JP5722548B2 - バイオセンサ - Google Patents

Description

本発明は、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素（以下、「ＰＱＱ依存性ＰＤＨ」または単に「ポリオール脱水素酵素」とも称する）を含む、酵素組成物およびそれを用いたバイオセンサに関する。

試料中の特定成分を簡易に定量する方法として、様々なバイオセンサが提案されているが、代表的なものとしては、絶縁性の基板上に少なくとも作用極および対極からなる電極系を形成し、この電極系上に、電極系に接して親水性高分子と酸化還元酵素と電子伝達体を含む反応層を形成したものがある。

このようにして作製されたバイオセンサの反応層に、基質を含む試料液を供給すると、反応層が試料液によって溶解することにより、酵素と基質が反応し、これに伴って電子伝達体が還元され、この還元された電子伝達体を電気化学的に酸化し、得られる酸化電流値から試料液中の基質濃度を定量することができる（例えば、特許文献１）。

かかる酵素としては、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素を用いる方法が知られている。補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素は、バクテリアの細胞膜に存在し、グルコノバクター属の細菌などから抽出、精製する方法が知られている。かような酵素を用いてグリセロールやソルビトール、マンニトールなどの定量に利用されている。

特許第２５１７１５３号明細書

しかしながら、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素をバイオセンサに適用する際に、場合によってはバイオセンサの測定値にバラツキが生じるという問題があった。

そこで本発明は、バイオセンサに適用した際に精度のバラツキを最小限に抑えることができるポリオール脱水素酵素組成物を提供することを目的とする。

また、本発明のさらに他の目的は、かかるポリオール脱水素酵素組成物を用いたバイオセンサを提供することである。

本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意研究を行った。その結果、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素と、ショ糖脂肪酸エステルと、を含む、ポリオール脱水素酵素組成物を提供することによって、上記目的を達成できることを見出して、本発明の完成に至った。

また、絶縁性基板と、前記絶縁性基板上に形成されてなる、少なくとも作用極および対極を含む電極と、前記電極上に形成されてなる試料供給部と、を有するバイオセンサであって、前記試料供給部が、かかるポリオール脱水素酵素組成物と、電子伝達体と、を含む反応層を有する、バイオセンサを提供することによって、上記目的を達成できることを見出して、本発明の完成に至った。

本発明によれば、バイオセンサに適用した際に精度のバラツキを最小限に抑えることができるポリオール脱水素酵素組成物を提供することができる。

また、本発明によれば、かかるポリオール脱水素酵素組成物を用いたバイオセンサを提供することができる。

本発明の第１のバイオセンサの一実施形態を示す分解斜視図である。 図１のバイオセンサの断面図である。 本発明の第２のバイオセンサの一実施形態を示す分解斜視図である。 図３のバイオセンサの断面図である。 実施例および比較例のバックグラウンド電流の測定結果を示す図である。

本発明は、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素と、ショ糖脂肪酸エステルと、を含む、ポリオール脱水素酵素組成物である（以下、「本発明のポリオール脱水素酵素組成物」とも称する）。

以下では、本発明のポリオール脱水素酵素組成物を、好ましい実施形態を挙げることによって説明する。本発明のポリオール脱水素酵素組成物は、バイオセンサに用いられることが好ましい。よって、本発明のポリオール脱水素酵素組成物を適用した本発明のバイオセンサの好ましい実施形態を説明する。

本発明のバイオセンサは、絶縁性基板と、前記絶縁性基板上に形成されてなる、少なくとも作用極および対極を含む電極と、前記電極上に形成されてなる試料供給部と、を有するバイオセンサであって、前記試料供給部が、本発明のポリオール脱水素酵素組成物と、電子伝達体と、を含む反応層を有する。

以下、図面を参照しながら本発明のバイオセンサの実施形態を説明する。なお、図面の寸法比率は、説明の都合上誇張されており、実際の比率とは異なる場合がある。

図１は、反応層が１つである本発明のバイオセンサの第１実施形態を示す分解斜視図である。図２は、図１のバイオセンサの断面図である。図３は、反応層が２つである本発明のバイオセンサの第２実施形態を示す分解斜視図である。図４は、図３のバイオセンサの断面図である。

本発明のバイオセンサの第１実施形態においては、反応層は１つである（図１、図２参照）。本発明のバイオセンサの第２実施形態においては、反応層は２つである（図３、図４参照）。反応層が１つである本発明のバイオセンサの第１実施形態においては、かかる反応層は、本発明のポリオール脱水素酵素組成物と、電子伝達体と、を含む。反応層が２つである本発明のバイオセンサの第２実施形態においては、かかる反応層は、電極上に形成される第一の反応層と、前記第一の反応層と分離されて形成されてなる第二の反応層を有し、前記第一の反応層が、前記本発明のポリオール脱水素酵素組成物および前記電子伝達体の一方を含み、かつ、前記第二の反応層が他方を含む。

図１、２が示すとおり、絶縁性基板１（本明細書中、単に「基板」とも称する）の上に、作用極２、参照極３および対極４が形成されている。さらに、接着剤６が、絶縁性基板１上の端部に設置される。作用極２、参照極３および対極４は、バイオセンサ外部を電気的に接続するための手段として機能している。作用極２、参照極３および対極４は、例えば、スクリーン印刷・スパッタリング法などの従来公知の知見を適宜参照し、あるいは組み合わせて、所望のパターンの電極を形成することができる。

そして、絶縁性基板１上に形成された作用極２、参照極３および対極４には電極を露出するように、絶縁層５が形成されている。絶縁層５は、各電極間の短絡を防止するための絶縁手段として機能する。絶縁層の形成方法についても特に制限はなく、スクリーン印刷法や接着法などの従来公知の手法により形成されうる。

また、絶縁層５を挟むように、作用極作用部分２−１、参照極作用部分３−１および対極作用部分４−１が形成されている。そして、作用極作用部分２−１、参照極作用部分３−１および対極作用部分４−１上には、反応層１０が形成されている。なお、図１では、反応層１０と、前記反応層１０とカバー７との間に位置する空間部Ｓと、が試料供給部を形成する。この反応層１０は、少なくとも、電子伝達体と、本発明のポリオール脱水素酵素組成物と、を含む。この作用部分（２−１、３−１、４−１）は、バイオセンサの使用時において、反応層１０中の試料に電位を印加するための電位印加手段および試料中に流れる電流を検出するための電流検出手段として機能する。なお、作用部分（２−１、３−１、４−１）を含めて作用極２、参照極３および対極４と称する場合もある。作用極２および対極４は、バイオセンサの使用時に一対となって、反応層１０中の試料に電位を印加した際に流れる酸化電流（応答電流）を測定するための電流測定手段として機能する。バイオセンサの使用時には、参照極３を基準として、対極４と、作用極２との間に所定の電位が印加される。

本実施形態のバイオセンサは、基板１に設置された接着剤（両面テープ）６を介して反応層１０を覆うようにカバー７が接着されることにより構成される。なお、接着剤（両面テープ）６は、電極側に設置してもよいし、カバー７側のみに設置してもよいし、両方に設置してもよい。

図３、４に示すとおり、基本的な構造は、図１、２で示す第１実施形態のバイオセンサと同様であるが、第１実施形態のバイオセンサとの相違点は、反応層を２つ（第一の反応層８と、第二の反応層９）設ける点である。この際、第一の反応層８と、第二の反応層９と、前記第一の反応層８と前記第二の反応層９との間に配置される空間部Ｓと、が試料供給部を形成する。前記第一の反応層８が、本発明のポリオール脱水素酵素組成物および前記電子伝達体の一方を含み、かつ、前記第二の反応層９が他方を含む。換言すれば、第２実施形態のバイオセンサにおいては、本発明のポリオール脱水素酵素組成物および前記電子伝達体が同時に同一の反応層に含まれない。具体的には、第一の反応層８に電子伝達体が含まれれば、本発明のポリオール脱水素酵素組成物は含まれず、前記第二の反応層９に、本発明のポリオール脱水素酵素組成物が含まれば、電子伝達体が含まれない。なお、便宜的に、カバー７側に形成される方を第一の反応層８と称し、電極側に形成される方を第二の反応層９と称する。なお、第一の反応層８は、両端に接着剤（両面テープ）６ａが設置されたカバー７上の両端の隙間に形成されてなる。

第２実施形態のバイオセンサは、第二の反応層９が形成されている基板１に接着された接着剤（両面テープ）６ｂと、第一の反応層８が形成されているカバー７に接着した接着剤（両面テープ）６ａと、が互いに貼り合わされることにより、構成されてなる。なお、接着剤（両面テープ）６は、基板１側のみに設置してもよいし、カバー７側のみに設置してもよい。

以下、各構成要件を詳説する。なお、上記の通り、第１実施形態のバイオセンサの構造と、第２実施形態のバイオセンサの構造の相違点は、反応層が１つだけであるか、反応層が２つ（第一の反応層８と、第二の反応層９）であるか、である。それ以外の点は同様であるので、特に明記しない限り、下記に記載する構成要件の具体的な説明は、第１実施形態のバイオセンサにも、第２実施形態のバイオセンサにも適用される。また、本明細書中において、各構成要件の含有量を説明する際に「１センサ」という用語を用いることがあるが、本明細書における「１センサ」とは、一般的なバイオセンサの大きさである、試料供給部に供給される試料が「０．１〜２０μｌ（好ましくは２μｌ程度）」であるものを想定している。よって、それよりも小さかったり、大きかったりするバイオセンサにおいては、各構成要件の含有量を適宜調整することによって制御することができる。

＜絶縁性基板＞
本発明において使用される絶縁性基板１は、特に制限はなく従来公知のものを使用することができる。一例を挙げると、プラスチック、紙、ガラス、セラミックスなどが挙げられる。また、絶縁性基板１の形状やサイズについては、特に制限されない。

プラスチックとしても、特に制限はなく従来公知のものを使用することができる。一例を挙げると、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリエステル、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリイミド、アクリル樹脂などが挙げられる。

＜電極＞
本発明の電極は、少なくとも作用極２と対極４を含む。

本発明の電極は、試料（測定対象物）と、本発明のポリオール脱水素酵素組成物との反応を電気化学的に検出できるものであれば特に制限されず、例えば、カーボン電極、金電極、銀電極、白金電極、パラジウム電極などが挙げられる。耐腐食性およびコストの観点からは、カーボン電極が好ましい。

本発明においては、作用極２と対極４のみの二電極方式であっても、参照極３をさらに含む三電極方式であってもよい。なお、電位の制御がより高感度で行われるという観点からは、二電極方式よりも三電極方式が好ましく用いられうる。また、その他、液量を感知するための感知電極などを含んでいてもよい。

また、試料供給部と接触する部分（作用部分）は、それ以外の電極部分と構成材料が異なってもよい。例えば、参照極３が、カーボンからなっている場合に、参照極作用部分３−１が、銀／塩化銀からなっていてもよい。なお、バイオセンサは、一般的に使い捨てであるため、電極としては、ディスポーザブル電極を用いるとよい。

＜絶縁層＞
絶縁層５を構成する材料は特に制限されないが、例えば、レジストインク、ＰＥＴやポリエチレン等の樹脂、ガラス、セラミックス、紙などにより構成されうる。好ましくは、ＰＥＴである。

＜試料供給部＞
上記の通り、第１実施形態のバイオセンサにおいて、試料供給部は、電子伝達体と、本発明のポリオール脱水素酵素組成物と、を含む反応層１０を有する。

第１実施形態のバイオセンサのような反応層を１つとする形態においては、簡便にバイオセンサを作製できる点で好ましい。また、大量生産時における製造コストが安くなる点で好ましい。

反応層１０の厚さにも特に制限はないが、好ましくは０．０１〜５０μｍ、より好ましくは０．０５〜４０μｍ、さらに好ましくは０．１〜２５μｍにするとよい。この際の、厚みの制御方法としても特に制限はないが、例えば、滴下する量を適宜調節することにより、制御することができる。

一方で、第２実施形態のバイオセンサにおいては、前記試料供給部が、電子伝達体と、本発明のポリオール脱水素酵素組成物と、を含む反応層を有し、前記反応層が、電極上に形成される第一の反応層８と、前記第一の反応層と分離されて形成されてなる第二の反応層９を有し、前記第一の反応層８が、本発明のポリオール脱水素酵素組成物および前記電子伝達体の一方を含み、かつ、前記第二の反応層９が他方を含む。

第２実施形態のバイオセンサのような反応層を２つとする形態においては、本発明のポリオール脱水素酵素組成物および電子伝達体を別々の反応層に含有させることができるため、電子伝達体と、本発明のポリオール脱水素酵素組成物とが接触することによる保存中の劣化を防ぐことができる点で好ましい。

また、第一の反応層８、第二の反応層９それぞれの厚さにも特に制限はないが、好ましくは０．０１〜１０μｍ、より好ましくは０．０２５〜１０μｍ、さらに好ましくは０．０５〜８μｍにするとよい。ここで、第一の反応層８と、第二の反応層９の厚さは、同じであっても異なってもよい。この際の、厚みの制御方法としても特に制限はないが、例えば、滴下する量を適宜調節することにより、制御することができる。なお、第一の反応層８と、第二の反応層９との、離隔距離には特に制限はないが、好ましくは０．０５〜１．５ｍｍ、より好ましくは０．０７５〜１．２５ｍｍ、さらに好ましくは０．１〜１ｍｍである。０．０５ｍｍ未満であると、保存中に本発明のポリオール脱水素酵素組成物と、電子伝達体が接触する場合がある。また、１．５ｍｍを超えると、毛細管現象が起こりにくく、試料が反応層に吸引されない場合がある。離隔距離は、接着剤の厚みを制御することにより、制御することができる。つまり、接着剤は、第一の反応層８と、第二の反応層９と、を離隔される、スペーサとしての役割をも担う。

＜本発明のポリオール脱水素酵素組成物＞
本発明における反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）は、本発明のポリオール脱水素酵素組成物を含む。

本発明のポリオール脱水素酵素組成物は、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素と、ショ糖脂肪酸エステルと、を含む。

ポリオール脱水素酵素は細胞膜結合型酵素であり、疎水性が高いために水溶媒系では不安定である。このため、溶液中におけるポリオール脱水素酵素の凝集を防ぎ、ポリオール脱水素酵素の安定性を向上させる目的で、酵素の安定化剤として界面活性剤を使用することが知られている。確かに酵素の安定化剤として界面活性剤を使用すると、酵素の保存安定性は向上する。一方で、本発明者は、かかる保存安定性が向上した酵素をバイオセンサに適用した場合であっても、バイオセンサの精度が不安定である場合があることを見出した。

本発明者らは、上記問題を解決すべく鋭意研究を行った。その結果、従来の補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素においては、かかる酵素の基質が存在しないにも関わらず、電子伝達体と反応することにより、還元型電子伝達体が生成され、結果として基質との反応以外の応答電流値が生じる場合があることを見出した（以下、「バックグラウンド電流」とも称する）。このことは、以下の問題が生じることを意味する。つまり、一般的にバイオセンサでは、酵素が失活することを考慮し、過剰量の酵素が用いられ、保存中に一部の酵素が失活しても測定対象物質に対応する応答電流値が変わらないように設計されている。しかしながら、バックグラウンド電流に関しては、酵素量（酵素活性）そのものが応答電流値に影響を与えるため、失活が少ないほどバックグラウンド電流値が高く、失活が大きいほど、バックグラウンド電流値も小さくなり、応答電流値が変動するという問題がある。そして、その問題は、バイオセンサの保存期間により、顕著になることがある。

上記の研究結果に鑑み、上記問題を解決するために鋭意検討を行った結果、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素に、ショ糖脂肪酸エステルを含ませることで、上記問題が解決できることを知得した。すなわち、本発明の課題は、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素と、ショ糖脂肪酸エステルと、を含むポリオール脱水素酵素組成物を提供することによって、解決されることを見出し、本発明の完成に至った。

かかる本発明の構成により、バイオセンサに適用した際にも、測定結果のバラツキを抑制することができることを見出した。そして、かかる組成物をバイオセンサに適用することによって、精度に信頼性をおけるバイオセンサを提供することができる。

なお、従来の酵素ではなく、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素と、ショ糖脂肪酸エステルと、を含むポリオール脱水素酵素組成物をバイオセンサに用いることによって、上記の効果を得ることができるメカニズムは必ずしも明らかではないが、以下のように推測する。すなわち、（ｉ）従来使用されていた界面活性剤（特に、ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）［(polyoxyethylene-p-t-octylphenol;TritonX-100)］）がポリオール脱水素酵素の基質となっていた。本発明の構成においては、ポリオール脱水素酵素組成物にショ糖脂肪酸エステルが含まれるので、かかるTritonX-100の基質的な機能を阻害することができる。あるいは、（ｉｉ）従来使用されていた界面活性剤（特にTritonX-100）に含まれていた微量成分がポリオール脱水素酵素の基質となっていた。本発明の構成においては、ポリオール脱水素酵素組成物にショ糖脂肪酸エステルが含まれるので、かかる微量成分の基質的な機能を阻害することができる。あるいは、（ｉｉｉ）ショ糖脂肪酸エステルが自動酸化能を有する物質の自動酸化能を抑制している。あるいは、（ｉｖ）目的とするポリオール脱水素酵素を精製する際に好ましく利用されるイオン交換クロマトグラフィの過程で、自動酸化能を有する物質（例えばシトクロムなど）が脱離もしくは除去される。無論、かかるメカニズムに本発明の技術的範囲が制限されない。

以下、本発明のポリオール脱水素酵素組成物を構成する構成要件について詳説する。

（補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素）
本発明において、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素（ＰＱＱ依存性ＰＤＨ）は、いずれのポリオールを基質としてもよく、２つ以上の水酸基を有するアルコール（糖アルコールを含む）であれば、特に制限されない。例えば、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ラクチトールなどの二糖由来アルコール、グリセロールなどのトリオール、エリスリトールなどのテトリトール、アラビトール、キシリトール、リビトールなどのペンチトール、マンニトール、ソルビトールなどのヘキシトール、イノシトールなどのシクリトールなどが挙げられる。中でも好ましくは、グリセロール（ピロロキノリンキノン依存性グリセロール脱水素酵素）、アラビトール（ピロロキノリンキノン依存性アラビトール脱水素酵素）、およびマンニトール（ピロロキノリンキノン依存性マンニトール脱水素酵素）を基質とし、より好ましくはグリセロール（ピロロキノリンキノン依存性グリセロール脱水素酵素）を基質とする。

本発明に用いられるＰＱＱ依存性ＰＤＨとしては、従来公知の酵素をいずれも好ましく使用することができる。該酵素は例えば、グルコノバクター属、シュードモナス属など、様々な細菌が生成することが知られている。本発明では、これらのＰＱＱ依存性ＰＤＨを産生することができる菌（以下、「ＰＱＱ依存性ＰＤＨ産生菌」とも称する）が生成するいずれのＰＱＱ依存性ＰＤＨも好適に使用することができる。これらの中でも特に、グルコノバクター属に由来するＰＱＱ依存性ＰＤＨを好適に使用することができる。さらに、入手の容易さから、グルコノバクター・アルビダス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ａｌｂｉｄｕｓ）ＮＢＲＣ ３２５０、３２７３、１０３５０９、１０３５１０、１０３５１６、１０３５２０、１０３５２１、１０３５２４；グルコノバクター・セリナス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｃｅｒｉｎｕｓ）ＮＢＲＣ ３２６７、３２７４、３２７５、３２７６；グルコノバクター・フラテウリ（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｆｒａｔｅｕｒｉｉ）ＮＢＲＣ ３１７１、３２５１、３２５３、３２６２、３２６４、３２６５、３２６８、３２７０、３２８５、３２８６、３２９０、１６６６９、１０３４１３、１０３４２１、１０３４２７、１０３４２８、１０３４２９、１０３４３７、１０３４３８、１０３４３９、１０３４４０、１０３４４１、１０３４４６、１０３４５３、１０３４５４、１０３４５６、１０３４５７、１０３４５８、１０３４５９、１０３４６１、１０３４６２、１０３４６５、１０３４６６、１０３４６７、１０３４６８、１０３４６９、１０３４７０、１０３４７１、１０３４７２、１０３４７３、１０３４７４、１０３４７５、１０３４７６、１０３４７７、１０３４８２、１０３４８７、１０３４８８、１０３４９０、１０３４９１、１０３４９３、１０３４９４、１０３４９９、１０３５００、１０３５０１、１０３５０２、１０３５０３、１０３５０４、１０３５０６、１０３５０７、１０３５１５、１０３５１７、１０３５１８、１０３５１９、１０３５２３；グルコノバクター・ジャポニカス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）ＮＢＲＣ ３２６０、３２６３、３２６９、３２７１、３２７２；グルコノバクター・カンチャナブリエンシス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｋａｎｃｈａｎａｂｕｒｉｅｎｓｉｓ）ＮＢＲＣ １０３５８７，１０３５８８；グルコノバクター・コンドニ（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｋｏｎｄｏｎｉｉ）ＮＢＲＣ ３２６６；グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ）ＮＢＲＣ ３１３０、３１８９、３２４４、３２８７、３２９２、３２９３、３２９４、３４６２、１２５２８、１４８１９；グルコノバクター・ロセウス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｒｏｓｅｕｓ）ＮＢＲＣ ３９９０；グルコノバクター・エスピー（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ）ＮＢＲＣ ３２５９、１０３５０８；グルコノバクター・スファエリカス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）ＮＢＲＣ １２４６７；グルコノバクター・タイランディカス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｔｈａｉｌａｎｄｉｃｕｓ）ＮＢＲＣ ３１７２、３２５４、３２５５、３２５６、３２５７、３２５８、３２８９、３２９１、１００６００、１００６０１等を使用することができる。

また、ＰＱＱ依存性ＰＤＨ産生菌であれば、これらの自然突然変異株または人為突然変異株を使用してもよい。人為突然変異処理方法は、当業者に周知の方法と同様にしてもしくは当業者に周知の方法を適宜修飾してまたはこれらの方法を適宜組合せて適用することができる。このような微生物の代表菌株として、グルコノバクター・タイランディカス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｔｈａｉｌａｎｄｉｃｕｓ）が使用され、特にグルコノバクター・タイランディカス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｔｈａｉｌａｎｄｉｃｕｓ）ＮＢＲＣ ３２９１が好ましく使用される。

（ショ糖脂肪酸エステル）
本発明において使用することができるショ糖脂肪酸エステルは、特に制限はないが、本発明の所期の目的を効果的に達成するとの観点から、ＨＬＢ値が、好ましくは８〜２０であり、より好ましくは９〜１９であり、さらに好ましくは１０〜１８であり、特に好ましくは１１〜１８である。なお、本明細書においては、ＨＬＢ値は、グリフィン法によって算出された値を意味する。

また、ショ糖脂肪酸エステルにおける脂肪酸の炭素数も特には制限ないが、５〜３０であると好ましく、好ましくは７〜２５であり、より好ましくは８〜２２であり、さらに好ましくは１０〜２０である。アルキル基の炭素数がいくつであっても、ＨＬＢ値が８〜２０となるように選択することが好ましい。

また、かかるショ糖脂肪酸エステルにおける脂肪酸としても特に制限はないが、市販品を購入する場合の入手性を考慮すると、ベヘニン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、ミリスチン酸、ラウリン酸、エルカ酸およびオレイン酸からなる群から選択されると好ましい。この場合も、ＨＬＢ値が８〜２０となるように選択することが好ましい。

これらのショ糖脂肪酸エステルは、従来公知の方法を適宜参照し、あるいは組み合わせて合成して準備することができる。また、市販品を購入して準備してもよい。市販品としては、三菱化学フーズ株式会社のサーフホープＳＥ ＰＨＡＲＭＡ（登録商標）のショ糖ベヘニン酸エステル（Ｊ−２２０３、Ｊ−２２０３）、ショ糖ステアリン酸エステル（Ｊ−１８０１、Ｊ−１８０２、Ｊ−１８０３Ｆ、Ｊ−１８０５、Ｊ−１８０７、Ｊ−１８０９、Ｊ−１８１１、Ｊ−１８１１Ｆ、Ｊ−１８１５、Ｊ−１８１６）、ショ糖パルミチン酸エステル（Ｊ−１６１５、Ｊ−１６１６）、ショ糖ミリスチン酸エステル（Ｊ−１４１６）、ショ糖ラウリン酸エステル（Ｊ−１２０１、Ｊ−１２０５、Ｊ−１２１６）、ショ糖エルカ酸エステル（Ｊ−２１０１、Ｊ−２１０２）、ショ糖オレイン酸エステル（Ｊ−１７０１、Ｊ−１７１５）などが例示できる。

中でも、ＨＬＢ値が８〜２０であり、本発明の所期の目的を効果的に達成するとの観点から、ショ糖ステアリン酸エステル（Ｊ−１８１１（ＨＬＢ値１１）、Ｊ−１８１１Ｆ（ＨＬＢ値１１）、Ｊ−１８１５（ＨＬＢ値１５）、Ｊ−１８１６（ＨＬＢ値１６））、ショ糖パルミチン酸エステル（Ｊ−１６１５（ＨＬＢ値１５）、Ｊ−１６１６（ＨＬＢ値１６））、ショ糖ミリスチン酸エステル（Ｊ−１４１６（ＨＬＢ値１６））、ショ糖ラウリン酸エステル（Ｊ−１２１６（ＨＬＢ値１６））、ショ糖オレイン酸エステル（Ｊ−１７１５（ＨＬＢ値１５））などが好ましい。

本発明のポリオール脱水素酵素組成物は、液状、乳液状等の溶液形態であっても、粉末状、顆粒状、錠剤状などの固体形態であっても、ペースト状等の半固体形態であってもよい。中でも、長期保存の安定性の理由で、本発明の効果が顕著に発揮されることから、固体状の形態であることが好ましい。溶液形態または半固体形態である本発明のポリオール脱水素酵素組成物は、適当量の緩衝液等で調製されることによって準備してもよいし、また、固体形態である本発明のポリオール脱水素酵素組成物は、かかる溶液形態または半固体形態である本発明のポリオール脱水素酵素組成物を従来公知の方法（例えば、凍結乾燥、スプレードライ）で乾燥させることによっても準備することができる。また、後述する「本発明のポリオール脱水素酵素組成物の製造方法」により得られたものを、そのまま溶液形態で、または、凍結乾燥などの従来公知の乾燥を施して粉末状になったものを用いてもよい。なお、本明細書でいう「半固体形態」とは、「溶液形態」「固体形態」の中間の形態を意味し、溶液形態の中に固体形態が含まれている状態を意味する。

本発明のポリオール脱水素酵素組成物に含まれるショ糖脂肪酸エステルの配合量は、特に限定されないが、本発明のポリオール脱水素酵素組成物のＰＱＱ依存性ＰＤＨの総質量を１００質量％として（対蛋白量あたり）、好ましくは０．１〜３０質量％、より好ましくは０．２〜２５質量％である。さらに好ましくは０．３〜２０質量％である。０．１質量％以上であれば、ポリオール脱水素酵素組成物の保存安定性を向上させることができるとの効果を十分に発揮でき、一方、３０質量％以下であれば、バックグラウンド電流を有意に防止できるとの効果の向上が認められる。また、バイオセンサに適用した際に、精度を有意に向上させることができる。

（緩衝剤）
また、本発明のポリオール脱水素酵素組成物は、安定化剤として緩衝剤を含むと好ましい。緩衝剤を添加することにより、ｐＨを酵素に好適な範囲と調節することができ、酵素の保存安定性を向上させることができる。緩衝剤としては、例えば、リン酸、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（Ｔｒｉｓ）、酢酸、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、グリシン、グリシルグリシン、ホウ酸、またはイミダゾールなどが挙げられる。中でも、低濃度の安定化剤でＰＱＱ依存性ＰＤＨの保存安定性を向上できる点で、グリシルグリシンを使用することが好ましい。グリシルグリシンはアミノ酸系緩衝剤の一種であるが、グリシンなどの他のアミノ酸系緩衝剤やＭＯＰＳなどの他のよく知られている緩衝剤を含む酵素組成物に比べて、酵素の残存活性を飛躍的に向上させることができる。これらの緩衝剤は、単独で使用しても、２種以上を組み合わせて使用してもよい。

本発明のポリオール脱水素酵素組成物に含まれる緩衝剤の量は、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの保存安定性を向上できる量であれば特に限定されないが、本発明のポリオール脱水素酵素組成物中のＰＱＱ依存性ＰＤＨの総質量を１００質量％として（対蛋白量あたり）、好ましくは１〜２００質量％、より好ましくは２〜１５０質量％、より好ましくは３〜１００質量％、さらに好ましくは４〜７５質量％、特に好ましくは５〜５０質量％である。１質量％以上であれば、安定化剤としての効果を十分に発揮でき、一方、２００質量％以下であれば、添加に見合う安定化剤としての効果の向上が認められる。また、バイオセンサに適用した際に、精度を有意に向上させることができる。

（ｐＨ調整剤）
また、本発明のポリオール脱水素酵素組成物において、緩衝剤に加えて酸またはアルカリなどのｐＨ調整剤を含むことが好ましい。これにより、酵素組成物のｐＨを所望の範囲に調整することができる。本発明のポリオール脱水素酵素組成物のｐＨは、酵素の安定ｐＨから極端に外れていなければよく、好ましくは６．０〜１１．０、より好ましくは６．５〜１０．５、最も好ましくは７．０〜１０．０である。かようなｐＨ調整剤としては、塩酸等の酸や水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリが挙げられる。ｐＨ調整剤の含有量は特に制限されず、所望のｐＨが実現される量を用いればよい。これらのｐＨ調整剤は、単独で使用しても、２種以上を組み合わせて使用してもよい。

緩衝剤を添加する方法は特に制限されず、緩衝剤をそのまま添加してもよいし、緩衝剤を予め水に溶解させた緩衝剤の形態で添加してもよい。なお、添加された緩衝剤は凍結乾燥等の処理により緩衝剤中の水分が除去され、かような場合には緩衝剤として酵素組成物中に存在する。

本発明で使用される具体的な緩衝剤としては、所望のｐＨを有するものであれば公知の緩衝剤が適宜使用でき、特に限定されるものではないが、例えば、リン酸緩衝剤、トリス−ＨＣｌ緩衝剤、酢酸緩衝剤、ＭＯＰＳもしくはＨＥＰＥＳなどのＧＯＯＤ緩衝剤、グリシン−ＮａＯＨ緩衝剤、グリシルグリシン−ＮａＯＨ緩衝剤やグリシルグリシン−ＫＯＨ緩衝剤などのアミノ酸系緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、またはイミダゾール緩衝剤などが用いられる。これらの中でも、グリシルグリシン−ＮａＯＨ緩衝剤またはグリシルグリシン−ＫＯＨ緩衝剤のようなグリシルグリシン緩衝剤が好ましい。

（非還元糖）
本発明のポリオール脱水素酵素組成物は、安定化剤としてさらに非還元糖を含むことが好ましい。非還元糖は、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの保存安定性（特に、凍結乾燥時の保存安定性）を向上させ、また、本発明のポリオール脱水素酵素組成物の保存安定性を向上しうる。

本発明において、「非還元糖」とは、遊離性のアルデヒド基やケトン基をもたないために還元性を有しない糖類を意味する。このような還元糖としては、上記したような性質を有するものであればよく、例えば、還元基同士の結合したトレハロース型小糖類、糖類の還元基および非糖類が結合した配糖体、糖類に水素添加して還元した糖アルコールなどがある。より具体的には、スクロース、トレハロース、ラフィノース等のトレハロース型小糖類；アルキル配糖体、フェノール配糖体、カラシ油配糖体等の配糖体；およびアラビトール、キシリトール、ソルビトール等の糖アルコールなどが挙げられる。中でも、トレハロース、ラフィノース、スクロースが好ましく、特にトレハロースおよびラフィノースが好ましい。また、これらのうち、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの基質となる糖アルコールは、好ましくない場合がある。

これらの還元糖は、単独で使用しても、２種以上を組み合わせて使用してもよい。

本発明のポリオール脱水素酵素組成物に含まれる非還元糖の量は、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの保存安定性を向上できる量であれば特に制限されないが、本発明の酵素組成物中のＰＱＱ依存性ＰＤＨの総質量を１００質量％として、好ましくは１〜２００質量％、より好ましくは５〜１００質量％である。１質量％以上であれば、安定化剤としての効果を十分に発揮でき、一方、２００質量％以下であれば、添加に見合う安定化剤としての効果の向上が認められる。

（２価の金属イオン）
本発明のポリオール脱水素酵素組成物は、安定化剤としてさらに２価の金属イオンを形成する金属を含む金属化合物を含んでもよい。本発明に用いられる２価の金属イオンを形成する金属を含む金属化合物は、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの保存安定性を向上させ、また、本発明の組成物の保存安定性を向上させうる。

本発明に用いられる２価の金属イオンを形成する金属を含む金属化合物としては、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの保存安定性を向上でき、かつ、２価のイオンを形成する化合物であれば特に制限されない。上記２価の金属イオンを形成する金属を含む金属化合物の具体的な例としては、カルシウム、マグネシウム、バリウム、マンガン、鉄、銅、コバルト、ニッケル、水銀、鉛および亜鉛などの２価の金属イオンを形成する金属を含む金属化合物が挙げられる。中でも、カルシウムを含む化合物およびマグネシウムを含む化合物からなる群より選択される少なくとも１種が好ましい。また、上記２価の金属イオンを形成する金属を含む金属化合物の形態は、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの安定性を向上できるものであれば特に制限されないが、例えば、上記金属のフッ化物、塩化物、臭化物、もしくはヨウ化物などのハロゲン化物、上記金属の硫酸塩、上記金属の硝酸塩、または上記金属のリン酸塩などが挙げられる。これらの中でも、塩化物、硫酸塩、および硝酸塩からなる群より選択される少なくとも１種であることが好ましい。なお、これら２価の金属イオンを形成する金属を含む金属化合物は単独で使用されても、また２種以上の混合物の形態で使用されてもよい。これらの中で、好ましい具体例は、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、硝酸カルシウムなどである。

本発明のポリオール脱水素酵素組成物に含まれる２価の金属イオンを形成する金属を含む金属化合物の量は、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの保存安定性を向上できる量であれば特に制限されないが、本発明のポリオール脱水素酵素組成物中のＰＱＱ依存性ＰＤＨの総質量を１００質量％として（対蛋白量あたり）、好ましくは１〜３０質量％、より好ましくは１〜２０質量％である。１質量％以上であれば、安定化剤としての効果を十分に発揮でき、一方、３０質量％以下であれば、添加に見合う安定化剤としての効果の向上が認められ、また、本発明の組成物を緩衝剤等で再溶解する際、２価の金属イオンを形成する金属を含む金属化合物を溶解できる。

（ＬＰＬ）
また、本発明のバイオセンサを中性脂肪センサとして使用する場合においては、本発明のポリオール脱水素酵素組成物に、脂質を構成するエステル結合を加水分解する酵素をさらに添加してもよい。かような酵素として、具体的には、リポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ）、リパーゼ、エステラーゼが好適に挙げられる。特に、反応性の観点で、リポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ）が好ましい。

ＬＰＬの含有量については特に制限はなく、測定する試料の種類や試料の添加量、使用する親水性高分子の量や電子伝達体の種類などによって適宜選択することができる。一例を挙げると、中性脂肪の分解を迅速に行い、且つ反応層の溶解性を下げない酵素量（酵素活性量）という観点から、１センサあたり、０．１〜１０００活性単位（Ｕ）、好ましくは１〜５００Ｕ、より好ましくは１０〜１００Ｕである。なお、ＬＰＬの活性単位（Ｕ）の定義および測定方法は、ＷＯ２００６／１０４０７７に記載の方法による。

また、本発明のバイオセンサにおける、本発明のポリオール脱水素酵素組成物の含有量については特に制限はなく、測定する試料の種類や試料の添加量、後述する電子伝達体の種類や、後述する親水性高分子の量などによって適宜選択することができる。一例を挙げると、１センサあたり、ポリオール（例えば、グリセロール）の分解を迅速に行い、且つ反応層の溶解性を下げない酵素量（酵素活性量）という観点から、０．０１〜１００Ｕ、好ましくは０．０５〜５０Ｕ、より好ましくは０．１〜１０Ｕの酵素が反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）に含まれるとよい。なお、本発明のポリオール脱水素酵素組成物の活性単位（Ｕ）の定義および測定方法は、特開２００６−２７１２５７号公報に記載の方法による。

なお、本発明の第２実施形態のバイオセンサにおいては、本発明のポリオール脱水素酵素組成物は、電子伝達体と同じ層に含まれなければ、第一の反応層８、第二の反応層９のいずれの反応層に含まれてもよいが、好ましくは第二の反応層９に含まれる。ここで、一般的なバイオセンサにおいては、電極に酵素が直接接触しないような構成を採る。それは、酵素はタンパク質から構成されているため、電極表面にそれが付着すると、電極表面が不動態化する虞があるからである。そのような一般的な常識があるため、例えば、本発明の第２実施形態のバイオセンサのように、反応層が２つある形態においては、電極に直接接しない第一の反応層８に本発明のポリオール脱水素酵素組成物を含有させるのが一般と考えられる。しかしながら、本発明の第２実施形態のバイオセンサにおいては、電極に接する側の第二の反応層９に本発明のポリオール脱水素酵素組成物を含有させると好ましい。それは、本発明においては、本発明のポリオール脱水素酵素組成物が電極に固着することが有意に防止することもできるからである。その理由は、後述する親水性高分子や界面活性剤の機能によるものと考えられる。逆に、第二の反応層９に本発明のポリオール脱水素酵素組成物を含有させることで電極近傍での、酸化型電子伝達体の還元型電子伝達体への変換効率が高くなる、換言すれば、より試料液中の基質濃度との相関性が高くなるという利点がある。

＜本発明のポリオール脱水素酵素組成物の製造方法＞
続いて、本発明のポリオール脱水素酵素組成物を製造する方法について詳説する。本発明のポリオール脱水素酵素組成物の製造方法は、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素と；ショ糖脂肪酸エステルと；を含ませる方法であれば、特に制限されない。

例えば、上記ＰＱＱ依存性ＰＤＨ産生菌からＰＱＱ依存性ＰＤＨを得る工程の途中で、または、得た後、ショ糖脂肪酸エステルを含有させればよい。

ここで、上記ＰＱＱ依存性ＰＤＨ産生菌からＰＱＱ依存性ＰＤＨを得るための具体的な方法は特に制限されず、例えば、上記ＰＱＱ依存性ＰＤＨ産生菌を栄養培地にて培養し、該培養物からＰＱＱ依存性ＰＤＨを抽出する方法が挙げられる。抽出方法は一般に使用される抽出方法を用いることができ、例えば超音波破砕法、フレンチプレス法、有機溶媒法、リゾチーム法等を用いることができる。抽出したＰＱＱ依存性ＰＤＨの精製方法は特に制限されず、例えば、硫安やぼう硝などの塩析法、塩化マグネシウムや塩化カルシウムを用いる金属凝集法、ストレプトマイシンやポリエチレンイミンを用いる除核酸、またはＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）−セファロース、ＣＭ（カルボキシメチル）−セファロースなどのイオン交換クロマト法などを用いることができる。つまり、このように抽出したＰＱＱ依存性ＰＤＨに、ショ糖脂肪酸エステルを含有させて本発明のポリオール脱水素酵素組成物としてもよいし、これらの精製方法における工程の途中で、上記ショ糖脂肪酸エステルを用いてＰＱＱ依存性ＰＤＨを精製して、本発明のポリオール脱水素酵素組成物とすればよい。

以下、本発明のポリオール脱水素酵素組成物の製造方法の好ましい実施形態を説明するが、本発明が、下記の実施形態に制限されないのは言うまでもない。

すなわち、本発明のポリオール脱水素酵素組成物の好ましい実施形態は、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素を有する細胞から、界面活性剤を含む溶液を用いて、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素を可溶化することによって、酵素−界面活性剤の集合体を含む溶液を得る第１工程と、前記酵素−界面活性剤の集合体を含む溶液をカラムにアプライした後、前記ショ糖脂肪酸エステルを含む溶離液を送液することによって、可溶化時に使用した遊離している界面活性剤を除去する第２工程と、前記除去後、前記カラムから、前記ポリオール脱水素酵素組成物を含む溶液を溶出することによって、ポリオール脱水素酵素活性画分を得る第３工程と、を含む。

上記のように、ポリオール脱水素酵素は細胞膜結合型酵素であり、疎水性が高いために水溶媒系では不安定である。このため、溶液中におけるポリオール脱水素酵素の凝集を防ぎ、ポリオール脱水素酵素の安定性を向上させる目的で、酵素の安定化剤として界面活性剤を使用することが知られている。確かに酵素の安定化剤として界面活性剤を使用すると、酵素の保存安定性は向上する。一方で、本発明者は、かかる保存安定性が向上した酵素をバイオセンサに適用した場合であっても、バイオセンサの精度が不安定である場合があることを見出した。

本発明者らは、かかる問題の原因を追究すべく鋭意研究を行った結果、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素に、ショ糖脂肪酸エステルを含有させることによって、バイオセンサに適用した際にも、測定結果のバラツキを抑制することができることを見出した。

以下、各工程について詳説する。無論、本発明は各工程の実施形態に限定されない。

（第１工程）
本発明のポリオール脱水素酵素組成物の製造方法の第１工程は、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素を有する細胞（特には、細胞膜）から、界面活性剤を含む溶液を用いて、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素を可溶化することによって、酵素−界面活性剤の集合体を含む溶液を得ると好ましい。ここで、かかる集合体は、酵素を界面活性剤が内包するミセルのような状態となっていることが好ましい。

上記のように、本発明に用いられるＰＱＱ依存性ＰＤＨとしては、従来公知の酵素をいずれも好ましく使用することができる。該酵素は例えば、グルコノバクター属、シュードモナス属など、様々な細菌が生成することが知られている。かかる菌は、上述のように、いずれの菌も好ましく使用することができるが、ポリオール脱水素酵素の生産量および精製のしやすさの観点で、グルコノバクター・タイランディカス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｔｈａｉｌａｎｄｉｃｕｓ）ＮＢＲＣ ３２９１が好ましい。

上記ＰＱＱ依存性ＰＤＨを産生する細菌からＰＱＱ依存性ＰＤＨを得るための具体的な方法は、特に制限されず、例えば、かかる細菌を栄養培地にて培養し、該培養物からＰＱＱ依存性ＰＤＨを抽出して得る方法が挙げられる。以下、具体的に説明する。

上記ＰＱＱ依存性ＰＤＨを産生する細菌を培養する培地は、使用菌株が資化しうる炭素源、窒素源、無機物、その他必要な栄養素を適量含むものであれば、合成培地であっても天然培地であってもよい。炭素源としては、例えば、コーンスティーブリカー、グルコース、グリセロール、ソルビトールなどが使用される。窒素源としては、例えば、尿素、ペプトン類（ポリペプトン）、肉エキス、酵母エキスなどの窒素含有天然物や、塩化アンモニウム、クエン酸アンモニウムなどの無機窒素含有物が使用される。無機物としては、リン酸カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸ナトリウム、塩化カルシウム（２水和物）、硫酸マグネシウムなどが使用される。その他、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。上記の炭素源、窒素源、無機物、およびその他の必要な栄養素は、単独で用いても２種以上組み合わせて用いてもよい。なお、かかる培地は、１００〜１４０℃程度で１０分〜６０分、オートクレーブ処理を行うことが好ましい。

培養は、振とう培養（例えば、１２０〜１６０ｍｉｎ^−１）あるいは通気撹拌培養で行うことが好ましい。培養温度は２０〜５０℃、好ましくは２２〜４０℃、最も好ましくは２５℃〜３５℃である。培養ｐＨは４〜９の範囲、好ましくは５〜８である。ｐＨの調製は、例えば塩酸などで行えばよい。これら以外の条件下でも、使用する菌株が生育すれば実施される。培養期間は通常０．５〜５日が好ましい。かかる培養は、２度〜５度繰り返して行ってもよい。なお、これらのＰＱＱ依存性ＰＤＨは、上記培養によって得られた酵素でも、ＰＱＱ依存性ＰＤＨ遺伝子を大腸菌等に形質導入して得られた組換え酵素であってもよい。

次いで、培養により得られた液を遠心分離（５００〜２０，０００×ｇ、５〜３０分、０〜１０℃）で集菌する。具体的には、集菌されたものを緩衝剤に懸濁して、ＰＱＱ依存性ＰＤＨを抽出する。抽出方法は一般に使用される抽出方法を用いることができ、例えばフレンチプレス法、超音波破砕法等を用い、菌体を破砕する。続いて、得られた破砕液をさらに遠心分離（５００〜２０，０００×ｇ、５〜３０分、０〜１０℃）する。得られた上清を超遠心分離（２００００を超えて１００００００×ｇ、３０〜１２０分、０〜１０℃）をすることによって、膜画分を沈殿物として得ることができる。

かかる膜画分の沈殿物から、界面活性剤を含む溶液を用いて、ＰＱＱ依存性ＰＤＨを可溶化する。

まず、膜画分の沈殿物に、緩衝剤（例えば、濃度２〜２００ｍＭのトリス塩酸緩衝液 ｐＨ７〜９程度）で懸濁し、終濃度が０．１〜５ｇ／１００ｍｌ程度になるように、界面活性剤を加えて、界面活性剤を含む溶液を調製し、一定条件下（例えば、０〜１０℃で、１０分〜４８時間）で攪拌を行うことによって、ＰＱＱ依存性ＰＤＨを可溶化することによって、酵素−界面活性剤の集合体を含む溶液を得る。

かかる酵素−界面活性剤の集合体を含む溶液は、超遠心分離を施すことが好ましい。かかる超遠心分離の条件にも特に制限はないが、例えば、２００００を超えて１００００００×ｇ、３０〜１２０分、０〜１０℃で行う。かかる操作によって得た上清を、０．１〜１ｇ／１００ｍｌ程度界面活性剤を含む緩衝剤（例えば、濃度２〜１００ｍＭのトリス塩酸緩衝液 ｐＨ７〜９程度）によって一晩透析することも好ましい。

かかる界面活性剤としては、工業的な観点からしても酵素の可溶化に適しているという観点から、ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）［(polyoxyethylene-p-t-octylphenol;TritonX-100)］、本発明のショ糖脂肪酸エステルなどが好適である。また、下記＜界面活性剤＞の項で説明した界面活性剤を適宜しようすることができる。特に、ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）［(polyoxyethylene-p-t-octylphenol;TritonX-100)］は、細胞膜から抽出されたＰＱＱ依存性ＰＤＨを可溶化させ、それを抽出するためには、工業的な観点からしても好適である。

上記のようにして、必要に応じて、超遠心分離や透析などが施された酵素−界面活性剤の集合体を含む溶液を得ることができる。

（第２工程）
第２工程は、前記酵素−界面活性剤の集合体を含む溶液をカラムにアプライした後、前記ショ糖脂肪酸エステルを含む溶離液を送液することによって、可溶化時に使用した遊離している界面活性剤を除去すると好ましい。

本発明で用いられるクロマトグラフィとしては、イオン交換クロマトグラフィ、疎水クロマトグラフィ、ゲルろ過クロマトグラフィ、ヒドロキシアパタイト、アフィニティークロマトグラフィなどが好適である。

イオン交換クロマトグラフィとしては、界面活性剤の種類に応じて適宜選択することができ、陰イオン交換クロマトグラフィ、陽イオン交換クロマトグラフィなどがあるが、好ましくは陰イオン交換クロマトグラフィである。

クロマトグラフィに用いられるカラムにも特に制限はないが、ＲｅｓｏｕｒｃｅＱ、ＲｅｓｏｕｒｃｅＳ（例えば、ＧＥヘルスケア製のものが好適である）などが好適である。

前記酵素−界面活性剤の集合体を含む溶液をカラムにアプライする前に、カラムの平衡化を行っておくことが好ましい。カラムの平衡化を行うための溶液は、緩衝剤（例えば、濃度５〜１００ｍＭのトリス塩酸緩衝液 ｐＨ７〜９程度）と、０．０１〜０．２ ｇ／１００ｍｌの前記ショ糖脂肪酸エステルと、を含む溶液であることが好ましい。かかる溶液には、濃度１〜２０ｍＭの２価の金属イオン（例えば、硫酸マグネシウム）をさらに添加してもよい。また、本工程で添加せずに、他の工程で必要に応じ添加してもよい。

前記酵素−界面活性剤の集合体を含む溶液（可溶化膜画分）を上記カラムにアプライし、カラムの平衡化を行った溶液を、カラムの体積の、好ましくは２倍〜３０倍、より好ましくは３倍〜２０倍の量を送液することによって、少なくとも遊離している可溶化する際に用いた界面活性剤を除去することができる。このように遊離している界面活性剤が除去され、目的とする酵素組成物に、ショ糖脂肪酸エステルが存在することによって、バイオセンサに適用した際に、バックグラウンド電流を有意に防止する酵素組成物を提供することができることになる。

なお、本工程において、酵素−界面活性剤の集合体を含む溶液（可溶化膜画分）を上記カラムにアプライし、カラムの平衡化を行った溶液を、カラムの体積の、好ましくは２倍〜３０倍、より好ましくは３倍〜２０倍の量を送液後のパス液の２８０ｎｍにおける、可溶時に使用した界面活性剤（例えば、TritonX-100）の吸光度が０．０１以下であることが好ましい。

なお、第１工程において、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素を可溶化するための界面活性剤として本発明のショ糖脂肪酸エステルを用いた場合は、第２工程の「ショ糖脂肪酸エステルを含む溶液でクロマトグラフィをフローすることによって、遊離している界面活性剤を除去する」との工程は経ずに、ポリオール脱水素酵素組成物を含む溶液を溶出する第３工程に進んでもよい。第２工程の主たる特徴は、「工業的に可溶化する」ためには好適であるが、「バックグラウンド電流の発生を抑制する」ためには必ずしも好ましくないとされる、従来酵素の可溶化のために使用されていた界面活性剤（特に、TritonX-100)）の過剰分（つまり、遊離している界面活性剤）を除去することであるが、そもそも、かかる界面活性剤を本工程で使用しない場合は、かような操作は不要である。

（第３工程）
第３工程は、前記除去後、前記カラムから前記ポリオール脱水素酵素組成物を含む溶液を溶出することによって、ポリオール脱水素酵素活性画分を得ると好ましい。

溶出の方法にも特に制限されないが、グラジエント法、ステップワイズ法などが挙げられる。

例えば、カラムとして陰イオン交換体（ＲｅｓｏｕｒｃｅＱ）を用いる場合で、グラジエント法を採用する場合は、開始緩衝液として、０．００１〜０．５ ｇ／１００ｍｌの前記ショ糖脂肪酸エステルを含む１〜１００ｍＭ 緩衝液（ｐＨ７〜１２）が使用できる。なお、緩衝液の種類はｐＨが７〜１２のものであれば何でもよい。溶出緩衝液は、開始緩衝液にさらに、塩（ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ_４、ＣａＣｌ_２等）を含む。塩の濃度は、用いる塩にもよるが、０．０５〜２Ｍがよい。なお、前記開始もしくは溶出緩衝液には、必要に応じて０．０１〜２０ｍＭの２価の金属イオン（ＭｇＳＯ_４、ＣａＣｌ_２）や還元剤（２−メルカプトエタノールやジチオスレイトール）を加えてもよい。グラジエント溶出は、カラム体積の１〜５０倍量で行うことが好ましい。

（第４工程）
また、本発明の製造方法においては、前記工程により得られたポリオール脱水素酵素活性画分を、脱塩処理することによって、脱塩処理された酵素溶液を得る第４工程を含むと好ましい。かかる工程によって、溶離液に含まれていた塩を脱塩することができる。脱塩処理の方法としては特に制限はないが、透析、限外ろ過、脱塩カラムを使用する方法などが挙げられる。

例えば、透析を例に挙げると、上記で得られた画分（ポリオール脱水素酵素活性画分）を、緩衝剤（例えば、グリシルグリシン−ＮａＯＨ緩衝溶液 ｐＨ７〜９．５程度）で透析を行うことによって、本発明のポリオール脱水素酵素組成物を含む脱塩処理された酵素溶液を得ることができる。

（第５工程）
また、本発明の製造方法においては、前記脱塩処理された酵素溶液を、限外ろ過することによって、濃縮物を得る第５工程を含むと好ましい。限外ろ過は、酵素の失活が少なく、且つ簡便であるという点で好ましい。

限外ろ過の方法にも特に制限はないが、前記脱塩処理された酵素溶液をそのまま、あるいは、緩衝剤（例えば、グリシルグリシン−ＮａＯＨ緩衝溶液 ｐＨ７〜９．５程度）を加えた後、従来公知の方法によって行って、濃縮物を得る。限外ろ過の回数にも特に制限はないが、好ましくは１〜１５回、より好ましくは２〜１０回である。本発明で用いられるショ糖脂肪酸エステルは、本発明の所期の目的（すなわち、バックグラウンド電流を抑制する）観点で用いる。一方で、ショ糖脂肪酸エステルは、場合によっては溶血を引き起こす可能性がある。よって、より好ましくは２〜１０程度の限外ろ過を行うことによって、バックグラウンド電流を抑制しながら、かつ、溶血を引き起こす可能性のあるショ糖脂肪酸エステルを最小限にすることができ、バイオセンサの精度を有意に向上することができる。なお、かかる工程を経ることによって、本発明のポリオール脱水素酵素組成物のＰＱＱ依存性ＰＤＨの総質量を１００質量％として（対蛋白量あたり）、ショ糖脂肪酸エステルが、１０質量％以下となることが好ましい。１０質量％以下であることによって、溶血作用を抑制し、バックグラウンド電流を抑制し、ひいては、バイオセンサの精度を有意に向上することができる。また、下限としては、０．１質量％以上が好ましい。０．１質量％以上とすることによって、バックグラウンド電流を抑制し、ひいては、バイオセンサの精度を有意に向上することができる。

限外ろ過膜の分画分子量は好ましくは１０,０００〜５０，０００がよく、蛋白濃度（ＰＱＱ依存性ＰＤＨ濃度）は１〜１００ｍｇ／ｍｌとなるようにすることが好ましい。なお、本工程の変形例によれば、各種クロマトグラフィ法、塩析法などによって濃縮物を得ることもできる。

（第６工程）
上記手順により液体形態の酵素組成物が得られるが、本発明のポリオール脱水素酵素組成物は粉末状などの固体形態であってもよい。本発明のポリオール脱水素酵素組成物を粉末状とする場合は、限外ろ過されて得た酵素組成物を凍結乾燥すればよい。すなわち、本発明の製造方法は、前記濃縮物を含む濃縮調製物を、凍結乾燥することによって、ポリオール脱水素酵素組成物を得る第６工程を含むと好ましい。この際、凍結乾燥の方法は、特に限定されるものではなく、従来公知の方法を用いることができる。本発明により得られた凍結乾燥された酵素組成物においては、凍結乾燥時のＰＱＱ依存性ＰＤＨの失活が抑制されるとともに、凍結乾燥後のＰＱＱ依存性ＰＤＨの保存安定性が有意に向上する。なお、凍結乾燥をする前に、上記の非還元糖（例えば、トレハロース）などを添加しておいてもよい。

このようにして、ＰＱＱ依存性ＰＤＨと；前記ショ糖脂肪酸エステルと；を含む、ポリオール脱水素酵素組成物を製造することができる。

なお、本発明ではＰＱＱ依存性ＰＤＨを化学修飾しなくても、保存安定性が有意に向上した酵素組成物が得られるため、上記の方法で得られる部分精製酵素や精製酵素の溶液をそのままの形態で、すなわち、化学修飾されていないＰＱＱ依存性ＰＤＨ（非修飾ＰＱＱ依存性ＰＤＨ）を使用することが好ましい。ただし、ＰＱＱ依存性ＰＤＨを化学修飾された形態で使用してももちろんよい。

上記において、ポリオール脱水素酵素組成物を製造するための好ましい実施形態を説明したが、上記のように、ＰＱＱ依存性ＰＤＨと；前記ショ糖脂肪酸エステルと；を含ませることができれば、他の方法であってもよい。

＜電子伝達体＞
本発明における反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）は、電子伝達体（「電子受容体」とも称する場合がある）を含む。

電子伝達体は、バイオセンサの使用時において、酸化還元酵素の作用によって生成した電子を受け取る、すなわち還元される。そして、還元された電子伝達体は、酵素反応の終了後に電極への電位の印加によって電気化学的に酸化される。この際に流れる電流（以下、「酸化電流」とも称する）の大きさから、試料中の所望の成分の濃度が算出されうる。

本発明において使用される電子伝達体としては、従来公知のものを使用することができ、試料や使用する酸化還元酵素に応じて適宜決定できる。なお、電子伝達体は、単独で用いても、２種以上を組み合わせて使用してもよい。

電子伝達体としては、より具体的には、フェリシアン化カリウム、フェリシアン化ナトリウム、フェロセンおよびその誘導体、フェナジンメトサルフェートおよびその誘導体、ｐ−ベンゾキノンおよびその誘導体、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール、メチレンブルー、ニトロテトラゾリウムブルー、オスミウム錯体、ルテニウム錯体などを好適に使用することができる。

電子伝達体の含有量については特に制限はなく、試料の添加量などに応じて適宜調節されうる。一例を挙げると、１センサあたり、基質量に対して十分量を含有させるという観点から、１〜２０００μｇ、好ましくは５〜１０００μｇ、より好ましくは１０〜５００μｇの電子伝達体が含まれるとよい。また、電子伝達体は、グリシルグリシンのような緩衝剤で調製しておくことも好ましい。

第２実施形態のバイオセンサおいては、電子伝達体は、本発明のポリオール脱水素酵素組成物と同じ層に含まれなければ、第一の反応層８、第二の反応層９のいずれの反応層に含まれてもよいが、好ましくは第一の反応層８に含まれる。その理由は、電極に接する第二の反応層９に電子伝達体が存在すると、つまり、電極上に電子伝達体が存在すると、局部電池のような現象が生じ、電子伝達体が自動的に還元されてしまう虞がある。よって、より精度の向上されたバイオセンサを提供することを鑑みると、第一の反応層８（つまり、電極と接しない方）に含まれる。

＜界面活性剤＞
本発明のバイオセンサにおいては、反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）が、界面活性剤を有してもよい。界面活性剤が反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）に添加されることにより、反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）の溶解が促進されうる。ただ、本発明のポリオール脱水素酵素組成物は、界面活性剤として認識されるショ糖脂肪酸エステルが含まれるものであるので、バイオセンサにおける溶解性は有意に向上されているため、このような別途の界面活性剤を反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）に含ませることは必須ではない。

本発明に用いられる界面活性剤としては、使用するポリオール脱水素酵素組成物の酵素活性が低下しないものであれば、特に制限されないが、例えば、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、天然型界面活性剤などを適宜選択して使用することはできる。これらは、単独で用いても、混合物の形態で用いてもよい。好ましくはポリオール脱水素酵素組成物の酵素活性に影響を及ぼさないという観点から、非イオン性界面活性剤および両性界面活性剤の少なくとも一方である。

非イオン性界面活性剤としては、特に制限されないが、ポリオール脱水素酵素組成物の酵素活性に影響を及ぼさないという観点から、ポリオキシエチレン系またはアルキルグリコシド系であることが好ましい。

ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤としては、特に制限はないが、ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）［(polyoxyethylene-p-t-octylphenol;TritonX-100)］、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Polyoxyethylene Sorbitan Monolaurate；Tween 20）、ポリオキシエチレンソルビタンモノパリミテート（Polyoxyethylene Sorbitan Monopalmitate；Tween 40）、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート（Polyoxyethylene Sorbitan Monostearate；Tween 60）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Polyoxyethylene Sorbitan Monooleate；Tween 80）などが好ましい。中でも、ポリオール脱水素酵素組成物の溶解性を上げるという観点から、ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）［(polyoxyethylene-p-t-octylphenol;TritonX-100)］が好ましい。

アルキルグリコシド系非イオン性界面活性剤としては、特に制限はないが、炭素数７〜１２のアルキル基を有するアルキルグリコシド、アルキルチオグリコシドなどが好ましい。かかる炭素数については、より好ましくは７〜１０であり、特に好ましくは炭素数８である。糖部分は、グルコース、マルトースが好ましく、より好ましくはグルコースである。より具体的には、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコシドであると好ましい。アルキルグリコシド系非イオン性界面活性剤は、バイオセンサに使用する際、製造過程において、非常に塗りやすく、均一にできる。特に、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコシド）が反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）に含有されると、試料溶液を滴下した際の広がりが非常によく、濡れ性がよい（表面張力を起こしにくくする。）。よって、広がりや濡れ性の観点で考えると、「アルキルグリコシド」よりも「アルキルチオグリコシド」が非常に好ましい。なお、これらは、単独で用いても混合物の形態で用いてもよい。

両性界面活性剤としては、特に制限されないが、例えば、３−[（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ]−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）、３−[（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ]−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳＯ）、ｎ−アルキル−Ｎ−Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホン酸（Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ）などが挙げられる。
なお、これらは、単独で用いても、混合物の形態で用いてもよい。好ましくは、３−[（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ]−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）または３−[（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ]−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳＯ）である。特にＣＨＡＰＳが好ましい。その理由は、ＣＨＡＰＳは界面活性剤の中でも低溶血性のものだからである。

陽イオン性界面活性剤としては、特に制限されないが、例えば、セチルピリジニウムクロリド、トリメチルアンモニウムブロミドが挙げられる。これらは、単独で用いても、混合物の形態で用いてもよい。

陰イオン性界面活性剤としては、特に制限されないが、例えば、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウムなどが挙げられる。これらは、単独で用いても、混合物の形態で用いてもよい。

天然型界面活性剤としては、特に制限されないが、例えば、リン脂質が挙げられ、好ましくは、卵黄レシチン、大豆レシチン、水添レシチン、高純度レシチンなどのレシチンなどが挙げられる。これらは、単独で用いても、混合物の形態で用いてもよい。

上記の界面活性剤のうち、バイオセンサの精度をより向上させる観点で、試料として全血を使用する場合、低溶血性の界面活性剤を使用することが好ましい。具体例を挙げると、上記のＣＨＡＰＳや、Ｔｗｅｅｎ、エマルゲンＰＰ２９０（花王製）（ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール）が好ましい。特に、溶解性の観点で、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎが好ましい。

上記の界面活性剤のうち、第１実施形態のバイオセンサにおいては、界面活性剤としては、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ、エマルゲンＰＰ２９０が好ましく、中でも溶解性の観点から、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎが好ましい。

また、第２実施形態のバイオセンサにおいては、界面活性剤は、第一の反応層８、第二の反応層９のいずれの反応層に含まれてもよいし、両方の反応層に含まれてもよいが、好ましくは両方の反応層に含まれる。両方の反応層に含める各界面活性剤の種類は、同一であっても異なるものであってもよい。この際、第一の反応層８、第二の反応層９に含有される各構成要件との相互作用を考慮して選択することが好ましい。

より具体的には、まず、上記の通り、第二の反応層９においては、本発明のポリオール脱水素酵素組成物が含有されることが好ましいが、種類によっては疎水性が強いため、第二の反応層９には界面活性剤が含有されることが好ましい。この場合、界面活性剤の種類としては、バイオセンサの精度をより向上させる観点で、試料として全血を使用する場合、低溶血性の界面活性剤（例えば、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎなど）を使用することが好ましい。一方で、第一の反応層８においては、上記述べた通り、好ましくは電子伝達体（例えば、フェリシアン化カリウム）が含有されることが好ましいが、広がりや濡れ性を向上させて、バイオセンサの精度をより向上させるとの観点で、第一の反応層８にも界面活性剤が含有されることが好ましい。この場合、広がりや濡れ性の観点で考えると、界面活性剤の種類として、前記したアルキルチオグリコシド（ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコシドなど）を使用することが好ましい。

界面活性剤の含有量については特に制限はなく、試料の添加量などに応じて適宜調節されうる。

界面活性剤として、両性のものを用いる場合、１センサあたり、ポリオール脱水素酵素組成物の溶解性を上げ、且つ酵素活性を失活させず、また製造工程において塗布しやすいという観点から、０．０１〜１００μｇ、好ましくは０．０５〜５０μｇ、より好ましくは０．１〜１０μｇが含まれるとよい。なお、界面活性剤が１センサに２種類以上含まれるときは、含量は、その合計量を意味する。

界面活性剤として、非イオン性界面活性剤のものを用いる場合、１センサあたり、ポリオール脱水素酵素組成物の溶解性を上げ、且つ酵素活性を失活させず、また製造工程において塗布しやすいという観点から、０．０１〜１００μｇ、好ましくは０．０５〜５０μｇ、より好ましくは０．１〜１０μｇが含まれるとよい。また、かような界面活性剤は、グリシルグリシンのような緩衝剤で調製しておくことも好ましい。

＜親水性高分子＞
本発明における反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）は、さらに、親水性高分子を含んでもよい。

親水性高分子は、本発明のポリオール脱水素酵素組成物または電子伝達体などを電極上に固定化する機能を有する。また、反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）が親水性高分子を含むことにより、基板１および電極表面からの反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）の剥離が防止されうる。また、親水性高分子は、反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）表面の割れを防ぐ効果も有しており、バイオセンサの信頼性を高めるのに効果的である。さらに、タンパク質などの吸着性成分の電極への吸着もまた、抑制されうる。なお、反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）が親水性高分子を含む場合、反応層内に親水性高分子が含まれる形態を有していてもよく、または反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）を覆うように親水性高分子を含む親水性高分子層を形成させた形態を有してもよい。

本発明に用いることができる親水性高分子としては、従来公知のものを使用することができる。より具体的には、親水性高分子としては、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルエチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリリジンなどのポリアミノ酸、ポリスチレンスルホン酸、ゼラチンおよびその誘導体、アクリル酸の重合体またはその誘導体、無水マレイン酸の重合体またはその塩、スターチおよびその誘導体などが挙げられる。これらのうち、本発明のポリオール脱水素酵素組成物の酵素活性を失活させず、且つ溶解性が高いという観点から、カルボキシメチルセルロースが好ましい。なお、これらは、単独で用いても、混合物の形態で用いてもよい。

なお、このような親水性高分子の配合量は、１センサあたり、酵素や電子伝達体を固定化でき、且つ反応層の溶解性を下げないという観点から、好ましくは０．０１〜１００μｇであり、より好ましくは０．０５〜５０μｇであり、特に好ましくは０．１〜１０μｇである。親水性高分子は、後述もするが、例えば、グリシルグリシンのような緩衝液で調製しておくことも好ましい。

親水性高分子は、本発明の第２のバイオセンサにおいては、第一の反応層８、第二の反応層９のいずれに含有されてもよいが、好ましくは、第二の反応層９に本発明のポリオール脱水素酵素組成物が含まれるため、固定化の効果を勘案すると、酸化還元酵素が含まれる第二の反応層９に親水性高分子を含有させることが好ましい。

＜バイオセンサの製造方法＞
（第１実施形態のバイオセンサ）
第１実施形態のバイオセンサにおける反応層１０を形成する方法にも特に制限はないが、例えば以下の方法が考えられる。

本発明のポリオール脱水素酵素組成物と、電子伝達体と、を含む反応層１０を形成するための原料を、グリシルグリシン緩衝剤などで調製し、その調製した原料を、電極（作用部分）に、所定量滴下する。かかる原料には、例えば、界面活性剤が含まれていてもよい。調製した試料を滴下した後、所定の温度に保った恒温槽内やホットプレート上にて乾燥させる。なお、界面活性剤については、単に反応層内に含有されていてもよいし、反応層を覆うように界面活性剤を含む界面活性剤含有層を形成してもよい。また、必要に応じ上記した他の成分を添加してもよい。また、必要に応じエタノール等の揮発性有機溶媒を添加しておいてもよい。揮発性有機溶媒を添加しておくことで、早く乾きやすく、結晶化が小さくて済む。最後に、反応層１０にカバー７を覆うようにして、接着剤を介して張り合わせることにより、第１のバイオセンサを製造することができる。

（第２実施形態のバイオセンサ）
第２実施形態のバイオセンサにおける第一の反応層８、第二の反応層９を形成する方法にも特に制限はないが、例えば以下の方法が考えられる。

第一の反応層８については、電子伝達体（例えば、フェリシアン化カリウム）を含む第一の反応層８を形成するための原料を、グリシルグリシン緩衝剤などで調製し、その調製した原料を、カバー７に、所定量滴下する。この際、かかる原料には、例えば、界面活性剤（例えば、オクチルチオグルコシド）などの少なくとも１種を含んでいてもよい。この際、界面活性剤については、単に反応層内に含有されていてもよいし、反応層を覆うように界面活性剤を含む界面活性剤含有層を形成してもよい。なお、予めカバー７に接着剤を設置しておくとよい。調製した原料を滴下した後、所定の温度に保った恒温槽内やホットプレート上にて乾燥させる。このようにして、第一の反応層８を作製することができる。

一方で、第二の反応層９については、例えば、本発明のポリオール脱水素酵素組成物を含む第二の反応層９を形成するための原料を、グリシルグリシン緩衝剤などで調製し、その調製した原料を、電極に、所定量滴下する。この際、かかる原料には、リポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ）、親水性高分子（例えば、カルボキシメチルセルロース）、界面活性剤（例えば、ＣＨＡＰＳ）、などの少なくとも１種が含まれていてもよい。この際、界面活性剤については、単に反応層内に含有されていてもよいし、反応層を覆うように界面活性剤を含む界面活性剤含有層を形成してもよい。なお、予め基板１に接着剤を設置しておくとよい。調製した原料を滴下した後、所定の温度に保った恒温槽内やホットプレート上にて乾燥させる。このようにして、第二の反応層９を作製することができる。

最後に、第二の反応層９が形成されている基板１と、第一の反応層８が形成されているカバー７を、接着剤６ａ、６ｂを介して張り合わせることにより、第２のバイオセンサを製造することができる。

＜バイオセンサの適用＞
本発明において使用される試料は、好ましくは、溶液形態である。溶液形態における溶媒としても特に制限されず、従来公知の溶媒を適宜参照し、あるいは組み合わせて適用することができる。

試料としても、特に制限はされないが、例えば、全血、血漿、血清、唾液、尿、骨髄などの生体試料；ジュースなどの飲料水、醤油、ソースなどの食品類；排水、雨水、プール用水などが挙げられる。好ましくは、全血、血漿、血清、唾液、骨髄であり、より好ましくは全血である。

なお、試料は原液がそのまま用いられてもよいし、粘度などを調節する目的で適当な溶媒で希釈された溶液が用いられてもよい。試料に含まれる基質についても特に制限はなく、本発明のポリオール脱水素酵素組成物と反応しうる物質であればよい。

試料中の所望の成分（基質）としては、例えば、グルコースなどの糖類、グリセロール、ソルビトール、アラビトールなどの多価アルコール、中性脂肪、コレステロールなどの脂質、グルタミン酸や乳酸などの有機酸類、クレアチン、クレアチニンなどが挙げられる。上記と同様の理由から、中性脂肪やコレステロールなどの脂質が基質として選択されることが好ましい。

試料を試料供給部へ供給する形態は特に制限されず、例えば、毛細管現象を利用して、反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）に対して水平方向から試料を供給してもよい。

反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）へと試料が供給されると、試料中の所望の成分（基質）は、反応層に含まれる本発明のポリオール脱水素酵素組成物における酸化還元酵素の作用によって酸化され、自身の酸化と同時に電子を放出する。基質から放出された電子は、電子伝達体に捕捉され、これに伴って電子伝達体は酸化型から還元型へと変化する。試料の添加後、バイオセンサを所定時間放置することにより、酸化還元酵素によって基質が完全に酸化され、一定量の電子伝達体が酸化型から還元型へと変換される。

基質と酵素との反応を完結させるための放置時間については特に制限はないが、試料添加後、通常は１秒〜５分間、好ましくは３秒〜３分間、バイオセンサを放置すればよい。

その後、還元型の電子伝達体を酸化する目的で、電極を介して、作用極２と対極４との間に、所定の電位を印加する。これにより、還元型の電子伝達体が電気化学的に酸化され、酸化型へと変換される。この際に測定される電流（以下、「酸化電流」とも称する）の値から、電位印加前の還元型の電子伝達体の量が算出され、さらに、酵素と反応した基質の量が定量されうる。酸化電流を流す際に印加される電位の値は特に制限されず、従来公知の知見を参照して適宜調節されうる。一例を挙げると、−２００〜７００ｍＶ程度、好ましくは０〜５００ｍＶの電位を、対極４と作用極２との間に印加すればよい。電位を印加するための電位印加手段についても特に制限はなく、従来公知の電位印加手段が適宜用いられうる。

酸化電流値の測定、および当該電流値から基質濃度への換算の手法としては、所定の電位を印加してから一定時間後の電流値を測定するクロノアンペロメトリー法が用いられてもよいし、クロノアンペロメトリー法による電流応答を時間で積分して得られる電荷量を測定するクロノクーロメトリー法が用いられてもよい。簡単な装置系により測定されるという点で、クロノアンペロメトリー法が好ましく用いられうる。

以上、還元型の電子伝達体を酸化する際の電流（酸化電流）を測定することにより基質濃度を算出する形態を例に挙げて説明したが、場合によっては、還元されずに残存している酸化型の電子伝達体を還元する際の電流（還元電流）を測定することにより基質濃度を算出する形態が採用されてもよい。

本発明のバイオセンサは、いずれの形態で使用してもよく特に制限されない。例えば、
使い捨て用途としてのディスポーザブルタイプのバイオセンサ、少なくとも電極部分を人
体に埋め込んで連続的に所定の値を測定するためのバイオセンサなど、様々な用途に使用
できる。

本発明のバイオセンサは、中性脂肪センサ、グルコースセンサ等の従来公知のセンサに適用することが可能である。

本発明におけるポリオール脱水素酵素組成物は、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素と、ショ糖脂肪酸エステルと、を含むため、バイオセンサに適用した際に、バックグラウンド電流が抑制され、ひいては、バイオセンサの精度が向上する。よって、本発明は、本発明におけるポリオール脱水素酵素組成物が含まれたバイオセンサを用い、バイオセンサのバックグラウンド電流を抑制することによって、バイオセンサの精度を向上させる方法も提供する。

本発明の効果を、以下の実施例および比較例を用いて説明する。ただし、本発明の技術的範囲が以下の実施例のみに制限されるわけではない。なお、特に断りのない限り、「％」は「質量％」を意味する。なお、本発明において、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの酵素活性は、下記方法により測定した。

（酵素活性）
５０μＭ ＤＣＩＰ（２，６−ジクロロフェノールインドフェノール）、０．２ｍＭ ＰＭＳ（５−メチルフェナジニウムメチルサルフェート）、および４５０ｍＭ グリセロールを含む、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００を含む１０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）中に、酵素溶液を加えた。なお、かかる酵素溶液は、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００を含む１０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）で溶解した。この溶液中の酵素と基質の反応をＤＣＩＰの６００ｎｍの吸光度変化によって追跡し、その吸光度の減少速度を酵素の反応速度とした。ここで、１分間に１μｍｏｌのＤＣＩＰが還元される酵素活性を１単位（Ｕ）とした。なお、ＤＣＩＰのｐＨ ７．０におけるモル吸光係数は１６．３ｍＭ^−１とした。

［調製例１：［ポリオール脱水素酵素を含む可溶化膜画分の調製例］
ソルビトール １．５ｇ／１００ｍＬ、グルコン酸ナトリウム ０．５ｇ／１００ｍＬ、酵母エキス ０．３ｇ／１００ｍＬ、肉エキス ０．３ｇ／１００ｍＬ、コーンスティープリカー ０．３ｇ／１００ｍＬ、ポリペプトン １ｇ／１００ｍＬ、尿素 ０．１ｇ／１００ｍＬ、ＫＨ_２ＰＯ_４ ０．１ｇ／１００ｍＬ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ０．０２ｇ／１００ｍＬ、およびＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ ０．１ｇ／１００ｍＬからなり、塩酸でｐＨを５．５に調整した培地１００ｍＬを調製し、５００ｍＬ容の坂口フラスコに該培地８０ｍＬを移し、１２１℃、２０分間オートクレーブ処理した。

上記培地に、種菌として、グルコノバクター・タイランディカス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｔｈａｉｌａｎｄｉｃｕｓ）ＮＢＲＣ ３２９１を一白金耳植菌し、３０℃で２４時間、１４０ｍｉｎ^−１で振とう培養し、これを種培養液とした。

次に、上記と同じ組成で調製した培地５Ｌを８Ｌ容ジャーファーメンターに移し、１２１℃で５０分間オートクレーブを行い、放冷後、種培養液２４０ｍＬを移した。これを、４００ｒｐｍ、通気量５Ｌ／ｍｉｎ、３０℃の条件で２６時間培養した。

所定時間培養した後、この培養液を遠心分離（８，０００×ｇ、１０分、４℃）して集菌し、緩衝液で懸濁後、フレンチプレスにより菌体を破砕した。破砕液を遠心分離（４，０００×ｇ、１０分、４℃）し、得られた上清を超遠心分離（４０，０００ｒｐｍ、９０分、４℃）して、膜画分を沈殿物として得た。

この膜画分を１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で懸濁し、終濃度が０．５ｇ／１００ｍＬとなるようにＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００を加え、４℃で２時間撹拌した。超遠心分離（４０，０００ｒｐｍ、９０分、４℃）し、上清を０．１ｇ／１００ｍＬ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００を含む１０ｍＭ ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）で一晩透析し、これを可溶化膜画分とした。

［実施例 ポリオール脱水素酵素の調製例］
得られた可溶化膜画分をＦＰＬＣ（Ｆａｓｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；ＧＥヘルスケア製）にて精製した。カラムはＲｅｓｏｕｒｃｅＱ ６ｍＬ（ＧＥヘルスケア製）を使用した。カラムの平衡化は、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８ ＋０．０５％ショ糖ラウリン酸エステル（サーフホープＪ−１２１６ 三菱化学フーズ（株式会社）） ＋５ｍＭ ＭｇＳＯ_４で行った。可溶化膜画分をアプライ後、非吸着画分（つまり、蛋白と結合していない遊離している可溶化に用いた界面活性剤および非吸着の蛋白）を、カラムの平衡化に用いた溶液にてカラム体積の１０倍量で洗浄した。溶出緩衝液（溶離液）には、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８ ＋０．０５％ショ糖ラウリン酸エステル（サーフホープＪ−１２１６ 三菱化学フーズ（株式会社））＋５ｍＭ ＭｇＳＯ_４ ＋ ０．４Ｍ ＮａＣｌを用い、カラム体積の１０倍量でグラジエント溶出を行った。ポリオール脱水素酵素活性画分は、０．２Ｍ ＮａＣｌ前後で溶出した。可溶化膜画分からの回収率は、８５％であった。得られたポリオール脱水素酵素活性画分を１０ｍＭ グリシルグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ ７．５）およびｐＨ８ ＋０．０５％ショ糖ラウリン酸エステル（サーフホープＪ−１２１６ 三菱化学フーズ（株式会社）で一晩透析することにより、蛋白濃度２ｍｇ／ｍＬ、比活性３０Ｕ／ｍｇ蛋白の酵素標品を得た。これをＰＱＱ依存性ＰＤＨ溶液と称する。得られたＰＱＱ依存性ＰＤＨ溶液（蛋白濃度２ｍｇ／ｍＬ、比活性３０Ｕ／ｍｇ蛋白） ２０ｍｌに１０ｍＭ グリシルグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ ７．５） １２０ｍｌを加えた後、限外ろ過（分画分子量：５０，０００）し、蛋白濃度が５ｍｇ／ｍＬ以上となるように濃縮した。濃縮後、さらに、２００ｍｌの１０ｍＭ グリシルグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ ７．５）を加え、濃縮するという作業を５回繰り返した。最後の６回目の濃縮においては、濃縮後、ローリー法（ＢＩＯ ＲＡＤ社製、ＤＣ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ）により蛋白濃度を測定した。測定後、１０ｍＭ グリシルグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ ７．５）を加えることにより、ＰＱＱ依存性ＰＤＨ溶液中の蛋白濃度を５ｍｇ／ｍＬに調整した。調整後、対蛋白量あたり、３０％となるようにトレハロースを添加後、−８０℃にて凍結させた。凍結後、凍結乾燥を行い、粉末状の酵素組成物を得た。酵素組成物重量あたりの酵素活性は、１３Ｕ／ｍｇ・粉末であった。なお、かかる酵素組成物中の緩衝剤の量は、理論値で、対蛋白量あたり、２６％である。ここで、「理論値」としたのは、かかる実施例で使用した「緩衝剤」は、上記透析、限外ろ過によっては、分子量が有意に大きいものであるので、除去されないものであるからである。

なお、上記限外ろ過において、ショ糖ラウリン酸エステルが除去（減量）されないと仮定した場合のショ糖ラウリン酸エステルの量は、対蛋白量あたり、２５％である。ただし、「ショ糖ラウリン酸エステル」は、上記全６回の限外ろ過の工程を経ることで５〜９５％程度に減量されている場合がある。そのため、酵素組成物中のショ糖ラウリン酸エステルの量は、対蛋白量あたり、１．２５〜２３．７５％程度と推定される。

［比較例 ポリオール脱水素酵素の調製例（従来法；界面活性剤にＴｒｉｔｏｎＸ−１００使用）］
得られた可溶化膜画分をＦＰＬＣ（Ｆａｓｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；ＧＥヘルスケア製）にて精製した。カラムはＲｅｓｏｕｒｃｅＱ ６ｍＬ（ＧＥヘルスケア製）を使用した。カラムの平衡化は、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ８ ＋０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００＋５ｍＭ ＭｇＳＯ_４で行った。可溶化膜画分をアプライ後、非吸着画分を前記緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ８ ＋０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００＋５ｍＭ ＭｇＳＯ_４）にてカラム体積の１０倍量で洗浄した。溶出緩衝液（溶離液）には、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ８ ＋０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００＋５ｍＭ ＭｇＳＯ_４ ＋ ０．２Ｍ ＮａＣｌを用い、カラム体積の１０倍量でグラジエント溶出を行った。ポリオール脱水素酵素活性画分は、０．１Ｍ ＮａＣｌ前後で溶出した。可溶化膜画分からの回収率は６２％であった。得られたポリオール脱水素酵素活性画分を１０ｍＭ グリシルグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ ７．５）で一晩透析することにより、蛋白濃度１ｍｇ／ｍＬ、比活性３０Ｕ／ｍｇ蛋白の酵素標品を得た。これをＰＱＱ依存性ＰＤＨ溶液と称する。得られたＰＱＱ依存性ＰＤＨ溶液（蛋白濃度１ｍｇ／ｍＬ、比活性３０Ｕ／ｍｇ蛋白） ２０ｍｌに１０ｍＭ グリシルグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ ７．５） １２０ｍｌを加えた後、限外ろ過（分画分子量：５０，０００）した。濃縮後、さらに、２００ｍｌの１０ｍＭ グリシルグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ ７．５）を加え、濃縮するという作業を５回繰り返した。最後の６回目の濃縮においては、蛋白濃度が５ｍｇ／ｍＬ以上となるように濃縮した。濃縮後、ローリー法（ＢＩＯ ＲＡＤ社製、ＤＣ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ）により蛋白濃度を測定した。測定後、１０ｍＭ グリシルグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ ７．５）を加えることにより、ＰＱＱ依存性ＰＤＨ溶液中の蛋白濃度を５ｍｇ／ｍＬに調整した。調整後、対蛋白量あたり、３０％となるようにトレハロースを添加後、−８０℃にて凍結させた。凍結後、凍結乾燥を行い、粉末状の酵素組成物を得た。酵素組成物重量あたりの酵素活性は、１０Ｕ／ｍｇ・粉末であった。

界面活性剤としてＴｒｉｔｏｎＸ−１００とポリエチレングリコール脂肪酸エステルを用いた場合、陰イオン交換カラム（カラム：ＲｅｓｏｕｒｃｅＱ ６ｍｌ）の回収率は同じであり、粉末あたりの酵素活性は、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００が１０Ｕ／ｍｇ・粉末に対し、ポリエチレングリコール脂肪酸エステルでは１５Ｕ／ｍｇ・粉末であり、ポリエチレングリコール脂肪酸エステルの方が優れていることが分かった。

（バックグラウンド電流測定）
実施例で調製したポリオール脱水素酵素組成物を２．５Ｕ／μＬとなるように１０ｍＭ グリシルグリシン−ＮａＯＨ ｐＨ ７．５で溶解後、１．５ｍＬプラスチックチューブに４μＬ加えた。さらに、４００ｍＭ フェリシアン化カリウム ４μＬを加え、ピペッティングした。所定時間経過後、２μＬサンプリングし、電極の各作用部分を覆うように滴下し、参照極を基準として作用極と対極の間に＋５００ｍＶの電位を印加して、５秒後に作用極と対極との間に流れる電流値を測定することにより、基質（ポリオール）がない状態でのＰＱＱ依存性ＰＤＨと電子伝達体との反応を評価した。なお、電極は、ＤＥＰ Ｃｈｉｐ ＥＲ−Ｎ（有限会社バイオデバイステクノロジー製）を使用した。結果を表１および図１に示す。

比較のため、比較例で調製したポリオール脱水素酵素組成物を用い、同様の検討を行った。

１ 絶縁性基板、
２ 作用極、
２−１ 作用極作用部分、
３ 参照極、
３−１ 参照極作用部分、
４ 対極、
４−１ 対極作用部分、
５ 絶縁層、
６（６ａ、６ｂ） 接着剤、
７ カバー、
８ 第一の反応層、
９ 第二の反応層、
１０ 反応層、
Ｓ 空間部。

Claims (8)

1. 補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素と、
   ショ糖脂肪酸エステルと、
   を含む、ポリオール脱水素酵素組成物。
2. 前記ショ糖脂肪酸エステルのＨＬＢ値が、８〜２０である、請求項１に記載のポリオール脱水素酵素組成物。
3. 前記ショ糖脂肪酸エステルにおける脂肪酸の炭素数が、５〜３０である、請求項１または２に記載のポリオール脱水素酵素組成物。
4. 前記ショ糖脂肪酸エステルにおける脂肪酸が、ベヘニン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、ミリスチン酸、ラウリン酸、エルカ酸およびオレイン酸からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリオール脱水素酵素組成物。
5. 前記ポリオール脱水素酵素は、グリセロール脱水素酵素である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリオール脱水素酵素組成物。
6. 絶縁性基板と、前記絶縁性基板上に形成されてなる、少なくとも作用極および対極を含む電極と、前記電極上に形成されてなる試料供給部と、を有するバイオセンサであって、
   前記試料供給部が、
   請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリオール脱水素酵素組成物と、
   電子伝達体と、
   を含む反応層を有する、バイオセンサ。
7. 中性脂肪センサである、請求項６に記載のバイオセンサ。
8. 請求項６または７に記載のバイオセンサを用い、バイオセンサのバックグラウンド電流を抑制することによって、バイオセンサの精度を向上させる方法。

Images