NO159620B - Immunologisk bestemmelsesmetode. - Google Patents
Immunologisk bestemmelsesmetode. Download PDFInfo
- Publication number
- NO159620B NO159620B NO811407A NO811407A NO159620B NO 159620 B NO159620 B NO 159620B NO 811407 A NO811407 A NO 811407A NO 811407 A NO811407 A NO 811407A NO 159620 B NO159620 B NO 159620B
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- cea
- substance
- immunologically active
- active reaction
- reaction partner
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 28
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 title claims description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 37
- 102000012406 Carcinoembryonic Antigen Human genes 0.000 claims description 34
- 108010022366 Carcinoembryonic Antigen Proteins 0.000 claims description 34
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 29
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 19
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 19
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 claims description 15
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 claims description 15
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 14
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 14
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 14
- 230000002494 anti-cea effect Effects 0.000 claims description 9
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 6
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 claims description 6
- 241000283707 Capra Species 0.000 claims description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 4
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 17
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 13
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 11
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 10
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 10
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 10
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 9
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 8
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 4
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 229960002635 potassium citrate Drugs 0.000 description 4
- 239000001508 potassium citrate Substances 0.000 description 4
- QEEAPRPFLLJWCF-UHFFFAOYSA-K potassium citrate (anhydrous) Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O QEEAPRPFLLJWCF-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 235000011082 potassium citrates Nutrition 0.000 description 4
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 4
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 3
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 3
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 3
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 3
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 238000005191 phase separation Methods 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 239000002824 redox indicator Substances 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 2
- 102100031126 6-phosphogluconolactonase Human genes 0.000 description 1
- 108010029731 6-phosphogluconolactonase Proteins 0.000 description 1
- 102000012440 Acetylcholinesterase Human genes 0.000 description 1
- 108010022752 Acetylcholinesterase Proteins 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 1
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 1
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 1
- 235000011330 Armoracia rusticana Nutrition 0.000 description 1
- 240000003291 Armoracia rusticana Species 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000011022 Chorionic Gonadotropin Human genes 0.000 description 1
- 108010062540 Chorionic Gonadotropin Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 102000002464 Galactosidases Human genes 0.000 description 1
- 108010093031 Galactosidases Proteins 0.000 description 1
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 1
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 1
- 108010073178 Glucan 1,4-alpha-Glucosidase Proteins 0.000 description 1
- 102100022624 Glucoamylase Human genes 0.000 description 1
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 description 1
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 description 1
- 108010018962 Glucosephosphate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000013460 Malate Dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010026217 Malate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 206010029719 Nonspecific reaction Diseases 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 229930182558 Sterol Natural products 0.000 description 1
- 241001441724 Tetraodontidae Species 0.000 description 1
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 229940022698 acetylcholinesterase Drugs 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000000274 adsorptive effect Effects 0.000 description 1
- 229930013930 alkaloid Natural products 0.000 description 1
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 description 1
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 229920000592 inorganic polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- SZVJSHCCFOBDDC-UHFFFAOYSA-N iron(II,III) oxide Inorganic materials O=[Fe]O[Fe]O[Fe]=O SZVJSHCCFOBDDC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 229920000620 organic polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 239000005373 porous glass Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 150000003432 sterols Chemical class 0.000 description 1
- 235000003702 sterols Nutrition 0.000 description 1
- 230000008719 thickening Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
- G01N33/76—Human chorionic gonadotropin including luteinising hormone, follicle stimulating hormone, thyroid stimulating hormone or their receptors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse vedrører en enzymatisk immunologisk metode ifølge det såkalte "sandwich-prinsipp". Ifølge dette prinsippet bringes substansen som skal bestemmes,hvilken kan være et antigen, et antistoff eller et hapten til omsetning med to immunologisk aktive reaksjonspartnere med etterfølgende adskillelse som angitt i krav l's ingress.
Som regel er en av disse immunologiske aktive reaks jonspartnere bundet til en vannuløselig bærer, mens den andre er forsynt med et egnet enzym. I praksis bringes substansen som skal bestemmes først i en omsetning med den reaksjonspartner som
er bundet til en bærer, hvorpå, etter faseskille og vask den substans som i mellomtiden er immunologisk bundet til bæreren bringes til omsetning med den andre, enzymmerkete reaksjonspartner.
Etter nytt faseskille skjer den enzymatiske reaksjon for kvantitativ påvisning med substansen som skal bestemmes enten
i den faste eller flytende fase.
I DE-OS 27 44 836 blir det beskrevet en immunokjemisk målfremgangsmåte som angår en kombinasjon av sandwich-metoden og den konkurrerende metode og som er særpreget ved at etter omsetning mellom antigenene som skal måles og de uløseliggjorte antistoff blir de merkete antistoff bragt til antigenet av antigen/antistoff-komplekset uten fjerning av reaksjonsblandingen for kontinuerlig omsetning.
I DE-OS 29 25 565 blir det beskrevet en entrinns-sandwich-
måte som blir eksemplifisert ved en radioimmunofremgangsmåte under anvendelse av polyklonale antistoff. Anvendelsen av monoklonale antistoff henh. anvendelse av et monoklonalt antistoff og et polyklonalt antistoff såvel som anvendelsen av en enzymimmunofremgangsmåte blir ved denne publikasjon på ingen måte nærliggende.
Innenfor rammen av foreliggende oppfinnelse fant man nå over-raskende at man i motsetning til den tidligere oppfatning kan arbeide i en "entrinns-metode" ved hvilken substansen som skal bestemmes samtidig bringes til omsetrting med de to immunologisk aktive reaksjonspartnere i en enkel inkubasjon, og den kan også utføres når man som immunologisk reaksjonspartner setter inn to forskjellige monoklonale antistoff og et antistoff fra en forskjellig dyrefamilie.
Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig en enzymatisk immunologisk fremgangsmåte for påvisning hhv. bestemmelse av en substans med en immunologisk aktiv reaksjonspartner, hvilken er utstyrt med et enzym, samt en immunologisk aktiv reaksjonspartner som er eller blir bundet til en vannuløslig bærer, gjennom inkubering av substansen som skal bestemmes
med de immunologisk aktive reaksjonspartnere, etterfølgende adskillelse av fast og flytende fase og måling av graden av enzym-merkLng enten i den faste eller flytende fase som
mål for den mengde av substans som skal bestemmes, hvilken
er særpreget ved de trekk som er angitt i krav l's karakteriserende del .
Som substans som skal bestemmes kan det nevnes alle bestanddeler i fysiologiske væsker, celle- eller vevsekstrakter, for hvilke immunologiske reaksjonspartnere eksisterer eller kan dannes, og som har to eller flere immunologisk aktive punkter. Til disse hører peptider, proteiner, lipoproteiner, glykoproteiner, steroler, steroider, lipoider/ nukleinsyrer, enzymer, hormoner, polysaccarider, alkaloider. Foretrukne immunologisk aktive substanser er de naturlige antigener så som hormoner, enzymer, organspesifikke antigener, bindevevs-komponenter, blodcelleanti-gener, plasmaproteiner, patologiske globuliner. Særlig foretrukne substanser er det carcinoembryo-nale antigen (CEA) samt det humane coriogonadotropin (HCG).
Ved metoden ifølge oppfinnelsen tjener den immunologisk aktive reaksjonspartner, som er forsynt med et enzym, som indikator for den immunologiske reaksjon. Foretrukne enzymer er alkal-isk fosfatase, malat-dehydrogenase, glukose-6-fosfat-dehydrogenase, glucose-oxidase, glucoamylase, galaktosidase og ace-tylcolinesterase. Et særlig foretrukket enzym er peroxidase fra pepperrot.
Enzymet som indikator for den immunologiske reaksjon måles ifølge kjente metoder i den flytende, eller fortrinnsvis i den faste fase, og er et mål for den mengde av substans som skal bestemmes. Ved peroxidasen fra pepperrot som markør, måles fortrinnsvis enzymmengden på grunnlag av den tilstede-værende katalytiske aktivitet, hvilken bestemmes ved hjelp av ^ 2^ 2 °^ o-fenylendiamin som redoxindikator. Derunder måles etter en 30 minutters katalytisk reaksjon fargeintensiteten til den oksyderte redoxindikator fotometrisk.
Den andre immunologisk aktive reaksjonspartner tjener til adskillelsen av substansen som skal bestemmes fra analyse-prøven. For dette adskillelsestrinn kan den andre immunologisk aktive reaksjonspartneren fra begynnelsen av være bundet til en vannuløselig bærer eller kan under eller etter den immunologiske reaksjonen bindes til en tilsvarende bærer.
Som vannuløselig bærer for den andre immunologisk aktive reaksjonspartner er følgende egnet: organiske og uorganiske polymere (amylase, dextraner, opprinnelig eller modifisert cellulose, polyacrylamid, agarose, magnetitt,porøst glass-pulver, polyvinylidenfluorid (Latex), innvendig vegg av forsøksbeholdere (prøverør, titreringsplater eller kyvetter av glass eller kunststoff1 samt overflaten av faste legemer (glass- og plaststav, stav med fortykkelse på enden, stav med vinger eller lameller på enden). Særlig egnede bær-ere for metoden ifølge oppfinnelsen er glass- og plastkuler.
Den andre immunologisk aktive reaksjonspartner kan være fysikalsk eller kjemisk bundet til den vannuløslige bærer (adsorptiv^eller kan, ved1 hjelp av en ytterligere reaks jonspart-ner som på sin side igjen er bundet til en bærer, bindes under eller etter reaksjonen.
Vesentlig for metoden ifølge oppfinnelsen er at substansen
som skal bestemmes har minst to immunologisk aktive punkter (epitoper), hvilke kan gjenkjennes av de to immunologisk aktive reaksjonspartnere, den reaksjonspartner som er bundet til en bærer og den reaksjonspartner som er utstyrt med et enzym,
og kan bringes til reaksjon. Som immunologisk aktive reaksjonspartnere benyttes fortrinnsvis to forskjellige komponenter som riktignok begge reagerer med substansen som skal bestemmes, men hver er rettet mot forskjellige immunologisk aktive punkter. For bestemmelse av antigener er spesielt to antistoffer for dette antigenet egnet, hvilke produseres i to forskjellige dyrearter og som er rettet mot forskjellige epitoper av dette antigenet. Særlig egnet er kombinasjonen av antistoffer av forskjellige kloner eller av monoklonale antistoffer og antist°ffer fra en forskjellig dyreart.
For den immunologiske reaksjon kan prøven med substansen for bestemmelse bli tilsatt direkte eller fortynnet på forhånd, eller være forbehandlet på egnet måte. Til forbehandling kan substansen til bestemmelse bli isolert, anriket eller frigjort for forstyrrende bestanddeler.
Ifølge fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen blir substansen til bestemmelse samtidig bragt til omsetning med den enzym-merkete såvel som den bærerbundete immunologisk aktive reaksjonspartner. Rekkefølgen til reagenstilsetningen er avhengig av arten til det valgte bærersystem. Under arbeidet med en sensibilisert plastik-kule blandes først den enzym-merkete reaksjonspartner sammen med substansen som skal bestemmes i et egnet prøverør og tilsettes deretter kulen som er sensibilisert med den andre reaksjonspartner.
Den immunologiske reaksjonen utføres under bibehold av en optimal pH-verdi som kan ligge mellom 4 og 9 i et egnet puf-fersystem. Foretrukne puffere er f.eks. acetatpuffer, citrat-puffer, fosfatpuffer, tris-puffer, trietanolaminpuffer, borat-puffer eller glycinpuffer. Det kan også anvendes puffer-blandinger.
Den immunologiske reaksjonen skjer fortrinnsvis ved en tempe-ratur mellom 0 og 55°C. Normalt tiltar den immunologiske reak-sjonshastighet med høyere temperaturer, hvor ved like-
vekten raskere oppnås under ellers like forsøksbetingelser.
Inkubasjonen av substansen som skal bestemmes med den enzym-merkete reaksjonspartner og den bærer-bundne reaksjonspartner kan finne sted inntil likevekt oppnås. Den immunologiske reaksjonen kan imidlertid også avbrytes på et tidligere tids-punkt, idet den faste og flytende fase adskilles etter en bestemt inkubasjonsvarighet og graden av enzym-merking bestemmes enten i den flytende eller i den faste fase.
Ved den immunologiske reaksjon kan det treffes tiltak for å stabilisere den immunologiske aktiviteten til reaksjonspart-nerne og substansen som skal bestemmes samt enzymet. Videre kan inkubasjonsløsningen tilsettes bestanddeler så som proteiner og detergenter for å utelukke uspesifikke reaksjon-er, for å redusere hemmende påvirkning eller for-aktivering.
Den nye metoden ifølge foreliggende oppfinnelse er overor-dentlig ømfindtlig og utmerker seg ved at den er enkel å utføre.
De etterfølgende eksempler belyser oppfinnelsen.
EKSEMPLER
Eksempel 1
Kvantitativ bestemmelse av CEA i pasientplasmaer med et monoklonalt CEA- antistoff og et vanlig CEA antistoff ( geit)
I de nødvendige antall prøverør (10 x 75 mm) pipeteres i hvert 0,2 mm prøveløsning (0,2 mol NaH2P04/Na2HPO^, pH 6,5 med 2 g pr. 1 storfeserumalbumin, 20% normalt geiteserum og 0,2 ug/ml geit-anti-CEA-peroxidase-konjugat), 0,050 ml av pasientplasma som skal analyseres hhv. CEA standard (0 ng/ml CEA 2,5 ng/ml CEA, 10 ng/ml og 20 ng/ml CEA) og CEA-kontrollserumet (5,0 ng/ml CEA - 1,0 ng/ml) tilblandes, hvert tilsettes en polystyrenkule (diam.=6,5 mm) sensibilisert med monoklonalt muse anti-CEA og inkuberes ved 3 7°C i 16 timer. Deretter vaskes polystyrenkulene 3 ganger med hver gang 2-5 ml dest. vann, over-føres i 0,5 ml substratpuffer for aktivitetsbestemmelse av peroxidase (0,1 mol/l kaliumcitratpuffer med pH 5,0 med 6 mmol pr. 1 H202 og 20 mmol/1 o-fenylendiamin) og inkuberes 30 min. ved romtemperatur (22°C). For avbrudd av peroksydaseaktivi-teten samt for intensivering av fargeintensiteten tilblandes 2,0 ml IN HC1 og i løpet av 30 min. måles ekstinksjonen ved bølgelengden 4 92 nm fotometrisk målt. I tabell 1 er verdiene for en CEA-bestemmelse oppført og sammenlignet med de verdier man får med radioimmunomålingen til Roche.
x Fremstillingen av monoklonalt muse anti-CEA skjer analogt med den metode som er beskrevet i Journal of Immunological Methods, 32 (1980) 297-304 hvorunder myelomlinjen Sp 2/01-AG anvendes som utgangscellelinje for fusjonen, hvilken er depo-nert under nr. CRL 800 6 hos ATCC. Fusjonen skjer med milt-celler fra mus som er immunisert med CEA. Immuniseringen av musene skjedde analogt til tabell 1 i den nevnte publikasjon, hvorunder de første to immuniseringer skjedde begge med 50 ug CEA, immuniseringene 3 og 4 ble utelatt, immunisering 5 med
50 ug CEA og immuniseringene 6-8 alle med 200 ug CEA.
Verdier under 2,5 ng/ml CEA ligger i normalområdet, mens verdier over 2,5 ng/ml ligger i det patologiske området.
Eksempel 2
Kvantitativ bestemmelse av CEA i pasientplasmaer med monoklonale CEA antistoffer fra to forskjellige kloner.
I det nødvendige antall prøverør (10 x 75 mm) pipeteres i hvert 0,2 mm prøveløsning (0,2 mol/l NaH2P04/Na2HP04, pH
6,5 med 2 g/l storfeserumalbumin, 20% normalt geiteserum og 0,15 ug/l monoklonalt mus-anti-CEA-peroxidase-konjugat ), 0,050 ml av pasientplasmaene som skal analyseres hhv. CEA-standardene (0 ng/ml CEA, 2,5 ng/ml CEA, 10 ng/ml CEA og 2 0 ng/ml CEA) og av CEA kontrollserumet (5,0 ng/ml CEA - 1,0 ng/ml) tilblandet, hvert tilsettes en polystyrenkule (diam.= 6,5 mm) sensibilisert med monoklonalt mus-anti-CEA og inkuberes 16 t ved 37°C. Deretter vaskes polystyrenkulene 3 ganger med 2-5 ml dest. vann, overføres i 0,5 ml substratpuffer for aktivitets-bestemmelsen av peroxidase (0,1 mol/l kaliumcitratpuffer med pH 5,0 med 6 mmol/1 H202 og 20 mmol/1 o-fenylendiamin) og inkuberes 3 0 min. ved romtemperatur (22 C). For å avbryte peroxidaseaktiviteten samt for intensivering av fargeintensiteten tilblandes 2,0 ml IN HC1 og i løpet av 3 0 min. måles ekstinksjonen ved bølgelengden 4 92 nm fotometrisk.I tabell III er verdien for en CEA-bestemmelse oppført og sammenlignet med de verdier som erholdtes med radioimmunmålingen fra Roche.
x
Fremstillingen av monoklonalt mus anti-CEA skjer analogt etter den metode som er beskrevet i Journal of Immunological
Méthods, 32 (1980) 297-304, hvorunder myelomlinjen Sp 2/01-Ag anvendes som utgangscellelinje for fusjonen, hvilken er depo-nert under nr. CRL 8006 hos ATCC. Fusjonen skjer med milt-celler av mus som er immunisert med CEA. Immuniseringen av musene fant sted analogt med tabell 1 i den nevnte publikasjon, idet de første to immuniseringer fant sted med 50 ug CEA, immuniseringene 3 og 4 ble utelatt, immunisering 5 med 50 jug CEA
og immuniseringene 6-8 med hver 200 rø CEA- Det anvendes to forskjellige egnede monoklonale antistoffer som er rettet mot forskjellige epitoper av CEA antigener.
Verdier under 2,5 ng/ml CEA ligger i normalområdet, mens verdier over 2,5 ng/ml ligger i det patologiske området.
Eksempel 3
Kvantitativ bestemmelse av HCG 1 serum/ plasma/ urin:
1 det nødvendige antall prøverør (10 x 75 mm) pipeteres 0,2 ml prøveløsning (0,1 mol/l NaH2P04/Na2HP04, pH 7,0 med 2 g/l storfeserumalbumin, og 1,0 ug/ml monoklonal mus-anti-HCG-peroxidase-konjugat<x>), 0,050 ml av pasientplasmaene som skal analyseres hhv. HCG-standardene (0, 25, 50, 100 og 250 mIU/ml HCG) tilblandes, hvert tilsettes en polystyrenkule (diam.= 6,5 mm) sensibilisert med kanin-anti-HCG og inkuberes ved romtemperatur i 16 t i vannmettet atmosfære. Deretter vaskes polystyrenkulene tre ganger med 2--5 ml dest. vann, overføres i 0,5 ml substratpuffer for aktivitetsbestem-melsen av peroxidase (0,1 mol/l kaliumcitratpuffer med pH 5,0 med 6 mmol/1 H202 og 20 mmol/1 o-fenylendiamin) og inkuberes i 30 min. under romtemperatur (16*-30°C) . For å avbryte peroxidaseaktiviteten samt for intensivering av fargeintensiteten tilblandes 2,0 ml IN HC1 og ekstinksjonen måles fotometrisk i løpet av 30 min. med bølgelengden 492 nm. I tabellen er det oppført verdiene av en HCG-bestemmelse i serum og i urin.
x
Fremstilling av monoklonalt anti~-HCG kan skje etter en metode som er beskrevet i Journal of Immunological Methods 32 (1980) 297-304.
HCG bestemmelse i serum og 1 urin.
1. Standardkurver
2. Pasientprøver
Omregning: 1 ng rent HCG tilsvarer ca. 10 mlU HCG.
Eksempel 4
Kvantitativ bestemmelse av HCG i serum med monoklonale HCG- antistoffer fra to forskjellige kloner.
I det nødvendige antall prøverør (10 x 75 mm) pipeteres
0,2 ml prøveløsning (0,1 mol/l NaH2P04/Na2HP04,pH 7,0
med 2 g/l storfeserumalbumin og 1,0 ug/ml monoklonalt mus-anti-HCG-peroxidase-konjugat jf),0,050 ml av pasientplasmaene som skal analyseres hhv. HCG-standardene (0, 25, 50, 100 og 200 mIU/ml HCG) tilblandes, hver tilføres en polystyrenkule ) (diam. = 6,5.mm) sensibilisert med monoklonalt mus-anti-HCG og inkuberes f.eks. i 2 timer ved 3 7°C. Deretter vaskes polystyrenkulene tre ganger med hver 2-5 ml dest. vann, overføres i 0,5 ml substratpuffer for aktivitetsbestemmelse av peroxidase (0,1 mol/l kaliumcitratpuffer med pH 5,0 med 6 mmol/1 H202 og 20 mmol/1 o^fenylendiamin)
og inkuberes i 30 min. ved romtemperatur (16-30 C). For å avbryte peroxidaseaktiviteten samt for intensivering av fargeintensiteten tilblandes 1,0 ml 2N HC1 og ekstinksjonen måles fotometrisk ved bølgelengden 492 nm i løpet av 30 min. I tabellen er verdiene for HCG-bestemmelsene i serum opp-ført.
Fremstillingen av monoklonale mus-HCG-antistoffer skjer ifølge den metode som er beskrevet i Journal of Immunological Meitods, 32 (1980) 297-304. Det anvendes to forskjellige egnede monoklonale antistoffer som er rettet mot forskjellige epitoper av HCG-antigenet.
HCG bestemmelse i humanserum (Middelverdi fra dobbel-bestemmeIsene)
j^ Standardkurver
HCG-verdiene til de nedenfor anførte eksempler fra pasientsera ble avlest fra standardkurven 1). Standardkurvene 2), 3) og 4) ble målt på en annen dag med nye HCG standarder.
2. Pasientsera
Claims (6)
1. Immunologisk fremgangsmåte ved påvisning henholdsvis bestemmelse av en substans med en immunologisk aktiv reaksjonspartner, hvilken er forsynt med et enzym, samt en immunologisk aktiv reaksjonspartner, som er eller blir bundet til en vannuløselig bærersubstans ved inkubering med substansen til bestemmelse med den immunologisk aktive reaksjonspartner, med etterfølgende adskillelse av fast og flytende fase og måling av graden av enzymmerking enten i den faste eller flytende fase som mål for mengden av substans til bestemmelse, karakterisert ved at det blir satt inn som immmunologisk aktiv reaksjonspartner to forskjellige monoklonale antistoff eller et monoklonalt antistoff og et antistoff av en forskjellig dyregruppe som blir inkubert fra begynnelsen sammen med substansen til bestemmelse.
2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at substansen til bestemmelse er et antigen.
3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at substansen til bestemmelse er karcinoembryonalt antigen (CEA).
4. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at den immunologisk aktive reaksjonspartner som er bundet til en vannuløselig bæresubstans, er monoklonalt muse-anti-CEA og ved at den immunologisk aktive reaksjonspartner som er utstyrt med en markør, enten er et peroksydase-merket andre monoklonalt muse-anti-CEA eller et peroksydase-merket geite-anti-CEA.
5. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at antigenet er HCG.
6. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at den immunologisk aktive reaksjonspartner som er bundet til en vannuløselig bæresubstans, er kanin-anti-HCG, og ved at den immunologisk aktive reaksjonspartner som er utstyrt med en markør, er peroksydase-merket monoklonalt muse-anti-HCG.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CH320980A CH642458A5 (en) | 1980-04-25 | 1980-04-25 | Immunological method |
| CH589880A CH651396A5 (en) | 1980-08-04 | 1980-08-04 | Immunological method for detecting and determining carcinoembryonic antigen |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO811407L NO811407L (no) | 1981-10-26 |
| NO159620B true NO159620B (no) | 1988-10-10 |
| NO159620C NO159620C (no) | 1989-01-18 |
Family
ID=25692464
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO811407A NO159620C (no) | 1980-04-25 | 1981-04-24 | Immunologisk bestemmelsesmetode. |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| AT (1) | AT373398B (no) |
| AU (1) | AU542563B2 (no) |
| CA (1) | CA1160566A (no) |
| DE (1) | DE3115115A1 (no) |
| DK (1) | DK151399C (no) |
| FR (1) | FR2481318A1 (no) |
| GB (1) | GB2074727B (no) |
| IT (1) | IT1137344B (no) |
| NL (1) | NL187545B (no) |
| NO (1) | NO159620C (no) |
| SE (1) | SE460930B (no) |
Families Citing this family (35)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0146654A3 (en) * | 1980-06-20 | 1986-08-20 | Unilever Plc | Processes and apparatus for carrying out specific binding assays |
| US6406920B1 (en) | 1980-06-20 | 2002-06-18 | Inverness Medical Switzerland Gmbh | Processes and apparatus for carrying out specific binding assays |
| EP0044219A1 (en) * | 1980-07-16 | 1982-01-20 | Unilever Plc | Methods of immuno analysis using monoclonal antibodies |
| US4486530A (en) * | 1980-08-04 | 1984-12-04 | Hybritech Incorporated | Immunometric assays using monoclonal antibodies |
| US4879219A (en) * | 1980-09-19 | 1989-11-07 | General Hospital Corporation | Immunoassay utilizing monoclonal high affinity IgM antibodies |
| DE3174064D1 (en) * | 1980-10-15 | 1986-04-17 | Takeda Chemical Industries Ltd | Method for immunochemical assay and kit therefor |
| US4837167A (en) * | 1981-01-30 | 1989-06-06 | Centocor, Inc. | Immunoassay for multi-determinant antigens using high-affinity |
| GB2118300B (en) * | 1982-02-12 | 1985-06-19 | Corning Glass Works | Method of immunoassay |
| DK76983A (da) * | 1982-03-05 | 1983-09-06 | Takeda Chemical Industries Ltd | Fremgangsmaade og reagens til immunkemisk bestemmelse af humant choriogonadotropin |
| DE3225027A1 (de) * | 1982-07-05 | 1984-01-05 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Immunchemisches messverfahren |
| IL73938A (en) * | 1984-01-02 | 1989-09-28 | Boehringer Mannheim Gmbh | Process and reagent for the determination of polyvalent antigen by incubation with three different receptors |
| US4690890A (en) * | 1984-04-04 | 1987-09-01 | Cetus Corporation | Process for simultaneously detecting multiple antigens using dual sandwich immunometric assay |
| US5011771A (en) * | 1984-04-12 | 1991-04-30 | The General Hospital Corporation | Multiepitopic immunometric assay |
| US4935339A (en) * | 1985-05-07 | 1990-06-19 | Nichols Institute Diagnostics | Delayed solid phase immunologic assay |
| US5770459A (en) * | 1986-04-30 | 1998-06-23 | Igen International, Inc. | Methods and apparatus for improved luminescence assays using particle concentration, electrochemical generation of chemiluminescence detection |
| DE3638767A1 (de) * | 1986-11-13 | 1988-05-26 | Behringwerke Ag | Laktoferrin enthaltendes inkubationsmedium fuer festphasenimmunometrisches verfahren und seine verwendung |
| US5935779A (en) * | 1988-11-03 | 1999-08-10 | Igen International Inc. | Methods for improved particle electrochemiluminescence assay |
| US6881589B1 (en) | 1987-04-30 | 2005-04-19 | Bioveris Corporation | Electrochemiluminescent localizable complexes for assay compositions |
| US5190861A (en) * | 1987-08-25 | 1993-03-02 | Fuji Yakuhin Kogyo Kabushiki Kaisha | Method for the diagnosis of rheumatoid arthritis |
| KR920002182B1 (ko) * | 1987-10-30 | 1992-03-19 | 후지야쿠힝 고오교오 가부시끼가이샤 | 간장암질환의 진단법 |
| DE3807440A1 (de) * | 1988-03-07 | 1989-09-21 | Progen Biotechnik Gmbh | Verfahren zum immunologischen nachweis von substanzen sowie eine derartige zusammensetzung und ein testkit |
| US5705402A (en) * | 1988-11-03 | 1998-01-06 | Igen International, Inc. | Method and apparatus for magnetic microparticulate based luminescence assay including plurality of magnets |
| US5798083A (en) * | 1988-11-03 | 1998-08-25 | Igen International, Inc. | Apparatus for improved luminescence assays using particle concentration and chemiluminescence detection |
| US5746974A (en) * | 1988-11-03 | 1998-05-05 | Igen International, Inc. | Apparatus for improved luminescence assays using particle concentration, electrochemical generation of chemiluminescence and chemiluminescence detection |
| US5962218A (en) * | 1988-11-03 | 1999-10-05 | Igen International Inc. | Methods and apparatus for improved luminescence assays |
| US5779976A (en) * | 1988-11-03 | 1998-07-14 | Igen International, Inc. | Apparatus for improved luminescence assays |
| ES2131497T3 (es) * | 1988-12-12 | 1999-08-01 | Csl Ltd | Inmunoensayo en fase solida con conjugado marcado. |
| US5176999A (en) * | 1989-12-07 | 1993-01-05 | Eastman Kodak Company | Buffered wash composition, insolubilizing composition, test kits and method of use |
| ZA92803B (en) | 1991-02-06 | 1992-11-25 | Igen Inc | Method and apparatus for magnetic microparticulate based luminescene asay including plurality of magnets |
| US6201109B1 (en) | 1993-01-13 | 2001-03-13 | Dade Behring Marburg Gmbh | Assay for bone alkaline phosphatase |
| FR2710410B1 (fr) * | 1993-09-20 | 1995-10-20 | Bio Merieux | Procédé et dispositif pour la détermination d'un analyte dans un échantillon . |
| ATE310247T1 (de) * | 1994-02-19 | 2005-12-15 | Seikagaku Kogyo Co Ltd | Verfahren zur bestimmung von normalem aglycan, bestimmungssatz und verfahren zur beurteilung von informationen bezüglich der gelenke |
| EP1030179B1 (en) | 1998-09-01 | 2005-11-09 | Taiho Pharmaceutical Company Limited | Method for assaying human thymidylate synthase and assay kit |
| EP1169647B1 (en) | 1999-04-12 | 2007-06-20 | Sumitomo Chemical Company, Limited | Method for analyzing the amount of intraabdominal adipose tissue |
| KR101385384B1 (ko) | 2005-06-03 | 2014-04-14 | 보드 오브 리전츠 오브 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템 | 단일 패러데이 전극에서의 전기발생 화학발광 및 전기화학 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1572220A (en) * | 1976-10-07 | 1980-07-30 | Mochida Pharm Co Ltd | Immunochemical process of measuring physiologically active substances |
| GB1549069A (en) * | 1976-12-10 | 1979-08-01 | Erba Farmitalia | Enzyme linked immunoassay |
| US4244940A (en) * | 1978-09-05 | 1981-01-13 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Single-incubation two-site immunoassay |
| GB2107053A (en) * | 1980-06-20 | 1983-04-20 | Unilever Plc | Processes and apparatus for carrying out specific binding assays |
-
1981
- 1981-03-23 CA CA000373607A patent/CA1160566A/en not_active Expired
- 1981-04-06 DK DK155881A patent/DK151399C/da not_active IP Right Cessation
- 1981-04-13 IT IT21122/81A patent/IT1137344B/it active
- 1981-04-14 DE DE19813115115 patent/DE3115115A1/de active Granted
- 1981-04-15 NL NLAANVRAGE8101860,A patent/NL187545B/xx not_active Application Discontinuation
- 1981-04-22 SE SE8102558A patent/SE460930B/sv not_active IP Right Cessation
- 1981-04-23 FR FR8108105A patent/FR2481318A1/fr active Granted
- 1981-04-24 AT AT0186481A patent/AT373398B/de not_active IP Right Cessation
- 1981-04-24 GB GB8112730A patent/GB2074727B/en not_active Expired
- 1981-04-24 AU AU69811/81A patent/AU542563B2/en not_active Expired
- 1981-04-24 NO NO811407A patent/NO159620C/no not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE3115115C2 (no) | 1987-02-12 |
| FR2481318B1 (no) | 1984-10-19 |
| DK151399B (da) | 1987-11-30 |
| ATA186481A (de) | 1983-05-15 |
| DK155881A (da) | 1981-10-26 |
| NL187545B (nl) | 1991-06-03 |
| AT373398B (de) | 1984-01-10 |
| DE3115115A1 (de) | 1982-02-04 |
| NL8101860A (nl) | 1981-11-16 |
| DK151399C (da) | 1988-09-05 |
| IT8121122A0 (it) | 1981-04-13 |
| SE8102558L (sv) | 1981-10-26 |
| GB2074727B (en) | 1983-11-30 |
| GB2074727A (en) | 1981-11-04 |
| IT1137344B (it) | 1986-09-10 |
| FR2481318A1 (fr) | 1981-10-30 |
| AU542563B2 (en) | 1985-02-28 |
| NO159620C (no) | 1989-01-18 |
| SE460930B (sv) | 1989-12-04 |
| NO811407L (no) | 1981-10-26 |
| AU6981181A (en) | 1981-10-29 |
| CA1160566A (en) | 1984-01-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| NO159620B (no) | Immunologisk bestemmelsesmetode. | |
| JPH0239747B2 (no) | ||
| Kurstak | Progress in enzyme immunoassays: production of reagents, experimental design, and interpretation | |
| US4228237A (en) | Methods for the detection and determination of ligands | |
| US4661444A (en) | Homogeneous immunoassays employing double antibody conjugates comprising anti-idiotype antibody | |
| US4467031A (en) | Enzyme-immunoassay for carcinoembryonic antigen | |
| JP2599058B2 (ja) | クラス特異的な免疫グロブリン抗体の免疫分析法 | |
| EP0315364A2 (en) | Simultaneous immunoassay for the determination of antigens and antibodies | |
| EP2458378B1 (en) | Insulin measurement method | |
| CA1256025A (en) | Immuno-chemical measurement process for haptens and proteins | |
| JP3363466B2 (ja) | 酵素結合体を安定化する方法 | |
| US5804391A (en) | Elimination of rheumatoid factor interference using anti-FD antibodies | |
| EP0062892B1 (en) | Single incubation immunochemical assay for creatin phosphokinase mb | |
| EP0008473A1 (en) | Method for the detection and/or determination of an antigen specific immunoglobulin, immuno-reagents to be used in said method and test kit for said determination | |
| JPH081438B2 (ja) | 酵素免疫測定法 | |
| EP0212522A2 (en) | Method for the measurement of TSH | |
| EP3531129B1 (en) | Immunoassay method using anti-human bnp fragment (4-32) antibody | |
| EP0303980A2 (en) | Carrier coated with antigen or antibody | |
| EP0918218A2 (en) | Method for immunological assay | |
| US4812395A (en) | Method for detecting enzymatic activity using particle agglutination | |
| US5137807A (en) | Method for determining beta-subunit of human prolyl 4-hydroxylase by immunoassay to detect hepatic disease | |
| JPH03170058A (ja) | イムノアッセイ用試薬複合体 | |
| Clarke | Immunoassays for therapeutic drug monitoring and clinical toxicology | |
| JPS61245060A (ja) | ヒト補体１ｑ定量用キツト及び定量法 | |
| Terouanne et al. | Centrifugal analyzer used for enzyme immunoassay of progesterone and choriomammotropin. |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MK1K | Patent expired |
Free format text: EXPIRED IN APRIL 2001 |