CN1910458B - 蛋白质测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种根据使液体试样与蛋白质测定用指示剂共存时的显色程度，测定蛋白质的技术。本发明涉及一种在取得反映液体试样中肌酸酐浓度的信息之后，根据上述信息，消除肌酸酐对测定蛋白质浓度时的影响量的蛋白质测定方法。

Description

蛋白质测定方法
技术领域
本发明涉及测定液体试样中的蛋白质的技术。
背景技术
血液中含有用于维持生命的多种蛋白质。在这些蛋白质中，含量最多的是白蛋白，白蛋白在其机能中发挥着重要的作用。
血液中的白蛋白不仅起到能够溶解脂质或与有害于生物体的代谢产物结合，将这些运回肝脏的功能，而且在保证血液的渗透压方面也起着重要的作用。另一方面，尿中也存在着极少量的白蛋白。尿中的白蛋白含量反映了例如肾脏中的肾小球的过滤机能。即，当尿中的白蛋白含量增加时，有可能肾脏中肾小球过滤机能降低。因此，如果无视尿中的白蛋白量的增加状态，就有可能导致蛋白尿，陷于慢性肾炎、肾衰竭等状态。出现这种疾病的情况下，就需要做透析治疗，根据情况，就演变成除肾脏移植以外，再没有其他治疗方法的局面。因此，测定尿中的白蛋白含量在早期发现肾功能障碍方面具有重要意义。
就可适用于白蛋白等蛋白质测定的技术而言，有人开发出被称为免疫色谱法的简便测定方法(例如，参照专利文献1、2)。可在产生毛细管作用的带状物(strip)上，分别在第一区域固定标识抗体，在第二区域固定捕捉用抗体(抗白蛋白抗体)的分析要素下实现上述方法。更具体而言，向第一区域供给液体试样(例如尿)，利用带状物的毛细管作用使标识抗体与液体试样一起移动到第二区域。此时，在液体试样中含有作为检测对象的抗原(白蛋白)的情况下，抗原与标识抗体一边结合，一边移动到第二区域。在第二区域中，利用捕捉用抗体捕捉抗原-标识抗体复合体。因此，在上述分析要素下，根据第二区域的抗原-标识抗体复合体的色调，就能通过目视定性判断尿中是否含有规定量以上的蛋白质。
由于免疫色谱法是通过目视判定阴性还是阳性的定性方法，因此是一种有效的预先检测是否存在肾功能障碍的方法。反之，免疫色谱法也存在着不能测定到肾功能障碍的程度的缺点，以及由于采用使液体试样在带状物上移动的方法，以致到结束测定为止需要10～15分钟，测定时间长的缺陷。
另一方面，用于定量测定蛋白质浓度的简便方法已知有蛋白误差发或染料结合法(例如参照专利文献3、4)。蛋白误差法是利用了pH指示剂之一的蛋白误差指示剂与试样中所含的蛋白质含量成比例，在高于试剂的实际pH值的pH值下，出现显色的现象的方法。而染料结合法是利用了蛋白质与染料结合时，染料的最大吸收波长出现偏移的现象的方法。
由于蛋白误差法以及染料结合法均是简便的方法，因此便利性很高。然而，由于用于这些测定方法的普通试剂对尿中的白蛋白的特异性少，因此蛋白误差法以及染料结合法会受到尿中所含的各种物质的影响，难以实现高精度的蛋白质测定。因此，人们就意图对蛋白误差法以及染料结合法做各种改进，以提高测定精确度等。但是，蛋白误差法以及染料结合法在测定精确度等方面仍有提高的余地。
作为不受到尿中的共存物质的影响的方法已知有利用金属胶体的方法(例如，参照专利文献5)、免疫比浊法以及免疫乳胶凝集法。利用金属胶体的方法是在使蛋白质吸附在膜上之后，通过清洗、除去共存物质，使金属胶体与蛋白质结合，根据金属胶体的色调，对蛋白质进行定量的方法。在该方法中，尽管的确不易受到共存物质的影响，但却具有将蛋白质吸附到膜上的工序、清洗工序、以及使金属胶体结合的工序这一系列测定操作十分繁琐的缺点。另一方面，免疫比浊法以及免疫乳胶凝集法需要使用价格昂贵的试剂，因此在测定成本方面不具备优势。
专利文献1：日本特公平7-13640号公报
专利文献2：日本特开平10-73592号公报
专利文献3：日本特公昭57-51627号公报
专利文献4：日本特开昭61-155757号公报
专利文献5：日本特开昭63-127160号公报
发明内容
本发明的目的在于，提供一种简单易行、成本低、且能以高精度对液体试样中的蛋白质(例如白蛋白)进行定量的技术方案。
本发明的发明人为达到上述目的进行了深入研究。结果发现，当使用蛋白质测定用指示剂对白蛋白进行定量时，针对特定的蛋白质测定用指示剂，肌酸酐具有与白蛋白同样的表现。换言之，本发明是使肌酸酐与特定的蛋白质测定用指示剂反应，使肌酸酐作为定量白蛋白时的误差对体系发生影响的技术方案。
即，本发明是测定液体试样(例如尿、血液或髓液)中的蛋白质(例如白蛋白)浓度的方法，是在取得反映液体试样中肌酸酐浓度的信息之后，根据上述信息，消除肌酸酐对测定蛋白质浓度时的影响量的技术方案。
本发明的蛋白质测定方法例如包括：第一步骤，根据使液体试样与蛋白质测定用指示剂共存的体系的显色，取得与液体试样中的蛋白质浓度相关的第一响应值；第二步骤，在含有未同时存在蛋白质测定用指示剂的液体试样的体系中，取得与液体试样中的肌酸酐浓度相关的第二响应值；和第三步骤，考虑第二响应值，并根据第一响应值计算液体试样中的蛋白质浓度。
用于消除肌酸酐量影响的具体方法可举出例如，在第二步骤中，根据第二响应值，计算肌酸酐量对第一响应值的影响量，在第三步骤中，根据第一响应值计算蛋白质浓度，将此作为第一次计算值，由第一次计算值对肌酸酐量的影响量进行差分，计算最终蛋白质浓度的方法。另外，可举出的另一种消除肌酸酐量影响的方法是，在第三步骤中，根据第一响应值和第二响应值，取得修正了第一响应值的修正响应值，根据修正响应值计算液体试样中的蛋白质浓度的方法。
在此，本发明的蛋白质测定方法的其中一例是通过测定肌酸酐浓度，根据该肌酸酐浓度计算最终蛋白质浓度，这与现有的肌酸酐修正是不同的。
即，现有的肌酸酐修正，在液体试样为尿的情况下，基于尿的稀释或浓缩的试样间测定条件差异是必然的，它是通过用白蛋白浓度除以肌酸酐浓度，假定为在同一条件下测定蛋白质浓度时为了取得蛋白质浓度而作出的修正。而本发明的蛋白质测定方法，是在尿的稀释或浓缩问题之外，通过测定肌酸酐浓度掌握肌酸酐与蛋白质测定用试剂反应而得的第一响应值的增加量，事实上，是根据对该增加量进行间隔剔除处理后的响应值而测定蛋白质的技术方案。换言之，可将为了现有的肌酸酐修正而取得的肌酸酐浓度，作为本发明蛋白质测定方法的肌酸酐浓度。
在本发明中，在掌握了液体试样中肌酸酐浓度(或与肌酸酐浓度相关的响应)之后，消除肌酸酐浓度对蛋白质浓度测定的影响。因此，在本发明中，不仅采用了使用蛋白质测定用指示剂的简便且有利于节约成本的测定方法，而且还能消除肌酸酐的影响，取得精度更高的测定结果。
附图说明
图1为根据蛋白误差法测得的反射率与根据邻苯三酚红法测得的蛋白质浓度的关系曲线示意图。
图2为消除肌酸酐影响前后的蛋白质浓度计算值曲线示意图。
图3为根据染料结合法测得的反射率与根据免疫比浊法测得的白蛋白浓度的关系曲线示意图。
图4为肌酸酐量对使用低白蛋白含量试样与使用高白蛋白含量试样时实际测得的反射率的影响曲线示意图。
图5为使用低白蛋白含量试样与使用高白蛋白含量试样时，消除肌酸酐影响前后的白蛋白浓度计算值曲线示意图。
图6为肌酸酐浓度100mg/dL时的反射率与图4所示曲线斜率绝对值的关系曲线示意图。
具体实施方式
本发明包括根据液体试样和蛋白质测定用指示剂共存时的显色程度测定蛋白质时，消除肌酸酐影响的技术。即，本发明的蛋白质测定方法是在取得反映液体试样中肌酸酐浓度的信息之后，根据上述信息，消除肌酸酐对蛋白质浓度测定时的影响量的技术方案。本发明可适用于例如尿、血液、髓液的液体试样。当然，可适用于本发明的液体试样只要含有蛋白质即可，例如，既可以是含蛋白质的饮料，也可以是工厂排水等。作为本发明测定对象的蛋白质的典型例可举出白蛋白，但也不限于白蛋白，在测定球蛋白、本-琼氏蛋白(Bence-Jones protein)等其它蛋白质时，也能适用于本发明。
本发明的蛋白质测定方法例如包括：第一步骤，根据使液体试样与蛋白质测定用指示剂共存的体系的显色，取得反映液体试样中的蛋白质浓度的第一响应值；第二步骤，在含有未同时存在蛋白质测定用指示剂的液体试样的体系中，取得反映液体试样中的肌酸酐浓度的第二响应值；和第三步骤，考虑第二响应值，并根据第一响应值计算液体试样中的蛋白质浓度。
在第一步骤中，第一响应值根据例如第一蛋白质测定方法(例如染料结合法或蛋白误差法)取得。
这些，本发明的染料结合法是指在蛋白质与染料(指示剂)结合的情况下，利用染料的最大吸收波长产生偏移的现象的蛋白质测定方法。染料可使用例如卤化呫吨系染料、考马斯亮兰(Coomassie brilliantblue)。在这些指示剂中，优选使用卤化呫吨系染料。卤化呫吨系染料可使用具有下述化学式1所示的化学结构的染料。
[化学式1]
Figure S05802899X20060731D000051
在化学式1中，X1为卤素、硝基或亚硝基，X2为卤素，X3为卤素或氢，X4为羟基或其盐，X5为羧基或其盐。
本发明中的卤化呫吨系染料优选使用化学式1中，X1为碘、溴、氯或硝基，X2为碘或溴，X3为氯、溴或氢的卤化呫吨系染料，特别优选使用X1和X2为碘或溴，X3为氯的卤化呫吨系染料。X4和X5中的盐的典型例可举出Na盐。
本发明中的卤化呫吨系染料优选使用下述化学式2～6所示的染料。其中特别优选使用下述化学式2和3的蛋白质测定用指示剂。
[化学式2]
[化学式3]
Figure S05802899X20060731D000062
[化学式4]
Figure S05802899X20060731D000063
[化学式5]
Figure S05802899X20060731D000071
[化学式6]
Figure S05802899X20060731D000072
化学式2～6举例说明的卤化呫吨系染料易于从下述表1所示制造商得到。
表1
商品名 制造商
化学式2 焰红染料B(phloxine B) 东京化成株式会社(日本)
化学式3 玫瑰红(Rose Bengal) 东京化成株式会社(日本)
化学式4 赤藓红B(Erythrosine B) 东京化成株式会社(日本)
化学式5 曙红Y(Eosine Y) 和光纯药工业株式会社(日本)
化学式6 曙红B(Eosine B) 东京化成株式会社(日本)
本发明的蛋白误差法是指pH指示剂之一的蛋白误差指示剂与试样中所含蛋白质量成比例，利用了在高于试样的实际pH值的pH值下显色的现象的测定方法。蛋白误差指示剂可使用例如三苯甲烷系染料。三苯甲烷系染料可使用四溴酚蓝(TBPB)、溴氯酚蓝(BCPB)、或溴酚蓝(BPB)，典型例可使用四溴酚蓝(TBPB)。
在本发明的第二步骤中，根据例如酶法、Jaffe法、铜螯合物氧化法、钯络合物竞争法、或本尼迪特(Benedict)(ベネジエクト)法测定第二响应值。
酶法是根据酶作用于肌酸酐时的生成物的量、测定肌酸酐的方法。用于该方法的酶可举出肌酸酐脱氨酶或肌酸酐酰胺基水解酶(肌酸酐酶)。在使用前一种酶的情况下，肌酸酐脱氨酶作用于肌酸酐，生成氨，可根据氨量测定肌酸酐量。而在使用后一种酶的情况下，肌酸酐酰胺基水解酶(肌酸酐酶)作用于肌酸酐，生成肌酸，可根据肌酸量测定肌酸酐量。可通过使肌酸脒基水解酶、肌氨酸氧化酶、过氧化物酶作用于肌酸，将生成的过氧化氢引入显色系统，通过测定肌酸量来测定肌酸酐量。
Jaffe法是在碱性条件下，通过测定肌酸酐与苦味酸结合时褐色的显色程度来测定肌酸酐的方法。
铜螯合物氧化法是在中性条件下，利用铜与肌酸酐形成络合物时，显示出过氧化酶活性的反应来测定肌酸酐的方法。
钯络合物竞争法是根据将钯和染料的络合物与肌酸酐共存的情况下的染料的最大吸收波长的变化，测定肌酸酐的方法。有关该方法的细节，揭示于日本特开2004-138407号公报。该方法中的染料可举出例如铬天青S(2，6-二氯-4′-羟基-3′，3″-二甲基对二苯亚甲基环己二烯酮-5′，5″-二羧酸，二钠盐)(2，6-Dichloro-4’-hydroxy-3’，3”-dimethylfuchsone-5’，5”-dicarboxylic acid，disodium salt)。
本尼迪特法是在碱性条件下，利用本尼迪特试剂与肌酸酐的反应
(本尼迪特反应)，定量肌酸酐的方法。
在第三步骤中，根据事先作出的检量线计算蛋白质浓度。检量线可根据例如包括以下步骤的方法作出：基于第一蛋白质测定方法分别取得多个液体试样的多个响应值的步骤；根据即使通过第一蛋白质测定方法也难以受到肌酸酐影响的第二蛋白质测定方法来测定多个液体试样中的蛋白质浓度的步骤；以及将多个响应值相对于根据第二蛋白质测定方法测定的蛋白质浓度建立关系的步骤。
第二蛋白质测定方法可举出例如免疫比浊法、免疫乳胶凝集法、或三元络合物法。
免疫比浊法是基于因抗原(蛋白质)与抗体反应时生成的网格状结合物导致的混浊，测定抗原(蛋白质)的方法。抗体只要根据作为测定对象的蛋白质的种类做出相应选择即可，例如，在测定白蛋白时，可使用单克隆抗体或多克隆抗体。
免疫乳胶凝集法是使载持有对蛋白质显示出特定反应性的免疫反应物的乳胶微粒与蛋白质反应，根据由此时生成的凝集物导致的混浊，测定蛋白质的方法。
三元络合物法是使蛋白质与染料-金属络合物反应，根据此时络合物的色调，测定蛋白质的方法。与染料形成络合物的金属可举出例如铟、钼、钴、铜、镍。
与铟形成络合物的染料可举出多羟基苯磺酞系染料以及多羟基苯酞系染料。可使用的典型例有邻苯二酚紫、邻苯三酚红、溴代邻苯三酚红、二甲苯酚橙、邻苯三酚酞、或邻羟基氢醌酞。
与钼形成络合物的染料可举出邻苯三酚红、溴代邻苯三酚红、邻羟基氢醌酞。
在本发明的蛋白质测定方法中，例如，在第二步骤中，根据第二响应值计算肌酸酐量对上述第一响应值的影响量，在第三步骤中，根据第一响应值计算蛋白质浓度，将此作为第一次计算值，然后由第一次计算值对肌酸酐量的影响量进行差分，计算最终蛋白质浓度。
在第二步骤中，肌酸酐的影响量根据预先作成的检量线计算。检量线用于根据上述第一蛋白质测定方法、例如染料结合法或蛋白误差法分别测定例如蛋白质浓度相同而肌酸酐浓度不同的多个液体试样的响应值，建立该响应值与肌酸酐浓度之间的关系。
在本发明的蛋白质测定方法中，也可以在第三步骤中，根据第一响应值和第二响应值，取得修正了第一响应值的修正响应值，根据修正响应值计算液体试样中的蛋白质浓度。
根据例如蛋白质浓度相同而肌酸酐浓度不同的多个液体试样构成的多个组、各组中的蛋白质浓度不同的多个组，作成计算式，通过该计算式计算修正响应值。计算式例如使用根据包括以下步骤的方法求得的计算式：分别测定构成各组的多个液体试样各自的响应值的步骤；取得表示每一组中、相关于构成该组的多个液体试样的多个响应值与肌酸酐浓度的关系的多个线性关系式的步骤；以及取得将上述各关系式的斜率、与对应上述各组中具有特定肌酸酐浓度的液体试样的响应值建立关系的关系式的步骤。
在实践中使用本测定方法时，向含有蛋白质测定用指示剂的液体试剂供给液体试样，或向含有蛋白质测定用指示剂的固体层试剂供给液体试样。但是，为确立简便的测定方法，优选采用向固体层试剂供给液体试样的方法。固体层试剂的典型例可举出试纸。
试纸可通过使含有指示剂、缓冲剂等的浸渍液浸渍在吸收性载体中，将其干燥而制得。试片可直接使用，也可与例如由合成树脂等形成的非吸收性载体粘合后使用。
浸渍液中的指示剂浓度没有特别限定，并且只要可根据所用的指示剂的种类决定即可，典型浓度值为0.1～10mM、优选为0.5～2mM。
浸渍液的pH值取为例如稍低于指示剂的pKa值，例如指示剂采用卤化呫吨系染料的情况下，pH取值范围为1.5～4.5、优选pH取值范围为2.0～3.5。
作为缓冲剂，只要在浸渍液的pH值(例如pH＝1.5～4.5)下具有良好缓冲性能，能避免妨碍蛋白质测定用试剂和蛋白质的反应，就可以。缓冲剂可采用例如甘氨酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、琥珀酸缓冲液、苹果酸缓冲液、或酒石酸缓冲液。浸渍液中的缓冲剂浓度没有特别限定，典型浓度值为0.1～1.5M、优选为0.3～1M。
吸收性载体可使用不含蛋白质成分的多孔性物质。多孔性物质可举出例如纸状物、泡沫(发泡体)、纺布状物、无纺布状物、以及编织物。用于形成吸收性载体的材料可以举出例如棉、麻、纤维素、硝基纤维素、乙酸纤维素、石棉、玻璃纤维、石英纤维、碳纤维、硼纤维、聚酰胺、芳族聚酰胺、聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯、人造纤维、聚酯、尼龙、聚丙烯酸、聚丙烯酸酯、聚烯烃。
实施例1
在本实施例中，使用蛋白质浓度不同的液体试样，研究将其点附在载有蛋白质误差指示剂的试纸上时的反射率与利用三元络合物法之一的邻苯三酚红法测得的各液体试样的蛋白质浓度之间的关系。
试纸通过将混合有0.5mM四溴酚蓝(TBPB)、0.5M苹果酸缓冲液(pH＝3.4)以及30wt％乙醇的浸渍液浸渍在滤纸(Whatman公司制，“3MMChr”)后干燥制得。反射率根据使用色差计、向试纸照射峰值波长630nm的光时的反射光测得。
液体试样使用在肌酸酐浓度为20mg/dL以下的低肌酸酐浓度的健康人尿中添加有适量来自人血清白蛋白的试样。另外，在试纸上的液体试样点附量为7μL。
以横轴表示反射率，以纵轴表示蛋白质浓度，在图1中表示反射率以及蛋白质浓度的测定结果。由图1可知，使用蛋白质误差指示剂测得的反射率与蛋白质浓度之间存在函数关系，通过测定反射率，就能求得蛋白质浓度。反射率(x(％))与蛋白质浓度(y(mg/dL))的函数关系可利用最小二乘法，用下述数学式1表示。
[数学式1]
y＝2*109*x-4.4653
实施例2
在本实施例中，使用肌酸酐浓度不同的多个液体试样，研究肌酸酐量对蛋白质浓度实测值的影响。
试纸使用按照与实施例1相同方式制成的制品，反射率根据使用色差计、向试纸照射峰值波长630nm的光时的反射光测得。
将测得的反射率代入上述数学式1，计算蛋白质浓度。另一方面，采用酶法测定肌酸酐量。在酶法中，在将肌酸酐酰胺基水解酶用作酶生成肌酸之后，按照将肌酸脒基水解酶、肌氨酸氧化酶、过氧化物酶作用于肌酸的方法来定量肌酸，从而根据肌酸量定量肌酸酐浓度。
多个液体试样使用蛋白质浓度一定而肌酸酐浓度不同的试样。各液体试样通过向蛋白质浓度约5.3mg/dL、肌酸酐浓度为20mg/dL以下的低肌酸酐浓度的健康人尿中添加适量肌酸酐来调节肌酸酐量。另外，在试纸上的液体试样点附量为7μL。
以横轴表示肌酸酐浓度，以纵轴表示蛋白质浓度，用符号(◆)在图2中表示肌酸酐浓度以及蛋白质浓度的测定结果。由图2可知，在蛋白质实际浓度为定值的情况下，肌酸酐浓度越大，根据数学式1计算的蛋白质浓度也与其成比例地增大。即，肌酸酐与作为蛋白质误差指示剂的TBPB反应而测定的反射率减小，使计算值为高于蛋白质实际浓度的偏高值。这就意味着一旦能够掌握肌酸酐浓度，就能掌握计算值高于蛋白质实际浓度值到何种程度，即能够掌握肌酸酐的影响量。
在本实施例中，图2所示肌酸酐浓度(x(mg/dL))与根据数学式1计算的蛋白质浓度(y(mg/dL))之间的关系利用最小二乘法可表示为由下述数学式2表示的比例式。
[数学式2]
y＝0.0051x+5.3076
而且，消除肌酸酐量影响之后的蛋白质浓度(Y(mg/dL))的计算式可用下述数学式3表示。
[数学式3]
Y＝y-0.0051x
在本实施例中，以健康人尿中的肌酸酐平均浓度100mg/dL为基准的情况下，上述数学式3可用下述数学式4表示。
[数学式4]
Y＝y-0.0051(x-100)
同时用符号(◇)在图2中表示了用数学式4计算的蛋白质浓度的计算结果，在数学式4中计算的蛋白质浓度与肌酸酐浓度无关，大致呈定值，可以说消除了肌酸酐量的影响。
实施例3
在本实施例中，研究将液体试样点附在载有卤化呫吨系染料的试纸上后的反射率与利用免疫比浊法测得的白蛋白浓度之间的关系。
除了蛋白质测定用指示剂使用上述化学式2所示的卤化呫吨系染料(焰红染料B：日本东京化成株式会社制)之外，其它与实施例1一样地制成试纸。反射率根据使用色差计、向试纸照射峰值波长560nm的光时的反射光测得。液体试样使用按照与实施例1同样的方法调制而得的试样。
根据免疫比浊法测定白蛋白浓度时，根据向作为抗体的单克隆抗体与白蛋白反应而得的反应液照射波长340nm的光时的吸光度进行定量。
以横轴表示反射率，以纵轴表示白蛋白浓度，在图3中表示反射率以及蛋白质浓度的测定结果。由图3可知，使用卤化呫吨系染料测得的反射率与白蛋白浓度之间存在函数关系，通过测定反射率，就能求得白蛋白浓度。反射率(x(％))与白蛋白浓度(y(mg/dL))之间的函数关系可利用最小二乘法，用下述数学式5表示。
[数学式5]
y＝8*1014*x-7.2932
实施例4
在本实施例中，使用肌酸酐浓度不同的多个液体试样，研究肌酸酐量对反射率(白蛋白浓度实测值)的影响。
试纸使用按照与实施例3相同方法制成的制品，反射率根据使用色差计向试纸照射峰值波长560nm的光时的反射光测得。将测得的反射率代入上述数学式5，计算得到白蛋白浓度。与实施例2一样，采用酶法测定肌酸酐量。
多个液体试样使用蛋白质浓度一定而肌酸酐浓度不同的试样。各液体试样使用通过向肌酸酐浓度为20mg/dL以下的低肌酸酐浓度的健康人尿中添加适量肌酸酐而调节了肌酸酐量的试样(低白蛋白试样)，以及同上所述的在健康人尿中添加了人血清白蛋白，并添加了适量肌酸酐而调节了肌酸酐量的试样(高白蛋白试样)。另外，在试纸上的液体试样点附量为7μL。
以横轴表示肌酸酐浓度，以纵轴表示反射率，用图4表示白蛋白浓度以及反射率的测定结果。在图4中，用符号(◆)表示低白蛋白试样，用符号(■)表示高白蛋白试样。由图4可知，在白蛋白实际浓度为定值的情况下，肌酸酐浓度越大，反射率成比例地变小。结果是肌酸酐与卤化呫吨系染料反应而测定的反射率减小，这就意味着计算值为高于蛋白质实际浓度的偏高值。这还意味着一旦同时能够掌握肌酸酐浓度，就能掌握计算值高于蛋白质实际浓度值到何种程度，即能够掌握肌酸酐的影响量。
在本实施例中，可利用最小二乘法由下述数学式6(1)表示低白蛋白试样的肌酸酐浓度(x(mg/dL))与反射率(y(％))之间的关系，由下述数学式6(2)表示高白蛋白试样的肌酸酐浓度与反射率之间的关系。
[数学式6]
y＝—0.0188x+89.135    (1)
y＝—0.0158x+70.837    (2)
在上述数学式6(1)和数学式6(2)中，应当注意的是，如果白蛋白浓度不同，则斜率不同。即，数学式6(1)和数学式6(2)中的斜率是表明肌酸酐量影响程度的指标，斜率不同时，如果白蛋白浓度不同，就意味着肌酸酐影响量的不同。至于这一点，也可从图3中理解到白蛋白浓度与反射率之间的关系呈非线性，反射率存在下限值。实际情况下，根据使用低白蛋白试样以及高白蛋白试样时测得的反射率、使用数学式5计算而得的白蛋白浓度结果示于图5中。在图5中，低白蛋白试样用符号(◇)表示，高白蛋白试样用符号(○)表示。由图5可知，无论是低白蛋白试样还是高白蛋白试样，肌酸酐浓度越大，计算而得的白蛋白浓度值越高，而且，与低白蛋白试样相比，高白蛋白试样受肌酸酐的影响更大。换言之，使实测的反射率对应白蛋白浓度，对肌酸酐影响量进行修正后，基于数学式5计算白蛋白浓度，就能消除肌酸酐量所造成的影响。
在本实施例中，以横轴表示肌酸酐浓度为100mg/dL时的反射率(x(％))，以纵轴表示数学式6(1)和数学式6(2)的斜率的绝对值(y(—))，曲线如图6所示。图6所示曲线可用下述数学式7表示。
[数学式7]
y＝0.0002x+0.0042
因此，考虑了与白蛋白浓度相应的肌酸酐量的影响的反射率(R′(％))的修正式可用下述数学式8表示。在数学式8中，R为反射率(％)的实际测定值，Cre为肌酸酐浓度(mg/dL)。
[数学式8]
R′(％)＝R+(0.0002R+0.0042)×Cre
在本实施例中，以健康人尿中的肌酸酐平均浓度100mg/dL为基准的情况下，上述数学式8可用下述数学式9表示。
[数学式9]
R′(％)＝R+(0.0002R+0.0042)×(Cre—100)
在图5中，用数学式9修正反射率后，并同时表示了用数学式5计算白蛋白浓度的结果。在图5中，用符号(◆)表示低白蛋白试样的计算结果，用符号(●)表示高白蛋白试样的计算结果。由图5可知，采用使用数学式9修正过的反射率R′，用数学式5计算的白蛋白浓度，无论是低白蛋白试样还是高白蛋白试样，均与肌酸酐浓度无关，基本上呈定值，即，意味着消除了肌酸酐量的影响。
发明人认为，只要肌酸酐与蛋白质测定用指示剂反应，即使在用于求取例如数学式1、数学式5的关系式的蛋白质测定方法采用其它测定方法的情况下，或者肌酸酐测定方法采用例如Jaffe法、铜螯合物氧化法、钯络合物竞争法或本尼迪特法的情况下，也能达到根据实施例1～4证实的效果。

Claims (13)

1.一种蛋白质测定方法，根据使液体试样与蛋白质测定用指示剂共存时的显色程度，测定蛋白质，其特征在于：
在取得反映液体试样中肌酸酐浓度的信息之后，根据所述信息，消除肌酸酐对测定蛋白质浓度时的影响量，
该蛋白质测定方法包括：
第一步骤，根据使液体试样和蛋白质测定用指示剂共存的体系的显色，取得反映液体试样中蛋白质浓度的第一响应值；
第二步骤，在含有未同时存在所述蛋白质测定用指示剂的液体试样的体系中，取得反映液体试样中肌酸酐浓度的第二响应值；和
第三步骤，考虑所述第二响应值，并根据所述第一响应值计算液体试样中的蛋白质浓度，
在所述第二步骤中，根据所述第二响应值，计算肌酸酐量对所述第一响应值的影响量，
在所述第三步骤中，根据所述第一响应值计算蛋白质浓度，将此作为第一次计算值，然后由所述第一次计算值对所述肌酸酐量的影响量进行差分，计算最终蛋白质浓度，
在所述第二步骤中，根据事先作出的检量线计算所述肌酸酐的影响量，
所述检量线使用利用染料结合法或蛋白误差法分别测定蛋白质浓度相同而肌酸酐浓度不同的多个液体试样的响应值，使所述响应值与肌酸酐浓度建立关系的曲线。
2.一种蛋白质测定方法，根据使液体试样与蛋白质测定用指示剂共存时的显色程度，测定蛋白质，其特征在于，
在取得反映液体试样中肌酸酐浓度的信息之后，根据所述信息，消除肌酸酐对测定蛋白质浓度时的影响量，
该蛋白质测定方法包括：
第一步骤，根据使液体试样和蛋白质测定用指示剂共存的体系的显色，取得反映液体试样中蛋白质浓度的第一响应值；
第二步骤，在含有未同时存在所述蛋白质测定用指示剂的液体试样的体系中，取得反映液体试样中肌酸酐浓度的第二响应值；和
第三步骤，考虑所述第二响应值，并根据所述第一响应值计算液体试样中的蛋白质浓度，
在所述第三步骤中，根据所述第一响应值和第二响应值，修正所述第一响应值，取得修正响应值后，根据所述修正响应值，计算液体试样中的蛋白质浓度，
根据由蛋白质浓度相同而肌酸酐浓度不同的多个液体试样构成的多个组、各组中的蛋白质浓度不同的多个组，作成计算式，利用该计算式计算所述修正响应值，
所述计算式使用根据包括以下步骤的方法求得的计算式：
测定构成各组的多个液体试样各自的响应值的步骤；
取得表示每一组中、相关于构成该组的多个液体试样的多个响应值与肌酸酐浓度的关系的多个线性关系式的步骤；和
取得将所述各关系式的斜率与对应于所述各组中具有特定肌酸酐浓度的液体试样的响应值建立关系的关系式的步骤。
3.如权利要求1或2所述的蛋白质测定方法，其特征在于：
在所述第一步骤中，所述第一响应值根据作为第一蛋白质测定方法的染料结合法或蛋白误差法进行测定。
4.如权利要求1或2所述的蛋白质测定方法，其特征在于：
在所述第二步骤中，根据酶法、捷非氏法、铜螯合物氧化法、钯络合物竞争法、或本尼迪特法测定所述第二响应值。
5.如权利要求3所述的蛋白质测定方法，其特征在于：
在所述第三步骤中，根据事先作出的检量线计算蛋白质浓度，
所述检量线使用根据包括以下步骤的方法作出的检量线：
基于所述第一蛋白质测定方法分别取得相对于多个液体试样的多个响应值的步骤；
根据比所述第一蛋白质测定方法难以受到肌酸酐影响的第二蛋白质测定方法，测定所述多个液体试样中蛋白质浓度的步骤；和
将所述多个响应值相对于根据所述第二蛋白质测定方法测定的蛋白质浓度建立关系的步骤。
6.如权利要求5所述的蛋白质测定方法，其特征在于：
所述第二蛋白质测定方法为免疫比浊法、免疫乳胶凝集法、或三元络合物法。
7.如权利要求3所述的蛋白质测定方法，其特征在于：
所述蛋白质测定用指示剂为呫吨系染料或三苯甲烷系染料。
8.如权利要求7所述的蛋白质测定方法，其特征在于：
所述呫吨系染料为具有下述化学式1所示的化学结构的卤化呫吨系染料，
化学式1
Figure FSB00000199267900031
在化学式1中，X1为卤素、硝基或亚硝基，X2为卤素，X3为卤素或氢，X4为羟基或其盐，X5为羧基或其盐。
9.如权利要求8所述的蛋白质测定方法，其特征在于：
所述卤化呫吨系染料为选自具有下述化学式2～6所示的化学结构的染料的一种。
化学式2
Figure FSB00000199267900041
化学式3
Figure FSB00000199267900042
化学式4
化学式5
Figure FSB00000199267900051
化学式6
Figure FSB00000199267900052
10.如权利要求7所述的蛋白质测定方法，其特征在于：
所述三苯甲烷系染料为四溴酚蓝TBPB、溴氯酚蓝BCPB、或溴酚蓝BPB。
11.如权利要求1或2所述的蛋白质测定方法，其特征在于：
所述蛋白质测定用指示剂在与液体试样共存之前，在干燥状态下被保持在载体上。
12.如权利要求1或2所述的蛋白质测定方法，其特征在于：
所述蛋白质为白蛋白。
13.如权利要求1或2所述的蛋白质测定方法，其特征在于：
所述液体试样为尿、血液或髓液。
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Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5055507B2 (ja) * 2006-03-06 2012-10-24 株式会社シノテスト 試料中のタンパク質の測定方法及び測定試薬
US8758648B2 (en) * 2008-03-19 2014-06-24 Arkray, Inc. Stabilizer of color former and use thereof
JP5334643B2 (ja) * 2009-03-30 2013-11-06 シスメックス株式会社 尿試料分析装置
CN101750413B (zh) * 2009-11-09 2011-05-04 河南工业大学 一种食品中蛋白质含量快速检测方法
JP5542888B2 (ja) * 2011-10-17 2014-07-09 アークレイ株式会社 蛋白質濃度評価方法、分析用具、及び分析装置
CN103901034B (zh) * 2014-04-29 2016-07-06 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 一种检测尿液中微量白蛋白的检测试剂条及其制备方法
DK3234562T3 (da) 2014-12-18 2020-02-03 Radiometer Medical Aps Kalibreringskoncept til amperometrisk creatininsensor med korrigering for endogene modulatorer
JP6615464B2 (ja) * 2015-02-23 2019-12-04 国立大学法人三重大学 紙製試験管立て、及び紙製試験管立て封入袋密封装置
EP3542146A4 (en) * 2016-11-18 2019-10-30 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. MULTIPLE SEQUENCED WAVELENGTH MEASUREMENT OF A LIQUID TEST
CN108088839B (zh) * 2017-12-21 2018-12-11 广州市进德生物科技有限公司 一种尿微量白蛋白/尿肌酐检测试剂盒
BR112020012916A2 (pt) 2018-01-09 2020-12-08 Idexx Laboratories, Inc. Métodos para medição de analito e/ou proteína em amostras biológicas
WO2023162620A1 (ja) * 2022-02-28 2023-08-31 富士フイルム株式会社 イムノクロマトグラフキット

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1033575A2 (en) * 1999-03-01 2000-09-06 Bayer Corporation Device for carrying out lateral-flow assays involving more than one analyte
US6306660B1 (en) * 1997-10-14 2001-10-23 Bayer Corporation Method for improving the accuracy of the semi-quantitative determination of analyte in fluid samples

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2510633C3 (de) 1975-03-12 1978-07-13 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Diagnostisches Mittel zum Nachweis von Eiweiß in Körperflüssigkeiten und dafür geeignete Indikatorfarbstoffe
JPS61155757A (ja) 1984-12-27 1986-07-15 Wako Pure Chem Ind Ltd 微量蛋白定量法
JPS63127160A (ja) 1986-06-30 1988-05-31 Sukeyasu Yoneda 特異的蛋白質の検出方法
CA1303983C (en) 1987-03-27 1992-06-23 Robert W. Rosenstein Solid phase assay
JPS6473592A (en) 1987-09-14 1989-03-17 Ricoh Kk Fifo memory circuit
US5049358A (en) * 1988-09-30 1991-09-17 Miles Inc. Composition and test device for assaying for proteins
JP3021167B2 (ja) * 1992-01-30 2000-03-15 テルモ株式会社 分析装置
US5385847A (en) * 1993-12-02 1995-01-31 Miles Inc. Method for the determination of urinary protein and creatinine
US5804452A (en) * 1995-04-27 1998-09-08 Quidel Corporation One step urine creatinine assays
US5796476A (en) * 1995-06-28 1998-08-18 Kyoto Dai-Ichi Kagaku Co., Ltd. Method of optically measuring component in solution
JPH0979982A (ja) * 1995-09-13 1997-03-28 Kdk Corp 体液中成分の光学的同時測定方法
TW591230B (en) * 1997-10-14 2004-06-11 Bayer Ag Method for improving the accuracy of the semi-quantitative determination of analyte in fluid samples
JP2002116203A (ja) * 2000-10-04 2002-04-19 Nitto Denko Corp 尿中アルブミン検出用試験片
CA2451611A1 (en) 2001-06-25 2003-01-03 Bayer Healthcare Llc Total protein detection methods and devices at low ph

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6306660B1 (en) * 1997-10-14 2001-10-23 Bayer Corporation Method for improving the accuracy of the semi-quantitative determination of analyte in fluid samples
EP1033575A2 (en) * 1999-03-01 2000-09-06 Bayer Corporation Device for carrying out lateral-flow assays involving more than one analyte

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
waheed a.a. et al.mechanism of dye binding in the protein assay using eosindyes.analytical biochemistry287.2000,28773-79. *
WO 03/001213 A2,说明书2－11页.

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Publication number Publication date
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WO2005071420A1 (ja) 2005-08-04
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US8460877B2 (en) 2013-06-11
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EP1715347B1 (en) 2011-09-21
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