JP5512996B2

JP5512996B2 - ポリオール脱水素酵素組成物

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Publication number: JP5512996B2
Application number: JP2009086747A
Authority: JP
Inventors: 基晶桑原; 博宣村瀬
Original assignee: Shishiai KK; Ultizyme International Ltd
Current assignee: Shishiai KK; Ultizyme International Ltd
Priority date: 2009-03-31
Filing date: 2009-03-31
Publication date: 2014-06-04
Anticipated expiration: 2029-03-31
Also published as: JP2010233531A

Description

本発明は、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素（以下、「ＰＱＱ依存性ＰＤＨ」または単に「ポリオール脱水素酵素」とも称する）の保存安定性、特に凍結乾燥後のポリオール脱水素酵素の保存安定性を向上させたポリオール脱水素酵素組成物、当該組成物を含むポリオール測定試薬、および当該組成物を用いたポリオールの定量方法に関する。

補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素は、バクテリアの細胞膜に存在し、グルコノバクター属の細菌などから抽出、精製する方法が知られており、グリセロールやソルビトール、マンニトールなどの定量に利用されている。

従来から、例えば、グリセロールに関しては、下記式（１）および式（２）で示すように、グリセロールキナーゼ（ＧＫ）とグリセロール−３−リン酸オキシダーゼ（ＧＰＯ）もしくはグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤＨ）とを用いることによる定量方法が知られている。

しかし、この方法は二種類の酵素を用いるため反応が煩雑である。さらに、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼを用いた場合は溶存酸素の影響を受けるという問題点がある。また、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼを用いた場合は、高価なＮＡＤ^＋を添加する必要がある。

溶存酸素の影響を受けず、一種類の酵素を用いる方法としては、下記式（３）で示すようなＮＡＤ依存性グリセロールデヒドロゲナーゼを用いた方法が知られている。

しかし、ＮＡＤ依存性グリセロールデヒドロゲナーゼを用いた場合、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼと同様、高価なＮＡＤ^＋を添加する必要がある。

これに対して、より安価で簡便なグリセロールの定量方法として、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素（ＰＱＱ依存性ＰＤＨ）を用いる方法がある。この方法は、下記式（４）の反応によって行われるため、溶存酸素の影響を受けない、反応が簡便で複数の酵素を用いる必要がない、高価なＮＡＤ^＋を添加する必要がないなどのメリットがある。

しかし、ＰＱＱ依存性ＰＤＨは、膜結合型酵素であるため、保存安定性が悪いという問題点がある。したがって、上記ＰＱＱ依存性ＰＤＨの安定性を向上させることが重要な課題となっている。

ＰＱＱ依存性ＰＤＨの安定性を向上させる方法として、特許文献１には、ＰＱＱ依存性ＰＤＨと類似する、補欠分子族としてピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）を含むグルコース脱水素酵素に対して、（ｉ）アスパラギン酸、グルタミン酸、α―ケトグルタル酸、リンゴ酸、α―ケトグルコン酸、α―サイクロデキストリンおよびこれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種の化合物、ならびに（ｉｉ）アルブミンを含む安定化剤を添加することにより、従来に比べて安定な酵素組成物が得られることが開示されている。

また、特許文献２には、ＰＱＱ依存性ＰＤＨに対して、２価の金属イオンを有する化合物、非還元糖、および界面活性剤を安定化剤として添加することにより、保存安定性の向上したポリオール脱水素酵素組成物が得られることが開示されている。

さらに、特許文献３には、ＰＱＱ依存性ＰＤＨに対して、ストレプトマイシンおよびジヒドロストレプトマイシンの少なくとも一方と、２価の金属イオンを形成する金属を含む化合物と、界面活性剤とを安定化剤として添加することにより、安定なポリオール脱水素酵素組成物が得られることが開示されている。

特開２００１−２２４３６８号公報特開２００７−２５９８１４号公報特開２００８−２４５５３３号公報

しかし、特許文献１に記載の安定化剤では、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの保存安定性を向上させることはできない。

特許文献２に記載の酵素組成物では、３７℃で１週間保存した際の酵素活性の残存活性が８０％前後であり、酵素の保存安定性が十分であるとはいえない。

また、特許文献２や特許文献３に記載の酵素組成物には、高濃度の安定化剤が含まれるため、酵素組成物を再溶解させる場合に溶解が困難であるという問題や、溶解した場合であっても溶液の粘度が高くなりすぎるという問題がある。

さらに、特許文献３に記載の酵素組成物では、酵素活性の残存活性は向上しているものの、保存中に酵素組成物が渇変するという問題が生じるおそれがある。渇変するということは、すなわち、保存中に制御できない反応が起こることを意味するため、定量用試薬として利用する際には十分な精度が得られないおそれがある。

よって、酵素組成物の渇変を防止し、酵素の保存安定性をさらに向上させる技術が望まれている。

本発明は、上記事情を鑑みてなされたものであり、保存中の渇変が抑制され、且つ、酵素の保存安定性が向上したポリオール脱水素酵素組成物を提供することを目的とする。また、本発明の他の目的は、正確にポリオールを定量できる上記ＰＱＱ依存性ＰＤＨ組成物を含むポリオール測定試薬、および上記ＰＱＱ依存性ＰＤＨ組成物を用いたポリオールの定量方法を提供することである。

本発明者らは、上記従来の問題点に鑑み、鋭意研究を積み重ねた。その結果、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素に対して、グリシルグリシンおよび界面活性剤を添加することにより、ポリオール脱水素酵素の安定性、特に凍結乾燥後のポリオール脱水素酵素の安定性が向上することを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素と、グリシルグリシンと、界面活性剤とを含む、ポリオール脱水素酵素組成物である。

本発明によれば、低濃度の安定化剤によって補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素（ＰＱＱ依存性ＰＤＨ）の経時的な酵素活性の低下、特に凍結乾燥後の経時的な酵素活性の低下を有意に抑制・防止することができ、これによりＰＱＱ依存性ＰＤＨの保存安定性を著しく向上させることができる。特に、グリシルグリシンを含む本発明の酵素組成物は、よく知られている２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（Ｔｒｉｓ）、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、グリシンなどの緩衝剤を含む酵素組成物に比べて、酵素の残存活性を有意に向上させることができる。さらに、本発明の酵素組成物では渇変が防止されうる。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明の一形態によれば、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素と、グリシルグリシンと、界面活性剤と、を含む、ポリオール脱水素酵素組成物が提供される。

本発明において、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素（ＰＱＱ依存性ＰＤＨ）は、いずれのポリオールを基質としてもよく、２つ以上の水酸基を有するアルコール（糖アルコールを含む）であれば、特に制限されない。例えば、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ラクチトールなどの二糖由来アルコール、グリセロールなどのトリオール、エリスリトールなどのテトリトール、アラビトール、キシリトール、リビトールなどのペンチトール、マンニトール、ソルビトールなどのヘキシトール、イノシトールなどのシクリトールなどが挙げられる。中でも好ましくは、グリセロール（ピロロキノリンキノン依存性グリセロール脱水素酵素）、アラビトール（ピロロキノリンキノン依存性アラビトール脱水素酵素）、およびマンニトール（ピロロキノリンキノン依存性マンニトール脱水素酵素）を基質とし、より好ましくはグリセロールを基質とする。

本発明に用いられるＰＱＱ依存性ＰＤＨとしては、従来公知の酵素をいずれも好ましく使用することができる。該酵素は例えば、グルコノバクター属、シュードモナス属など、様々な細菌が生成することが知られている。本発明では、これらのＰＱＱ依存性ＰＤＨを産生することができる菌（以下、「ＰＱＱ依存性ＰＤＨ産生菌」とも称する）が生成するいずれのＰＱＱ依存性ＰＤＨも好適に使用することができるが、これらの中でも特に、グルコノバクター属に由来するＰＱＱ依存性ＰＤＨを好適に使用することができる。さらに、入手の容易さから、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒｏｘｙｄａｎｓ）ＮＢＲＣ３１３０、３１７１、３１７２、３１８９、３２４４、３２５０、３２５３、３２５５、３２５６、３２５７、３２５８、３２８５、３２８７、３２８９、３２９０、３２９１、３２９２、３２９３、３２９４、３４６２、３９９０、１２４６７、１４８１９；グルコノバクター・フラテウリ（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒｆｒａｔｅｕｒｉｉ）ＮＢＲＣ３２５１、３２５４、３２６０、３２６４、３２６５、３２６８、３２７０、３２７１、３２７２、３２７３、３２７４、３２８６、１６６６９；グルコノバクター・セリナス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒｃｅｒｉｎｕｓ）ＮＢＲＣ３２６２、３２６３、３２６６、３２６７、３２６９、３２７５、３２７６等を使用することができる。

また、ＰＱＱ依存性ＰＤＨ産生菌であれば、これらの自然突然変異株または人為突然変異株を使用してもよい。人為突然変異処理方法は、当業者に周知の方法と同様にしてもしくは当業者に周知の方法を適宜修飾してまたはこれらの方法を適宜組合せて適用することができる。このような微生物の代表菌株として、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒｏｘｙｄａｎｓ）が使用され、特にグルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒｏｘｙｄａｎｓ）ＮＢＲＣ３２９１が好ましく使用される。

上記ＰＱＱ依存性ＰＤＨ産生菌からＰＱＱ依存性ＰＤＨを得るための具体的な方法は、特に制限されず、例えば、上記ＰＱＱ依存性ＰＤＨ産生菌を栄養培地にて培養し、該培養物からＰＱＱ依存性ＰＤＨを抽出する方法が挙げられる。

上記ＰＱＱ依存性ＰＤＨ産生菌を培養する培地は、使用菌株が資化しうる炭素源、窒素源、無機物、その他必要な栄養素を適量含有するものであれば、合成培地であっても天然培地であってもよい。炭素源としては、例えば、グルコース、グリセロール、ソルビトールなどが使用される。窒素源としては、例えば、ペプトン類、肉エキス、酵母エキスなどの窒素含有天然物や、塩化アンモニウム、クエン酸アンモニウムなどの無機窒素含有物が使用される。無機物としては、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、硫酸マグネシウムなどが使用される。その他、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。上記の炭素源、窒素源、無機物、およびその他の必要な栄養素は、単独で用いても２種以上組み合わせて用いてもよい。

培養は、振とう培養あるいは通気撹拌培養で行うことが好ましい。培養温度は２０〜５０℃、好ましくは２２〜４０℃、最も好ましくは２５℃〜３５℃である。培養ｐＨは４〜９の範囲、好ましくは５〜８である。これら以外の条件下でも、使用する菌株が生育すれば実施される。培養期間は通常０．５〜５日が好ましい。なお、これらのＰＱＱ依存性ＰＤＨは、上記培養によって得られた酵素でも、ＰＱＱ依存性ＰＤＨ遺伝子を大腸菌等に形質導入して得られた組換え酵素であってもよい。

次いで、得られたＰＱＱ依存性ＰＤＨを抽出する。抽出方法は一般に使用される抽出方法を用いることができ、例えば超音波破砕法、フレンチプレス法、有機溶媒法、リゾチーム法等を用いることができる。抽出したＰＱＱ依存性ＰＤＨの精製方法は特に制限されず、例えば、硫安やぼう硝などの塩析法、塩化マグネシウムや塩化カルシウムを用いる金属凝集法、ストレプトマイシンやポリエチレンイミンを用いる除核酸、またはＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）−セファロース、ＣＭ（カルボキシメチル）−セファロースなどのイオン交換クロマト法などを用いることができる。なお、これらの方法で得られる部分精製酵素や精製酵素液は、そのままの形態で使用しても、または化学修飾された形態で使用してもよい。本発明において、化学修飾された形態のＰＱＱ依存性ＰＤＨを使用する場合には、上記の方法で得られる培養物由来のＰＱＱ依存性ＰＤＨを、例えば、特開２００６−２７１２５７号公報に記載されるような方法などを用いて適宜化学修飾して使用することができる。なお、化学修飾方法は、上記公報に記載の方法に限定されるものではない。

本発明の酵素組成物はＰＱＱ依存性ＰＤＨおよびＰＱＱ依存性ＰＤＨを安定化する安定化剤を含む。そして、本発明の酵素組成物に含まれる安定化剤はグリシルグリシンと、界面活性剤とを含み、さらに、好ましくは、必要に応じて、非還元糖および／または２価の金属イオンを形成する金属を含む金属化合物を含む。

本発明に用いられるグリシルグリシンは緩衝剤として機能し、アミノ酸系緩衝剤の一種である。グリシルグリシンはＰＱＱ依存性ＰＤＨの保存安定性を向上させ、また、本発明の酵素組成物の保存安定性を向上させうる。本発明の酵素組成物は、緩衝剤であるグリシルグリシンを安定化剤として用いるため、低濃度の安定化剤でＰＱＱ依存性ＰＤＨの保存安定性を向上できるというメリットがある。特に、グリシルグリシンは、グリシンなどの他のアミノ酸系緩衝剤や他のよく知られている緩衝剤を含む酵素組成物に比べて、酵素組成物の保存時の安定性を飛躍的に向上させることができる。

本発明の酵素組成物に含まれるグリシルグリシンの量は、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの保存安定性を向上できる量であれば特に限定されないが、組成物中のＰＱＱ依存性ＰＤＨの総質量を１００質量％として、好ましくは２〜２５０質量％、より好ましくは３〜２００質量％である。さらに好ましくは５〜１５０質量％である。２質量％以上であれば、安定化剤としての効果を十分に発揮でき、一方、２５０質量％以下であれば、添加に見合う安定化剤としての効果の向上が認められる。

また、本発明の酵素組成物において、グリシルグリシンに加えて酸またはアルカリなどのｐＨ調整剤を含むことが好ましい。これにより、酵素組成物のｐＨを所望の範囲に調整することができる。本発明の酵素組成物のｐＨは、酵素の安定ｐＨから極端に外れていなければよく、好ましくは６．０〜１１．０、より好ましくは６．５〜１０．５、最も好ましくは７．０〜１０．０である。なお、酵素組成物のｐＨとは、酵素組成物が溶液形態や半固体形態の場合には当該酵素組成物のｐＨをいい、酵素組成物が固体形態の場合には当該酵素組成物１ｇを１００ｍｌ水溶液とした際の当該水溶液のｐＨをいう。かようなｐＨ調整剤としては、塩酸等の酸や水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリが挙げられる。ｐＨ調整剤の含有量は特に制限されず、所望のｐＨが実現される量を用いればよい。

本発明に用いられる界面活性剤は、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの保存安定性を向上させ、また、本発明の酵素組成物の保存安定性を向上させうる。

前記界面活性剤の種類は特に制限されず、膜タンパク質の可溶化に一般的に使用されているものであれば、陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、および天然型界面活性剤などが挙げられ、これらのいずれを用いてもよい。陽イオン性界面活性剤としては、セチルピリジニウムクロリド、トリメチルアンモニウムブロミドが挙げられる。陰イオン性界面活性剤としては、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウムなどが挙げられる。両性界面活性剤としては、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホナート（ＣＨＡＰＳ）、ｎ−アルキル−Ｎ−Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホン酸（Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ）などが挙げられる。非イオン性界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝４〜４０）（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ８０）、アルキルグリコシドなどが挙げられる。天然型界面活性剤としては、例えば、リン脂質が挙げられ、好ましくは、卵黄レシチン、大豆レシチン、水添レシチン、高純度レシチンなどのレシチンなどが挙げられる。ただし、これら以外の界面活性剤が用いられてもよいことは勿論である。これらは単独で使用しても、または２種以上の混合物の形態で使用してもよい。中でも、好ましくは、ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝７〜１６）、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホナート（ＣＨＡＰＳ）、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコシドである。かような界面活性剤はＰＱＱ依存性ＰＤＨの保存安定性を向上させ、また、本発明の酵素組成物の保存安定性を向上させうる。さらにこれらの中でも、酵素活性の低下を抑制するという観点から、ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）であるＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００がより好ましい。

本発明に使用される界面活性剤の量は、酵素の安定性が向上できる量であれば特に限定されない。ここで、例えば、界面活性剤は酵素組成物を調製する際に、限外ろ過等の濃縮過程により除去されうる。界面活性剤としてＴｒｉｔｏｎＸ（登録商標）−１００を使用する場合、得られた酵素組成物中のＴｒｉｔｏｎＸ（登録商標）−１００の含有量は、本来であれば、質量分率（質量％）で規定することが望ましいが、下記理由により現状では規定困難である。

ＰＱＱ依存性ＰＤＨを含む溶液中のＴｒｉｔｏｎＸ（登録商標）−１００の定量方法としては、（１）ＰＱＱ依存性ＰＤＨを加熱やトリクロロ酢酸等により変性後、遠心分離することにより沈殿させ、ＰＱＱ依存性ＰＤＨを含まない上清の２８０ｎｍの吸光度を測定する方法や（２）ＪＩＳ法により測定する方法などが考えられる。しかし、（１）の方法では、完全にＰＱＱ依存性ＰＤＨを沈殿させることが困難であり、測定誤差が生じる。また、（２）の方法では、ＰＱＱ依存性ＰＤＨが発色反応を妨害し、定量できないという問題が生じる。そこで本発明者らは簡易なＴｒｉｔｏｎＸ（登録商標）−１００量の確認方法として、ローリー法により測定された蛋白濃度が５ｍｇ／ｍｌである溶液とした場合の２８０ｎｍにおける吸光度により規定することとした。具体的には、ローリー法（ＢＩＯＲＡＤ社製、ＤＣｐｒｏｔｅｉｎａｓｓａｙ）により測定された蛋白濃度が５ｍｇ／ｍｌとなるように濃度調整されたＰＱＱ依存性ＰＤＨ溶液を調製し、このＰＱＱ依存性ＰＤＨ溶液の２８０ｎｍにおける吸光度を分光光度計（株式会社島津製作所製）により測定した場合の吸光度の大きさにより酵素組成物中のＴｒｉｔｏｎＸ（登録商標）−１００の含有量を評価することとした。ローリー法（ＢＩＯＲＡＤ社製、ＤＣｐｒｏｔｅｉｎａｓｓａｙ）は界面活性剤等の干渉を受けにくく、高精度な蛋白質の定量法として知られている。なお、標準液としては牛血清アルブミンを用いた。一方、酵素組成物中の蛋白質およびＴｒｉｔｏｎＸ−１００は波長２８０ｎｍで吸光を示し、当該２８０ｎｍにおける吸光度の大きさは酵素組成物中に含まれる蛋白質およびＴｒｉｔｏｎＸ（登録商標）−１００の合計量に対応する。したがって、ローリー法により蛋白濃度が５ｍｇ／ｍｌである溶液、すなわち同一の蛋白濃度を有する溶液の２８０ｎｍにおける吸光度を測定することにより、ＴｒｉｔｏｎＸ（登録商標）−１００量を確認することができる。

具体的には、界面活性剤としてＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００を使用した場合には、酵素組成物を、ローリー法により測定された蛋白濃度が５ｍｇ／ｍｌである溶液とした場合の２８０ｎｍにおける吸光度が好ましくは６〜１６の範囲であり、より好ましくは６〜１４の範囲であり、特に好ましくは６〜１２の範囲である。６未満である場合にはＴｒｉｔｏｎＸ−１００の量が少なすぎて安定化効果が得られず、１６を超える場合にはＴｒｉｔｏｎＸ−１００が高濃度となり、保存安定性が低下する。ＴｒｉｔｏｎＸ−１００の含有量をこの吸光度の値が上記範囲とすることにより、酵素の失活を防止し、酵素組成物の保存安定性を向上させることが可能となる。

本発明の酵素組成物は、さらに非還元糖を含むことが好ましい。本発明に用いられる非還元糖は、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの保存安定性を向上させ、また、本発明の酵素組成物の保存安定性を向上しうる。

本発明において、「非還元糖」とは、遊離性のアルデヒド基やケトン基をもたないために還元性を有しない糖類を意味する。このような還元糖としては、上記したような性質を有するものであればよく、例えば、還元基同士の結合したトレハロース型小糖類、糖類の還元基および非糖類が結合した配糖体、糖類に水素添加して還元した糖アルコールなどがある。より具体的には、スクロース、トレハロース、ラフィノース等のトレハロース型少糖類；アルキル配糖体、フェノール配糖体、カラシ油配糖体等の配糖体；およびアラビトール、キシリトール、ソルビトール等の糖アルコールなどが挙げられる。中でも、トレハロース、ラフィノース、スクロースが好ましく、特にトレハロースおよびラフィノースが好ましい。また、これらのうち、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの基質となる糖アルコールは、好ましくない場合がある。これらの還元糖は、単独で使用しても、２種以上を組み合わせて使用してもよい。

本発明の酵素組成物に含まれる非還元糖の量は、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの保存安定性を向上できる量であれば特に制限されないが、酵素組成物中のＰＱＱ依存性ＰＤＨの総質量を１００質量％として、好ましくは１〜２００質量％、より好ましくは５〜１００質量％である。１質量％以上であれば、安定化剤としての効果を十分に発揮でき、一方、２００質量％以下であれば、添加に見合う安定化剤としての効果の向上が認められる。

本発明の酵素組成物は、さらに２価の金属イオンを形成する金属を含む金属化合物を含むことが好ましい。本発明に用いられる２価の金属イオンを形成する金属を含む金属化合物は、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの保存安定性を向上させ、また、本発明の組成物の保存安定性を向上させうる。

本発明に用いられる２価の金属イオンを形成する金属を含む金属化合物としては、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの保存安定性を向上でき、かつ、２価のイオンを形成する化合物であれば特に制限されない。上記２価の金属イオンを形成する金属を含む金属化合物の具体的な例としては、カルシウム、マグネシウム、バリウム、マンガン、鉄、銅、コバルト、ニッケル、水銀、鉛および亜鉛などの２価の金属イオンを形成する金属を含む金属化合物が挙げられる。中でも、カルシウムを含む化合物およびマグネシウムを含む化合物からなる群より選択される少なくとも１種が好ましい。また、上記２価の金属イオンを形成する金属を含む金属化合物の形態は、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの安定性を向上できるものであれば特に制限されないが、例えば、上記金属のフッ化物、塩化物、臭化物、もしくはヨウ化物などのハロゲン化物、上記金属の硫酸塩、上記金属の硝酸塩、または上記金属のリン酸塩などが挙げられる。これらの中でも、塩化物、硫酸塩、および硝酸塩からなる群より選択される少なくとも１種であることが好ましい。なお、これら２価の金属イオンを形成する金属を含む金属化合物は単独で使用されても、また２種以上の混合物の形態で使用されてもよい。

本発明の酵素組成物に含まれる２価の金属イオンを形成する金属を含む金属化合物の量は、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの保存安定性を向上できる量であれば特に制限されないが、組成物中のＰＱＱ依存性ＰＤＨの総質量を１００質量％として、好ましくは１〜３０質量％、より好ましくは１〜２０質量％である。１質量％以上であれば、安定化剤としての効果を十分に発揮でき、一方、３０質量％以下であれば、添加に見合う安定化剤としての効果の向上が認められ、また、本発明の組成物を緩衝液等で再溶解する際、２価の金属イオンを形成する金属を含む金属化合物を溶解できる。

本発明の酵素組成物は、本発明の目的を損なわない範囲内で、ジチオスレイトール、２−メルカプトエタノール等の還元剤などの付加成分を所望に応じて含有することができる。

本発明の酵素組成物の形態は特に制限されず、例えば粉末状、顆粒状、錠剤状などの固体形態；液状、乳液状等の液体形態；またはペースト状等の半固体形態などの、任意の形態でありうる。中でも、本発明の効果が顕著に発揮されることから、固体状の形態であることが好ましい。

本発明の酵素組成物の製造方法は、特に制限されないが、例えば、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素（ＰＱＱ依存性ＰＤＨ）に対して、グリシルグリシンおよび界面活性剤を添加する方法が挙げられる。

グリシルグリシンの添加形態は特に制限されず、グリシルグリシンをそのまま添加してもよいが、グリシルグリシンを含む緩衝液（以下「グリシルグリシン緩衝液」とも称する）として添加することが好ましい。グリシルグリシン緩衝液とは、グリシルグリシンを緩衝剤として含む緩衝液をいう。

すなわち、本発明の一実施形態は、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素に、グリシルグリシンを含む緩衝液と、界面活性剤と、を安定化剤として添加する段階を有する、ポリオール脱水素酵素組成物の製造方法である。

グリシルグリシン緩衝液の濃度は、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの保存安定性を向上できる量であれば特に制限されないが、好ましくは０．５〜５００ｍＭ、より好ましくは０．７５〜４００ｍＭ、最も好ましくは１〜３００ｍＭである。なお、本発明においてグリシルグリシン緩衝液の濃度とは、緩衝液中に含まれるグリシルグリシンの濃度（ｍＭ）をいう。０．５ｍＭ以上であれば、安定化剤としての効果を十分に発揮でき、一方、５００ｍＭ以下であれば、添加に見合う安定化剤としての効果の向上が認められる。

上記グリシルグリシン緩衝液のｐＨは、酵素の安定ｐＨから極端に外れていなければよく、好ましくは６．０〜１１．０、より好ましくは６．５〜１０．５、最も好ましくは７．０〜１０．０である。グリシルグリシン緩衝液のｐＨは、酸（塩酸等）もしくはアルカリ（水酸化ナトリウムや水酸化カリウム等）を添加することにより、所望の値に調整することができる。具体的には、グリシルグリシン−ＮａＯＨ緩衝液やグリシルグリシン−ＫＯＨ緩衝液を用いることができる。

上記方法において、各成分の添加順序も特に制限されず、ＰＱＱ依存性ＰＤＨに対して、各成分を順次添加してもよく、各成分を同時に添加してもよい。酵素組成物がＰＱＱ依存性ＰＤＨ、グリシルグリシン緩衝液および界面活性剤に加えて非還元糖、２価の金属イオンを形成する金属を含む金属化合物、および／またはその他の付加成分を含む場合においても、上記の方法と同様に、各成分を順次または同時にＰＱＱ依存性ＰＤＨに対して添加すればよく、各成分の添加順序も特に制限されない。

上記手順により液体形態の酵素組成物が得られるが、本発明の酵素組成物は粉末状などの固体形態であってもよい。

本発明の酵素組成物が粉末状とする場合は、ＰＱＱ依存性ＰＤＨに対して、グリシルグリシン緩衝液および界面活性剤、必要に応じて、非還元糖、２価の金属イオンを形成する金属を含む金属化合物、その他の付加成分を添加して得た溶液状の酵素組成物を凍結乾燥等によって粉末状にすることができる。この際、凍結乾燥の方法は、特に限定されるものではなく、従来公知の方法を用いることができる。また、酵素組成物の凍結乾燥する段階は上記の安定化剤を添加して酵素組成物を得る段階の直後に行ってもよく、または安定化剤を添加して酵素組成物を得る段階と酵素組成物の凍結乾燥する段階との間に他の工程を行ってもよい。

本発明のポリオール脱水素酵素組成物は、ポリオール脱水素酵素の安定性を向上することができ、特に、凍結乾燥時のＰＱＱ依存性ＰＤＨの失活を抑えるとともに、凍結乾燥後のＰＱＱ依存性ＰＤＨの保存安定性を有意に向上させることができる。特に、グリシルグリシン緩衝液を用い、さらに界面活性剤としてＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００を用いる場合に、上記効果が顕著に得られる。

ＰＱＱ依存性ＰＤＨは、ポリオールと電子受容体とを、対応する脱水素物と還元型電子受容体とに変換することができる。本発明のＰＱＱ依存性ＰＤＨが好適に使用できる電子受容体としては、フェリシアン化カリウム、フェナジニウムメチルサルフェートおよびその誘導体、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＩＰ）、Ｗｕｒｓｔｅｒ’ｓｂｌｕｅ、ニトロテトラゾリウムブルー等が挙げられる。

本発明の別の一形態によれば、本発明の上記形態の酵素組成物を含むポリオール測定試薬が提供される。また、本発明のさらに別の一形態によれば、本発明の上記形態の酵素組成物をポリオールと反応させることを特徴とする、ポリオールの定量方法が提供される。本発明の酵素組成物に含まれるＰＱＱ依存性ＰＤＨは、ポリオールの定量に優れるため、ポリオール測定試薬として好適に使用することができる。また、ＰＱＱ依存性ＰＤＨは補欠分子族としてＰＱＱを有するため、あえてＰＱＱを反応系に添加することなく、ポリオールを定量することができる。

本発明において「ポリオール」とは、２つ以上の水酸基を有するアルコール（糖アルコールを含む）を意味する。本発明で用いられるポリオールとしては、特に制限されないが、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、またはラクチトールなどの二糖由来アルコール、グリセロールなどのトリオール、エリスリトールなどのテトリトール、アラビトール、キシリトール、またはリビトールなどのペンチトール、マンニトール、またはソルビトールなどのヘキシトール、イノシトールなどのシクリトールなどが挙げられる。これらの中でも、好ましくはグリセロールである。

本発明のポリオール測定試薬は、ポリオールを定量するための試薬であり、ポリオール脱水素酵素組成物中にＰＱＱ依存性ＰＤＨを含む。ポリオール脱水素酵素として、ＰＱＱ依存性ＰＤＨを使用する点に特徴がある。例えば特許公報第３０４１８４０号、特許公報第３４５０９１１号、特許公報第３４９４３９８号などに記載されるポリオール測定で使用するポリオール脱水素酵素として、本発明の酵素組成物に含まれるＰＱＱ依存性ＰＤＨを使用することができる。

本発明の定量方法に用いられるポリオールを含む試料としては、食品、血清、血漿または全血などが挙げられる。また、本発明の酵素組成物に含まれるＰＱＱ依存性ＰＤＨは血清、血漿、または全血などの中性脂肪測定にも使用することができる。すなわち、これらの試料に含まれる中性脂肪は、例えば、リポプロテインリパーゼにより遊離脂肪酸とグリセロールとに分解されるが、ここで生じたグリセロールを上記のＰＱＱ依存性ＰＤＨを用いて定量することができる。精神病治療患者および透析患者においては、中性脂肪測定時に遊離グリセロールが問題になるが、本発明に用いられるＰＱＱ依存性ＰＤＨを使用して、グリセロールを予め消去するか、またはその量を測定しておくことにより、真の中性脂肪値を求めることが可能となる。なお、本発明に用いられるＰＱＱ依存性ＰＤＨは溶液中に界面活性剤を含んでいてもポリオールを正確に定量することができる。

次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は何ら本発明を制限するものではない。なお、本発明において、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの酵素活性は、下記方法により測定した。

（酵素活性）
５０μＭＤＣＩＰ（２，６−ジクロロフェノールインドフェノール）、０．２ｍＭＰＭＳ（５−メチルフェナジニウムメチルサルフェート）、および４５０ｍＭグリセロールを含んだ０．１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中に、酵素溶液を加えた。この溶液中の酵素と基質との反応をＤＣＩＰの６００ｎｍの吸光度変化によって追跡し、その吸光度の減少速度を酵素の反応速度とした。ここで、１分間に１μｍｏｌのＤＣＩＰが還元される酵素活性を１単位（Ｕ）とした。なお、ＤＣＩＰのｐＨ７．０におけるモル吸光係数は１６．３ｍＭ^−１とした。

［調製例１：修飾ＰＤＨの調製］
ソルビトール２ｇ／１００ｍＬ、酵母エキス０．３ｇ／１００ｍＬ、肉エキス０．３ｇ／１００ｍＬ、コーンスティープリカー０．３ｇ／１００ｍＬ、ポリペプトン１ｇ／１００ｍＬ、尿素０．１ｇ／１００ｍＬ、ＫＨ_２ＰＯ_４０．１ｇ／１００ｍＬ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ０．０２ｇ／１００ｍＬ、およびＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ０．１ｇ／１００ｍＬからなり、ｐＨが７．０である培地１００ｍＬを調製し、５００ｍＬ容の坂口フラスコに該培地８０ｍＬを移し、１２１℃、２０分間オートクレーブ処理した。

上記培地に、種菌として、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒｏｘｙｄａｎｓ）ＮＢＲＣ３２９１を一白金耳植菌し、３０℃で２４時間、１４０ｍｉｎ^−１で振とう培養し、これを種培養液とした。

次に、上記と同じ組成で調製した培地５Ｌを８Ｌ容ジャーファーメンターに移し、１２１℃で５０分間オートクレーブを行い、放冷後、種培養液２４０ｍＬを移した。これを、４００ｒｐｍ、通気量５Ｌ／ｍｉｎ、３０℃の条件で２６時間培養した。

所定時間培養した後、この培養液を遠心分離（８，０００×ｇ、１０分、４℃）して集菌し、緩衝液で懸濁後、フレンチプレスにより菌体を破砕した。破砕液を遠心分離（４，０００×ｇ、１０分、４℃）し、得られた上清を超遠心分離（４０，０００ｒｐｍ、９０分、４℃）して、膜画分を沈殿物として得た。

この膜画分を１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で懸濁し、終濃度が１ｇ／１００ｍＬとなるようにＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００を加え、４℃で２時間撹拌した。超遠心分離（４０，０００ｒｐｍ、９０分、４℃）し、上清を０．１ｇ／１００ｍＬＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で一晩透析し、これを可溶化膜画分とした。

この可溶化膜画分をＦＰＬＣ（ＦａｓｔＰｒｏｔｅｉｎＬｉｑｕｉｄＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にてＲｅｓｏｕｒｃｅＱ６ｍＬで夾雑するグルコース脱水素酵素を除いたポリオール脱水素酵素活性画分を得た。この画分を０．１ｇ／１００ｍＬＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００を含む２０ｍＭＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．５）で一晩透析することにより、比活性３０Ｕ／ｍｇ蛋白の酵素標品を得た。これをグルコノバクター・オキシダンス由来ＰＤＨと称する。

次いで、該グルコノバクター・オキシダンス由来ＰＤＨ（比活性３０Ｕ／ｍｇ蛋白、蛋白濃度：０．６２５ｍｇ／ｍＬ）４０ｍＬに、終濃度０．２ｇ／１００ｍＬになるように１ｇ／１００ｍＬグルタルアルデヒド溶液１０ｍＬを加え、２０℃で６０分間穏やかに撹拌した。

続いて、０．５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を５０ｍＬ加え、２０℃で３０分間反応させることにより架橋反応を停止した。反応終了後、０．１ｇ／１００ｍＬＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００を含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で一晩透析することにより低分子量の夾雑物を取り除いた後、限外ろ過し、蛋白濃度を５ｍｇ／ｍＬに調整し、これを修飾ＰＤＨとした。

［実施例１、比較例１〜４］グリシルグリシン緩衝液の安定化効果の検討
調製例１で得られた修飾ＰＤＨ（比活性２８Ｕ／ｍｇ蛋白）を０．１ｇ／１００ｍＬＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００を含む表１に記載の１０ｍＭ緩衝液（ｐＨ７．５）で一晩透析することにより、異なる緩衝液を含む酵素溶液を得た。

次いで、これらの酵素溶液をそれぞれ−８０℃で凍結後、凍結乾燥を２４時間行い、粉末状の酵素組成物を得た。この際、凍結乾燥直後の酵素組成物の酵素活性を測定した。さらに、得られた酵素組成物を３７℃で１週間、インキュベートした後の酵素活性を測定した。そして、凍結乾燥直後の酵素組成物の酵素活性を１００％とした場合の、３７℃で１週間インキュベートした後の残存活性（単位：％）を算出した。結果を表１に示す。

上記表１に示される結果から、ＰＱＱ依存性ＰＤＨ（修飾ＰＤＨ）に界面活性剤（Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００）およびグリシルグリシン−ＮａＯＨ緩衝液を含んでなる酵素組成物は、凍結乾燥後の酵素の失活を有意に抑制できることが確認された。一方、同じｐＨを有するＫ−リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液、グリシン−ＮａＯＨ緩衝液を用いた酵素組成物では、グリシルグリシン−ＮａＯＨ緩衝液を用いた酵素組成物に比べて、酵素の残存活性が小さくなった。この結果から、ＰＱＱ依存性ＰＤＨに対してグリシルグリシン緩衝液および界面活性剤がＰＱＱ依存性ＰＤＨの安定性を有意に向上でき、グリシルグリシン緩衝液が優れた安定化効果を有することがわかる。

［実施例２〜８］グリシルグリシン緩衝液のｐＨ依存性
調製例１で得られた修飾ＰＤＨ（比活性２８Ｕ／ｍｇ蛋白）を０．１ｇ／１００ｍＬＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００を含む表２に記載の各ｐＨ値を有する１０ｍＭグリシルグリシン−ＮａＯＨ緩衝液で一晩透析することにより、グリシルグリシン−ＮａＯＨのｐＨの異なる酵素溶液を得た。なお、１０ｍＭグリシルグリシン−ＮａＯＨ緩衝液のｐＨは１ＭＮａＯＨにより調整した。

次いで、これらの酵素溶液をそれぞれ−８０℃で凍結後、凍結乾燥を２４時間行い、粉末状の酵素組成物を得た。この際、凍結乾燥直後の酵素組成物の酵素活性を測定した。さらに、得られた酵素組成物を３７℃で１週間、インキュベートした後の酵素活性を測定した。そして、凍結乾燥直後の酵素組成物の酵素活性を１００％とした場合の、３７℃で１週間インキュベートした後の残存活性（単位：％）を算出した。結果を表２に示す。

上記表２に示される結果から、本発明の酵素組成物において、グリシルグリシン緩衝液のｐＨ値は６〜１１までのいずれのｐＨ値でも安定化効果が発揮されることがわかる。ｐＨ７〜１０である場合には、特に優れたＰＱＱ依存性ＰＤＨの安定性の向上効果が発揮されることがわかる。

［実施例９〜１３］グリシルグリシン緩衝液の濃度の依存性
調製例１で得られた修飾ＰＤＨ（比活性２８Ｕ／ｍｇ蛋白）を０．１ｇ／１００ｍＬＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００を含む表３に記載の各濃度のグリシルグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）で一晩透析することによりグリシルグリシン緩衝液の濃度の異なる酵素溶液を得た。

次いで、これらの酵素溶液をそれぞれ−８０℃で凍結後、凍結乾燥を２４時間行い、粉末状の酵素組成物を得た。この際、凍結乾燥直後の酵素組成物の酵素活性を測定した。さらに、得られた酵素組成物を３７℃で１週間、インキュベートした後の酵素活性を測定した。そして、凍結乾燥直後の酵素組成物の酵素活性を１００％とした場合の、３７℃で１週間インキュベートした後の残存活性（単位：％）を算出した。結果を表３に示す。

上記表２に示される結果から、本発明の酵素組成物において、グリシルグリシン緩衝液の濃度は０．５〜５００ｍＭまでの比較的広い範囲で安定化効果が発揮されることがわかる。さらに、濃度が１〜５００ｍＭである場合には、特に優れたＰＱＱ依存性ＰＤＨの安定性の向上効果が発揮されることがわかる。

［実施例１４〜２５］非還元糖および２価の金属イオンを形成する金属を含む金属化合物の添加による効果
調製例１で得られた修飾ＰＤＨ（比活性２８Ｕ／ｍｇ蛋白）を０．１ｇ／１００ｍＬＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００を含む１０ｍＭグリシルグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）で一晩透析後、表４〜６に記載の非還元糖および／または２価の金属イオンを形成する金属を含む金属化合物を、表４〜６に記載の濃度になるようにそれぞれ加え、安定化剤の構成成分の異なる酵素溶液を得た。

これらの各酵素溶液を−８０℃で凍結後、凍結乾燥を２４時間行い、粉末状の酵素組成物を得た。この際、凍結乾燥直後の酵素組成物の酵素活性を測定した。得られた酵素組成物を３７℃で１週間、インキュベートした後の酵素活性を測定した。凍結乾燥直後の酵素組成物の酵素活性を１００％とした場合の、３７℃で１週間、インキュベートした後の残存活性（単位：％）を算出した。結果を表４〜６に示す。

上記表４〜６に示される結果から、グリシルグリシンおよび界面活性剤に加えて、非還元糖（トレハロースもしくはラフィノース）および／または２価の金属イオンを形成する金属を含む金属化合物（ＭｇＳＯ_４もしくはＣａＣｌ_２）を含む場合には、ＰＱＱ依存性ＰＤＨを安定化する効果が著しく向上することが確認された。

さらに、本発明の酵素組成物においては、低濃度の安定化剤（グリシルグリシン、界面活性剤、非還元糖、２価の金属イオンを形成する金属を含む金属化合物）を用いた場合においてもＰＱＱ依存性ＰＤＨの安定化を図ることができることが確認された。

以上の結果から、本発明の酵素組成物は、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの安定性を有意に向上でき、凍結乾燥による酵素活性の低下を有意に抑制することができることが確認された。

本発明によれば、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素の凍結乾燥後の経時的な酵素の安定性を向上させることが可能である。このため、本発明の酵素組成物は、正確にポリオールを定量することにおいて好適に使用できる。

Claims

補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むグリセロール脱水素酵素と、
緩衝剤としてはグリシルグリシンのみを含むｐＨ７〜８の緩衝液と、
界面活性剤と、
を含む、グリセロール脱水素酵素組成物であって、
前記緩衝液中に含まれる前記グリシルグリシンの濃度が１０〜１００ｍＭであり、
前記グリセロール脱水素酵素組成物中の前記グリセロール脱水素酵素の総質量（１００質量％）に対する、前記グリシルグリシンの含有量が２６〜２６０質量％である、
グリセロール脱水素酵素組成物。
前記界面活性剤は、ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）である、請求項１に記載のグリセロール脱水素酵素組成物。
非還元糖をさらに含む、請求項１または２に記載のグリセロール脱水素酵素組成物。
前記非還元糖は、トレハロースおよびラフィノースの少なくとも一方を含むことを特徴とする、請求項３に記載のグリセロール脱水素酵素組成物。
２価の金属イオンを形成する金属を含む金属化合物をさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のグリセロール脱水素酵素組成物。
前記金属化合物は、カルシウムを含む化合物およびマグネシウムを含む化合物からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項５に記載のグリセロール脱水素酵素組成物。
前記グリセロール脱水素酵素、緩衝液および界面活性剤を含む溶液を凍結乾燥することによって得られる固体形態である、請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリオール脱水素酵素組成物。
請求項１〜７のいずれか１項に記載のグリセロール脱水素酵素組成物を含む、グリセロール測定試薬。
請求項１〜８のいずれか１項に記載のグリセロール脱水素酵素組成物をグリセロールと反応させる段階を有する、グリセロールの定量方法。
補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むグリセロール脱水素酵素に、緩衝剤としてはグリシルグリシンのみを１０〜１００ｍＭ含むｐＨ７〜８の緩衝液と、界面活性剤と、を安定化剤として添加する段階を有し、
前記グリセロール脱水素酵素組成物中の前記グリセロール脱水素酵素の総質量（１００質量％）に対する、前記グリシルグリシンの含有量が２６〜２６０質量％である、グリセロール脱水素酵素組成物の製造方法。
補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むグリセロール脱水素酵素に、緩衝剤としてはグリシルグリシンのみを１０〜１００ｍＭ含むｐＨ７〜８の緩衝液と、界面活性剤と、を安定化剤として、酵素組成物を得る段階と、
前記酵素組成物を凍結乾燥する段階と、
を有し、
前記グリセロール脱水素酵素組成物中の前記グリセロール脱水素酵素の総質量（１００質量％）に対する、前記グリシルグリシンの含有量が２６〜２６０質量％である、グリセロール脱水素酵素組成物の製造方法。