JP5255283B2 - 発色剤の液体試薬、及び、その安定化方法 - Google Patents

Description

本発明は、メチレンブルー系発色剤の液体試薬、及び、その安定化方法に関する。

酸化されて発色する基質として、例えば、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン等のメチレンブルー系発色剤が知られている。このメチレンブルー系発色剤は、発色団であるメチレンブルーが退色し難いことから、高感度の検出が可能であり、様々な分析への使用が期待されている。

このような発色剤は、例えば、酸化還元酵素によって生成された過酸化水素等の酸化物質と反応させ、その発色量を吸光度測定することによって前記酸化物質の量を決定する場合に使用できる。このような酵素反応に供する際、発色剤は、通常、水に溶解させ、調製した溶液を液体試薬として使用する。

しかし、前述のようなメチレンブルー系発色剤は、水等の溶媒中で不安定なため、自然発色するという問題がある。このため、液体状態で保存した発色剤を使用すると、吸光度測定におけるバックグラウンドが上昇し、測定精度が低下するおそれがある。特に、メチレンブルー系発色剤の発色団であるメチレンブルーは、前述のように退色し難いという性質を有するため高感度というメリットを有するけれども、他の発色団と比較して自然酸化により遊離した発色団（メチレンブルー）についても退色し難いため、その影響を回避することが困難という問題がある。例えば、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンは、水溶液の状態で保存した場合、約１日程度で、測定に影響を及ぼす自然発色が確認され、約３日程度で分析用試薬としての使用が困難となる（特許文献１又は同文献の対応米国特許ＵＳ４，９１６，０５８参照）。

このような自然発色による影響を防止するには、測定の度に液体試薬を調製することが必要になるが、これでは操作が煩雑になり、コストもかかってしまう。
特公平４−２７８３９号公報

そこで、本発明は、液体状態でも安定に保存可能なメチレンブルー系発色剤の液体試薬、及び、前記発色剤を溶媒中で安定化する方法の提供を目的とする。

前記目的を達成するために、本発明の液体試薬は、メチレンブルー系発色剤、炭素数１２以上の炭化水素鎖を有する第四級アンモニウム又はその塩、及び、液体媒体を含む。

また、本発明のメチレンブルー系発色剤を含む液体試薬の安定化方法は、液体媒体中で前記発色剤と炭素数１２以上の炭化水素鎖を有する第四級アンモニウム又はその塩とを共存させることを含む。

このように、メチレンブルー系発色剤を含む液体試薬において、炭素数１２以上の炭化水素鎖を有する第四級アンモニウム又はその塩（以下、あわせて「第四級アンモニウム」ともいう）を共存させることによって、メカニズムは不明であるが、メチレンブルー系発色剤の自然発色を抑制できる。これにより、前記発色剤の液体状態での保存が可能になり、例えば、測定の度に発色剤の液体試薬を調製する必要がなくなるため、測定等の操作が容易になり、低コスト化も可能となる。さらに、保存した本発明の発色剤の液体試薬を発色反応の発色試薬として使用しても、吸光度測定におけるバックグラウンドの上昇が抑制されるため、測定精度の向上も可能になる。

本発明のメチレンブルー系発色剤の液体試薬は、前述のように、少なくともメチレンブルー系発色剤を含み、炭素数１２以上の炭化水素鎖を有する第四級アンモニウム又はその塩、及び、液体媒体を含むことを特徴とする。

このような本発明の液体試薬は、メチレンブルー系発色剤が前記第四級アンモニウムとの共存によって自然発色が抑制され、安定化されるため、液体状態での保存が可能になる。この保存温度は、特に制限されないが、例えば、０〜４０℃の範囲であり、好ましくは０〜２５℃の範囲であり、より好ましくは０〜１０℃の範囲である。

具体的に、メチレンブルー系発色剤の液体試薬に第四級アンモニウムを添加しない場合、１０℃で保存すると、例えば、メチレンブルー系発色剤の濃度が０．０５ｍｍｏｌ／Ｌのとき、メチレンブルーの吸収波長６５８ｎｍにおける吸光度は、１０日間保存した場合で、例えば、１８０ｍＡｂｓ．に増加してしまう。これに対し、本発明の液体試薬は、１０℃で保存しても、少なくとも３日、例えば、４、５、６、７、８、９、１０日間保存した場合でもメチレンブルー系発色剤の自然発色を防止及び／又は抑制でき、２０〜３００日程度は、十分に発色剤の試薬として使用可能である。

本発明のメチレンブルー系発色剤の液体試薬の用途としては、特に制限されないが、例えば、前述のように酸化還元反応における発色基質等の液体試薬として有用である。

本発明においてメチレンブルー系発色剤とは、メチレンブルー系酸化発色剤であり、酸化によって発色団であるメチレンブルーを遊離する化合物を言い、例えば、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン（以下、「ＤＡ−６７」という）、１０−（アセチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン、１０−（フェニルカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン（特公平４−２７８３９に記載の化合物Ｎｏ．２０）、１０−（３−（メチルカルボキシアミノ）−ヘキサメチル−アミノ）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン（特公昭６０−３３４７９に記載の化合物Ｎｏ．ＩＩ−４）、１０−（（（３−（メチルカルボキシアミノ）−４−メチル）−フェニル）−アミノ）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン（同文献の化合物Ｎｏ．ＩＩ−５）、１０−（（３−（メチルカルボキシアミノメチル）−フェニル）−メチルアミノ）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン（同文献の化合物Ｎｏ．ＩＩ−６）、１０−（１−ナフタレンアミノ）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン（同文献の化合物Ｎｏ．ＩＩ−７）、１０−（メチル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン（同文献の化合物Ｎｏ．ＩＩ−８）、１０−（フェニルアミノ）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン（同文献の化合物Ｎｏ．ＩＩ−９）、１０−（メチルアミノ）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン（同文献の化合物Ｎｏ．ＩＩ−１１）等があげられる。

本発明における第四級アンモニウムの炭化水素鎖の炭素数は、１２以上であればよく、例えば、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０であって、好ましくは、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１４〜１８の範囲、１６〜１８の範囲、１７、１８である。本発明において、"第四級アンモニウムの炭化水素鎖の炭素数"とは、好ましくは、第四級アンモニウムの４つの基のいずれかの炭化水素基の炭素数をいう。

前記炭化水素基は、例えば、直鎖又は分枝のアルキル、環状アルキル、直鎖若しくは分枝又は環状であり置換基を有するアルキル、置換基を有するアリール等があげられ、前記置換基は、互いに同一であるか又は異なり、前記置換基は、例えば、ハロゲン、直鎖もしくは分枝アルキル、フェニル、ヒドロキシ、直鎖もしくは分枝Ｃ₁〜Ｃ₆アルコキシであり、前記アリールは、例えば、フェニル又はシクロヘキシルである。また、これらに代えて、直鎖又は分枝鎖アルキルカルボニルであってもよい。

本発明における第四級アンモニウムの具体例としては、例えば、塩化ベンゼトニウム、塩化ステアリルトリメチルアンモニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、塩化セチルトリメチルアンモニウム、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、塩化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンジルジメチルテトラデシルアンモニウム、臭化ミリスチルトリメチルアンモニウム、塩化ミスチリルトリメチルアンモニウム、ココナットアミンアセテート、塩化ラウリルトリメチルアンモニウム、等があげられる。これらの化合物は、いずれか一種類でもよいし、二種類以上を使用してもよい。また、前記第四級アンモニウムは、異なる炭化水素鎖の炭素数の第四級アンモニウムの混合物であっても、それらのいずれかが上記範囲の炭素数であれば使用できる。また、本発明において、第四級アンモニウム塩における塩の種類は特に制限されない。

本発明の液体試薬における前記発色剤の濃度は、例えば、１〜１０，０００μｍｏｌ／Ｌの範囲であり、好ましくは５〜１，０００μｍｏｌ／Ｌの範囲である。前記液体試薬における前記第四級アンモニウムの濃度は、例えば、２〜１００，０００μｍｏｌ／Ｌの範囲であり、好ましくは５０〜３０，０００μｍｏｌ／Ｌの範囲であり、特に好ましくは１００〜１０，０００μｍｏｌ／Ｌの範囲である。なお、本発明の液体試薬における前記発色剤ならびに前記第四級アンモニウムの含有量は特に制限されないが、例えば、試料や反応液等に添加した際、必要とされる濃度になるように設定すればよい。

本発明の液体試薬において、前記発色剤０．１ｍｍｏｌに対する前記第四級アンモニウム又はその塩の添加割合は、例えば、１０〜１００，０００μｍｏｌの範囲であり、好ましくは１００〜１０，０００μｍｏｌの範囲であり、さらに好ましくは５００〜１０，０００μｍｏｌである。

前記液体試薬に含まれる液体媒体は、特に制限されないが、通常、水性溶媒であり、例えば、水、緩衝液等があげられる。緩衝液としては、一般的なものを使用でき、例えば、ＡＤＡ緩衝液、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液、ＰＩＰＥＳ緩衝液、リン酸緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、クエン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＴＡＰＳ緩衝液、グリシルグリシン緩衝液、グリシンアミド緩衝液、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液等があげられる。前記緩衝液の濃度は、例えば、１〜５００ｍＭの範囲であり、好ましくは５〜１００ｍＭの範囲である。

調製後の本発明の液体試薬のｐＨは、特に制限されないが、例えば、ｐＨ３〜１１の範囲であり、好ましくはｐＨ４．５〜９である。

本発明の液体試薬は、例えば、さらに、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、トランス−１，２−ジアミノシクロヘキサン−Ｎ、Ｎ、Ｎ'、Ｎ'−テトラ酢酸（ＣｙＤＴＡ）、Ｏ，Ｏ'−ビス（２−アミノエチル）エチレングリコール−Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラ酢酸（ＧＥＤＴＡ）、及びニトリロトリ酢酸（ＮＴＡ）からなる群から選択された少なくとも一つのキレート剤や、アジ化ナトリウム等を共存させることが好ましい。これらの物質を共存させることにより、さらに自然発色を抑制できる。なお、これらの物質は、一種類でもよいし二種類以上を共存させてもよい。

また、本発明の液体試薬は、用途に応じて、例えば、酸化還元反応に必要な添加剤を適宜含有させてもよい。

つぎに、本発明の安定化方法は、少なくともメチレンブルー系発色剤を含む液体試薬の安定化方法であって、前記発色剤と前述の第四級アンモニウムとを前述の液体媒体中で共存させることを特徴とする。なお、特に示さない限り、前記発色剤、前記第四級アンモニウム及び溶媒の種類や添加割合等は、前述と同様である。本発明において、"発色剤の液体試薬の安定化"とは、液体媒体中のメチレンブルー系発色剤の自己発色の抑制が継続されること、又は、その状態をいい、例えば、"液体媒体中の前記発色剤及び／又は前記液体試薬の保存"及び"液体媒体中の前記発色剤及び／又は前記液体試薬の維持"の意味を含む。本発明の安定化方法であれば、液体試薬中のメチレンブルー系発色剤を、少なくとも３日、例えば、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４日以上、又は、２０〜３００日程度、自然発色を防止及び／又は抑制した状態で安定化、保存、及び／又は維持でき、これらの日数を経過後も、好ましくは、本発明の液体試薬を発色反応の試薬として使用できる。

本発明の安定化方法は、例えば、メチレンブルー系発色剤及び前述の第四級アンモニウムを前述の液体媒体に溶解又は懸濁することによって行える。このように調製された液体は、本発明の液体試薬として使用できる。

本発明は、その他の態様において、本発明の安定化方法を行うためのキットであって、メチレンブルー系発色剤及び前述の第四級アンモニウムを含むキットを提供する。前記キットは、さらに、必要応じて、前述の液体媒体、及び／又は、取扱説明書を含むことが好ましい。前記取扱説明書には、例えば、前記キットで行う本発明の安定化方法であれば、少なくとも３日、例えば、４、５、６、７、８、９、１０、１１，１２，１３、１４日以上、又は、２０〜３００日程度、自然発色を防止及び／又は抑制した状態で安定化、保存、及び／又は維持でき、発色反応の試薬として使用できることが記載されることが好ましい。

さらにその他の態様において、本発明は、検出及び／又は測定のためのキットであって、メチレンブルー系発色剤、前述の第四級アンモニウム、メチレンブルー系発色剤を発色させる反応に用いる試薬、及び、本発明の安定化方法を行うための取扱説明書を含むキットを提供する。前記キットは、必要応じて、前述の液体媒体を含むことが好ましい。本態様において、"検出及び／又は測定"とは、特に制限されず、例えば、過酸化水素の検出及び／又は測定、又は、従来公知の過酸化水素の発生を介した化学物質の検出及び／又は測定を含む。本態様において、"メチレンブルー系発色剤を発色させる反応に用いる試薬"は、特に制限されず、例えば、各種ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）等があげられる。前記試薬は、さらに、基質と反応して過酸化水素は発生させる酸化還元酵素、例えば、各種オキシダーゼ、デヒドロゲナーゼ等、及び、基質に作用するプロテアーゼ等を含んでもよい。したがって、本態様の具体例としては、糖化タンパク質の検出／測定キットであって、メチレンブルー系発色剤、前述の第四級アンモニウム、ＰＯＤ、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＤ）、前記取扱説明書、必要に応じて各種プロテアーゼを含むキットが挙げられる。前記取扱説明書には、例えば、本態様のキットで行う本発明の安定化方法であれば、少なくとも３日、例えば、４、５、６、７、８、９、１０、１１，１２，１３、１４日以上、又は、２０〜３００日程度、自然発色を防止及び／又は抑制した状態で安定化、保存、及び／又は維持でき、検出及び／又は測定に使用できることが記載されることが好ましい。

溶媒中で、ＤＡ−６７を第四級アンモニウムと共存させた場合の安定性（吸光度変化）を調べた。

＜測定方法＞
４℃で１２日間保存した前記第１試薬（Ｒ１−１）７８μＬに、同様に４℃で１２日間保存した前記第２試薬（Ｒ２−１）２６μＬを添加し、３７℃で５分間インキュベートした。そして、第２試薬添加直前の反応液における波長６５８ｎｍの吸光度（Ａ₀）と、第２試薬の添加５分後の反応液における波長６５８ｎｍの吸光度（Ａ₅）とを、生化学自動分析装置（商品名ＪＣＡ−ＢＭ８：日本電子社製、以下同じ）によって測定し、その差（Ａ₅−Ａ₀）を求めた。これらの結果を下記表２に示す。

上記表２に示すように、コントロール（比較例１−１）では、１２日間の保存により自然発色が生じたため、吸光度の増加が見られた。これに対して、実施例１では、第１試薬においてＤＡ−６７と第四級アンモニウムとを共存させたため、吸光度の増加をコントロール（比較例１−１）の約１／５に抑えることができた。また、発色剤等の安定性が低い場合には、通常、ポリマー等の安定化剤と共存することが考えられるが、各種ポリマーを共存させた比較例１−２〜比較例１−２７と比べても、実施例１によれば顕著に吸光度の増加を防止できた。この結果より、ＤＡ‐６７等のメチレンブルー系発色剤に第四級アンモニウムを共存させることによって、液体状態でも前記発色剤の自然発色を防止でき、バックグランドの上昇を抑制できるといえる。

溶媒中で、ＤＡ−６７を各種第四級アンモニウムと共存させた場合の安定性（吸光度変化）を調べた。

４℃で１４日間保存した前記第１試薬（Ｒ１−２Ａ又はＲ１−２Ｂ）７８μＬに、同様に４℃で１４日間保存した前記第２試薬（Ｒ２−２）２６μＬを添加し、３７℃で５分間インキュベートした。そして、第２試薬添加直前の反応液における波長６５８ｎｍの吸光度（Ａ₀）と、第２試薬の添加５分後の反応液における波長６５８ｎｍの吸光度（Ａ₅）とを、生化学自動分析装置（商品名ＪＣＡ−ＢＭ８：日本電子社製、以下同じ）によって測定し、その差（Ａ₅−Ａ₀）を求めた。なお、前記第２試薬（Ｒ２−２）の第四級アンモニウムに代えて精製水を使用した結果をコントロール（比較例２−１）とした。これらの結果を下記表４に示す。なお、第１試薬としてＲ１−２Ａ（精製水）を使用することによって、第２試薬に含まれるＤＡ‐６７の自然発色の抑制を確認した。また、Ｒ１−２Ｂ（酵素試薬）を使用することによって、糖化タンパク質（ＨｂＡ１ｃ）測定系に適用した場合であっても、ＤＡ‐６７の自然発色が抑制されることを確認した。

上記表４に示すように、炭素数１２以上の炭化水素鎖を有する第四級アンモニウムを用いた実施例２−１〜２−８によれば、第四級アンモニウム無添加のコントロール（比較例２−１）、ならびに、前記炭素数を満たさない第四級アンモニウムを使用した比較例２−２〜２−４に比べて、保存時における自然発色を抑制できることがわかった。

溶媒中でＤＡ−６７を第四級アンモニウムと共存させた場合における、ｐＨによる安定性（吸光度変化）を調べた。

＜測定方法＞
第２試薬（Ｒ２−３Ａ，Ｒ２−３Ｂ）をそれぞれ５℃で２日間保存した。前記第１試薬（Ｒ１−３）７８μＬと精製水１３μＬとを混合し、３７℃で５分間インキュベートした。この混合液に、さらに保存した前記第２試薬１９．５μＬを添加し、３７℃で５分間インキュベートして発色反応を行った。そして、第２試薬添加直前の反応液における波長６５８ｎｍの吸光度（Ａ₀）と、第２試薬の添加５分後の反応液における波長６５８ｎｍの吸光度（Ａ₅）とを、生化学自動分析装置（商品名ＪＣＡ−ＢＭ８）によって測定し、その差（Ａ₅−Ａ₀）を求めた。第２試薬としてＲ２−３Ａを使用した結果が実施例３であり、Ｒ２−３Ｂを使用した結果が比較例３である。また、実施例３と比較例３の結果の差を求めた。これらの結果を下記表６にあわせて示す。

上記表６に示すように、第四級アンモニウムを添加した実施例３によれば、第四級アンモニウム無添加の比較例３に比べて、種々の緩衝液においてｐＨを変化させても、保存時における自然発色を抑制できることがわかった。

以上のように、本発明のメチレンブルー系発色剤の液体試薬によれば、前記発色剤の液体状態での保存が可能になり、例えば、測定の度に液体試薬を調製する必要がなくなるため、測定等の操作が容易になり、低コスト化も可能となる。さらに、保存した本発明の液体試薬を発色反応の試薬として使用しても、吸光度測定におけるバックグラウンドの上昇が抑制されるため、測定精度の向上も可能になる。

Claims (10)

1. メチレンブルー系発色剤、炭素数１２以上の炭化水素鎖を有する第四級アンモニウム又はその塩、及び、液体媒体を含む、液系の発色試薬であることを特徴とする液体発色試薬（但し、その用途が酸素インジケーター用組成物である場合を除く）。
2. メチレンブルー系発色剤、炭素数１２以上の炭化水素鎖を有する第四級アンモニウム又はその塩、及び、液体媒体を含み、前記メチレンブルー系発色剤の発色反応を吸光度により測定するための液系の発色試薬であることを特徴とする液体発色試薬。
3. 前記メチレンブルー系発色剤が、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン、又は、１０−（アセチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンである、請求項１又は２に記載の液体発色試薬。
4. 前記第四級アンモニウムの少なくとも１つの基が、炭素数が１２以上である炭化水素基である請求項１〜３のいずれか一項に記載の液体発色試薬。
5. 前記炭素数が、１４〜１８の範囲である請求項１〜４のいずれか一項に記載の液体発色試薬。
6. 調製後、少なくとも３日経過した請求項１〜５のいずれか一項に記載の液体発色試薬。
7. 前記第四級アンモニウムは、塩化ベンゼトニウム、塩化ステアリルトリメチルアンモニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、塩化セチルトリメチルアンモニウム、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、塩化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンジルジメチルテトラデシルアンモニウム、臭化ミリスチルトリメチルアンモニウム、塩化ミスチリルトリメチルアンモニウム、ココナットアミンアセテート、及び塩化ラウリルトリメチルアンモニウムからなる群から選択される請求項1〜６のいずれか一項に記載の液体発色試薬。
8. メチレンブルー系発色剤を含み、前記メチレンブルー系発色剤の発色反応を吸光度により測定するための液体発色試薬の安定化方法であって、液体媒体中で前記発色剤と炭素数１２以上の炭化水素鎖を有する第四級アンモニウム又はその塩とを共存させることを特徴とする安定化方法。
9. 前記共存を少なくとも３日間続ける請求項８記載の方法。
10. メチレンブルー系発色剤の発色反応を吸光度の測定により検出及び／又は測定するためのキットであって、
    メチレンブルー系発色剤と、
    炭素数１２以上の炭化水素鎖を有する第四級アンモニウム又はその塩と、
    メチレンブルー系発色剤を発色させる反応に用いる試薬と、
    請求項８又は９に記載の安定化方法を行うための取扱説明書を含むキット。