JP2013253247A

JP2013253247A - 発色剤の安定化剤およびその用途

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Publication number: JP2013253247A
Application number: JP2013146029A
Authority: JP
Inventors: Satoshi Yonehara; 聡米原; Norio Inamura; 範郎稲村
Original assignee: Arkray Inc
Current assignee: Arkray Inc
Priority date: 2008-03-19
Filing date: 2013-07-12
Publication date: 2013-12-19
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Also published as: EP2270105A4; US8758648B2; US20110015391A1; JP5616498B2; CN103540156B; WO2009116575A1; CN101959965A; EP2270105A1; EP2543706A2; EP2543706A3; JPWO2009116575A1; CN103540156A; EP2543706B1

Abstract

【課題】１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン塩またはその誘導体を保存時に安定化可能な安定化剤を提供する。
【解決手段】下記（１）および（２）の少なくとも一方の化合物を、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン塩またはその誘導体の安定化剤として使用する。（１）炭素数８〜１６のアルキル基を有する界面活性剤（２）下記式（Ｉ）で表される化合物、下記式（II）で表される化合物およびフラボノイド系色素からなる群から選択される少なくとも一つの色素物質。Ｒ^１−Ｎ＝Ｎ−Ｒ^２・・・（Ｉ）

【選択図】なし

Description

本発明は、発色剤である１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンもしくはその誘導体、またはその塩を安定化する安定化剤およびその用途に関する。

目的成分の測定（定性、定量）方法として、酸化還元反応を利用した酵素法が広く実用されている。この方法は、例えば、測定する目的成分から酸化物質を生成させ、この酸化物質と酸化により発色化合物を生成する発色剤とを、酸化酵素によって反応させ、生じた発色の吸光度を測定する方法である。この方法において、吸光度の大きさは、生成した発色化合物の量に相当し、生成した前記発色化合物の量は、生成した酸化物質の量に相当し、前記酸化物質の量は、目的成分の量に相当する。つまり、生じた発色（生成した発色化合物）の検出によって、このような酸化還元反応を介して、間接的に目的成分を測定できる。

このような酸化により発色する発色剤として、発色団であるメチレンブルーを酸化により遊離する、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンが知られている。この発色剤は、メチレンブルーが再還元により退色し難いことから、高感度の検出が可能であり、様々な分析への使用が期待されている。

この発色剤は、例えば、前述のような酸化還元反応に使用するにあたって、例えば、取り扱い性が容易であることから、水や緩衝液等の溶媒に溶解した液体試薬（ウェット系）として使用時まで保存される。また、試料を添加するのみで前記酸化還元反応を開始できるように、前記発色剤を多孔質体等の基材に固定化させた試験片（ドライ系）として使用時まで保存されている。しかしながら、この発色剤は、非常に不安定であり、前述のように、酵素の添加による人為的な酸化還元反応の開始前、すなわち、保存時において自然発色が生じてしまうという問題がある。この原因としては、例えば、前記ウェット系の場合、前記溶媒中で前記発色剤が不安定になること、ドライ系の場合、空気中の水分を吸収することで、前記発色剤が不安定になること等が推測されている。また、ウェット系およびドライ系のいずれにかかわらず、紫外線等の光照射条件下で保存した場合にも、前記発色剤は、不安定化して自然発色が生じることが問題視されている。

このように、前記発色剤が自然発色すると、実際の使用時において、自然発色によるメチレンブルーの遊離が原因となり、吸光度測定におけるバックグラウンドが上昇し、測定精度が低下するおそれがある。特に、前記発色剤において、遊離したメチレンブルーは、前述のように退色し難いという性質を有する。このため、高感度というメリットを有するものの、一方では、他の発色団と比較して、自然酸化により遊離した発色団（メチレンブルー）についても退色し難いため、その影響を回避することが困難という問題がある。前記発色剤を液体状態で保存した場合、例えば、約１日程度で、測定に影響を及ぼす自然発色が確認され、約３日程度で分析用試薬としての使用が困難となる（特許文献１）。

このような自然発色による影響を防止するには、測定の度に、前記発色剤の試薬を調製することが必要になるが、これでは操作が煩雑になり、コストもかかってしまう。
特開平４−２７８３９

そこで、本発明は、例えば、水分存在下や光照射の条件下であっても、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンもしくはその誘導体、またはその塩を安定化可能な安定化剤の提供を目的とする。

本発明の安定化剤は、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンもしくはその誘導体、またはその塩の安定化剤であって、下記（１）および（２）の少なくとも一方の化合物を含むことを特徴とする。
（１）炭素数８〜１６のアルキル基を有する界面活性剤
（２）下記式（Ｉ）で表される化合物、下記式（II）で表される化合物およびフラボノイド系色素からなる群から選択される少なくとも一つの色素物質
Ｒ^１−Ｎ＝Ｎ−Ｒ^２・・・（Ｉ）
前記式（Ｉ）において、

Ｒ^１およびＲ^２において、
Ｘは、水素、ハロゲン、ナトリウムまたはカリウムであり、各Ｘは、同一でも異なってもよく、
Ｙは、水素またはＳＯ_３Ｘであり、各Ｙは同一でも異なっていても良く、
Ｚは、水素、メチル基またはメトキシ基であり、各Ｚは同一でも異なっていても良い。

前記式（II）において、
Ｘは、水素、ハロゲン、ナトリウムまたはカリウムであって、各Ｘは、同一でも異なっていても良く、
Ｙは、水素、ハロゲン、ナトリウムまたはカリウムであって、各Ｙは、同一でも異なっていても良い。

本発明の発色試薬は、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンもしくはその誘導体、またはその塩を含む発色試薬であって、さらに、本発明の安定化剤を含むことを特徴とする。

本発明の安定化方法は、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンもしくはその誘導体、またはその塩を安定化する方法であって、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン塩またはその誘導体と本発明の安定化剤とを共存させることを特徴とする。

本発明の保存方法は、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンもしくはその誘導体、またはその塩の保存方法であって、本発明の安定化方法により安定化させた状態で保存することを特徴とする。

本発明の発色反応用キットは、発色剤として、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンもしくはその誘導体、またはその塩を含み、さらに、本発明の安定化剤とを含むことを特徴とする。

本発明において、前記１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンもしくはその誘導体、またはその塩は、特に示さない限り、「発色剤」ともいう。

本発明者らは、鋭意研究の結果、前述の（１）または（２）の化合物によれば、前記発色剤と共存させることで、前記発色剤の自然発色を抑制できることを見出した。このため、本発明の安定化剤を用いれば、自然発色を抑制し、前記発色剤を安定化でき、これによって従来困難であった前記発色剤の保存も可能となる。また、本発明の安定化方法によれば、例えば、高感度測定が可能な前記発色剤の自然発色を防止することで、安定化を向上できるため、前記発色剤の適用範囲を、さらに広げることができる。したがって、本発明は、例えば、臨床検査等において極めて有用といえる。

本発明において、「前記発色剤の安定化」とは、例えば、前記発色剤の自然発色を抑制すること、および、前記発色剤の発色剤としての機能を維持すること等を意味する。本発明の安定化剤は、不安定な前記発色剤の自然発色を抑制できることから、前記発色剤の自然発色抑制剤ということもできる。

本発明において、前記発色剤は、前述のように、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンもしくはその誘導体、またはその塩である。１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンは、下記式で表わされ、酸化されるとメチレンブルーを遊離して、これにより発色を示す。１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン塩は、例えば、商品名ＤＡ−６７として和光純薬から入手可能である。前記１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンの誘導体は、特に制限されず、例えば、発色するメチレンブルーまたは発色するメチレンブルー誘導体を、酸化により遊離するものであればよい。具体的には、例えば、下記式において、水素原子が、ハロゲンまたは水酸基等に置換された誘導体等があげられる。また、前記塩は、特に制限されず、前記塩のカウンターイオンとしては、例えば、ナトリウム、カリウム等の一価金属イオンがあげられる。

前記発色剤は、一般的に、試料中の目的成分を、酸化還元反応を利用して検出する際に使用される。前記発色剤は、例えば、反応系に添加すると、前記発色剤と前記反応系における酸化物質との酸化還元反応により、フェノチアジン誘導体色素であるメチレンブルーを生成（遊離）する。この遊離したメチレンブルーの量は、酸化物質の量に相当することから、遊離したメチレンブルーの有無や量を検出することによって、反応系における酸化物質の有無または量を判断できる。前記酸化物質は、例えば、検出対象となる目的成分から酸化還元反応によって生成させればよい。また、目的成分が酸化物質の場合は、これをそのまま前記発色剤と反応させてもよいし、目的成分からさらに酸化物質を生成させ、これと前記発色剤とを反応させてもよい。

本発明の安定化剤は、前述のように、前記発色剤を安定化するための安定化剤であって、下記（１）および（２）の少なくとも一方の化合物を含むことを特徴とする。
（１）炭素数８〜１６のアルキル基を有する界面活性剤
（２）前記式（Ｉ）で表される化合物、前記式（II）で表される化合物およびフラボノイド系色素からなる群から選択される少なくとも一つの色素物質

本発明の安定化剤は、例えば、さらに、下記（３）および（４）の少なくとも一方の化合物を含んでもよい。
（３）炭素数１２以上の炭化水素基を有する第４級アンモニウムまたはその塩
（４）β−シクロデキストリンまたはその誘導体

前記（１）の界面活性剤は、前記発色剤のフェノチアジン骨格との疎水性結合により、前記発色剤からのメチレンブルーの遊離を抑制していると推測される。また、前記（２）の色素物質は、フェノチアジン骨格の３位および７位のジメチルアミノ基に作用して、前記発色剤からのメチレンブルーの遊離を抑制していると推測される。なお、本発明は、これらのメカニズムにより、何ら制限されない。

前記（３）の第４級アンモニウムは、前記発色剤のカルボニル基とのイオン結合および前記発色剤のフェノチアジン骨格との疎水結合によって、前記発色剤からのメチレンブルーの遊離を抑制していると推測される。また、前記（４）のβ−シクロデキストリンは、前記発色剤を抱合することで、前記発色剤からのメチレンブルーの遊離を抑制していると推測される。なお、本発明は、これらのメカニズムにより、何ら制限されない。

以下に、前記（１）〜（４）の化合物について、それぞれ説明する。

（１）界面活性剤
本発明において前記界面活性剤は、炭素数８〜１６のアルキル基を有する界面活性剤である。前記アルキル基は、例えば、直鎖アルキル基、分枝鎖アルキル基、シクロアルキル基等の置換アルキル基、アルコキシアルキル基等があげられ、また、直鎖アシル基、分枝鎖アシル基等も含む。前記界面活性剤としては、例えば、下記式（IV）で表される化合物等があげられる。
Ｒ−Ｘ・・・（IV）

前記式（IV）において、Ｒは、例えば、炭素数が８以上または９以上のアルキル基もしくは置換アルキル基、または、アシル基もしくは置換アシル基である。具体例としては、炭素数９〜１６の直鎖アルキル基もしくは直鎖アシル基、炭素数１０〜４０であり主鎖炭素数が９〜１６である分枝鎖アルキル基もしくは分枝鎖アシル基、または、シクロアルキルで置換された直鎖アルキル基（例えば、シクロアルキルの炭素数が３〜８であり、シクロアルキルを除く直鎖の炭素数が４〜１３）等があげられる。前記シクロアルキルは、例えば、シクロヘキシル、シクロペンチル、シクロブチル等があげられる。

前記式（IV）において、Ｘは、糖残基であり、例えば、単糖または二糖の残基であることが好ましい。前記単糖としては、例えば、マンノシド、グルコシド、チオグルコシド等、二糖としては、例えば、マルトシド、フルクトピラノシル−グルコピラノシド、チオマルトシド、スクロース等があげられる。これらの糖の構造は、α、β、Ｄ、Ｌのいずれでもよい。また、糖の環式構造に結合する水素や、ＯＨ基の水素は、例えば、Ｎａ、Ｋ等の一価金属、ハロゲン等で置換されてもよい。なお、本発明において、前記Ｒと糖残基の環式構造との結合を介している原子（例えば、−Ｏ−、−Ｓ−等）は、糖残基の構成要素とする。

本発明における前記界面活性剤の具体例としては、例えば、
ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド（ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド）、
６−シクロヘキシルヘキシル−β−Ｄ−マルトシド、
スクロースモノラウレート（β−Ｄ−フルクトピラノシル−α−Ｄ−グルコピラノシドモノドデカノエート）、
ｎ−デシル−β−Ｄ−マルトシド（ｎ−デシル−β−Ｄ−マルトピラノシド）、
ｎ−ノニル−β−Ｄ−チオマルトシド（ｎ−ノニル−β−Ｄ−チオマルトピラノシド）、
５−シクロヘキシルペンチル−β−Ｄ−マルトシド、
ウンデシル−β−Ｄ−マルトシド、
ｎ−ドデシル−α−Ｄ−マルトシド、
ヘキサデシル−β−Ｄ−マルトシド、および、
３−オキサトリデシル−α−Ｄ−マンノシド等があげられる。これらの化合物の化学式を以下に示す。本発明において、前記界面活性剤は、いずれか一種類でもよいし、二種類以上を併用してもよい。

これらの中でも、前記式（IV）におけるＲ（アルキル鎖またはアシル基）の炭素数が１２以上である、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド、スクロースモノラウレート、ヘキサデシル−β−Ｄ−マルトシド等が好ましい。また、Ｒの炭素数が同じ場合（例えば、炭素数が同じアルキル基またはアシル基）、前記Ｒは、アシル基が好ましい。前記界面活性剤としては、例えば、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド（ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド）が好ましい。

（２）色素物質
本発明における化合物（２）は、前記式（Ｉ）で表される化合物、前記式（II）で表される化合物およびフラボノイド系色素からなる群から選択される少なくとも一つの色素物質である。

前記色素物質としては、例えば、前記式（Ｉ）で表される化合物、前記（II）で表される化合物および前記フラボノイド系色素のうち、いずれか一種類でもよいし、いずれか二種類を併用してもよいし、三種類全てを併用してもよい。

Ｒ^１−Ｎ＝Ｎ−Ｒ^２・・・（Ｉ）
前記式（Ｉ）において、

Ｒ^１およびＲ^２において、
Ｘは、水素、ハロゲン、一価金属（例えば、ナトリウムまたはカリウム）であり、各Ｘは、同一でも異なってもよく、
Ｙは、水素またはＳＯ_３Ｘであり、前記Ｙは、同一でも異なってもよく、
Ｚは、水素、メチル基またはメトキシ基であり、各Ｚは同一でも異なっていても良い。また、各式において、水素は、ハロゲン、一価金属（ナトリウムまたはカリウム等）等に置換されてもよい（以下、同様）。

前記式（Ｉ）で表される色素物質の具体例としては、例えば、以下の化合物があげられる。

前記式（２）において、Ｒ^２は、例えば、下記式（５）が好ましく、前記式（３）において、Ｒ^２は、例えば、下記式（６）が好ましく、前記式（４）において、Ｚは、例えば、それぞれ、メチル基と、メトキシ基であることが好ましく、Ｒ^２は、下記式（５）が好ましい。

前記式（Ｉ）で表される色素物質としては、例えば、
５−ヒドロキシ−１−（４−スルホフェニル）−４−（４−スルホフェニルアゾ）ピラゾール−３−カルボン酸またはその塩（例えば、三ナトリウム塩）、
６−ヒドロキシ−５−（４−スルホフェニルアゾ）−２−ナフタレンスルホン酸またはその塩（例えば、二ナトリウム塩）、
３−ヒドロキシ−４−（４−スルホナフチルアゾ）−２，７−ナフタレンジスルホン酸またはその塩（例えば、三ナトリウム塩）、
６−ヒドロキシ−５−[（２−メトキシ−５−メチル−４−スルホナトフェニル）ジアゼニル]ナフタレン−２−スルホン酸またはその塩（例えば、二ナトリウム塩）、
７−ヒドロキシ−８−（４−スルホナフチルアゾ）−１，３−ナフタレンジスルホン酸もしくはその塩（例えば、三ナトリウム塩）またはその水和物（例えば、１１／２水和物）等があげられる。これらの塩や水和物としては、例えば、市販品が使用でき、これらの色素物質は、食用であってもよいし、非食用であってもよい。具体例としては、以下のものがあげられる。
黄色３号
別名：タートラジン、ＦＤ＆ＣＹｅｌｌｏｗＮｏ．５
化学名：５−ヒドロキシ−１−（４−スルホナトフェニル）−４−［（４−スルホナトフェニル）ジアゼニル]−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸三ナトリウム塩
黄色５号
別名：ＳｕｎｓｅｔＹｅｌｌｏｗＦＣＦ
化学名：６−ヒドロキシ−５−（４−スルホナトフェニルアゾ）−２−ナフタレン−２−スルホン酸二ナトリウム塩
赤色２号
別名：Ａｍａｒａｎｔｈ
化学名：３−ヒドロキシ−４−（４−スルホナト−１−ナフチルアゾ）−２，７−ナフタレンジスルホン酸三ナトリウム
赤色４０号
別名：ＡｌｌｕｒａＲｅｄＡＣ
化学名：６−ヒドロキシ−５−[（２−メトキシ−５−メチル−４−スルホナトフェニル）ジアゼニル]ナフタレン−２−スルホン酸二ナトリウム
赤色１０２号
別名：ＮｅｗＣｏｃｉｎｅ
化学名：７−ヒドロキシ−８−（４−スルホナト−１−ナフチルアゾ）−１，３−ナフタレンジスルホン酸三ナトリウム１・１／２水和物

前記式（Ｉ）で表される色素物質は、例えば、いずれか一種類でもよいし、二種類以上を併用してもよい。

前記式（II）において、
Ｘは、水素、ハロゲン、一価金属（例えば、ナトリウムまたはカリウム）であって、各Ｘは、同一でも異なっていても良く、
Ｙは、水素、ハロゲン、一価金属（例えば、ナトリウムまたはカリウム）であって、各Ｙは、同一でも異なっていても良い。

また、前記式（II）で表される色素物質としては、例えば、
３’，６’−ジヒドロキシ−２’，４’，５’，７’−テトラヨードスピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−（９Ｈ）キサンテン］−３−オンもしくはその塩（例えば、二ナトリウム塩）または水和物（例えば、一水和物）、
３’，６’−ジヒドロキシ−２’，４’，５’，７’−テトラブロモ−４，５，６，７，−テトラクロロスピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オンまたはその塩（例えば、二ナトリウム塩）、
４，５，６，７−テトラクロロ−３’，６’−ジヒドロキシ−２’，４’，５’，７’−テトラヨードスピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサンテン］−３−オンまたはその塩（例えば、二ナトリウム塩）、
２，４，５，７−テトラブロモ−３，６−ジヒドロキシキサンテン−９−スピロ−１’−３Ｈ−イソベンゾフラン−３’−オンまたはその塩（例えば、二ナトリウム塩）、
３，６−ジヒドロキシキサンテン−９−スピロ−１'−３’Ｈ−イソベンゾフラン−３’−オンまたはその塩（例えば、二ナトリウム塩）
等があげられる。
これらの塩や水和物としては、例えば、市販品が使用でき、これらの色素物質は、食用であってもよいし、非食用であってもよい。具体例としては、以下のものがあげられる。
赤色３号
別名：Ｅｒｙｔｈｒｏｓｉｎｅ
化学名：２’，４’，５’，７’−テトラヨード−３’，６’−ジヒドロキシキサンテン−９−スピロ−１‘−３Ｈ−イソベンゾフラン−３’−オン二ナトリウム
赤色１０４号
別名：赤色１０４−１号、ＰｈｌｏｘｉｎｅＢ
化学名：２,４，５，７−テトラブロモ−３，６−ジヒドロキシキサンテン−９−スピロ−１’−４’，５’，６’，７’−テトラクロル−３’Ｈ−イソベンゾフラン−３’−オン二ナトリウム
赤色１０５号
別名：赤色１０５−１号、ＲｏｓｅＢｅｎｇａｌ
化学名：２,４，５，７−テトラヨード−３，６−ジヒドロキシキサンテン−９−スピロ−１’−４’，５’，６’，７’−テトラクロル−３’Ｈ−イソベンゾフラン−３’−オン二カリウム
赤色２３０−１号
別名：エオシン、アシッドレッド８７
化学名：２’，４’，５’，７’−テトラブロモ−３’，６’−ジヒドロキシキサンテン−９−スピロ−１’−３Ｈ−イソベンゾフラン−３’−オン二ナトリウム
黄色２０２−１号
別名：ウラニン
化学名：３，６−ジヒドロキシキサンテン−９−スピロ−１'−３’Ｈ−イソベンゾフラン−３’−オン二ナトリウム

前記式（II）で表される色素物質は、例えば、いずれか一種類でもよいし、二種類以上を併用してもよい。

前記フラボノイド系色素としては、例えば、フラボノイドや、フラボノイドの重合体等があげられる。前記フラボノイドとしては、例えば、市販のカキ色素（Japanese persimmon color from Diospyros kaki THUMB.）等があげられる。前記カキ色素は、通常、果実から抽出したフラボノイドを主成分とする。また、前記フラボノイドの重合体としては、例えば、市販のカカオ色素（Cacao color from Theobroma cacao LINNE.）等があげられる。前記カカオ色素は、通常、前記フラボノイドの一種であるアントシアニンの重合体を主成分とする。前記アントシアニンの重合体は、例えば、下記式で表される。下記式中、ｎは重合度である。ｎは、特に制限されないが、例えば、５以上であり、好ましくは６以上である。ｎの上限は特に制限されない。Ｒは、配糖体ガラクチュロン酸である。

前記フラボノイド色素は、例えば、いずれか一種類でもよいし、二種類以上を併用してもよい。

本発明において、前記色素物質は、例えば、光照射の条件下で前記発色剤を保存する可能性がある場合に、特に好ましい。この色素物質を前記発色剤と共存させた場合、前記色素物質の存在によって、例えば、発色剤に対する光の照射が遮断されると考えられる。前記発色剤は、光に対して不安定であり、光照射によっても自然発色するおそれがあるため、そのような条件下での保存が考えられる際には、前記色素物質を本発明の安定化剤として使用することが好ましい。

（３）第４級アンモニウムまたはその塩
本発明における化合物（３）は、前述のように、炭素数１２以上の炭化水素基を有する第４級アンモニウムまたはその塩である。以下、「第４級アンモニウム」という。

前記炭化水素基の炭素数は、１２以上であればよく、例えば、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０等があげられる。前記炭素数は、好ましくは、１４以上、１６以上、１７以上であり、その上限は限定されない。前記炭素数の範囲としては、例えば、１４〜１８の範囲、１６〜１８の範囲があげられる。

前記第４級アンモニウムは、例えば、Ｎに連結する４つの炭化水素基のうち、いずれが前記炭素数の炭化水素基であってもよい。前記第４級アンモニウムは、例えば、４つの炭化水素基のうち、１つのみが前記炭素数の炭化水素基であってもよいし、２つ以上が前記炭素数の炭化水素基であってもよいし、３以上が前記炭素数の炭化水素基であってもよいし、全てが前記炭素数の炭化水素基であってもよい。中でも、４つの炭化水素基のうち１つが前記炭素数の炭化水素基である第４級アンモニウムが好ましい。

前記炭化水素基は、例えば、直鎖または分枝鎖のアルキル、環状アルキル、直鎖もしくは分枝鎖または環状であり、置換基を有するアルキルまたは置換基を有するアリール等があげられる。前記置換基は、例えば、互いに同一であっても異なってもよい。前記置換基は、例えば、ハロゲン、直鎖もしくは分枝鎖のアルキル、フェニル、ヒドロキシ、直鎖もしくは分枝鎖のＣ１〜Ｃ６アルコキシ等があげられる。前記アリールは、例えば、フェニル等があげられる。前記環状アルキルは、例えば、シクロヘキシル等があげられる。また、これらに代えて、例えば、直鎖または分枝鎖のアルキルカルボニル等であってもよい。

第４級アンモニウムの具体例としては、例えば、
ベンゼトニウム、
ステアリルトリメチルアンモニウム、
セチルトリメチルアンモニウム、
ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、
ベンザルコニウム、
ベンジルジメチルテトラデシルアンモニウム、
ミリスチルトリメチルアンモニウム、
ラウリルトリメチルアンモニウム
ドデシルトリメチルアンモニウム、または、
ココナットアミンアセテート等があげられる。
また、前記４級アンモニウムの塩としては、例えば、塩化物塩、臭化物塩等があげられ、中でも塩化物塩または臭化物塩が好ましい。これらの具体例としては、例えば、塩化ベンゼトニウム、塩化ステアリルトリメチルアンモニウム、塩化セチルトリメチルアンモニウム、塩化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンジルジメチルテトラデシルアンモニウム、塩化ミリスチルトリメチルアンモニウム、塩化ラウリルトリメチルアンモニウム、塩化ドデシルトリメチルアンモニウム、塩化ココナットアミンアセテート、臭化ベンゼトニウム、臭化ステアリルトリメチルアンモニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、臭化ベンザルコニウム、臭化ベンジルジメチルテトラデシルアンモニウム、臭化ミリスチルトリメチルアンモニウム、臭化ラウリルトリメチルアンモニウム、臭化ドデシルトリメチルアンモニウム、臭化ココナットアミンアセテート等があげられる。

これらの化合物は、いずれか一種類でもよいし、二種類以上を使用してもよい。また、前記炭素数の炭化水素基を有する第４級アンモニウムは、例えば、異なる炭素数の炭化水素基を有するアミンと併用してもよく、炭素数１１以下の炭化水素基を有する第４級アンモニウム等と併用してもよい。

（４）β−シクロデキストリンまたはその誘導体
本発明における化合物（４）は、前述のように、β−シクロデキストリンまたはその誘導体である（以下、「β−シクロデキストリン」という）。前記誘導体としては、例えば、
マルトシル−β−シクロデキストリン、
グルコシル−β−シクロデキストリン、
カルボキシメチル−β−シクロデキストリン、
ジメチル−β−シクロデキストリン、
モノアミノ−β−シクロデキストリン、
２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、
メチル−β−シクロデキストリン、
グルクロニルグルコシル−β−シクロデキストリン、
ヘプタキス（２，６−ジ−Ｏ−メチル）−β−シクロデキストリン、
トリ−Ｏ−メチル−β−シクロデキストリン、
サクシニル−β−シクロデキストリン、
スルホプロピル−β−シクロデキストリン、
サクシニルヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、
トリアセチル−β−シクロデキストリン等があげられる。本発明において、前記β−シクロデキストリンは、一種類でもよいし二種類以上を併用してもよい。

本発明における各化合物は、例えば、その互変異性体または立体異性体（例：幾何異性体、配座異性体および光学異性体等）等の異性体であっても良い。また、前記各化合物は、塩の場合、カウンターイオンは特に制限されないが、例えば、六フッ化リン酸イオン（ＰＦ_６ ⁻）、四フッ化ほう酸イオン（ＢＦ_４ ⁻）、水酸化物イオン（ＯＨ⁻）、酢酸イオン、炭酸イオン、リン酸イオン、硫酸イオン、硝酸イオン、ハロゲン化物イオン、次亜ハロゲン酸イオン、亜ハロゲン酸イオン、ハロゲン酸イオン、過ハロゲン酸イオン、トリフルオロメタンスルホン酸イオン（ＯＳＯ_２ＣＦ_３ ⁻）、テトラキスペンタフルオロフェニルほう酸イオン（Ｂ（Ｃ_６Ｆ_５）_４ ⁻）等のアニオン（陰イオン）があげられる。前記ハロゲン化物イオンとしては、例えば、フッ化物イオン（Ｆ⁻）、塩化物イオン（Ｃｌ⁻）、臭化物イオン（Ｂｒ⁻）、ヨウ化物イオン（Ｉ⁻）等があげられる。前記次亜ハロゲン酸イオンとしては、例えば、次亜フッ素酸イオン、次亜塩素酸イオン、次亜臭素酸イオン、次亜ヨウ素酸イオン等があげられる。前記亜ハロゲン酸イオンとしては、例えば、亜フッ素酸イオン、亜塩素酸イオン、亜臭素酸イオン、亜ヨウ素酸イオン等があげられる。前記ハロゲン酸イオンとしては、例えば、フッ素酸イオン、塩素酸イオン、臭素酸イオン、ヨウ素酸イオン等があげられる。前記過ハロゲン酸イオンとしては、例えば、過フッ素酸イオン、過塩素酸イオン、過臭素酸イオン、過ヨウ素酸イオン等があげられる。

本発明において、「ハロゲン」とは、任意のハロゲン元素を指す。前記ハロゲンとしては、例えば、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素等があげられる。また、本発明において、「アルキル基」とは、例えば、前述のように炭素数を限定しない限り、特に限定されない。前記アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基、オクタデシル基、ノナデシル基、イコシル基等があげられる。また、本発明において、置換基等に異性体が存在する場合は、特に制限がない限り、どの異性体でも良い。例えば、単に「プロピル基」という場合は、ｎ−プロピル基およびイソプロピル基のどちらでも良い。例えば、単に「ブチル基」という場合は、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基およびｔｅｒｔ−ブチル基のいずれでも良い。

本発明の安定化剤は、例えば、前記（１）および（２）の化合物のうち、いずれか一種類のみを含有してもよいし、両方を含有してもよい。また、本発明の安定化剤は、例えば、さらに、前記（３）および（４）の少なくとも一方を含有してもよいし、両方を含有してもよい。本発明の安定化剤が、例えば、前記（１）〜（４）の化合物のうち二種類以上を含有する場合、その組み合わせは、特に制限されないが、例えば、前記（２）および（３）の組み合わせ、前記（２）〜（４）の組み合わせ、前記（１）〜（３）の組み合わせ、前記（１）〜（４）の組み合わせ等があげられる。前記（２）および（３）の組み合わせとしては、例えば、タートラジンと、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムおよび塩化ドデシルヘキサデシルアンモニウムの少なくとも一方との組み合わせが例示できる。また、前記（２）〜（４）の組み合わせとしては、例えば、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムおよび塩化ドデシルヘキサデシルアンモニウムの少なくとも一方と、タートラジンと、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、マルトシル−β−シクロデキストリン、グルコシル−β−シクロデキストリンおよびグロクロニルグルコシル−β−シクロデキストリンからなる群から選択された少なくとも一つとの組み合わせがあげられる。また、前記（１）〜（３）の組み合わせとしては、例えば、ｎ−ドデシル−α，β−マルトシドと、タートラジンと、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムとの組み合わせがあげられる。前記（１）〜（４）の組み合わせとしては、例えば、ｎ−ドデシル−α，β−Ｄ−マルトシドと、タートラジンと、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムおよびドデシルトリメチルアンモニウムの少なくとも一方と、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンとの組合せ等があげられる。

前記安定化剤の形態は、特に制限されず、例えば、液体（ウェット系）でも乾燥体（ドライ系）であってもよい。

本発明の安定化剤の使用方法は、特に制限されず、前記発色剤と共存させればよく、特に、前記発色剤を使用時まで保存する際に、前記発色剤と共存させることが好ましい。前記発色剤をウェット系で保存する場合は、例えば、前記発色剤を添加する溶媒に、本発明の安定化剤を添加すればよい。なお、前記溶媒に対する前記発色剤と前記安定化剤の添加順序は、特に制限されない。また、前記発色剤をドライ系で保存する場合は、例えば、ドライ系の前記発色剤とドライ系の安定化剤とを混合してもよいし、前記発色剤と安定化剤とを含む溶媒を乾燥することによって、ドライ系としてもよい。なお、本発明の安定化剤は、例えば、後述する本発明の発色試薬と同様に使用することができる。

本発明の安定化剤は、前記（１）および（２）の少なくとも一方の化合物に代えて、前記（３）および（４）の化合物を含んでもよい。この場合、前記（３）および（４）の化合物の他に、例えば、前記（１）および（２）の少なくとも一方の化合物を含んでもよい。なお、前記（３）および（４）の化合物を使用する以外は、前述と同様である。

＜発色試薬＞
本発明の発色試薬は、前記発色剤の保存が可能な試薬であって、前記発色剤と本発明の安定化剤とを含むことを特徴とする。

本発明の発色試薬は、前記安定化剤として、前記（１）および（２）の少なくとも一方の化合物を含んでいればよい。具体的には、例えば、前記（１）および（２）の化合物のうち、いずれか一種類を含んでもよいし、両方の化合物を含んでもよい。本発明の発色試薬は、さらに、前記（３）および（４）のいずれか一方を含んでもよいし、両方を含んでも。また、前記（１）〜（４）の化合物は、それぞれ、一種類であってもよいし、例えば、炭素数や置換基が異なる化合物を、二種類以上を含んでもよい。

本発明の発色試薬が、例えば、前記（１）〜（４）の化合物のうち二種類以上を含有する場合、その組み合わせは、特に制限されないが、例えば、前記（２）および（３）の組み合わせ、前記（２）〜（４）の組み合わせ、前記（１）〜（３）の組み合わせ、前記（１）〜（４）の組み合わせ等があげられる。

本発明の発色試薬において、前記発色剤に対する本発明の安定化剤の添加割合は、特に制限されないが、前記発色剤（Ａ）と前記安定化剤（Ｂ）とのモル比（Ａ：Ｂ）が、例えば、１：１〜１：１，０００，０００の範囲であることが好ましい。

具体例としては、前記発色剤（Ａ）と前記（１）の界面活性剤（Ｂ１）とのモル比（Ａ：Ｂ１）は、例えば、１：２〜１：５０，０００の範囲であることが好ましい。前記発色剤（Ａ）と前記（２）の色素物質（Ｂ２）とのモル比（Ａ：Ｂ２）は、例えば、１：１〜１：１００，０００の範囲であることが好ましく、より好ましくは、１：２〜１：５０，０００の範囲である。

前記発色剤（Ａ）と前記（３）の第４級アンモニウム（Ｂ３）とのモル比（Ａ：Ｂ３）は、例えば、１：１〜１：１００，０００の範囲であることが好ましく、より好ましくは、１：２〜１：５０，０００の範囲である。前記発色剤（Ａ）と前記（４）のβ−シクロデキストリン（Ｂ４）とのモル比（Ａ：Ｂ４）は、例えば、１：１〜１：１００，０００の範囲であることが好ましく、より好ましくは、１：２〜１：５０，０００の範囲である。

前記発色試薬が乾燥試薬の場合、例えば、前記発色剤と前記安定化剤とが共存した乾燥体等があげられる。前記乾燥試薬は、このようなドライ系の発色試薬は、例えば、前述のような溶媒に前記発色剤および本発明の安定化剤を溶解等した後、溶媒を除去することで調製できる。前記ドライ系の発色試薬は、例えば、パウダー状であって、容器等に収容されてもよいし、例えば、担体等の担持された状態であってもよい。後者としては、例えば、試験用チップ等があげられる。具体的には、前記試験用チップの場合、例えば、前記発色剤と前記安定化剤とを前記溶媒に溶解等して、前記液体試薬を準備し、これを前記チップ基板の所望の領域にアプライしてから、前記溶媒を除去することによって調製できる。前記試験用チップの基板としては、特に制限されず、例えば、ろ紙、多孔質体、プラスチック製基板等があげられる。

本発明の発色試薬は、例えば、さらに、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）およびトランス−１，２−ジアミノシクロヘキサン−Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラ酢酸（ＣｙＤＴＡ）、Ｏ，Ｏ’−ビス（２−アミノエチル）エチレングリコール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸（ＧＥＤＴＡ）またはニトリロトリ酢酸（ＮＴＡ）等のキレート剤、アジ化ナトリウム等を共存させてもよい。これらの物質を共存させることにより、さらに自然発色を安定化できる。なお、これらの物質は、一種類でもよいし二種類以上を共存させてもよい。

また、本発明の発色試薬は、用途に応じて、例えば、前記発色剤の発色反応（酸化還元反応）に必要な添加剤を適宜含有してもよい。前記添加剤としては、例えば、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）、オキシダーゼ、プロテアーゼ等の酵素、緩衝剤、前記酵素の安定化剤、前述のような溶媒等があげられる。

前記発色試薬の形態は、特に制限されず、例えば、液体試薬（ウェット系）でもあってもよいし、乾燥試薬（ドライ系）であってもよい。

前記発色試薬が液体試薬の場合、前記発色試薬における前記発色剤の濃度は、例えば、１〜１０，０００μｍｏｌ／Ｌの範囲であり、好ましくは５〜１,０００μｍｏｌ／Ｌの範囲である。なお、本発明の発色試薬における前記発色剤および安定化剤の濃度は、特に制限されないが、例えば、試料や反応系等と混合した際に、必要とされる濃度になるように設定すればよい。前記発色試薬は、例えば、反応系への添加により、例えば、１．２〜１００倍に希釈されることが好ましく、より好ましくは２〜２０倍である。

前記発色試薬が液体試薬の場合、例えば、前記発色剤と前記安定化剤とを、溶媒に溶解、懸濁または分散（以下、「溶解等」ともいう）させることで調製できる。前記溶媒としては、特に制限されないが、例えば、水、緩衝液等の水系溶媒等があげられ、また、水系溶媒と有機溶媒との混合溶媒等も使用できる。前記緩衝液としては、一般的なものが使用でき、例えば、Ｔｒｉｓ緩衝液、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、ＭＥＳ−Ｔｒｉｓ緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、ＭＯＰＳ−Ｔｒｉｓ緩衝液、ＡＤＡ緩衝液、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液、ＰＩＰＥＳ緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＴＡＰＳ緩衝液、グリシルグリシン緩衝液、グリシンアミド緩衝液等があげられる。前記緩衝液の濃度は、例えば、１〜５００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、好ましくは５〜１００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。前記緩衝液の中でも、例えば、カルボキシル基やスルホ基等の酸を有する場合、使用時のｐＨよりも低いｐＫａを示す緩衝液を使用することが好ましい。また、前記緩衝液の中でも、例えば、アミノ基等のアルカリを有する場合、使用時のｐＨよりも高いｐＫａを示す緩衝液を使用することが好ましい。

前記発色試薬のｐＨは、特に制限されないが、例えば、ｐＨ３〜１２であり、好ましくはｐＨ４〜１０であり、より好ましくはｐＨ５〜９である。

前述のように、本発明の安定化剤を共存させることで、前記発色剤を安定化できる。したがって、本発明の発色試薬によれば、本発明の発色剤を使用時まで安定に保存することが可能である。保存期間は、特に制限されないが、例えば、１０日以上であっても、自然発色を抑制して、従来よりも安定に前記発色剤を保存することができる。保存期間は、好ましくは２０年以内、より好ましくは４年以内である。なお、本発明の安定化剤を共存させずに液体の発色試薬として保存した場合、例えば、１０日程度で約２０〜９０％が自然発色を起こす。前記本発明の発色試薬の保存温度は、特に制限されず、例えば、４０℃以下であり、好ましくは０〜３０℃、より好ましくは２〜１０℃である。

なお、本発明の発色試薬は、前述のように、保存時において、酸化還元反応による発色を前記安定化剤が抑制していても、使用時には、前述のように、検体等の添加により前記安定化剤の濃度は低下するため、使用時における発色の抑制は十分に回避可能である。

また、本発明の発色試薬は、前記（１）および（２）の少なくとも一方の化合物に代えて、前記（３）および（４）の化合物を含んでもよい。この場合、前記（３）および（４）の化合物の他に、例えば、前記（１）および（２）の少なくとも一方の化合物を含んでもよい。なお、前記（３）および（４）の化合物を使用する以外は、前述と同様である。

＜安定化方法＞
本発明の安定化方法は、前記発色剤の安定化方法であって、前記発色剤と前記安定化剤とを共存させることを特徴とする。

前記発色剤と前記安定化剤とを共存させる形態は、何ら制限されず、前述のように、液体状態で共存させてもよいし、乾燥状態で共存させてもよい。また、前記発色剤と前記安定化剤との添加割合等も、前述と同様である。なお、本発明の安定化方法は、例えば、前記本発明の安定化剤または本発明の発色試薬を使用することによっても実現でき、具体的な方法は、前述と同様である。

＜保存方法＞
本発明の保存方法は、前記発色剤の保存方法であって、前述のように、発色剤を、本発明の安定化方法により安定化させた状態で保存することを特徴とする。本発明においては、本発明の安定化剤と発色剤とを共存させた状態で保存すればよく、その他の形態や条件は、何ら制限されない。また、前記両者の添加割合や、保存日数、保存温度等も、前述の通りである。

＜発色反応用キット＞
本発明の発色反応用キットは、前記発色剤を含むキットであって、さらに、本発明の安定化剤とを含むことを特徴とする。

本発明の発色反応用キットにおいて、前記発色剤と前記安定化剤とは、前述のように、液体状態または乾燥状態で混合されていてもよい。また、本発明の発色反応用キットにおいて、前記発色剤と前記安定化剤とは、別個の容器に収容されてもよい。その場合、前記発色剤は、例えば、乾燥状態であることが好ましい。そして、例えば、前記乾燥状態の発色剤と前記安定化剤とを、溶媒に溶解等することで、液体試薬として、前記発色剤を保存できる。

前記発色剤の発色反応に使用する試薬としては、特に制限されない。具体例として、例えば、目的の検出物質から過酸化水素を発生させ、前記過酸化水素と前記発色剤とを基質として酸化還元反応（発色反応）を行う場合は、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）等の酸化酵素等を含むことが好ましい。また、前記目的の検出物質から過酸化水素を発生させるための各種酵素、例えば、プロテアーゼ、酸化酵素、還元酵素等を含んでもよい。この他にも、前記試薬としては、例えば、緩衝剤、緩衝液等の溶媒等があげられる。

＜目的成分の測定方法＞
本発明の測定方法は、メチレンブルーの検出により試料中の目的成分を測定する方法であって、下記（Ａ）〜（Ｅ）工程を含むことを特徴とする。
（Ａ）前記試料中の前記目的成分から酸化物質を生成させる工程
（Ｂ）前記試料に、本発明の発色試薬を添加する工程
（Ｃ）前記酸化物質と前記発色試薬中の発色剤との酸化還元反応により、前記発色剤からメチレンブルーを遊離させる工程
（Ｄ）遊離したメチレンブルーを検出して、前記メチレンブルーの生成の有無または生成量を測定する工程
（Ｅ）前記測定結果から、前記試料中の目的成分の有無または量を決定する工程

本発明は、前記発色剤を、本発明の安定化剤と共存させることが特徴であって、その他の工程や条件は何ら制限されない。つまり、前記発色剤からメチレンブルーを遊離させ、遊離したメチレンブルーを検出する工程を含むあらゆる測定方法（例えば、定性方法または定量方法等）に適用できる。このため、本発明は、例えば、酸化還元反応によりメチレンブルーを生成させ、メチレンブルーの有無またはその量の増減を測定することによって目的成分を定性または定量する方法等に、適用することが好ましい。また、前記発色試薬の添加順序も特に制限されず、例えば、前記（Ａ）工程の前後のいずれであってもよい。

前記反応系におけるメチレンブルーは、前述のように、吸光度測定によって行うことができる。一般的に、メチレンブルーの極大吸収波長は、例えば、約６６０〜６７０ｎｍ（例えば、約６６６ｎｍ）であり、検出波長は、例えば、６００〜６８０ｎｍの範囲である。なお、本発明の安定化剤として、前記（２）の色素物質を使用し、前記反応系において前記発色剤と前記色素物質とが共存する場合、例えば、メチレンブルーのスペクトルを長波長側にシフトできる。このため、前記（２）の色素物質を使用する際には、例えば、６７０ｎｍ以上、６８０ｎｍ以上、６９０ｎｍ以上での測定も可能である。具体的な波長範囲としては、例えば、６１０〜７３０ｎｍであり、好ましくは６５０〜７１５ｎｍであり、より好ましくは６６０〜７００ｎｍである。

本発明における目的成分は、例えば、発色剤を利用した測定が可能であれば、その種類は何ら制限されない。前記目的成分としては、例えば、前記目的成分から酸化還元反応により酸化物質を生成できるもの等があげられる。また、前記目的成分自体が酸化物質である場合は、前述のように、前記目的成分から酸化物質をさらに生成させてもよいし、例えば、前記（Ａ）工程を省略し、前記（Ｂ）工程において、酸化物質である目的成分そのものを発色剤と反応させてもよい。前記目的成分の具体例としては、例えば、糖化ヘモグロビン（Ｈｂ）、糖化アルブミン等の糖化タンパク質、糖化ペプチド、糖化アミノ酸、グルコース、尿酸、コレステロール、クレアチニン、サルコシン、グリセロール等があげられる。

以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

前記発色剤は、一般的に、光により分解され易いという性質を示す。そこで、前記発色剤について、色素物質の共存下、前記色素物質による、メチレンブルーの自然発生によるバックグラウンド上昇の安定化（抑制）を確認した。前記発色剤としては、和光純薬社製の商品名ＤＡ−６７を使用した。

まず、前記第２試薬を調製し、光に暴露した状態で冷蔵庫内に３０日間保存した。前記第２試薬には、前記色素物質として、タートラジン（キシダ化学社製）または食品添加物食用黄色４号（東京化成社製）を使用した。前記色素物質は、共に、前記式（Ｉ）で表される前記（２）の色素物質である。

つぎに、前記第１試薬を調製し、前記第１試薬７８μＬと精製水１３μＬとを混合して３７℃で５分間インキュベートした後、保存後の前記第２試薬１９．５μＬを添加した。そして、前記第２試薬添加直前の反応液における波長６９４ｎｍの吸光度（Ａ_０’）と、前記第２試薬の添加５分後の反応液における波長６９４ｎｍの吸光度（Ａ_５’）とを、生化学自動分析装置（商品名ＪＣＡ−ＢＭ８：日本電子社製）により測定し、その差（Ａ_５’−Ａ_０’）を求めた。また、比較例１として、色素物質無添加の第２試薬を使用したものについて、同様に測定を行った。なお、前記第２試薬のバックグラウンドの上昇を公平に比較するために、前記第１試薬には、多量のタートラジンを添加した。

前記表２に示すように、色素物質無添加（−）の第２試薬を用いた比較例１に対して、色素物質を加えた前記第２試薬を用いた各実施例は、６９４ｎｍにおける吸光度上昇（バックグラウンド上昇）を抑制できた。つまり、前記発色剤は光で分解し易い性質を有しているが、前記第２試薬に前記色素物質を加えることによって、光が遮断され、メチレンブルーの自然生成が抑制されたといえる。このため、前記発色剤と前記色素物質とを共存させれば、前述のように、使用時まで、水分存在下で保存することも可能となり、光に弱い前記発色剤を使用する測定方法において、非常に有用な試薬となる。

酸化によりメチレンブルーを生成する前記発色剤について、前記色素物質の共存下で、光を照射し、前記色素物質による、発色剤の安定化効果（メチレンブルーの自然発生の抑制）を確認した。

（発色剤溶液）
前記発色剤として、実施例１と同様のＤＡ−６７（商品名）を使用し、０．０５ｍｍｏｌ／Ｌとなるように、３０ｍｍｏｌ／ＬのＭＯＰＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．６）に溶解した。

（色素物質溶液）
下記色素物質を、１０ｍｍｏｌ／Ｌとなるように精製水に溶解した。下記色素物質は、全て、共に、前記式（Ｉ）で表される前記（２）の色素物質である。
Ｎｏ．１タートラジン
Ｎｏ．２食品添加物食用黄色５号
Ｎｏ．３食品添加物食用赤色２号

前記発色剤の終濃度が０．０２５ｍｍｏｌ／Ｌ、前記色素物質の終濃度が所定濃度（０．１ｍｍｏｌ／Ｌ、０．２ｍｍｏｌ／Ｌ、０．４ｍｍｏｌ／Ｌ）となるように、前記発色剤溶液、前記色素物質溶液および精製水とを混合して、サンプル（各１０ｍＬ）を調製した。これらのサンプルを入れた透明ガラスの容器を、１５時〜１６時の１時間、南向きのすりガラスの近くに放置し、日光に暴露した。温度は２５℃であった。暴露後、前記サンプルについて、分光光度計（Ｖ−５５０、日本分光社製）によりスペクトルの測定をした。また、対照として、前記色素物質溶液に代えて精製水を使用し、同様の測定を行った。各サンプルについて、前記各色素物質に応じた最大吸収波長における吸光度の測定結果を下記表に示す。前記最大吸収波長は、それぞれ、Ｎｏ．１（タートラジン）が６６６ｎｍ、Ｎｏ．２（黄色５号）が６８１ｎｍ、Ｎｏ．３（赤色２号）が６４６ｎｍである。なお、下記表において、最大発色吸光度とは、前記各サンプルにおいて、含有する全発色剤からメチレンブルーが生成された場合の吸光度であり、メチレンブルー生成率とは、暴露後のメチレンブルーの生成率であって、最大発色吸光度を１００％とした場合の暴露後の吸光度の割合により表される。

前記表に示すように、前記色素物質の共存下で前記発色剤を日光に暴露した場合、前記色素物質無添加の対照と比較して、暴露による吸光度の上昇が抑制された。すなわち、前記色素物質によって、前記発色剤からのメチレンブルーの生成（自然発生）が抑制された。

前記安定化剤としてタートラジンと第４級アンモニウム塩との共存下、前記発色剤を保存し、前記安定化剤による、発色剤の安定化効果（メチレンブルーの自然発生の抑制）を確認した。

まず、前記第２試薬を調製し、２５℃で所定期間（０日、３日、７日）放置した。前記第２試薬には、安定化剤１としてタートラジンおよび安定化剤２として第４級アンモニウムを使用した。前記タートラジンは、前記式（Ｉ）で表される前記（２）の色素物質である。また、前記第４級アンモニウムは、前記（３）の化合物であり、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムおよび塩化ドデシルヘキサデシルアンモニウムを使用した。なお、前記第２試薬における各安定化剤の添加割合は、下記表５に示す。

そして、前記第１試薬を調製し、前記第１試薬７８μＬと精製水６．５μＬとを混合し、３７℃で５分間インキュベートし、放置後の前記第２試薬１９．５μＬを添加して、３７℃で発色反応を行った。そして、放置（３日間、７日間）した第２試薬または未放置の第２試薬を添加する直前の反応液における主波長６９４ｎｍ／副波長７５１ｎｍの吸光度（Ａ_０）と、前記第２試薬を添加してから５分後の反応液における主波長６９４ｎｍ／副波長７５１ｎｍの吸光度（Ａ_５）とを、生化学自動分析装置（商品名ＪＣＡ−ＢＭ８：日本電子社製）により測定し、各測定値の差（Ａ_５−Ａ_０）を求めた。これらの結果を下記表５に示す。

前記表に示すように、タートラジンと一種類または二種類の第４級アンモニウム塩を共存させることで、前記発色剤を含む第２試薬を保存しても、大幅な吸光度増加は見られなかった。このことから、タートラジンと第４級アンモニウム塩を共存させることで、発色剤の自然発色を抑制できることがわかった。

下記第２試薬（Ｒ２−４）を使用した以外は、前記実施例３と同様にして、前記第２試薬の保存ならびに吸光度測定を行い、各種安定化剤による、発色剤の安定化効果（メチレンブルーの自然発生の抑制）を確認した。

下記第２試薬において、安定化剤１のタートラジンは、前記式（Ｉ）で表される前記（２）の色素物質であり、安定化剤２のヘキサデシルトリメチルアンモニウムは、前記第４級アンモニウムである。安定化剤３は、下記各表に示すように、前記（４）のβシクロデキストリン誘導体を使用した。なお、前記第２試薬における各安定化剤の添加割合は、下記各表に示す。

前記表７に示すように、タートラジン、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムおよびβ−シクロデキストリン類を共存させることで、前記発色剤を含む第２試薬を保存しても、大幅な吸光度増加は見られなかった。

前記表８に示すように、タートラジンとｎ−ドデシル−α，β−Ｄ−マルトシドを共存させることで、前記発色剤を含む第２試薬を保存しても、大幅な吸光度増加は見られなかった。

下記表９において、下記Ｆ２〜Ｆ４は、前記第２試薬（Ｒ２−４）において、ＭＥＳ、ＴｒｉｓおよびＴｒｉｓ−ＨＣｌを使用してｐＨを調整し、下記Ｆ５およびＦ６は、ＭＯＰＳ、Ｔｒｉｓ、ＭＯＰＳ−Ｔｒｉｓを使用してｐＨを調整した以外は、前記実施例３と同様にして、前記第２試薬の保存および吸光度測定を行った。

前記表９に示すように、タートラジンおよびヘキサデシルトリメチルアンモニウムの共存下、ｐＨを相対的に高く（例えば、ｐＨ７．２程度）設定する程、前記発色剤の自然発色を抑制できることがわかった。

下記表１０において、下記Ｇ１〜Ｇ５は、下記表記載のｐＨに調整した以外は、前記実施例３と同様にして、前記第２試薬の保存および吸光度測定を行った。また、下記Ｇ６は、前記第２試薬（Ｒ２−４）において、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＴｒｉsおよびＭＥＳの含量を、Ｔｒｉs ７０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＭＥＳ（ｐＫａ）９７ｍｍｏｌ／Ｌとした以外は、前記実施例３と同様にして、前記第２試薬の保存および吸光度測定を行った。

前記表に示すように、タートラジンやヘキサデシルトリメチルアンモニウムに加えて、β−シクロデキストリン類、ｎ−ドデシル−α，β−Ｄ−マルトシド、トリメチルアンモニウムを添加しても、発色剤の自然発色を抑制できることがわかった。

以上のように、本発明によれば、発色剤を安定化して、その自然発色を抑制できることから、従来困難であった発色剤の保存も可能となる。このように、本発明の方法によれば、高感度測定が可能な発色剤の安定化を向上できることから、従来よりも、発色剤としての適用範囲を、さらに広げることができるため、例えば、臨床検査等において極めて有用といえる。

Claims

１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンもしくはその誘導体、またはその塩を安定化する安定化剤であって、
下記（２）の化合物を含むことを特徴とする安定化剤。
（２）下記式（Ｉ）で表される色素物質
Ｒ^１−Ｎ＝Ｎ−Ｒ^２・・・（Ｉ）
前記式（Ｉ）において、

Ｒ^１およびＲ^２において、
Ｘは、水素、ハロゲン、ナトリウムまたはカリウムであり、各Ｘは、同一でも異なってもよく、
Ｙは、水素またはＳＯ_３Ｘであり、各Ｙは、同一でも異なっていても良く、
Ｚは、水素、メチル基またはメトキシ基であり、各Ｚは同一でも異なっていても良い。
さらに、下記（３）および（４）の少なくとも一方の化合物を含む、請求項１記載の安定化剤。
（３）炭素数１２以上の炭化水素基を有する第４級アンモニウムまたはその塩
（４）β−シクロデキストリンまたはその誘導体
前記（３）および（４）の化合物を含む、請求項２記載の安定化剤。
前記（２）の色素物質が、
５−ヒドロキシ−１−（４−スルホフェニル）−４−（４−スルホフェニルアゾ）ピラゾール−３−カルボン酸およびその塩、
６−ヒドロキシ−５−（４−スルホフェニルアゾ）−２−ナフタレンスルホン酸およびその塩、
３−ヒドロキシ−４−（４−スルホナフチルアゾ）−２，７−ナフタレンジスルホン酸およびその塩、
６−ヒドロキシ−５−［（２−メトキシ−５−メチル−４−スルホナトフェニル）ジアゼニル］ナフタレン−２−スルホン酸およびその塩、ならびに、
７−ヒドロキシ−８−（４−スルホナフチルアゾ）−１，３−ナフタレンジスルホン酸およびその塩からなる群から選択される少なくとも一つの前記式（Ｉ）で表される化合物である、請求項１から３のいずれか一項に記載の安定化剤。
前記（３）の第４級アンモニウムが、
ベンゼトニウム、
ステアリルトリメチルアンモニウム、
セチルトリメチルアンモニウム、
ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、
ベンザルコニウム、
ベンジルジメチルテトラデシルアンモニウム、
ミリスチルトリメチルアンモニウム、
ラウリルトリメチルアンモニウム
ドデシルトリメチルアンモニウム、
およびココナットアミンアセテートからなる群から選択される少なくとも１つである、請求項２から４のいずれか一項に記載の安定化剤。
前記（３）の第４級アンモニウムの塩が、塩化物塩および臭化物塩の少なくとも一方である、請求項２から５のいずれか一項に記載の安定化剤。
前記（４）のβ−シクロデキストリンの誘導体が、
マルトシル−β−シクロデキストリン、
グルコシル−β−シクロデキストリン、
カルボキシメチル−β−シクロデキストリン、
ジメチル−β−シクロデキストリン、
モノアミノ−β−シクロデキストリン、
２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、
メチル−β−シクロデキストリン、
グルクロニルグルコシル−β−シクロデキストリン、
ヘプタキス（２，６−ジ−Ｏ−メチル）−β−シクロデキストリン、
トリ−Ｏ−メチル−β−シクロデキストリン、
サクシニル−β−シクロデキストリン、
スルホプロピル−β−シクロデキストリン、
サクシニルヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンおよび
トリアセチル−β−シクロデキストリンからなる群から選択される少なくとも１つである、請求項２から６のいずれか一項に記載の安定化剤。
前記１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンもしくはその誘導体、またはその塩の自然発色を防止する、請求項１から７のいずれか一項に記載の安定化剤。
１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンもしくはその誘導体、またはその塩を含む発色試薬であって、
さらに、請求項１から８のいずれか一項に記載の安定化剤を含むことを特徴とする発色試薬。
前記発色試薬が、液体試薬である、請求項９記載の発色試薬。
１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンもしくはその誘導体、またはその塩を安定化する方法であって、
１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンまたはその誘導体と、請求項１から８のいずれか一項に記載の安定化剤を共存させることを特徴とする安定化方法。
溶媒中で、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンもしくはその誘導体、またはその塩と前記安定化剤とを共存させる、請求項１１記載の安定化方法。
前記安定化剤により、前記１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンもしくはその誘導体、またはその塩の自然発色を防止する、請求項１１または１２記載の安定化方法。
１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンもしくはその誘導体、またはその塩の保存方法であって、
１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンもしくはその誘導体、またはその塩を、請求項１１から１３のいずれか一項に記載の安定化方法により安定化させた状態で保存することを特徴とする保存方法。
発色剤として１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンもしくはその誘導体、またはその塩を含む発色反応用キットであって、
さらに、請求項１から８のいずれか一項に記載の安定化剤を含むことを特徴とする、発色反応用キット。