ml are used in each case). mouse monoclonal anti-HCG-peroxidase conjugate *) pipetted, 0.050 ml of the patient plasmas to be analyzed and respectively the HCG standards (0, 25, 50, 100 and 250 ml / ml HCG) added with mixing, each one with rabbit anti-HCG sensitized polystyrene ball (⁄ 6.5 mm) added and incubated at room temperature for 16 hours in a water-saturated atmosphere. The polystyrene balls are then washed three times with 2 - 5 ml of distilled water, in 0.5 ml of substrate buffer for determining the activity of the peroxidase (0.1 mol / l potassium citrate buffer with a pH of 5.0 with 6 mmol / l 30 ^). 10g and 20mmol / l o-phenylenediamine) and incubated at room temperature (16-30 ° C) for 30 minutes. To stop the peroxidase activity as well as to intensify the color intensity, 2.0 ml of 1N HCl are added with mixing and the extinction at the wavelength 492 nm photo-55 is measured metrically within 30 minutes. The table shows the values of an HCG determination in serum and in urine.
* De bereiding van het monoklonale anti-HCG kan volgens een in Journal of Immunological Methods 32 (1980) 297 - 304 beschreven methode plaats hebben.* The preparation of the anti-HCG monoclonal may be by a method described in Journal of Immunological Methods 32 (1980) 297-304.
61 018 6ö61 018 6ö
» * V»* V
-10- HCG-bepaling in serum en in urine.-10- HCG determination in serum and in urine.
1. Standaardkrommen.1. Standard curves.
ώΒ492 na/50 τηΤΤΤ HCG/ml serum urine 5 0 0,185 0,385 25 0,385 0,525 50 , 0,530 0,720 100 0,830 1,05 . ” v ’250'..... ’ ‘ . 0,185 ’ ’ . 1,59 10 2. Patiëntenmonsters.ώΒ492 na / 50 τηΤΤΤ HCG / ml serum urine 5 0 0.185 0.385 25 0.385 0.525 50, 0.530 0.720 100 0.830 1.05. "V" 250 "....." ". 0.185 ". 1.59 10 2. Patient samples.
Monstemr. ^E492 nm^° min./ST = mlTJ HCG/ml monster urine F-1032 E 0,375 0 " 58-418 0,575 (x 50) * 1500 " 58414 0,775 (x 100% 2 5500 15 " 58417 0,81.0 (x 500) * 32000 serum 2559 0,155 0 " 2560 0,125 0 " 1543 0,195 1,5 ” 2673 0,505 44 20 " 1167 1,085 181 " 1492 0,98 (x 10) 2 1370 - v··.·,,-·, -.-279.3.. .·: ...-0,.77- (x· , 20).2 . . r;.. t-740 " 924 0,69 (x 100) 2 7300 2 Verdunning van het monster 25 Omrekening: 1 ng zuiver HCG komt overeen met ongeveer 10 mlU HCG. Voorbeeld V.Monstemr. ^ E492 nm ^ ° min./ST = mlTJ HCG / ml sample urine F-1032 E 0.375 0 "58-418 0.575 (x 50) * 1500" 58414 0.775 (x 100% 2 5500 15 "58417 0.81.0 (x 500) * 32000 serum 2559 0.155 0 "2560 0.125 0" 1543 0.195 1.5 ”2673 0.505 44 20” 1167 1.085 181 ”1492 0.98 (x 10) 2 1370 - v ··. .-279.3 ... ·: ...- 0, .77- (x ·, 20) .2.. R; .. t-740 "924 0.69 (x 100) 2 7300 2 Dilution of the sample Conversion: 1 ng of pure HCG corresponds to approximately 10 mlU of HCG Example V.
Kwantitatieve bepaling van HOG in serum met monoklonale HCG- antiliohamen van twee verschillende klonen.Quantitative determination of serum HOG with HCG monoclonal antibodies from two different clones.
In het vereiste aantal proefbuisjes (10 x 75 mm) worden telkens 50 0,2 ml proefoplossing (0,1 mol/l HaHgPO^/ïïagHPO^, pH 7,0 met 2 g/l runderserumalbumine en 1,0 /ug/ml monoklonaal muis-anti-HCG-peroxi-ï\ dase-conjugaat ) gepipetteerd, 0,050 ml van de te analyseren patiëntenplasma's respectievelijk de HGG-standaard (O, 25, 50, 100 en 200 mlïï/ml HCG) onder mengen toegevoegd, telkens een met monoklonaal 35 muis-anti-HCG gesensibiliseerde polystyreenkogel2) (0 6,5 mm) toe- 8101860 * -11- gevoegd en bijvoorbeeld bij 37°C gedurende 2 uren geïnkubeerd. Aansluitend worden de polystyreenkogels driemaal met telkens 2 - 5 ml gedestilleerd water gewassen, in telkens 0,5 ml substraatbuffer voor de activiteitsbepaling van het peroxidase (0,1 mol/l kaliumcitraat-5 buffer met een pH van 5>0 met 6 mmol/l HgOg en 20 mmol/l o-fenyleen-diamine) overgebracht en gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (16 - 30°C) geïnkubeerd. Voor het stoppen van de peroxidase-activi-teit alsmede voor de intensivering van de kleurintensiteit wordt 1,0 ml 2N HCl onder mengen toegevoegd en binnen 30 minuten wordt de 10 extinktie bij de golflengte 492 nm fotometrisch bepaald. In de tabel zijn de waarden van HCG-bepalingen in serum vermeld.In the required number of test tubes (10 x 75 mm), 50 0.2 ml of test solution (0.1 mol / l HaHgPO2 / ïagHPO2, pH 7.0 with 2 g / l bovine serum albumin and 1.0 / µg / ml are used in each case). mouse monoclonal anti-HCG peroxy phase conjugate), 0.050 ml of the patient plasmas to be analyzed, respectively the HGG standard (0.25, 50, 100 and 200 ml / ml HCG) are added with mixing, each time 8101860 * -11- with monoclonal mouse anti-HCG sensitized polystyrene ball2) (0 6.5 mm) and incubated, for example, at 37 ° C for 2 hours. The polystyrene balls are then washed three times with 2 - 5 ml of distilled water, in 0.5 ml of substrate buffer for determining the activity of the peroxidase (0.1 mol / l potassium citrate-5 buffer with a pH of 5> 0 with 6 mmol / l). 1 HgOg and 20 mmol / l o-phenylene diamine) and incubated at room temperature (16-30 ° C) for 30 minutes. To stop the peroxidase activity as well as to intensify the color intensity, 1.0 ml of 2N HCl is added with mixing and the extinction at the wavelength 492 nm is determined photometrically within 30 minutes. The table lists the values of serum HCG determinations.
* De bereiding van de monoklonale muis-HCG-antilichamen heeft plaats volgens de in Journal of Immunological Methods, 32 (1980) 297 - 304 beschreven methode. Er worden twee verschillende, geschik-15 te monoklonale antilichamen toegepast, die tegen verschillende epi-topen van het HCG-antigeen gericht zijn.* The preparation of the mouse monoclonal HCG antibodies is by the method described in Journal of Immunological Methods, 32 (1980) 297 - 304. Two different suitable monoclonal antibodies are directed against different epitopes of the HCG antigen.
HCG-benaling in menseli.ik serum (gemiddelde waarde uit duplobepa- lingen).HCG reference in human serum (mean value from duplicate determinations).
1♦ Standaardkrommen.1 ♦ Standard curves.
20 &E 492 nm/30 min./RT20 & E 492 nm / 30 min./RT
mlïï/ml HCG 1) serum 2) plasma 3) urine 4) buffer 0 0,038 0,054 0,158 0,180 25 0,226 - - -50 0,475 0,544 0,557 0,716 25 100 0,905 . 0,955 0,970 1,40 200 1,75 1,55 1 >90 2,44 i -| ][ _ml / ml HCG 1) serum 2) plasma 3) urine 4) buffer 0 0.038 0.054 0.158 0.180 25 0.226 - -50 0.475 0.544 0.557 0.716 25 100 0.905. 0.955 0.970 1.40 200 1.75 1.55 1> 90 2.44 i - | ] [_
De HCG-waarden van de hierna vermelde voorbeelden van patiëntensera werden uit de standaardkromme 1) afgelezen. De standaardkrommen 2), 3) en 4) werden op een andere dag met nieuwe HCG-standaards be-30 paald.The HCG values of the patient sera examples listed below were read from the standard curve 1). Standard curves 2), 3) and 4) were determined with new HCG standards on another day.
2. Patiëntensera.2. Patient sera.
Serum &E 492/30 min./Rï mlïï/ml HCGSerum & E 492/30 min / Ri ml / ml HCG
gemeten uit kromme 1) pool 091080 0,041 0 35 nr. 2801 0,025 0 nr. 3881 0,450 47 nr. 2673 1,13 127 nr. 1167 2,12 (1:2) 470 nr. 4891 0,975 (1:50) 5'450 81 01 860 r ^ * -v -12- %measured from curve 1) pole 091080 0.041 0 35 No. 2801 0.025 0 No. 3881 0.450 47 No. 2673 1.13 127 No. 1167 2.12 (1: 2) 470 No. 4891 0.975 (1:50) 5 ' 450 81 01 860 r ^ * -v -12-%
Vervolg tabel.Table continued.
Serum ΔΕ 492/30 min./M mlïï/ml HCGSerum ΔΕ 492/30 min./M mlïï / ml HCG
gemeten uit kromme 1) nr. 3240 1,06 (1:20 2'280 nr. 4418 1,475 (1:1000) 167'000 8101860measured from curve 1) No. 3240 1.06 (1:20 2'280 No. 4418 1,475 (1: 1000) 167'000 8101860
Claims (13)
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CH320980 | 1980-04-25 | ||
| CH320980A CH642458A5 (en) | 1980-04-25 | 1980-04-25 | Immunological method |
| CH589880 | 1980-08-04 | ||
| CH589880A CH651396A5 (en) | 1980-08-04 | 1980-08-04 | Immunological method for detecting and determining carcinoembryonic antigen |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NL8101860A true NL8101860A (en) | 1981-11-16 |
| NL187545B NL187545B (en) | 1991-06-03 |
Family
ID=25692464
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NLAANVRAGE8101860,A NL187545B (en) | 1980-04-25 | 1981-04-15 | METHOD FOR THE IMMUNOLOGICAL DETECTION RESPECTIVE DETERMINATION OF A SUBSTANCE |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| AT (1) | AT373398B (en) |
| AU (1) | AU542563B2 (en) |
| CA (1) | CA1160566A (en) |
| DE (1) | DE3115115C2 (en) |
| DK (1) | DK151399C (en) |
| FR (1) | FR2481318A1 (en) |
| GB (1) | GB2074727B (en) |
| IT (1) | IT1137344B (en) |
| NL (1) | NL187545B (en) |
| NO (1) | NO159620C (en) |
| SE (1) | SE460930B (en) |
Families Citing this family (35)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6406920B1 (en) | 1980-06-20 | 2002-06-18 | Inverness Medical Switzerland Gmbh | Processes and apparatus for carrying out specific binding assays |
| EP0111762B1 (en) * | 1980-06-20 | 1987-11-19 | Unilever Plc | Processes and apparatus for carrying out specific binding assays |
| WO1982000364A1 (en) * | 1980-07-16 | 1982-02-04 | Jefferis R | Methods of immuno-analysis using monoclonal antibodies |
| US4486530A (en) * | 1980-08-04 | 1984-12-04 | Hybritech Incorporated | Immunometric assays using monoclonal antibodies |
| US4879219A (en) * | 1980-09-19 | 1989-11-07 | General Hospital Corporation | Immunoassay utilizing monoclonal high affinity IgM antibodies |
| DE3174064D1 (en) * | 1980-10-15 | 1986-04-17 | Takeda Chemical Industries Ltd | Method for immunochemical assay and kit therefor |
| US4837167A (en) * | 1981-01-30 | 1989-06-06 | Centocor, Inc. | Immunoassay for multi-determinant antigens using high-affinity |
| GB2118300B (en) * | 1982-02-12 | 1985-06-19 | Corning Glass Works | Method of immunoassay |
| DK76983A (en) * | 1982-03-05 | 1983-09-06 | Takeda Chemical Industries Ltd | METHOD AND REAGENT FOR IMMUNKEMIC DETERMINATION OF HUMAN CHORIOGONADOTROPIN |
| DE3225027A1 (en) * | 1982-07-05 | 1984-01-05 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | IMMUNCHEMICAL MEASUREMENT METHOD |
| IL73938A (en) * | 1984-01-02 | 1989-09-28 | Boehringer Mannheim Gmbh | Process and reagent for the determination of polyvalent antigen by incubation with three different receptors |
| US4690890A (en) * | 1984-04-04 | 1987-09-01 | Cetus Corporation | Process for simultaneously detecting multiple antigens using dual sandwich immunometric assay |
| US5011771A (en) * | 1984-04-12 | 1991-04-30 | The General Hospital Corporation | Multiepitopic immunometric assay |
| US4935339A (en) * | 1985-05-07 | 1990-06-19 | Nichols Institute Diagnostics | Delayed solid phase immunologic assay |
| US5770459A (en) * | 1986-04-30 | 1998-06-23 | Igen International, Inc. | Methods and apparatus for improved luminescence assays using particle concentration, electrochemical generation of chemiluminescence detection |
| DE3638767A1 (en) * | 1986-11-13 | 1988-05-26 | Behringwerke Ag | INCUBATION MEDIUM CONTAINING LACTOTRINE FOR SOLID-PHASE IMMUNOMETRIC METHOD AND ITS USE |
| US6881589B1 (en) | 1987-04-30 | 2005-04-19 | Bioveris Corporation | Electrochemiluminescent localizable complexes for assay compositions |
| US5935779A (en) * | 1988-11-03 | 1999-08-10 | Igen International Inc. | Methods for improved particle electrochemiluminescence assay |
| WO1989002078A1 (en) * | 1987-08-25 | 1989-03-09 | Fuji Yakuhin Kogyo Kabushiki Kaisha | Method for diagnosing chronic articular rheumatism |
| EP0339097B1 (en) * | 1987-10-30 | 1994-08-03 | Fuji Yakuhin Kogyo Kabushiki Kaisha | Method for diagnosis of liver cancer |
| DE3807440A1 (en) * | 1988-03-07 | 1989-09-21 | Progen Biotechnik Gmbh | Method for the immunological detection of substances, and a composition and a test kit |
| US5962218A (en) * | 1988-11-03 | 1999-10-05 | Igen International Inc. | Methods and apparatus for improved luminescence assays |
| US5705402A (en) * | 1988-11-03 | 1998-01-06 | Igen International, Inc. | Method and apparatus for magnetic microparticulate based luminescence assay including plurality of magnets |
| US5798083A (en) * | 1988-11-03 | 1998-08-25 | Igen International, Inc. | Apparatus for improved luminescence assays using particle concentration and chemiluminescence detection |
| US5746974A (en) * | 1988-11-03 | 1998-05-05 | Igen International, Inc. | Apparatus for improved luminescence assays using particle concentration, electrochemical generation of chemiluminescence and chemiluminescence detection |
| US5779976A (en) * | 1988-11-03 | 1998-07-14 | Igen International, Inc. | Apparatus for improved luminescence assays |
| EP0485377B1 (en) * | 1988-12-12 | 1999-05-06 | Csl Limited | Solid phase immuno-assay with labelled conjugate |
| US5176999A (en) * | 1989-12-07 | 1993-01-05 | Eastman Kodak Company | Buffered wash composition, insolubilizing composition, test kits and method of use |
| ZA92804B (en) | 1991-02-06 | 1992-12-30 | Igen Inc | Methods and apparatus for improved luminescence assays |
| US6201109B1 (en) | 1993-01-13 | 2001-03-13 | Dade Behring Marburg Gmbh | Assay for bone alkaline phosphatase |
| FR2710410B1 (en) * | 1993-09-20 | 1995-10-20 | Bio Merieux | Method and device for determining an analyte in a sample. |
| WO1995022765A1 (en) * | 1994-02-19 | 1995-08-24 | Seikagaku Kogyo Kabushiki Kaisha | Method of assaying normal aglycan, assaying kit, and method of judging joint-related information |
| DE69928213T2 (en) | 1998-09-01 | 2006-06-01 | Taiho Pharmaceutical Co. Ltd. | METHOD FOR DETERMINING HUMAN THYMIDYLATE SYNTHASE AND KIT THEREFOR |
| EP1169647B1 (en) | 1999-04-12 | 2007-06-20 | Sumitomo Chemical Company, Limited | Method for analyzing the amount of intraabdominal adipose tissue |
| EP1893990B1 (en) | 2005-06-03 | 2018-05-02 | Board of Regents of the University of Texas System | Electrochemistry and electrogenerated chemiluminescence with a single faradaic electrode |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1572220A (en) * | 1976-10-07 | 1980-07-30 | Mochida Pharm Co Ltd | Immunochemical process of measuring physiologically active substances |
| GB1549069A (en) * | 1976-12-10 | 1979-08-01 | Erba Farmitalia | Enzyme linked immunoassay |
| US4244940A (en) * | 1978-09-05 | 1981-01-13 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Single-incubation two-site immunoassay |
| JPH0235944B2 (en) * | 1980-06-20 | 1990-08-14 | Unilever Nv | TOKUITEKIKETSUGOKENTEIOJITSUSHISURUHOHOOYOBIGAIHOHOOJITSUSHISURUTAMENOSHIKENKITSUTO |
-
1981
- 1981-03-23 CA CA000373607A patent/CA1160566A/en not_active Expired
- 1981-04-06 DK DK155881A patent/DK151399C/en not_active IP Right Cessation
- 1981-04-13 IT IT21122/81A patent/IT1137344B/en active
- 1981-04-14 DE DE3115115A patent/DE3115115C2/en not_active Expired
- 1981-04-15 NL NLAANVRAGE8101860,A patent/NL187545B/en not_active Application Discontinuation
- 1981-04-22 SE SE8102558A patent/SE460930B/en not_active IP Right Cessation
- 1981-04-23 FR FR8108105A patent/FR2481318A1/en active Granted
- 1981-04-24 GB GB8112730A patent/GB2074727B/en not_active Expired
- 1981-04-24 AT AT0186481A patent/AT373398B/en not_active IP Right Cessation
- 1981-04-24 AU AU69811/81A patent/AU542563B2/en not_active Expired
- 1981-04-24 NO NO811407A patent/NO159620C/en not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2481318A1 (en) | 1981-10-30 |
| AT373398B (en) | 1984-01-10 |
| GB2074727B (en) | 1983-11-30 |
| AU6981181A (en) | 1981-10-29 |
| FR2481318B1 (en) | 1984-10-19 |
| NO159620B (en) | 1988-10-10 |
| DE3115115A1 (en) | 1982-02-04 |
| DK155881A (en) | 1981-10-26 |
| GB2074727A (en) | 1981-11-04 |
| NO811407L (en) | 1981-10-26 |
| SE460930B (en) | 1989-12-04 |
| SE8102558L (en) | 1981-10-26 |
| NL187545B (en) | 1991-06-03 |
| DK151399C (en) | 1988-09-05 |
| NO159620C (en) | 1989-01-18 |
| IT8121122A0 (en) | 1981-04-13 |
| AU542563B2 (en) | 1985-02-28 |
| ATA186481A (en) | 1983-05-15 |
| DE3115115C2 (en) | 1987-02-12 |
| DK151399B (en) | 1987-11-30 |
| IT1137344B (en) | 1986-09-10 |
| CA1160566A (en) | 1984-01-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| NL8101860A (en) | METHOD FOR IMMUNOLOGICAL DETECTION RESPECTIVE DETERMINATION OF SUBSTANCES | |
| EP1618383B1 (en) | Membrane strip biosensor system for point-of-care testing | |
| CA1336675C (en) | Assay for antigens | |
| EP0398913B1 (en) | Test method and reagent kit therefor | |
| JPH0239747B2 (en) | ||
| US20040171092A1 (en) | Compensation for variability in specific binding in quantitative assays | |
| JPH01123149A (en) | Metal sol trapping immunoassay, kit used therefor and metal-containing composite material to be trapped | |
| EP2458378B1 (en) | Insulin measurement method | |
| US7125517B2 (en) | Systems and methods for detection of analytes in biological fluids | |
| JPS598779B2 (en) | Antibodies, Antigens or Antibodies: Methods for Analyzing Antigen Complexes | |
| JP3055789B2 (en) | Assay for alkaline phosphatase from bone | |
| Clarke et al. | Immunoassays | |
| JPH07325083A (en) | Method for measuring ratio of specific sugar chain of glycoprotein | |
| JP2579972B2 (en) | Membrane affinity concentrated immunoassay | |
| JPH03170058A (en) | Reagent complex for immunoassay | |
| Clarke | Immunoassays for therapeutic drug monitoring and clinical toxicology | |
| WO1987002779A1 (en) | Idiotypic-antigenic conjunction binding assay | |
| AU703940B2 (en) | Regenerable solid phase for carrying out specific binding reactions | |
| JPH01295165A (en) | Immunoassay | |
| JP5137880B2 (en) | Method for producing dry particles with immobilized binding substance | |
| WO1987006006A1 (en) | Anti-enzyme antibody immunoassay | |
| JPH08509064A (en) | Immobilization of chemically crosslinked proteins on a solid support | |
| Kricka et al. | 15 Immunochemical Techniques | |
| JPH04258766A (en) | Simple immunity diagnostic method processing many objects | |
| JPH07114716B2 (en) | Enzyme labeling assay |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A85 | Still pending on 85-01-01 | ||
| BA | A request for search or an international-type search has been filed | ||
| BT | A notification was added to the application dossier and made available to the public | ||
| BB | A search report has been drawn up | ||
| BC | A request for examination has been filed | ||
| CNR | Transfer of rights (patent application after its laying open for public inspection) |
Free format text: HOFFMANN-LA ROCHE AG. F. - |
|
| R1B | Notice of opposition during period of laying open | ||
| R2C | Refused after opposition |