JP4399556B2 - 酸化発色剤の安定化方法 - Google Patents
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Description
技術分野
本発明は、酸化発色剤を溶液中で安定化する方法および前記方法を用いた酸化発色剤試薬に関する。
背景技術
Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムは、 般に、酸化により発色する高感度発色剤としての使用が知られている。このような高感度発色剤は、例えば、酸化還元酵素により酸化物質と反応させ、その発色量を吸光度測定することによって前記酸化物質の量を決定する場合等に使用できる。このような酵素反応に供する際、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムは、通常、水に溶解してその溶液を調製し、これを液体試薬として使用している。
しかし、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムのような酸化発色剤は水溶液中で不安定なため、一日も経たないうちに自然発色してしまうおそれがあった。このため、溶液状態で保存したＮ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムを使用すると、吸光度測定におけるバックグラウンドが上昇し、測定精度が低下するという問題があった。
このような自然発色による影響を防止するには、測定の度に前記液体試薬を調製することが必要になるが、これでは操作が煩雑になり、コストもかかってしまう。
発明の開示
そこで、本発明の目的は、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムのような酸化発色剤を溶液中で安定化する方法およびその方法を用いた試薬の提供である。
前記目的を達成するために、本発明の酸化発色剤の安定化方法は、前記酸化発色剤を溶液中で安定化する方法であって、前記溶液中にフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（以下、「ＦＡＯＤ」という）およびペルオキシダーゼ（以下、「ＰＯＤ」という）の少なくとも一方を共存させることを特徴とする。前記酸化発色剤としては、例えば、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムがあげられる。
このように、溶液中にＦＡＯＤまたはＰＯＤの少なくとも一方を共存させれば、そのメカニズムは不明であるが、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムのような酸化発色剤の自然発色を抑制できる。これにより、例えば、前記酸化発色剤の溶液状態での保存が可能になり、測定の度に液体試薬を調製する必要がなくなるため、測定等の操作が容易になり、低コスト化も可能となる。さらに、保存した溶液を発色反応の試薬として使用しても、吸光度測定においてバックグラウンドの上昇が抑制されるため、測定精度の向上も可能になる。
本発明の安定化方法において、酸化発色剤の濃度は、１〜１０，０００μｍｏｌ／Ｌの範囲であることが好ましい。
本発明の安定化方法において、ＦＡＯＤの濃度は０．００２〜２００ｇ／Ｌの範囲または０．１〜１０００ＫＵ／Ｌの範囲であることが好ましく、ＰＯＤの濃度は０．０２〜５０ｇ／Ｌの範囲または１〜５０００ＫＵ／Ｌの範囲であることが好ましい。
本発明の安定化方法において、酸化発色剤０．１ｍｍｏｌに対して、ＦＡＯＤは０．０１〜２００ｇの範囲または０．５〜１０００ＫＵの範囲で添加することが好ましく、ＰＯＤは、０．０２〜５０ｇの範囲または１〜５０００ＫＵの範囲で添加することが好ましい。また、前記両酵素を添加する場合は、ＦＡＯＤを０．０１〜１００ｇの範囲または０．５〜６００ＫＵの範囲で添加し、ＰＯＤを０．０２〜５０ｇの範囲または１〜５０００ＫＵの範囲で添加することが好ましい。
本発明の安定化方法において、より一層自然発色を抑制できることから、前記溶液が、ＡＤＡ緩衝液、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液、グリシルグリシン緩衝液、Ｂｉｃｉｎｅ緩衝液およびリン酸緩衝液からなる群から選択された少なくとも一つの緩衝液を含むことが好ましい。
本発明の安定化方法において、さらに、α−トコフェロール酢酸（ＶＥ）、エリソルビン酸カリウムおよびソルビン酸カリウムからなる群から選択された少なくとも一つの酸化防止剤や、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）およびトランス−１，２−ジアミノシクロヘキサン−Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラ酢酸（ＣｙＤＴＡ）、Ｏ，Ｏ’−ビス（２−アミノエチル）エチレングリコール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸（ＧＥＤＴＡ）およびニトリロトリ酢酸（ＮＴＡ）からなる群から選択された少なくとも一つのキレート剤や、アジ化ナトリウム等を共存させることが好ましい。これらの物質を共存させることにより、さらに自然発色を抑制できるからである。なお、これらの物質は、一種類でもよいし二種類以上を共存させてもよい。
つぎに、本発明の酸化発色剤試薬は、前記酸化発色剤を水性溶媒に溶解した試薬溶液であって、さらにＦＡＯＤおよびＰＯＤの少なくとも一方を溶解させた試薬である。前述と同様に、前記酸化発色剤としては、例えば、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム等があげられる。
このような試薬は、放置または保存しても、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムのような酸化発色剤の自然発色が抑制されるため、使用の度に試薬を調製する必要ない。このため、例えば、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムを使用する様々な測定反応等の操作が簡便になる。
発明を実施するための最良の形態
本発明の安定化方法について、酸化発色剤としてＮ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムを使用する一例を説明する。
本発明によるＮ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムの安定化は、例えば、前記Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムと、ＦＡＯＤおよびＰＯＤの少なくとも一方とを、水系の溶媒に溶解し、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム水溶液を調製することにより行うことができる。
前記ＦＡＯＤは、下記式（１）の反応を触媒する酵素であればよく、その起源は特に制限されないが、例えば、市販品である商品名ＦＡＯＸ−Ｅ（キッコーマン社製）、ＦＯＤ（旭化成社製）等が使用できる。
Ｒ１−ＣＯ−ＣＨ２−ＮＨ−Ｒ２ ＋ Ｈ２Ｏ ＋ Ｏ２
→Ｒ１−ＣＯ−ＣＨＯ ＋ ＮＨ２−Ｒ２ ＋ Ｈ２Ｏ２ …（１）
前記式（１）において、Ｒ１は、水酸基もしくは糖化反応前の糖に由来する残基（糖残基）を示す。前記糖残基（Ｒ１）は、反応前の糖がアルドースの場合はアルドース残基であり、反応前の糖がケトースの場合、ケトース残基である。例えば、反応前の糖がグルコースの場合は、アマドリ転位により、反応後の構造はフルクトース構造をとるが、この場合、糖残基（Ｒ１）は、グルコース残基（アルドース残基）となる。この糖残基（Ｒ１）は、例えば、
−［ＣＨ（ＯＨ）］ｎ−ＣＨ２ＯＨ
で示すことができ、ｎは、０〜６の整数である。
前記式（１）において、Ｒ２は、特に制限されないが、例えば、糖化アミノ酸、糖化ペプチドまたは糖化タンパク質の場合、α−アミノ基が糖化されている場合と、それ以外のアミノ基が糖化されている場合とで異なる。
前記式（１）において、α−アミノ基が糖化されている場合、Ｒ２は、下記式（２）で示すアミノ酸残基またはペプチド残基である。
−ＣＨＲ３−ＣＯ−Ｒ４ …（２）
前記式（２）において、Ｒ３はアミノ酸側鎖基を示す。また、Ｒ４は水酸基、アミノ酸残基またはペプチド残基を示し、例えば、下記式（３）で示すことができる。下記式（３）において、ｎは、０以上の整数であり、Ｒ３は、前述と同様にアミノ酸側鎖基を示す。
−（ＮＨ−ＣＨＲ３−ＣＯ）ｎ−ＯＨ …（３）
また、前記式（１）において、α−アミノ基以外のアミノ基が糖化されている（アミノ酸側鎖基が糖化されている）場合、Ｒ２は下記式（４）で示すことができる。
−Ｒ５−ＣＨ（ＮＨ−Ｒ６）−ＣＯ−Ｒ７ …（４）
前記式（４）において、Ｒ５は、アミノ酸側鎖基のうち、糖化されたアミノ基以外の部分を示す。例えば、糖化されたアミノ酸がリジンの場合、Ｒ５は
−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−
であり、
例えば、糖化されたアミノ酸がアルギニンの場合、Ｒ５は、
−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ２）−
である。
また、前記式（４）において、Ｒ６は、水素、アミノ酸残基またはペプチド残基であり、例えば、下記式（５）で示すことができる。なお、下記式（５）において、ｎは０以上の整数であり、Ｒ３は、前述と同様にアミノ酸側鎖基を示す。
−（ＣＯ−ＣＨＲ３−ＮＨ）ｎ−Ｈ …（５）
また、前記式（４）において、Ｒ７は、水酸基、アミノ酸残基またはペプチド残基であり、例えば、下記式（６）で示すことができる。なお、下記式（６）において、ｎは０以上の整数であり、Ｒ３は、前述と同様にアミノ酸側鎖基を示す。
−（ＮＨ−ＣＨＲ３−ＣＯ）ｎ−ＯＨ …（６）
また、ＰＯＤは、下記式（７）の反応を触媒する公知のものが使用できる。なお、下記式（７）において、ＡＨ２は基質を表わし、Ａは特に制限されない。
ＡＨ２ ＋ Ｈ２Ｏ２ → Ａ ＋ ２Ｈ２Ｏ …（７）
前記水溶液におけるＮ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムの濃度は、特に制限されないが、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムの水に対する溶解度等から、前述のように、例えば、１〜１０，０００μｍｏｌ／Ｌの範囲であり、好ましくは１〜１０００μｍｏｌ／Ｌの範囲である。
ＦＡＯＤを添加する場合、その濃度は、前述のように、例えば、０．００２〜２００ｇ／Ｌの範囲であり、好ましくは０．０１〜５０ｇ／Ｌの範囲であり、より好ましくは０．３〜２０ｇ／Ｌの範囲である。また、力価で表わす場合、例えば、０．１〜１０００ＫＵ／Ｌの範囲であり、好ましくは０．５〜３００ＫＵ／Ｌの範囲であり、より好ましくは１〜１５０ＫＵ／Ｌの範囲である。また、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム０．１ｍｍｏｌに対する添加割合は、例えば、０．０１〜２００ｇの範囲であり、好ましくは０．１〜５０ｇの範囲であり、より好ましくは０．６〜２０ｇの範囲であり、力価で示すと、例えば、０．５〜１０００ＫＵの範囲であり、好ましくは１〜３００ＫＵの範囲であり、より好ましくは２〜１００ＫＵの範囲である。
ＰＯＤを添加する場合、その濃度は、前述のように、例えば、０．０２〜５０ｇ／Ｌの範囲であり、好ましくは０．２〜１０ｇ／Ｌの範囲である。また、力価で表わす場合、例えば、１〜５０００ＫＵ／Ｌの範囲であり、好ましくは５〜１０００ＫＵ／Ｌの範囲である。また、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム０．１ｍｍｏｌに対する添加割合は、例えば、ＰＯＤ ０．０２〜５０ｇの範囲であり、好ましくは０．２〜１０ｇの範囲であり、力価で示すと、例えば、１〜５０００ＫＵの範囲であり、好ましくは５〜１０００ＫＵの範囲である。
また、ＦＡＯＤおよびＰＯＤの両方を添加してもよく、その場合は、例えば、ＦＡＯＤ ０．００２〜１００ｇ／Ｌ、ＰＯＤ ０．０２〜５０ｇ／Ｌの範囲であり、好ましくはＦＡＯＤ ０．０１〜５０ｇ／Ｌ、ＰＯＤ ０．２〜１０ｇ／Ｌの範囲であり、より好ましくはＦＡＯＤ ０．３〜２０ｇ／Ｌ、ＰＯＤ ０．２〜１０ｇ／Ｌの範囲である。また、力価で表わす場合、例えば、ＦＡＯＤ ０．１〜６００ＫＵ／Ｌ、ＰＯＤ １〜５０００ＫＵ／Ｌの範囲であり、好ましくはＦＡＯＤ ０．５〜３００ＫＵ／Ｌ、ＰＯＤ ５〜１０００ＫＵ／Ｌの範囲であり、より好ましくはＦＡＯＤ １〜１５０ＫＵ／Ｌ、ＰＯＤ ５〜１０００ＫＵ／Ｌの範囲である。
Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム０．１ｍｏｌに対する添加割合は、例えば、ＦＡＯＤ ０．０１〜１００ｇ、ＰＯＤ ０．０２〜５０ｇの範囲であり、好ましくはＦＡＯＤ ０．１〜５０ｇ、ＰＯＤ ０．２〜１０ｇの範囲であり、より好ましくはＦＡＯＤ ０．６〜２０ｇ、ＰＯＤ ０．２〜１０ｇの範囲である。また、力価で示すと、ＦＡＯＤ ０．５〜６００ＫＵ、ＰＯＤ １〜５０００ＫＵの範囲であり、好ましくはＦＡＯＤ １〜３００ＫＵ、ＰＯＤ ５〜１０００ＫＵの範囲であり、より好ましくはＦＡＯＤ ２〜１００ＫＵ、ＰＯＤ ５〜１０００ＫＵの範囲である。
また、ＦＡＯＤ（Ａ）とＰＯＤ（Ｂ）との添加割合（Ａ：Ｂ）は、重量比の場合、例えば、Ａ：Ｂ＝１００：０〜０：１００の範囲である。
前記水系の溶媒としては、例えば、水、各種緩衝液等が使用できる。この中でも、より一層Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムの自然発色を抑制できることから、各種緩衝液が好ましい。前記緩衝液としては、例えば、前述のようなＡＤＡ緩衝液、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液、グリシルグリシン緩衝液、Ｂｉｃｉｎｅ緩衝液、リン酸カリウム緩衝液（ＫＰＢ）等のリン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＨＥＰＳＯ緩衝液等が使用でき、好ましくはＡＤＡ緩衝液、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、リン酸緩衝液である。前記緩衝液のｐＨとしては、例えば、ｐＨ５．０〜９．０の範囲であり、好ましくは６．０〜８．０の範囲である。
また、前記緩衝液の濃度は、特に制限されず、例えば、１〜１０００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であるが、相対的に高濃度であるほうがＮ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムの自然発色を抑制できるため、好ましくは５０〜８００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、より好ましくは１００〜５００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。
また、調製した前記水溶液のｐＨは、特に制限されないが、例えば、ｐＨ５．０〜９．０の範囲であり、好ましくは６．０〜８．０の範囲である。
このようなＮ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム水溶液は、前記ＦＡＯＤおよびＰＯＤの少なくとも一方との共存によって安定化されるため、溶液状態での保存が可能になる。この保存温度は、特に制限されないが、例えば、０〜４０℃の範囲であり、好ましくは０〜２５℃の範囲であり、より好ましくは０〜１０℃の範囲である。
ＦＡＯＤおよびＰＯＤのいずれも添加しない場合、１０℃で保存すると、発色したＮ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムの吸収波長７２７ｎｍにおける吸光度は、５日間保存した場合で、例えば、２〜３倍に増加し、１８日間保存した場合で、例えば、１０〜１１倍に増加してしまう。これに対し、本発明により安定化させれば、１０℃で保存しても、例えば、９日間は、自然発色が防止でき、好ましくは１〜５日間である。
また、本発明の安定化方法においては、ＦＡＯＤおよびＰＯＤだけでなく、さらに、前述のような酸化防止剤、前記キレート剤、アジ化ナトリウム等を共存させてもよい。これらの中でも好ましくは、前記キレート剤、アジ化ナトリウムである。
前記酸化防止剤としては、前述のようなＶＥ、エリソルビン酸カリウム、ソルビン酸カリウム等が使用できる。前記酸化防止剤の添加割合としては、例えば、０．１〜１０００μｍｏｌ／Ｌの範囲であり、好ましくは０．２〜１００μｍｏｌ／Ｌの範囲であり、より好ましくは０．５〜２０μｍｏｌ／Ｌの範囲である。また、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム０．１ｍｍｏｌに対して、例えば、例えば、０．１〜１００μｍｏｌの範囲であり、好ましくは０．２〜２０μｍｏｌの範囲である。
前記キレート剤としては、前述のようにＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ＣｙＤＴＡ、ＧＥＤＴＡ、ＮＴＡ等が使用でき、好ましくはＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ＣｙＤＴＡである。前記キレート剤の添加割合としては、例えば、０．０１〜２０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、好ましくは０．０５〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、より好ましくは０．１〜５ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。また、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム０．１ｍｍｏｌに対して、例えば、０．０２〜１５ｍｍｏｌの範囲であり、好ましくは０．０５〜１０ｍｍｏｌの範囲であり、より好ましくは０．１〜５ｍｍｏｌの範囲である。
前記アジ化ナトリウムの添加割合としては、例えば、０．０１〜２０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、好ましくは０．０５〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、より好ましくは０．１〜５ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。また、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム０．１ｍｍｏｌに対して、例えば、０．０１〜１０ｍｍｏｌの範囲であり、好ましくは０．０５〜５ｍｍｏｌの範囲であり、より好ましくは０．１〜２ｍｍｏｌの範囲である。
このような方法で安定化されたＮ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムは、例えば、長期間溶液状態で保存しても、前述のように自然発色が抑制されるため、液体試薬として有用である。前記Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム試薬の用途としては、特に制限されないが、例えば、前述のように酸化還元反応における発色基質等として使用できる。このような反応に利用した場合、前述のように自然発色が抑制されるため、吸光度測定におけるバックグラウンドの上昇が抑制され、各種測定の精度を向上することもできる。なお、前記本発明の安定化方法と同様に、各種緩衝液、酸化防止剤、界面活性剤、キレート剤、アジ化ナトリウム等を添加することが好ましい。
（実施例）
（実施例１〜３および比較例１）
この実施例は、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムを、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中においてＦＡＯＤおよびＰＯＤと共存させた場合の安定性（吸光度変化）を調べた例である。
２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）に、０．０８８ｍＭの濃度になるようにＮ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム（商品名ＤＡ−６４、和光純薬工業社製、以下、「ＤＡ−６４」という）を添加した。このＤＡ−６４溶液に、ＦＡＯＤ（商品名ＦＯＤ、旭化成社製）、ＰＯＤ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を以下の濃度になるように添加したサンプルを調製し、これらのサンプルを１０℃で所定の時間（調製直後、５日、９日、１８日）保存した際の吸収スペクトルを、自動分析装置（商品名ＪＣＡ−ＢＭ８、日本電子社製）を用いて測定した。比較例は、ＦＡＯＤおよびＰＯＤが無添加である以外は、前記実施例と同様にしてサンプルを調製し、吸収スペクトルを測定した。
これらの結果を図１〜４に示す。なお、図１は実施例１、図２は実施例２、図３は実施例３、図４は比較例１の吸収スペクトルを、保存日数ごとに示したグラフである。
図示のように、ＦＡＯＤまたはＰＯＤを添加した実施例１〜３によれば、発色したＤＡ−６４の吸収波長７２７ｎｍにおける吸光度の増加は、保存期間が長くなっても、比較例に比べて、約１／２〜１／１０に抑制された。特に、ＦＡＯＤおよびＰＯＤの両方を添加した実施例３については、最も自然発色が抑制された。
産業上の利用の可能性
以上のように、本発明の安定化方法によれば、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムのような酸化発色剤を溶液状態で安定に保存することができる。このため、例えば、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム等の酸化発色剤の液体試薬が必要な場合でも、使用の度に試薬を調製する必要がないため、試薬の低コスト化が可能となり、操作も簡便なものとなる。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明の安定化方法の一実施例において、緩衝液中でＦＡＯＤを共存させた場合のＤＡ−６４の吸光度スペクトルを示したグラフである。
図２は、本発明の安定化方法のその他の実施例において、緩衝液中でＰＯＤを共存させた場合のＤＡ−６４の吸光度スペクトルを示したグラフである。
図３は、本発明の安定化方法のさらにその他の実施例において、緩衝液中でＦＡＯＤおよびＰＯＤを共存させた場合のＤＡ−６４の吸光度スペクトルを示したグラフである。
図４は、比較例において、緩衝液中のＤＡ−６４の吸光度スペクトルを示したグラフである。
本発明は、酸化発色剤を溶液中で安定化する方法および前記方法を用いた酸化発色剤試薬に関する。
背景技術
Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムは、 般に、酸化により発色する高感度発色剤としての使用が知られている。このような高感度発色剤は、例えば、酸化還元酵素により酸化物質と反応させ、その発色量を吸光度測定することによって前記酸化物質の量を決定する場合等に使用できる。このような酵素反応に供する際、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムは、通常、水に溶解してその溶液を調製し、これを液体試薬として使用している。
しかし、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムのような酸化発色剤は水溶液中で不安定なため、一日も経たないうちに自然発色してしまうおそれがあった。このため、溶液状態で保存したＮ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムを使用すると、吸光度測定におけるバックグラウンドが上昇し、測定精度が低下するという問題があった。
このような自然発色による影響を防止するには、測定の度に前記液体試薬を調製することが必要になるが、これでは操作が煩雑になり、コストもかかってしまう。
発明の開示
そこで、本発明の目的は、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムのような酸化発色剤を溶液中で安定化する方法およびその方法を用いた試薬の提供である。
前記目的を達成するために、本発明の酸化発色剤の安定化方法は、前記酸化発色剤を溶液中で安定化する方法であって、前記溶液中にフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（以下、「ＦＡＯＤ」という）およびペルオキシダーゼ（以下、「ＰＯＤ」という）の少なくとも一方を共存させることを特徴とする。前記酸化発色剤としては、例えば、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムがあげられる。
このように、溶液中にＦＡＯＤまたはＰＯＤの少なくとも一方を共存させれば、そのメカニズムは不明であるが、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムのような酸化発色剤の自然発色を抑制できる。これにより、例えば、前記酸化発色剤の溶液状態での保存が可能になり、測定の度に液体試薬を調製する必要がなくなるため、測定等の操作が容易になり、低コスト化も可能となる。さらに、保存した溶液を発色反応の試薬として使用しても、吸光度測定においてバックグラウンドの上昇が抑制されるため、測定精度の向上も可能になる。
本発明の安定化方法において、酸化発色剤の濃度は、１〜１０，０００μｍｏｌ／Ｌの範囲であることが好ましい。
本発明の安定化方法において、ＦＡＯＤの濃度は０．００２〜２００ｇ／Ｌの範囲または０．１〜１０００ＫＵ／Ｌの範囲であることが好ましく、ＰＯＤの濃度は０．０２〜５０ｇ／Ｌの範囲または１〜５０００ＫＵ／Ｌの範囲であることが好ましい。
本発明の安定化方法において、酸化発色剤０．１ｍｍｏｌに対して、ＦＡＯＤは０．０１〜２００ｇの範囲または０．５〜１０００ＫＵの範囲で添加することが好ましく、ＰＯＤは、０．０２〜５０ｇの範囲または１〜５０００ＫＵの範囲で添加することが好ましい。また、前記両酵素を添加する場合は、ＦＡＯＤを０．０１〜１００ｇの範囲または０．５〜６００ＫＵの範囲で添加し、ＰＯＤを０．０２〜５０ｇの範囲または１〜５０００ＫＵの範囲で添加することが好ましい。
本発明の安定化方法において、より一層自然発色を抑制できることから、前記溶液が、ＡＤＡ緩衝液、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液、グリシルグリシン緩衝液、Ｂｉｃｉｎｅ緩衝液およびリン酸緩衝液からなる群から選択された少なくとも一つの緩衝液を含むことが好ましい。
本発明の安定化方法において、さらに、α−トコフェロール酢酸（ＶＥ）、エリソルビン酸カリウムおよびソルビン酸カリウムからなる群から選択された少なくとも一つの酸化防止剤や、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）およびトランス−１，２−ジアミノシクロヘキサン−Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラ酢酸（ＣｙＤＴＡ）、Ｏ，Ｏ’−ビス（２−アミノエチル）エチレングリコール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸（ＧＥＤＴＡ）およびニトリロトリ酢酸（ＮＴＡ）からなる群から選択された少なくとも一つのキレート剤や、アジ化ナトリウム等を共存させることが好ましい。これらの物質を共存させることにより、さらに自然発色を抑制できるからである。なお、これらの物質は、一種類でもよいし二種類以上を共存させてもよい。
つぎに、本発明の酸化発色剤試薬は、前記酸化発色剤を水性溶媒に溶解した試薬溶液であって、さらにＦＡＯＤおよびＰＯＤの少なくとも一方を溶解させた試薬である。前述と同様に、前記酸化発色剤としては、例えば、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム等があげられる。
このような試薬は、放置または保存しても、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムのような酸化発色剤の自然発色が抑制されるため、使用の度に試薬を調製する必要ない。このため、例えば、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムを使用する様々な測定反応等の操作が簡便になる。
発明を実施するための最良の形態
本発明の安定化方法について、酸化発色剤としてＮ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムを使用する一例を説明する。
本発明によるＮ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムの安定化は、例えば、前記Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムと、ＦＡＯＤおよびＰＯＤの少なくとも一方とを、水系の溶媒に溶解し、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム水溶液を調製することにより行うことができる。
前記ＦＡＯＤは、下記式（１）の反応を触媒する酵素であればよく、その起源は特に制限されないが、例えば、市販品である商品名ＦＡＯＸ−Ｅ（キッコーマン社製）、ＦＯＤ（旭化成社製）等が使用できる。
Ｒ１−ＣＯ−ＣＨ２−ＮＨ−Ｒ２ ＋ Ｈ２Ｏ ＋ Ｏ２
→Ｒ１−ＣＯ−ＣＨＯ ＋ ＮＨ２−Ｒ２ ＋ Ｈ２Ｏ２ …（１）
前記式（１）において、Ｒ１は、水酸基もしくは糖化反応前の糖に由来する残基（糖残基）を示す。前記糖残基（Ｒ１）は、反応前の糖がアルドースの場合はアルドース残基であり、反応前の糖がケトースの場合、ケトース残基である。例えば、反応前の糖がグルコースの場合は、アマドリ転位により、反応後の構造はフルクトース構造をとるが、この場合、糖残基（Ｒ１）は、グルコース残基（アルドース残基）となる。この糖残基（Ｒ１）は、例えば、
−［ＣＨ（ＯＨ）］ｎ−ＣＨ２ＯＨ
で示すことができ、ｎは、０〜６の整数である。
前記式（１）において、Ｒ２は、特に制限されないが、例えば、糖化アミノ酸、糖化ペプチドまたは糖化タンパク質の場合、α−アミノ基が糖化されている場合と、それ以外のアミノ基が糖化されている場合とで異なる。
前記式（１）において、α−アミノ基が糖化されている場合、Ｒ２は、下記式（２）で示すアミノ酸残基またはペプチド残基である。
−ＣＨＲ３−ＣＯ−Ｒ４ …（２）
前記式（２）において、Ｒ３はアミノ酸側鎖基を示す。また、Ｒ４は水酸基、アミノ酸残基またはペプチド残基を示し、例えば、下記式（３）で示すことができる。下記式（３）において、ｎは、０以上の整数であり、Ｒ３は、前述と同様にアミノ酸側鎖基を示す。
−（ＮＨ−ＣＨＲ３−ＣＯ）ｎ−ＯＨ …（３）
また、前記式（１）において、α−アミノ基以外のアミノ基が糖化されている（アミノ酸側鎖基が糖化されている）場合、Ｒ２は下記式（４）で示すことができる。
−Ｒ５−ＣＨ（ＮＨ−Ｒ６）−ＣＯ−Ｒ７ …（４）
前記式（４）において、Ｒ５は、アミノ酸側鎖基のうち、糖化されたアミノ基以外の部分を示す。例えば、糖化されたアミノ酸がリジンの場合、Ｒ５は
−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−
であり、
例えば、糖化されたアミノ酸がアルギニンの場合、Ｒ５は、
−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ２）−
である。
また、前記式（４）において、Ｒ６は、水素、アミノ酸残基またはペプチド残基であり、例えば、下記式（５）で示すことができる。なお、下記式（５）において、ｎは０以上の整数であり、Ｒ３は、前述と同様にアミノ酸側鎖基を示す。
−（ＣＯ−ＣＨＲ３−ＮＨ）ｎ−Ｈ …（５）
また、前記式（４）において、Ｒ７は、水酸基、アミノ酸残基またはペプチド残基であり、例えば、下記式（６）で示すことができる。なお、下記式（６）において、ｎは０以上の整数であり、Ｒ３は、前述と同様にアミノ酸側鎖基を示す。
−（ＮＨ−ＣＨＲ３−ＣＯ）ｎ−ＯＨ …（６）
また、ＰＯＤは、下記式（７）の反応を触媒する公知のものが使用できる。なお、下記式（７）において、ＡＨ２は基質を表わし、Ａは特に制限されない。
ＡＨ２ ＋ Ｈ２Ｏ２ → Ａ ＋ ２Ｈ２Ｏ …（７）
前記水溶液におけるＮ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムの濃度は、特に制限されないが、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムの水に対する溶解度等から、前述のように、例えば、１〜１０，０００μｍｏｌ／Ｌの範囲であり、好ましくは１〜１０００μｍｏｌ／Ｌの範囲である。
ＦＡＯＤを添加する場合、その濃度は、前述のように、例えば、０．００２〜２００ｇ／Ｌの範囲であり、好ましくは０．０１〜５０ｇ／Ｌの範囲であり、より好ましくは０．３〜２０ｇ／Ｌの範囲である。また、力価で表わす場合、例えば、０．１〜１０００ＫＵ／Ｌの範囲であり、好ましくは０．５〜３００ＫＵ／Ｌの範囲であり、より好ましくは１〜１５０ＫＵ／Ｌの範囲である。また、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム０．１ｍｍｏｌに対する添加割合は、例えば、０．０１〜２００ｇの範囲であり、好ましくは０．１〜５０ｇの範囲であり、より好ましくは０．６〜２０ｇの範囲であり、力価で示すと、例えば、０．５〜１０００ＫＵの範囲であり、好ましくは１〜３００ＫＵの範囲であり、より好ましくは２〜１００ＫＵの範囲である。
ＰＯＤを添加する場合、その濃度は、前述のように、例えば、０．０２〜５０ｇ／Ｌの範囲であり、好ましくは０．２〜１０ｇ／Ｌの範囲である。また、力価で表わす場合、例えば、１〜５０００ＫＵ／Ｌの範囲であり、好ましくは５〜１０００ＫＵ／Ｌの範囲である。また、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム０．１ｍｍｏｌに対する添加割合は、例えば、ＰＯＤ ０．０２〜５０ｇの範囲であり、好ましくは０．２〜１０ｇの範囲であり、力価で示すと、例えば、１〜５０００ＫＵの範囲であり、好ましくは５〜１０００ＫＵの範囲である。
また、ＦＡＯＤおよびＰＯＤの両方を添加してもよく、その場合は、例えば、ＦＡＯＤ ０．００２〜１００ｇ／Ｌ、ＰＯＤ ０．０２〜５０ｇ／Ｌの範囲であり、好ましくはＦＡＯＤ ０．０１〜５０ｇ／Ｌ、ＰＯＤ ０．２〜１０ｇ／Ｌの範囲であり、より好ましくはＦＡＯＤ ０．３〜２０ｇ／Ｌ、ＰＯＤ ０．２〜１０ｇ／Ｌの範囲である。また、力価で表わす場合、例えば、ＦＡＯＤ ０．１〜６００ＫＵ／Ｌ、ＰＯＤ １〜５０００ＫＵ／Ｌの範囲であり、好ましくはＦＡＯＤ ０．５〜３００ＫＵ／Ｌ、ＰＯＤ ５〜１０００ＫＵ／Ｌの範囲であり、より好ましくはＦＡＯＤ １〜１５０ＫＵ／Ｌ、ＰＯＤ ５〜１０００ＫＵ／Ｌの範囲である。
Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム０．１ｍｏｌに対する添加割合は、例えば、ＦＡＯＤ ０．０１〜１００ｇ、ＰＯＤ ０．０２〜５０ｇの範囲であり、好ましくはＦＡＯＤ ０．１〜５０ｇ、ＰＯＤ ０．２〜１０ｇの範囲であり、より好ましくはＦＡＯＤ ０．６〜２０ｇ、ＰＯＤ ０．２〜１０ｇの範囲である。また、力価で示すと、ＦＡＯＤ ０．５〜６００ＫＵ、ＰＯＤ １〜５０００ＫＵの範囲であり、好ましくはＦＡＯＤ １〜３００ＫＵ、ＰＯＤ ５〜１０００ＫＵの範囲であり、より好ましくはＦＡＯＤ ２〜１００ＫＵ、ＰＯＤ ５〜１０００ＫＵの範囲である。
また、ＦＡＯＤ（Ａ）とＰＯＤ（Ｂ）との添加割合（Ａ：Ｂ）は、重量比の場合、例えば、Ａ：Ｂ＝１００：０〜０：１００の範囲である。
前記水系の溶媒としては、例えば、水、各種緩衝液等が使用できる。この中でも、より一層Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムの自然発色を抑制できることから、各種緩衝液が好ましい。前記緩衝液としては、例えば、前述のようなＡＤＡ緩衝液、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液、グリシルグリシン緩衝液、Ｂｉｃｉｎｅ緩衝液、リン酸カリウム緩衝液（ＫＰＢ）等のリン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＨＥＰＳＯ緩衝液等が使用でき、好ましくはＡＤＡ緩衝液、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、リン酸緩衝液である。前記緩衝液のｐＨとしては、例えば、ｐＨ５．０〜９．０の範囲であり、好ましくは６．０〜８．０の範囲である。
また、前記緩衝液の濃度は、特に制限されず、例えば、１〜１０００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であるが、相対的に高濃度であるほうがＮ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムの自然発色を抑制できるため、好ましくは５０〜８００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、より好ましくは１００〜５００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。
また、調製した前記水溶液のｐＨは、特に制限されないが、例えば、ｐＨ５．０〜９．０の範囲であり、好ましくは６．０〜８．０の範囲である。
このようなＮ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム水溶液は、前記ＦＡＯＤおよびＰＯＤの少なくとも一方との共存によって安定化されるため、溶液状態での保存が可能になる。この保存温度は、特に制限されないが、例えば、０〜４０℃の範囲であり、好ましくは０〜２５℃の範囲であり、より好ましくは０〜１０℃の範囲である。
ＦＡＯＤおよびＰＯＤのいずれも添加しない場合、１０℃で保存すると、発色したＮ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムの吸収波長７２７ｎｍにおける吸光度は、５日間保存した場合で、例えば、２〜３倍に増加し、１８日間保存した場合で、例えば、１０〜１１倍に増加してしまう。これに対し、本発明により安定化させれば、１０℃で保存しても、例えば、９日間は、自然発色が防止でき、好ましくは１〜５日間である。
また、本発明の安定化方法においては、ＦＡＯＤおよびＰＯＤだけでなく、さらに、前述のような酸化防止剤、前記キレート剤、アジ化ナトリウム等を共存させてもよい。これらの中でも好ましくは、前記キレート剤、アジ化ナトリウムである。
前記酸化防止剤としては、前述のようなＶＥ、エリソルビン酸カリウム、ソルビン酸カリウム等が使用できる。前記酸化防止剤の添加割合としては、例えば、０．１〜１０００μｍｏｌ／Ｌの範囲であり、好ましくは０．２〜１００μｍｏｌ／Ｌの範囲であり、より好ましくは０．５〜２０μｍｏｌ／Ｌの範囲である。また、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム０．１ｍｍｏｌに対して、例えば、例えば、０．１〜１００μｍｏｌの範囲であり、好ましくは０．２〜２０μｍｏｌの範囲である。
前記キレート剤としては、前述のようにＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ＣｙＤＴＡ、ＧＥＤＴＡ、ＮＴＡ等が使用でき、好ましくはＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ＣｙＤＴＡである。前記キレート剤の添加割合としては、例えば、０．０１〜２０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、好ましくは０．０５〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、より好ましくは０．１〜５ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。また、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム０．１ｍｍｏｌに対して、例えば、０．０２〜１５ｍｍｏｌの範囲であり、好ましくは０．０５〜１０ｍｍｏｌの範囲であり、より好ましくは０．１〜５ｍｍｏｌの範囲である。
前記アジ化ナトリウムの添加割合としては、例えば、０．０１〜２０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、好ましくは０．０５〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、より好ましくは０．１〜５ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。また、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム０．１ｍｍｏｌに対して、例えば、０．０１〜１０ｍｍｏｌの範囲であり、好ましくは０．０５〜５ｍｍｏｌの範囲であり、より好ましくは０．１〜２ｍｍｏｌの範囲である。
このような方法で安定化されたＮ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムは、例えば、長期間溶液状態で保存しても、前述のように自然発色が抑制されるため、液体試薬として有用である。前記Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム試薬の用途としては、特に制限されないが、例えば、前述のように酸化還元反応における発色基質等として使用できる。このような反応に利用した場合、前述のように自然発色が抑制されるため、吸光度測定におけるバックグラウンドの上昇が抑制され、各種測定の精度を向上することもできる。なお、前記本発明の安定化方法と同様に、各種緩衝液、酸化防止剤、界面活性剤、キレート剤、アジ化ナトリウム等を添加することが好ましい。
（実施例）
（実施例１〜３および比較例１）
この実施例は、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムを、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中においてＦＡＯＤおよびＰＯＤと共存させた場合の安定性（吸光度変化）を調べた例である。
２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）に、０．０８８ｍＭの濃度になるようにＮ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム（商品名ＤＡ−６４、和光純薬工業社製、以下、「ＤＡ−６４」という）を添加した。このＤＡ−６４溶液に、ＦＡＯＤ（商品名ＦＯＤ、旭化成社製）、ＰＯＤ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を以下の濃度になるように添加したサンプルを調製し、これらのサンプルを１０℃で所定の時間（調製直後、５日、９日、１８日）保存した際の吸収スペクトルを、自動分析装置（商品名ＪＣＡ−ＢＭ８、日本電子社製）を用いて測定した。比較例は、ＦＡＯＤおよびＰＯＤが無添加である以外は、前記実施例と同様にしてサンプルを調製し、吸収スペクトルを測定した。
図示のように、ＦＡＯＤまたはＰＯＤを添加した実施例１〜３によれば、発色したＤＡ−６４の吸収波長７２７ｎｍにおける吸光度の増加は、保存期間が長くなっても、比較例に比べて、約１／２〜１／１０に抑制された。特に、ＦＡＯＤおよびＰＯＤの両方を添加した実施例３については、最も自然発色が抑制された。
産業上の利用の可能性
以上のように、本発明の安定化方法によれば、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムのような酸化発色剤を溶液状態で安定に保存することができる。このため、例えば、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム等の酸化発色剤の液体試薬が必要な場合でも、使用の度に試薬を調製する必要がないため、試薬の低コスト化が可能となり、操作も簡便なものとなる。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明の安定化方法の一実施例において、緩衝液中でＦＡＯＤを共存させた場合のＤＡ−６４の吸光度スペクトルを示したグラフである。
図２は、本発明の安定化方法のその他の実施例において、緩衝液中でＰＯＤを共存させた場合のＤＡ−６４の吸光度スペクトルを示したグラフである。
図３は、本発明の安定化方法のさらにその他の実施例において、緩衝液中でＦＡＯＤおよびＰＯＤを共存させた場合のＤＡ−６４の吸光度スペクトルを示したグラフである。
図４は、比較例において、緩衝液中のＤＡ−６４の吸光度スペクトルを示したグラフである。
Claims (12)
- 酸化発色剤であるＮ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４'−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムを溶液中で安定化する方法であって、前記溶液中にフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、又は、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼおよびペルオキシダーゼを共存させることを特徴とする安定化方法。
- 酸化発色剤の濃度が１〜１０，０００μｍｏｌ／Ｌの範囲である請求項１記載の安定化方法。
- フルクトシルアミノ酸オキシダーゼの濃度が０．００２〜２００ｇ／Ｌの範囲または０．１〜１０００ＫＵ／Ｌの範囲である請求項１又は２に記載の安定化方法。
- ペルオキシダーゼの濃度が０．０２〜５０ｇ／Ｌの範囲または１〜５０００ＫＵ／Ｌの範囲である請求項１から３のいずれか一項に記載の安定化方法。
- 酸化発色剤０．１ｍｍｏｌに対して、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼを０．０１〜２００ｇの範囲または０．５〜１０００ＫＵの範囲で添加し、ペルオキシダーゼを０．０２〜５０ｇの範囲または１〜５０００ＫＵの範囲で添加する請求項１から４のいずれか一項に記載の安定化方法。
- 溶液が、ＡＤＡ緩衝液、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液、グリシルグリシン緩衝液、Ｂｉｃｉｎｅ緩衝液およびリン酸緩衝液からなる群から選択された少なくとも一つの緩衝液を含む請求項１から５のいずれか一項に記載の安定化方法。
- さらに、α−トコフェロール酢酸（ＶＥ）、エリソルビン酸カリウムおよびソルビン酸カリウムからなる群から選択された少なくとも一つの酸化防止剤を共存させる請求項１から６のいずれか一項に記載の安定化方法。
- さらに、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、トランス−１，２−ジアミノシクロヘキサン−Ｎ、Ｎ、Ｎ'、Ｎ'−テトラ酢酸（ＣｙＤＴＡ）、Ｏ，Ｏ'−ビス（２−アミノエチル）エチレングリコール−Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラ酢酸（ＧＥＤＴＡ）およびニトリロトリ酢酸（ＮＴＡ）からなる群から選択された少なくとも一つのキレート剤を共存させる請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
- さらに、アジ化ナトリウムを共存させる請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
- 溶液のｐＨが５．０〜９．０の範囲である請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
- 溶液の温度が、０〜４０℃の範囲である請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
- 酸化発色剤であるＮ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４'−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムを水性溶媒に溶解状態で含み、さらにフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、又は、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼおよびペルオキシダーゼを溶解状態で含む試薬溶液であって、請求項１から１１のいずれかに記載の安定化方法を１日間以上行うための、又は、請求項１から１１のいずれか記載の安定化方法を少なくとも１日間行った、試薬溶液。
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| US8080423B2 (en) | 2004-08-05 | 2011-12-20 | Asahi Kasei Pharma Corporation | Reagent containing protease reaction promoter and/or colorant stabilizer |
| JP4889396B2 (ja) * | 2005-07-27 | 2012-03-07 | 積水メディカル株式会社 | ロイコ色素の安定化方法 |
| US20070031914A1 (en) * | 2005-08-05 | 2007-02-08 | Wei Zhu | Devices for analyte assays and methods of use |
| JP4697809B2 (ja) * | 2007-02-22 | 2011-06-08 | 旭化成ファーマ株式会社 | ロイコ色素の安定化方法 |
| WO2009069310A1 (ja) * | 2007-11-28 | 2009-06-04 | Sekisui Medical Co., Ltd. | フェノチアジン系酸化発色剤及びプロテアーゼ含有水溶液の安定化方法 |
| JP2011026359A (ja) * | 2007-11-28 | 2011-02-10 | Sekisui Medical Co Ltd | フェノチアジン系酸化発色剤含有水溶液の安定化方法 |
| US9994827B2 (en) * | 2012-01-13 | 2018-06-12 | Toyobo Co., Ltd. | Method for producing fructosyl valyl histidine oxidase preparation |
| CN103884563B (zh) * | 2014-04-10 | 2016-08-17 | 上海太阳生物技术有限公司 | 过氧化物酶（pox）染色液（化学染色法） |
| CN108690868B (zh) * | 2017-04-10 | 2021-11-16 | 广州市伊川生物科技有限公司 | 一种腺苷脱氨酶测定试剂盒及其测定方法 |
| CN107907534A (zh) * | 2018-01-18 | 2018-04-13 | 深圳市安帝宝科技有限公司 | 一种用于1,5‑脱水‑d‑山梨醇检测显色试剂 |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6152300A (ja) * | 1984-08-22 | 1986-03-14 | Eiken Kagaku Kk | 過酸化水素測定用組成物 |
| WO1990002339A1 (en) * | 1988-08-16 | 1990-03-08 | Cetus Corporation | Stable indicator solutions for detection of peroxidatic activity |
| JPH07116382B2 (ja) * | 1992-01-28 | 1995-12-13 | 株式会社同仁化学研究所 | 水溶性メチレンビスジアルキルアニリン誘導体及びその塩類並びにそれらを用いた過酸化物質定量用組成物 |
| US5712138A (en) * | 1994-10-05 | 1998-01-27 | Kyoto Daiichi Kagaku Co., Ltd. | Fructosyl amino acid oxidase |
| EP0737744B1 (en) * | 1995-04-11 | 2005-11-30 | ARKRAY, Inc | Fructosyl amino acid oxidase and process for producing the same |
| JPH09201397A (ja) * | 1996-01-26 | 1997-08-05 | Kyowa Medex Co Ltd | 液状診断薬の保存方法 |
| EP0921198B1 (en) * | 1997-04-24 | 2006-07-19 | ARKRAY, Inc | Method for enzymatically assaying saccharification protein |
| US6352835B1 (en) * | 1998-11-17 | 2002-03-05 | Kyoto Daiichi Kagaku Co. Ltd. | Method of measuring substance in sample using a redox reaction |
| CN1214106C (zh) * | 1999-02-22 | 2005-08-10 | 爱科来株式会社 | 释放a氨基糖化的氨基酸的酶，产生该酶的菌体以及该酶的应用 |
| JP4613282B2 (ja) * | 1999-04-12 | 2011-01-12 | アークレイ株式会社 | α−糖化アミノ酸遊離酵素 |
| USRE46105E1 (en) * | 2000-07-14 | 2016-08-16 | Arkray, Inc. | Method of selectively determining glycated hemoglobin |
| WO2002027331A1 (fr) * | 2000-09-28 | 2002-04-04 | Arkray, Inc. | Methode d'analyse utilisant une reaction d'oxydo-reduction |
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