JP7253219B2 - 難水溶性物質の可溶化剤 - Google Patents
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Description
本発明は、難水溶性基質等の難水溶性物質を簡便且つ高濃度で安定に可溶化できる可溶化剤に関する。また、本発明は、当該可溶化剤を使用した基質溶液に関する。
抗原－抗体反応を利用した組織染色や、抗体を利用したELISAのような高感度検出法において、可視化や定量に使われる標識酵素用の発色基質及び発光基質（標識酵素であるペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等の基質）が数多く開発されている。このような発色基質及び発光基質の多くは可視領域に鮮やかな色調を呈すように、広いπ共役系を有している。また同時に、そのような広いπ共役系を有する化合物は検査に使用される媒体である水に極めて溶けにくい性質を持っている。例えば、がん組織染色に利用されている発色基質である３，３’－ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）は、アミノ基を塩酸や酢酸でプロトン化すれば酸性水溶液に対して１ｇ／５０ｍＬ程度の溶解度を示すが、中性水溶液にはほとんど溶解性を示さない。しかし、溶解に適した酸性水溶液でも、保存するとＤＡＢは速やかに酸化されてしまう。半日～数日、酸性水溶液中にＤＡＢを放置すれば、基質として使用することは不可能となる。
このような発色基質及び発光基質は、細胞染色、組織染色、ELISA等の抗体を介した生体微量成分の高感度検出等のために、医療や研究開発の現場で多く使用されているが、発色基質及び発光基質の溶解が不十分であれば、基質不在のため標識酵素による発色又は発光反応が起こらずに偽陰性の結果を、逆に標識酵素による反応を経ずに発色基質及び発光基質が空気酸化してしまえば偽陽性の結果をもたらしてしまう。医療現場にせよ、研究開発の現場にせよ、難水溶性の発色基質及び発光基質を必要とされる濃度で溶解させ、安定に実験、検査に供せられる手法が強く望まれている。
そこで、従来、難水溶性物質の溶解性の向上を図るべく、例えば、界面活性を有する脂質類や界面活性剤を使った可溶化法等が提案されている（特許文献１、非特許文献１参照）。しかしながら、特許文献１が開示する手法では難水溶性物質を脂質が形成するミセルやリポソームに内包させる必要があるために、難水溶性物質を事前に有機溶剤に可溶化させ、水溶液にインジェクションすることが不可欠となる。更に、このような有機溶剤の混入は、標識酵素等のタンパク質の変性を招いたり、可溶化に用いる脂質類や非特許文献１に記載の界面活性剤もタンパク質を変性させたり、その活性を低下させる可能性もある。
そのため、市販の界面活性剤等に可溶化、分散させた基質溶液を消費期限内に使うか、実験の都度、基質を酢酸緩衝溶液に溶解させて速やかに使うかのいずれかの方法がとられているのが現状である。このような従来技術を背景として、標識酵素等のタンパク質の変性を招くことのない成分を使用して、難水溶性物質を簡便且つ高濃度で安定に可溶化できる可溶化技術の開発が切望されている。
日本油化学会誌、第４９巻、第１号、１１－１６頁（２０００年）
本発明は、前記従来技術の問題点を鑑みて為されたものであり、その目的は、標識酵素等のタンパク質の変性を招くことがない成分を使用して、難水溶性物質を簡便且つ高濃度で安定に水性溶媒に可溶化できる可溶化技術を提供することである。
本発明者は、前記課題を解決すべく鋭意検討を行ったところ、特定のベタイン誘導体及び特定のテトラアルキルアンモニウム塩には、難水溶性基質等の難水溶性物質を簡便且つ高濃度で安定に水性溶媒に可溶化させる作用があり、難水溶性物質の可溶化剤として有効であることを見出した。当該特定のベタイン誘導体及びテトラアルキルアンモニウム塩は、タンパク質の変性を招くことがないため、従来技術の問題点を総合的に解決できる可溶化として有効である。本発明は、かかる知見に基づいて、更に検討を重ねることにより完成したものである。
即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１． 一般式（１）に示すベタイン誘導体、及び／又は一般式（２）に示すテトラアルキルアンモニウム塩を含む、難水溶性物質の可溶化剤。
［一般式（１）中、Ｒ1～Ｒ3は、同一又は異なって、炭素数３～５の直鎖又は分岐状のアルキル基を示す。］
［一般式（２）中、Ｒ4～Ｒ7は、同一又は異なって、炭素数３～５の直鎖又は分岐状のアルキル基を示す。Ｘ-は、対アニオンを示す。］
項２． 前記一般式（１）中、Ｒ1～Ｒ3は、同一又は異なって、ｎ－ブチル基及び／又はｎ－ペンチル基である、項１に記載の可溶化剤。
項３． 前記一般式（２）中、Ｒ4～Ｒ7は、同一又は異なって、ｎ－ブチル基及び／又はｎ－ペンチル基である、項１に記載の可溶化剤。
項４． 前記難水溶性物質が、難水溶性基質である、項１～３のいずれかに記載の可溶化剤。
項５． 前記難水溶性基質が、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン、３－アミノ－９－エチルカルバゾール、３，３’－ジアミノベンジジン、５－ブロモ－４－クロロ－２－インドリルホスフェート、及びニューフクシンよりなる群から選択される少なくとも１種である、項１～４のいずれかに記載の可溶化剤。
項６． 項１～５のいずれかに記載の可溶化剤と、難水溶性物質とを水性溶媒中で共存させる、難水溶性物質の可溶化方法。
項７． 項１～５のいずれかに記載の可溶化剤と、難水溶性基質とを含む、基質溶液。
項１． 一般式（１）に示すベタイン誘導体、及び／又は一般式（２）に示すテトラアルキルアンモニウム塩を含む、難水溶性物質の可溶化剤。
項２． 前記一般式（１）中、Ｒ1～Ｒ3は、同一又は異なって、ｎ－ブチル基及び／又はｎ－ペンチル基である、項１に記載の可溶化剤。
項３． 前記一般式（２）中、Ｒ4～Ｒ7は、同一又は異なって、ｎ－ブチル基及び／又はｎ－ペンチル基である、項１に記載の可溶化剤。
項４． 前記難水溶性物質が、難水溶性基質である、項１～３のいずれかに記載の可溶化剤。
項５． 前記難水溶性基質が、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン、３－アミノ－９－エチルカルバゾール、３，３’－ジアミノベンジジン、５－ブロモ－４－クロロ－２－インドリルホスフェート、及びニューフクシンよりなる群から選択される少なくとも１種である、項１～４のいずれかに記載の可溶化剤。
項６． 項１～５のいずれかに記載の可溶化剤と、難水溶性物質とを水性溶媒中で共存させる、難水溶性物質の可溶化方法。
項７． 項１～５のいずれかに記載の可溶化剤と、難水溶性基質とを含む、基質溶液。
本発明の可溶化剤によれば、難水溶性基質等の難水溶性物質を簡便且つ高濃度に水性溶媒に溶解させて可溶化させることができる。
また、難水溶性基質は、保存中に酸化等を受けると、基質としての機能を喪失してしまうが、本発明の可溶化剤によれば、難水溶性基質を溶解させた状態で長期間保存しても、酸化等による機能喪失を抑制し、難水溶性基質長期間安定な状態を維持させることもできる。更に、界面活性剤を利用した難水溶性物質の可溶化では、溶液の泡立ちや粘性が生じ、取り扱い難いという欠点があるが、本発明の可溶化剤は、このような従来の界面活性剤の欠点を克服しており、取り扱いが容易という利点もある。
更に、本発明の可溶化剤は、酵素活性を向上させる効果をも有しているので、本発明の可溶化剤を利用した基質溶液を用いて酵素反応を行うと、酵素反応の促進、酵素反応を利用した目的物質の検出感度の向上等を実現することもできる。
１．難水溶性物質の可溶化剤
本発明の可溶化剤は、難水溶性物質を水性溶媒に可溶化させるために使用される添加剤であり、一般式（１）に示すベタイン誘導体及び／又は一般式（２）に示すテトラアルキルアンモニウム塩からなることを特徴とする。以下、本発明の可溶化剤について詳述する。
本発明の可溶化剤は、難水溶性物質を水性溶媒に可溶化させるために使用される添加剤であり、一般式（１）に示すベタイン誘導体及び／又は一般式（２）に示すテトラアルキルアンモニウム塩からなることを特徴とする。以下、本発明の可溶化剤について詳述する。
［ベタイン誘導体］
本発明の可溶化剤として使用されるベタイン誘導体の構造は、下記一般式（１）に示す通りである。
本発明の可溶化剤として使用されるベタイン誘導体の構造は、下記一般式（１）に示す通りである。
一般式（１）において、Ｒ1～Ｒ3は、同一又は異なって、炭素数３～５の直鎖又は分岐状のアルキル基を示す。難水溶性物質をより一層効果的に高濃度で安定に可溶化させるという観点から、一般式(1)において、Ｒ1～Ｒ3は、同一又は異なって、好ましくは炭素数３～５の直鎖状のアルキル基であり、更に好ましくはｎ－ブチル基及び／又はｎ－ペンチル基、特に好ましくはｎ－ペンチル基が挙げられる。
一般式（１）に示すベタイン誘導体は、例えば、特開２００９－９６７６６号公報等に記載の有機合成法等によって得ることができる。
［テトラアルキルアンモニウム塩］
本発明の可溶化剤として使用されるテトラアルキルアンモニウム塩の構造は、下記一般式（２）に示す通りである。
本発明の可溶化剤として使用されるテトラアルキルアンモニウム塩の構造は、下記一般式（２）に示す通りである。
一般式（２）において、Ｒ4～Ｒ7は、同一又は異なって、炭素数３～５の直鎖又は分岐状のアルキル基を示す。難水溶性物質をより一層効果的に高濃度で安定に可溶化させるという観点から、一般式（２）において、Ｒ4～Ｒ7は、同一又は異なって、好ましくは炭素数３～５の直鎖状のアルキル基であり、更に好ましくはｎ－ブチル基及び／又はｎ－ペンチル基、特に好ましくはｎ－ペンチル基が挙げられる。
一般式（２）において、Ｘ-は、対アニオンを示す。当該対アニオンの種類については、特に制限されないが、例えば、塩化物イオン、臭化物イオン、ヨウ物イオン、フッ化物イオン等のハロゲン化物イオン；水酸化物イオン；酢酸イオン、硝酸イオン、亜硝酸イオン、硫酸イオン、リン酸イオン、過塩素酸イオン、過臭素酸イオン、過ヨウ素酸イオン、テトラフルオロホウ酸イオン、テトラフェニルホウ酸イオン、ヘキサフルオロリン酸イオン等の有機酸又は無機酸のイオン等が挙げられる。これらの対アニオンの中でも、好ましくはハロゲン化物イオン、更に好ましくは塩化物イオンが挙げられる。
［ベタイン誘導体及びテトラアルキルアンモニウム塩の組み合わせ態様］
本発明の可溶化剤として、一般式（１）に示すベタイン誘導体又は一般式（２）に示すテトラアルキルアンモニウム塩のいずれか一方のみを使用してもよく、また、これらを組み合わせて使用してもよい。また、一般式（１）に示すベタイン誘導体を使用する場合、一般式（１）に示すベタイン誘導体の内、１種の構造のものを単独で使用してもよく、また２種以上の構造のものを組み合わせて使用してもよい。また、一般式（１）に示すベタイン誘導体を使用する場合、一般式（２）に示すテトラアルキルアンモニウム塩の内、１種の構造のものを単独で使用してもよく、また２種以上の構造のものを組み合わせて使用してもよい。
本発明の可溶化剤として、一般式（１）に示すベタイン誘導体又は一般式（２）に示すテトラアルキルアンモニウム塩のいずれか一方のみを使用してもよく、また、これらを組み合わせて使用してもよい。また、一般式（１）に示すベタイン誘導体を使用する場合、一般式（１）に示すベタイン誘導体の内、１種の構造のものを単独で使用してもよく、また２種以上の構造のものを組み合わせて使用してもよい。また、一般式（１）に示すベタイン誘導体を使用する場合、一般式（２）に示すテトラアルキルアンモニウム塩の内、１種の構造のものを単独で使用してもよく、また２種以上の構造のものを組み合わせて使用してもよい。
［難水溶性物質］
本発明の可溶化剤の可溶化対象は、難水溶性物質である。ここで、「難水溶性物質」とは、２０℃において、１ｇ又は１ｍＬを溶かすに要する水の量１００００ｍＬ以上である溶質を意味する。
本発明の可溶化剤の可溶化対象は、難水溶性物質である。ここで、「難水溶性物質」とは、２０℃において、１ｇ又は１ｍＬを溶かすに要する水の量１００００ｍＬ以上である溶質を意味する。
本発明の可溶化剤の可溶化対象となる難水溶性物質の種類については、水への可溶化が求められるものであることを限度として特に制限されないが、好ましくは、標識酵素（ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等）の作用を受けて発色又は発光する難水溶性基質が挙げられる。難水溶性基質は、保存中に酸化等を受けると、基質としての機能を喪失してしまうが、本発明の可溶化剤は、難水溶性基質の酸化等による機能喪失を抑制し、可溶化した状態で長期間安定に維持させることもできる。
本発明の可溶化剤の可溶化対象として使用される難水溶性基質は、難水溶性である限り、発色基質又は発光基質のいずれであってもよい。ここで、「発色基質」とは、過酸化水素や脱リン酸化を伴う還元的なカップリング反応に伴って酸化される性質を有する基質であり、「発光基質」とは、酸素分子やアデノシン三リン酸等の化学結合エネルギーを光エネルギーに変換して発光する性質を有する基質や、リン酸エステルの加水分解反応等によって、蛍光分子の量子収率が上昇し、蛍光発光が増す性質を有する基質である。
本発明の可溶化剤の可溶化対象となる難水溶性の発色基質については、具体的には、ペルオキシダーゼの作用を受けて発色するものとして、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、３－アミノ－９－エチルカルバゾール(ＡＥＣ)、３，３’－ジアミノベンジジン(ＤＡＢ)、４-アミノアンチピリン／Ｎ－エチル－Ｎ－（２-ヒドロキシ-３-スルホプロピル）－ｍ－トルイジンナトリウム塩、２，２’－アジノ－ビス（３－エチルベンズチアゾリン）－６－スルホン酸、ｏ－フェニレンジアミン、ｏ－ジアニシジン、５－アミノサリサイクリックアシッド、３－アミノ－９－エチルカルバゾール、４－クロロ－１－ナフトール等；アルカリホスファターゼの作用を受けて発色するものとして、５－ブロモ－４－クロロ－２－インドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）、ニューフクシン（ＮＦ）、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）、ニトロフェニルホスフェート、ＰｅｒｍａＲｅｄ、ＰｅｒｍａＢｌｕｅ等が挙げられる。
本発明の可溶化剤の可溶化対象となる難水溶性の発光基質については、具体的には、ペルオキシダーゼの作用を受けて発光するものとして、ルミノール等；アルカリホスファターゼの作用を受けて発光するものとして、ヒドロキシ－３－ナフトニックアシッド－２’フェニルアニリドホスフェート、ジオキセタン等が挙げられる。
これらの難水溶性基質の中でも、本発明の可溶化剤の可溶化対象として、好ましくは難水溶性の発色基質、更に好ましくはＴＭＢ、ＡＥＣ、ＤＡＢ、ＢＣＩＰ、及びＮＦが挙げられる。
［使用態様］
本発明の可溶化剤は、難水溶性物質を可溶化させる水性溶媒に添加して使用される。
本発明の可溶化剤は、難水溶性物質を可溶化させる水性溶媒に添加して使用される。
本発明において、難水溶性物質を可溶化させる溶媒は、水性溶媒である。ここで、「水性溶媒」とは、水を必須として含む溶媒である。水性溶媒は、具体的には、水、水溶液（各種緩衝液等）であってもよく、また必要に応じて水溶性の有機溶剤等の他の成分を含んでいてもよい。
本発明の可溶化剤を用いて難水溶性物質を水性溶媒に可溶化させるには、本発明の可溶化剤と難水溶性物質とを水性溶媒中で共存させればよい。具体的には、水性溶媒に本発明の可溶化剤と難水溶性物質とを任意の順で添加して混合すればよいが、好適な方法として、水性溶媒に本発明の可溶化剤を添加して溶解させた後に、難水溶性物質を添加して混合する方法が挙げられる。
難水溶性物質を可溶化させる水溶液への本発明の可溶化剤の添加濃度については、可溶化させる難水溶性物質の種類や濃度、使用する可溶化剤の種類等に応じて適宜設定すればよいが、例えば２５０～３０００ｍＭ、好ましくは２５０～２０００ｍＭが挙げられる。より具体的には、本発明の可溶化剤の構造毎の水溶液への添加量の好適な範囲は以下に示す通りである。
Ｒ1～Ｒ3が炭素数３のアルキル基である一般式（１）に示すベタイン誘導体の場合：通常１０００ｍＭ以上、好ましくは１０００～３０００ｍＭ、更に好ましくは１０００～２０００ｍＭ。
Ｒ1～Ｒ3が炭素数４のアルキル基である一般式（１）に示すベタイン誘導体の場合：通常５００ｍＭ以上、好ましくは５００～３０００ｍＭ、更に好ましくは５００～２０００ｍＭ。
Ｒ1～Ｒ3が炭素数５のアルキル基である一般式（１）に示すベタイン誘導体の場合：通常２５０ｍＭ以上、好ましくは２５０～３０００ｍＭ、更に好ましくは２５０～２０００ｍＭ。
Ｒ4～Ｒ7が炭素数３のアルキル基である一般式（２）に示すテトラアルキルアンモニウム塩の場合：通常５００ｍＭ以上、好ましくは５００～３０００ｍＭ、更に好ましくは５００～２０００ｍＭ。
Ｒ4～Ｒ7が炭素数４のアルキル基である一般式（２）に示すテトラアルキルアンモニウム塩の場合：通常２５０ｍＭ以上、好ましくは２５０～３０００ｍＭ、更に好ましくは２５０～２０００ｍＭ。
Ｒ4～Ｒ7が炭素数５のアルキル基である一般式（２）に示すテトラアルキルアンモニウム塩の場合：通常２５０ｍＭ以上、好ましくは２５０～３０００ｍＭ、更に好ましくは２５０～２０００ｍＭ。
Ｒ1～Ｒ3が炭素数３のアルキル基である一般式（１）に示すベタイン誘導体の場合：通常１０００ｍＭ以上、好ましくは１０００～３０００ｍＭ、更に好ましくは１０００～２０００ｍＭ。
Ｒ1～Ｒ3が炭素数４のアルキル基である一般式（１）に示すベタイン誘導体の場合：通常５００ｍＭ以上、好ましくは５００～３０００ｍＭ、更に好ましくは５００～２０００ｍＭ。
Ｒ1～Ｒ3が炭素数５のアルキル基である一般式（１）に示すベタイン誘導体の場合：通常２５０ｍＭ以上、好ましくは２５０～３０００ｍＭ、更に好ましくは２５０～２０００ｍＭ。
Ｒ4～Ｒ7が炭素数３のアルキル基である一般式（２）に示すテトラアルキルアンモニウム塩の場合：通常５００ｍＭ以上、好ましくは５００～３０００ｍＭ、更に好ましくは５００～２０００ｍＭ。
Ｒ4～Ｒ7が炭素数４のアルキル基である一般式（２）に示すテトラアルキルアンモニウム塩の場合：通常２５０ｍＭ以上、好ましくは２５０～３０００ｍＭ、更に好ましくは２５０～２０００ｍＭ。
Ｒ4～Ｒ7が炭素数５のアルキル基である一般式（２）に示すテトラアルキルアンモニウム塩の場合：通常２５０ｍＭ以上、好ましくは２５０～３０００ｍＭ、更に好ましくは２５０～２０００ｍＭ。
また、本発明の可溶化剤によって、溶解可能な難水溶性物質の濃度については、使用する難水溶性物質の種類によって異なり、一律に規定することはできないが、例えば、ＴＭＢ、ＡＥＣ、ＤＡＢ、ＢＣＩＰ、及びＮＦの場合であれば、以下の範囲が例示される。
ＴＭＢの場合：２８８ｎｍの吸光度（１ｃｍセルを使用した場合、吸光度１は１０．３μｇ／ｍＬの溶解度と換算される）として０．０１～２００００程度、好ましくは０．０１～１２０００程度、更に好ましくは０．０１～９０００程度。
ＡＥＣの場合：２７０ｎｍの吸光度（１ｃｍセルを使用した場合、吸光度１は１１．４μｇ／ｍＬの溶解度と換算される）として０．０１～５０００程度、好ましくは０．０１～２５０００程度、更に好ましくは０．０１～１５００程度。
ＤＡＢの場合：２８０ｎｍの吸光度（１ｃｍセルを使用した場合、吸光度１は１４．１μｇ／ｍＬの溶解度と換算される）として０．０１～６０００程度、好ましくは０．０１～３０００程度、更に好ましくは０．０１～１６００程度。
ＢＣＩＰの場合：２９２ｎｍの吸光度（１ｃｍセルを使用した場合、吸光度１は７５．８μｇ／ｍＬの溶解度と換算される）として０．０１～１５００程度、好ましくは０．０１～５００程度、更に好ましくは０．０１～２４０程度。
ＮＦの場合：５５４ｎｍの吸光度（１ｃｍセルを使用した場合、吸光度１は３．８μｇ／ｍＬの溶解度と換算される）として０．０１～５００００程度、好ましくは０．０１～３５０００程度、更に好ましくは０．０１～１７０００程度。
ＴＭＢの場合：２８８ｎｍの吸光度（１ｃｍセルを使用した場合、吸光度１は１０．３μｇ／ｍＬの溶解度と換算される）として０．０１～２００００程度、好ましくは０．０１～１２０００程度、更に好ましくは０．０１～９０００程度。
ＡＥＣの場合：２７０ｎｍの吸光度（１ｃｍセルを使用した場合、吸光度１は１１．４μｇ／ｍＬの溶解度と換算される）として０．０１～５０００程度、好ましくは０．０１～２５０００程度、更に好ましくは０．０１～１５００程度。
ＤＡＢの場合：２８０ｎｍの吸光度（１ｃｍセルを使用した場合、吸光度１は１４．１μｇ／ｍＬの溶解度と換算される）として０．０１～６０００程度、好ましくは０．０１～３０００程度、更に好ましくは０．０１～１６００程度。
ＢＣＩＰの場合：２９２ｎｍの吸光度（１ｃｍセルを使用した場合、吸光度１は７５．８μｇ／ｍＬの溶解度と換算される）として０．０１～１５００程度、好ましくは０．０１～５００程度、更に好ましくは０．０１～２４０程度。
ＮＦの場合：５５４ｎｍの吸光度（１ｃｍセルを使用した場合、吸光度１は３．８μｇ／ｍＬの溶解度と換算される）として０．０１～５００００程度、好ましくは０．０１～３５０００程度、更に好ましくは０．０１～１７０００程度。
２．基質溶液
本発明は、更に、前記可溶化剤と難水溶性基質を含む基質溶液を提供する。本発明の基質溶液は、前記可溶化剤によって難水溶性基質を高濃度に可溶化できるので、標識酵素（ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等）の基質溶液として提供できる。また、本発明の基質溶液は、標識酵素を利用した測定キットの付属品として提供することもできる。
本発明は、更に、前記可溶化剤と難水溶性基質を含む基質溶液を提供する。本発明の基質溶液は、前記可溶化剤によって難水溶性基質を高濃度に可溶化できるので、標識酵素（ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等）の基質溶液として提供できる。また、本発明の基質溶液は、標識酵素を利用した測定キットの付属品として提供することもできる。
本発明の基質溶液で使用される可溶化剤の種類や濃度、難水溶性基質の種類や濃度、溶媒等については、前記「１．可溶化剤」の欄に記載の通りである。
以下、試験例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの試験例に限定されるものではない。
ベタイン誘導体の準備
以下に示す構造のベタイン誘導体（ベタイン１～５）を準備した。ベタイン１は、市販のグリシンベタイン（型番０２３-１０８６２、和光純薬工業製）を使用し、ベタイン２～５は特開2010-220607号公報等に記載の公知の合成方法を用いて合成した。
以下に示す構造のベタイン誘導体（ベタイン１～５）を準備した。ベタイン１は、市販のグリシンベタイン（型番０２３-１０８６２、和光純薬工業製）を使用し、ベタイン２～５は特開2010-220607号公報等に記載の公知の合成方法を用いて合成した。
テトラアルキルアンモニウム塩の準備
テトラアルキルアンモニウム塩は、市販のテトラメチルアンモニウムクロライド（型番Ｔ０１３６、東京化成工業製）、テトラエチルアンモニウムクロライド（型番Ｔ００９５、東京化成工業製）、テトラプロピルアンモニウムクロライド（型番Ｔ２１０６、東京化成工業製）、テトラブチルアンモニウムクロライド（型番Ｔ００５５、東京化成工業製）、テトラアミルアンモニウムクロライド（型番Ｔ１４３３、東京化成工業製）を使用した。本実験では対アニオンとしてクロライド（塩化物イオン）を用いた。
テトラアルキルアンモニウム塩は、市販のテトラメチルアンモニウムクロライド（型番Ｔ０１３６、東京化成工業製）、テトラエチルアンモニウムクロライド（型番Ｔ００９５、東京化成工業製）、テトラプロピルアンモニウムクロライド（型番Ｔ２１０６、東京化成工業製）、テトラブチルアンモニウムクロライド（型番Ｔ００５５、東京化成工業製）、テトラアミルアンモニウムクロライド（型番Ｔ１４３３、東京化成工業製）を使用した。本実験では対アニオンとしてクロライド（塩化物イオン）を用いた。
試験例１：難水溶性物質の溶解試験（１）
ベタイン誘導体水溶液に対する難水溶性物質の溶解挙動を調べるために次の実験を行った。難水溶性物質としては難水溶性基質であるＴＭＢ、ＡＥＣ、及びＤＡＢを用い、ベタイン誘導体としてはベタイン５を用いた。
ベタイン誘導体水溶液に対する難水溶性物質の溶解挙動を調べるために次の実験を行った。難水溶性物質としては難水溶性基質であるＴＭＢ、ＡＥＣ、及びＤＡＢを用い、ベタイン誘導体としてはベタイン５を用いた。
ミクロチューブに難水溶性基質（ＴＭＢ、ＡＥＣ、及びＤＡＢ）を乳鉢ですり潰して使用した）を２０ｍｇずつ量り取り、蒸留水又は２０００ｍＭのベタイン５を含むベタイン誘導体水溶液をそれぞれ１．０ｍＬずつ加えた。その後、ボルテックスミキサーで２分間撹拌し、粉末を溶解させた。
その結果を図１に示す。図１から明白に分かるように、蒸留水ではこれらの基質は溶解性をほとんど示さず、難水溶性基質が固体状態として沈殿、浮遊していたが、ベタイン５を含むベタイン誘導体水溶液では、難水溶性基質が完全に溶解していた。
試験例２：難水溶性物質の溶解試験（２）
一般式（１）に示すベタイン誘導体が難水溶性物質を簡便、且つ高濃度で溶解させることができる効果を実証するために比較化合物を用いて溶解実験を行った。比較化合物としては、包接分散剤として使われるα－シクロデキストリン（α-ＣＤｘ）、β-シクロデキストリン（β-ＣＤｘ）、γ－シクロデキストリン（γ-ＣＤｘ）、イオン性、非イオン性界面活性剤として難水溶性基質の可溶化にも使われるドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、塩化ベンザルコニウム（ＢＫＣｌ）、Ｎ－ドデシル－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アンモニオ－１－プロパンサルフェート（ＤＤＡＰ）、ＴｒｉｔｏｎＸ、ベタイン１、及びベタイン２を用いた。また、難水溶性物質としては難水溶性基質であるＴＭＢを用いた。
一般式（１）に示すベタイン誘導体が難水溶性物質を簡便、且つ高濃度で溶解させることができる効果を実証するために比較化合物を用いて溶解実験を行った。比較化合物としては、包接分散剤として使われるα－シクロデキストリン（α-ＣＤｘ）、β-シクロデキストリン（β-ＣＤｘ）、γ－シクロデキストリン（γ-ＣＤｘ）、イオン性、非イオン性界面活性剤として難水溶性基質の可溶化にも使われるドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、塩化ベンザルコニウム（ＢＫＣｌ）、Ｎ－ドデシル－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アンモニオ－１－プロパンサルフェート（ＤＤＡＰ）、ＴｒｉｔｏｎＸ、ベタイン１、及びベタイン２を用いた。また、難水溶性物質としては難水溶性基質であるＴＭＢを用いた。
１．５ｍＬのプラスチックチューブに予め乳鉢ですり潰しておいたＴＭＢを１．０ｍｇ量り取り、可溶化剤水溶液を１．０ｍＬずつ加え、ボルテックスミキサーで１分間混合、撹拌した後、サンプル溶液を４８時間遮光下、静置した。なお、可溶化剤水溶液は、α-ＣＤｘ、β-ＣＤｘ及びγ-ＣＤｘの場合は１０ｍＭ、ＳＤＳの場合は１００ｍＭ、ＴｒｉｔｏｎＸの場合は１０重量％、ＢＫＣｌの場合は１００ｍＭ、ＤＤＡＰの場合は１００ｍＭ、ベタイン１～５の場合は１０００ｍＭの濃度でそれぞれ溶解したものを使用した。静置後に、不溶物を遠心分離（ＫＵＢＯＴＡ３７４０（Ｋｕｂｏｔａ社製）、１５，０００ｒｐｍ、１２０分間）によって取り除き、マイクロプレートリーダー（Ｖａｒｉｐｏｓｋａｎ（サーモサイエンティフィック社製））で２８８ｎｍの吸光度を測定した。吸光度が高すぎる場合は、水：エタノール（容量比）＝１：９の組成で希釈した。その際の吸光度は、測定値に希釈倍率を掛けた値としている。吸光度が高いほど、より多くのＴＭＢが溶解していることを意味する。
結果を図２に示す。この結果から、ベタイン５では、包接相互作用によって可溶化できるシクロデキストリンと比較して６～２５倍高い溶解性を、ミセル形成によって可溶化できる界面活性剤と比較して２倍高い溶解性を示した。また、ベタイン誘導体の構造によって可溶化できる能力に違いがあることも示された。可溶化に最も適したベタイン誘導体は、ベタイン５であるが、シクロデキストリンや界面活性剤と同程度の溶解性を示すベタイン３及びベタイン４も可溶化剤として有効であることが確認された。更に、この実験においてベタイン５は難水溶性基質であるＴＭＢを完全に溶解させていたため、粉末量を１．０ｍｇから１０ｍｇに増やして同様の実験操作を行ったところ（図２右図）（溶け残りが生じ、上清は飽和溶解度となっている）、その上清の吸光度は５５５となり、非特許文献１において難水溶性基質に対する可溶化能があるとされるＢＫＣｌ、ＤＤＡＰ、及びＴｒｉｔｏｎＸとその飽和溶解度を比較して１３～２２倍も高い溶解性を示すことが確認された。
試験例３：難水溶性物質の溶解に要する時間の評価
一般式（１）に示すベタイン誘導体による難水溶性物質の溶解にどの程度の時間がかかるか検討するため、時間変化測定を行った。ベタイン誘導体としてはベタイン４及びベタイン５を１０００ｍＭの濃度で用い、難水溶性物質としては難水溶性基質であるＴＭＢを用いた。
一般式（１）に示すベタイン誘導体による難水溶性物質の溶解にどの程度の時間がかかるか検討するため、時間変化測定を行った。ベタイン誘導体としてはベタイン４及びベタイン５を１０００ｍＭの濃度で用い、難水溶性物質としては難水溶性基質であるＴＭＢを用いた。
１．５ｍＬのプラスチックチューブに予め乳鉢ですり潰しておいたＴＭＢを１．０ｍｇ量り取り、１０００ｍＭのベタイン４又はベタイン５を含むベタイン誘導体水溶液を１．０ｍＬずつ加え、ボルテックスミキサーで１分間混合、撹拌した後、サンプル溶液を０時間、２４時間、４８時間遮光下で静置した。静置後、それぞれ不溶物を遠心分離（ＫＵＢＯＴＡ３７４０（Ｋｕｂｏｔａ社製）、１５，０００ｒｐｍ、１２０分間）によって取り除き、マイクロプレートリーダー（Ｖａｒｉｐｏｓｋａｎ（サーモサイエンティフィック社製））で２８８ｎｍの吸光度を測定した。吸光度が高すぎる場合は、水：エタノール＝１：９の組成で希釈した。その際の吸光度は、測定値に希釈倍率を掛けた値としている。吸光度が高いほど、より多くのＴＭＢが溶解していることを意味する。
結果を図３に示す。この結果、ベタイン４及びベタイン５を使用した場合は共に、ボルテックスミキサーによる撹拌後、１時間から４８時間の範囲では２８８ｎｍの吸光度に差はほとんどなく、１分間のボルテックスミキサーによる撹拌だけでＴＭＢが飽和濃度まで達していることが明らかとなった。
試験例４：難水溶性物質の溶解に要するベタイン誘導体濃度の評価
一般式（１）に示すベタイン誘導体の濃度が難水溶性物質の溶解性に及ぼす影響を評価するために、難水溶性物質の添加量は１０ｍｇに固定し、ベタイン誘導体水溶液におけるベタイン誘導体の濃度を１００～２０００ｍＭに変化させ、難水溶性物質に対する溶解実験を行った。ベタイン誘導体としてはベタイン４及びベタイン５を用い、難水溶性物質としては難水溶性基質であるＴＭＢを用いた。
一般式（１）に示すベタイン誘導体の濃度が難水溶性物質の溶解性に及ぼす影響を評価するために、難水溶性物質の添加量は１０ｍｇに固定し、ベタイン誘導体水溶液におけるベタイン誘導体の濃度を１００～２０００ｍＭに変化させ、難水溶性物質に対する溶解実験を行った。ベタイン誘導体としてはベタイン４及びベタイン５を用い、難水溶性物質としては難水溶性基質であるＴＭＢを用いた。
１．５ｍＬのプラスチックチューブに予め乳鉢ですり潰しておいたＴＭＢを１０ｍｇ量り取り、ベタイン４及びベタイン５を１００～２０００ｍＭの濃度に調整したベタイン誘導体水溶液を１．０ｍＬずつ加え、ボルテックスミキサーで１分間混合、撹拌した後に、２４時間遮光下、静置した。次いで、不溶物を遠心分離（ＫＵＢＯＴＡ３７４０（Ｋｕｂｏｔａ社製）、１５，０００ｒｐｍ、１２０分間）によって取り除き、マイクロプレートリーダー（Ｖａｒｉｐｏｓｋａｎ（サーモサイエンティフィック社製））で２８８ｎｍの吸光度を測定した。吸光度が高すぎる場合は、水：エタノール＝１：９の組成で希釈した。希釈した場合の吸光度は、希釈溶液の吸光度に希釈倍率を掛けた値としている。吸光度が高いほど、より多くのＴＭＢが溶解していることを意味する。
結果を図４に示す。この結果、ベタイン４を使用した場合には、ＴＭＢの溶解性は、５００ｍＭ以上の濃度域で認められ、１０００ｍＭ以上の濃度域では緩やかな変化となった。一方、ベタイン５を使用した場合では、ＴＭＢの溶解性は、２５０ｍＭ以上の濃度域で高くなっており、１０００ｍＭ以上の濃度域で変化は緩やかとなるが、２０００ｍＭの濃度域までは濃度依存的に高まっていった。２０００ｍＭの濃度のベタイン４及びベタイン５の溶解度（２８８ｎｍの吸光度）はそれぞれ１５４、６３０であり、蒸留水のみの溶解度と比較すると、４５３倍、１８５０倍に上昇していた。また、同濃度（２０００ｍＭ）のベタイン誘導体水溶液において、ＴＭＢのベタイン５に対する溶解度は、ベタイン４のものよりも４倍高い値となった。
試験例５：難水溶性物質の溶解に要するテトラアルキルアンモニウム塩濃度の評価
一般式（２）に示すテトラアルキルアンモニウム塩によって溶解可能になる難水溶性物質量を評価するために、難水溶性物質の添加量は１０ｍｇに固定し、テトラアルキルアンモニウム塩水溶液におけるテトラアルキルアンモニウム塩の濃度を１００～２０００ｍＭに変化させ、難水溶性物質に対する溶解実験を行った。テトラアルキルアンモニウム塩としてはテトラメチルアンモニウムクロライド、テトラエチルアンモニウムクロライド、テトラプロピルアンモニウムクロライド、テトラブチルアンモニウムクロライド、又はテトラペンチルアンモニウムクロライドを１００～２０００ｍＭの濃度で用い、難水溶性物質としては難水溶性基質であるＴＭＢを用いた。
一般式（２）に示すテトラアルキルアンモニウム塩によって溶解可能になる難水溶性物質量を評価するために、難水溶性物質の添加量は１０ｍｇに固定し、テトラアルキルアンモニウム塩水溶液におけるテトラアルキルアンモニウム塩の濃度を１００～２０００ｍＭに変化させ、難水溶性物質に対する溶解実験を行った。テトラアルキルアンモニウム塩としてはテトラメチルアンモニウムクロライド、テトラエチルアンモニウムクロライド、テトラプロピルアンモニウムクロライド、テトラブチルアンモニウムクロライド、又はテトラペンチルアンモニウムクロライドを１００～２０００ｍＭの濃度で用い、難水溶性物質としては難水溶性基質であるＴＭＢを用いた。
１．５ｍＬのプラスチックチューブに予め乳鉢ですり潰しておいたＴＭＢを１０ｍｇ量り取り、テトラメチルアンモニウムクロライド、テトラエチルアンモニウムクロライド、テトラプロピルアンモニウムクロライド、テトラブチルアンモニウムクロライド、又はテトラペンチルアンモニウムクロライドを１００～２０００ｍＭの濃度に調整したテトラアルキルアンモニウム塩水溶液を１．０ｍＬずつ加え、ボルテックスミキサーで１分間混合、撹拌した後に、２４時間遮光下、静置した。次いで、不溶物を遠心分離（ＫＵＢＯＴＡ３７４０（Ｋｕｂｏｔａ社製）、１５，０００ｒｐｍ、１２０分間）によって取り除き、マイクロプレートリーダー（Ｖａｒｉｐｏｓｋａｎ（サーモサイエンティフィック社製））で２８８ｎｍの吸光度を測定した。吸光度が高すぎる場合は、水：エタノール＝１：９の組成で希釈した。希釈した場合の吸光度は、希釈溶液の吸光度に希釈倍率を掛けた値としている。吸光度が高いほど、より多くのＴＭＢが溶解していることを意味する。
結果を図５に示す。この結果、テトラメチルアンモニウムクロライド、テトラエチルアンモニウムクロライドの場合は、２０００ｍＭに濃度を上昇させても溶解度の上昇はほとんど確認されなかった。テトラプロピルアンモニウムクロライドの場合では、ＴＭＢの溶解度の向上は、１０００ｍＭ以上の濃度域で認められた。テトラブチルアンモニウムクロライドの場合では、ＴＭＢの溶解度の向上は、２５０ｍＭ以上の濃度域で認められた。一方、テトラペンチルアンモニウムクロライドを使用した場合では、ＴＭＢの溶解性は、２５０ｍＭ以上の濃度域で急激に高くなり、５００ｍＭ以上の濃度域で変化は緩やかとなった。２０００ｍＭの濃度のテトラプロピルアンモニウムクロライド、テトラブチルアンモニウムクロライド、テトラペンチルアンモニウムクロライドの溶解度（２８８ｎｍの吸光度）はそれぞれ１７４、５１９、６４３であり、蒸留水のみの溶解度と比較すると、５１１倍、１５２０倍、１８９０倍に上昇していた。また、アンモニウム基に同じペンチル基を持つテトラペンチルアンモニウムクロライドとベタイン５は、同等の溶解度を示すことが確認された。
試験例６：一定濃度のベタイン誘導体による難水溶性物質の飽和溶解濃度の評価
一般式（１）に示すベタイン誘導体によって溶解可能になる難水溶性物質量を評価するために、ベタイン誘導体水溶液におけるベタイン誘導体の濃度を固定し、難水溶性物質に対する溶解実験を行った。ベタイン誘導体としてはベタイン４、又はベタイン５を２０００ｍＭの濃度で用い、難水溶性物質としては難水溶性基質であるＴＭＢを用いた。
一般式（１）に示すベタイン誘導体によって溶解可能になる難水溶性物質量を評価するために、ベタイン誘導体水溶液におけるベタイン誘導体の濃度を固定し、難水溶性物質に対する溶解実験を行った。ベタイン誘導体としてはベタイン４、又はベタイン５を２０００ｍＭの濃度で用い、難水溶性物質としては難水溶性基質であるＴＭＢを用いた。
１．５ｍＬのプラスチックチューブに予め乳鉢ですり潰しておいたＴＭＢをそれぞれ１０ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、１２５ｍｇ、１５０ｍｇ量り取り、２０００ｍＭのベタイン４、又はベタイン５を含むベタイン誘導体水溶液を１．０ｍＬずつ加え、ボルテックスミキサーで１分間混合、撹拌した後、２４時間遮光下、静置した。不溶物を遠心分離（ＫＵＢＯＴＡ３７４０（Ｋｕｂｏｔａ社製）、１５，０００ｒｐｍ、１２０分間）によって取り除き、マイクロプレートリーダー（Ｖａｒｉｐｏｓｋａｎ（サーモサイエンティフィック社製））で２８８ｎｍの吸光度を測定した。吸光度が高すぎる場合は、水：エタノール＝１：９の組成で希釈した。希釈した場合の吸光度は、希釈溶液の吸光度に希釈倍率を掛けた値としている。吸光度が高いほど、より多くのＴＭＢが溶解していることを意味する。
結果を図６に示す。ベタイン４を使用した場合では、ＴＭＢの重量が１０ｍｇ以上でほとんど飽和溶解度に変化はないが（吸光度が１００－２７０程度）、ベタイン５を使用した場合では、ＴＭＢが１００ｍｇ以上でようやく飽和状態に達した（吸光度が４６００－６０００程度）。ベタイン５ではベタイン４の２２倍の量のＴＭＢを溶解させた。また、蒸留水のみの溶解度（吸光度）と比較すると、ベタイン４は７９０倍、ベタイン５は１７６００倍も高く、ベタイン４及びベタイン５は、ＴＭＢに対して極めて高い可溶化能を有していた。
試験例７：一定濃度のテトラアルキルアンモニウム塩による難水溶性物質の飽和溶解濃度の評価
一般式（２）に示すテトラアルキルアンモニウム塩によって溶解可能になる難水溶性物質量を評価するために、テトラアルキルアンモニウム塩水溶液におけるテトラアルキルアンモニウム塩の濃度を固定し、難水溶性物質に対する溶解実験を行った。テトラアルキルアンモニウム塩としてはテトラプロピルアンモニウムクロライド、テトラブチルアンモニウムクロライド、又はテトラペンチルアンモニウムクロライドを２０００ｍＭの濃度で用い、難水溶性物質としては難水溶性基質であるＴＭＢを用いた。
一般式（２）に示すテトラアルキルアンモニウム塩によって溶解可能になる難水溶性物質量を評価するために、テトラアルキルアンモニウム塩水溶液におけるテトラアルキルアンモニウム塩の濃度を固定し、難水溶性物質に対する溶解実験を行った。テトラアルキルアンモニウム塩としてはテトラプロピルアンモニウムクロライド、テトラブチルアンモニウムクロライド、又はテトラペンチルアンモニウムクロライドを２０００ｍＭの濃度で用い、難水溶性物質としては難水溶性基質であるＴＭＢを用いた。
１．５ｍＬのプラスチックチューブに予め乳鉢ですり潰しておいたＴＭＢをそれぞれ５０ｍｇ、１００ｍｇ、１２５ｍｇ、１５０ｍｇ量り取り、２０００ｍＭのテトラアルキルアンモニウム塩水溶液を１．０ｍＬずつ加え、ボルテックスミキサーで１分間混合、撹拌した後、２４時間遮光下、静置した。不溶物を遠心分離（ＫＵＢＯＴＡ３７４０（Ｋｕｂｏｔａ社製）、１５，０００ｒｐｍ、１２０分間）によって取り除き、マイクロプレートリーダー（Ｖａｒｉｐｏｓｋａｎ（サーモサイエンティフィック社製））で２８８ｎｍの吸光度を測定した。吸光度が高すぎる場合は、水：エタノール＝１：９の組成で希釈した。希釈した場合の吸光度は、希釈溶液の吸光度に希釈倍率を掛けた値としている。吸光度が高いほど、より多くのＴＭＢが溶解していることを意味する。
結果を図７に示す。その結果、テトラプロピルアンモニウムクロライドを使用した場合では、ＴＭＢの重量が５０ｍｇ以上でほとんど飽和溶解度に変化はないが（吸光度が５４０～７００程度）、テトラブチルアンモニウムクロライドを使用した場合では、ＴＭＢが１００ｍｇ以上でようやく飽和状態に達した（吸光度が３６００～３８００程度）。更にテトラペンチルアンモニウムクロライドを使用した場合では、１２５ｍｇ以上で飽和状態に達した（吸光度が８５００～８８００程度）テトラペンチルアンモニウムクロライドではテトラプロピルアンモニウムクロライド１３倍、テトラブチルアンモニウムクロライドの２倍もＴＭＢを溶解させた。ベタイン５と同様にアンモニウム基にｎ－ペンチル基を有するテトラペンチルアンモニウムクロライドは、ＴＭＢに対して極めて高い可溶化能を有していた。
試験例８：保存安定性の評価
難水溶性物質の内、酸化反応を触媒する標識酵素に使用される難水溶性基質は、保存中に空気酸化等を受けると基質としての機能を失ってしまう。そこで、一般式（１）に示すベタイン誘導体が難水溶性基質をどの程度酸化等から保護しながら長期間安定に保存できるか検討した。ベタイン誘導体としてはベタイン５を１０００ｍＭの濃度で用い、難水溶性基質としてはＴＭＢを用いた。また、比較として、蒸留水のみにＴＭＢを懸濁させたもの、及び一般的なＴＭＢ溶液の調製法である酢酸緩衝溶液にＴＭＢを溶解させたものを用いた。
難水溶性物質の内、酸化反応を触媒する標識酵素に使用される難水溶性基質は、保存中に空気酸化等を受けると基質としての機能を失ってしまう。そこで、一般式（１）に示すベタイン誘導体が難水溶性基質をどの程度酸化等から保護しながら長期間安定に保存できるか検討した。ベタイン誘導体としてはベタイン５を１０００ｍＭの濃度で用い、難水溶性基質としてはＴＭＢを用いた。また、比較として、蒸留水のみにＴＭＢを懸濁させたもの、及び一般的なＴＭＢ溶液の調製法である酢酸緩衝溶液にＴＭＢを溶解させたものを用いた。
５．０ｍＬのプラスチックチューブに予め乳鉢ですり潰しておいたＴＭＢを１２ｍｇ量り取り、蒸留水、もしくは１０００ｍＭのベタイン５を含むベタイン誘導体水溶液を５．０ｍＬ加え、ボルテックスミキサーで１分間混合、撹拌した後、得られたＴＭＢ溶液を遮光下、室温（１０℃から３０℃）で静置した。比較例として用いた酢酸緩衝溶液に溶解させたＴＭＢ溶液は、以下のように調製した。５．０ｍＬのプラスチックチューブに予め乳鉢ですり潰しておいたＴＭＢを１２ｍｇ量り取り、氷酢酸４８０μＬの酢酸に溶解させた後、蒸留水を少し加え、ｐＨを３．３に調整した後、蒸留水で５ｍＬに調製し、同様に遮光下、室温（１０℃～３０℃）で静置した。
すべてのサンプルは２０１６年１月４日に調製し、酢酸緩衝溶液は２０１６年１月１１日（調製１週間後）、他の２つ（蒸留水及びベタイン誘導体水溶液）は２０１７年１月５日（調製１年後）にそれぞれ写真撮影を行った。
結果を図８に示す。この結果、蒸留水を使用した場合には、調製直後にＴＭＢが溶解せず、底に沈殿しているのが確認された。また、その沈殿も１年後には黄色く着色していた。一方、酢酸緩衝溶液及びベタイン誘導体水溶液を使用した場合には、調製直後は、ＴＭＢは完全に溶解し、透明な溶液となっていた。しかしながら、酢酸緩衝溶液を使用した場合では、１週間経過すると、ＴＭＢが酸化され、変色が認められた。これに対して、ベタイン誘導体水溶液を使用した場合では１年経っても変色は全く確認されなかった。以上の結果から、一般式（１）に示すベタイン誘導体は、難水溶性基質を安定に溶解させるだけでなく、難水溶性基質の酸化等も抑制し、保存安定性を向上させる作用があることが明らかとなった。
試験例９：長期保存基質溶液が酵素反応に及ぼす影響の評価
試験例８において長期的な保存安定性が確認された長期保存ＴＭＢ溶液（１０００ｍＭのベタイン５及びＴＭＢを含む水溶液の１年間保存後のもの）が、酵素反応の基質溶液として使用可能かどうかを評価するため、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ、和光純薬工業製、カタログ番号：０７４－０２４０１）と西洋わさび由来ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ、和光純薬工業製、カタログ番号：１６５－１０７９３）を利用したグルコースの定量における検量線を作成した。比較例として、新しく調製した同組成のＴＭＢ溶液を使用した。
試験例８において長期的な保存安定性が確認された長期保存ＴＭＢ溶液（１０００ｍＭのベタイン５及びＴＭＢを含む水溶液の１年間保存後のもの）が、酵素反応の基質溶液として使用可能かどうかを評価するため、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ、和光純薬工業製、カタログ番号：０７４－０２４０１）と西洋わさび由来ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ、和光純薬工業製、カタログ番号：１６５－１０７９３）を利用したグルコースの定量における検量線を作成した。比較例として、新しく調製した同組成のＴＭＢ溶液を使用した。
１００ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．０）２２５０μＬに、ＧＯＤ溶液（２．４ｍｇ／ｍＬのＧＯＤを含有）３００μＬ、ＨＲＰ溶液（０．２４ｍｇ／ｍＬのＨＲＰを含有）３００μＬ、及びＴＭＢ溶液１５０μＬを混合し、酵素・基質溶液（［ＧＯＤ］＝０．２４ｍｇ／ｍＬ、［ＨＲＰ］＝０．０２４ｍｇ／ｍＬ、［ＴＭＢ］＝０．０５ｍｇ／ｍＬ、［ベタイン５］＝５０ｍＭ、９５ｍＭリン酸緩衝ｐＨ７．０）を得た。９６穴マルチプレートに定量されている各グルコースサンプル３０μＬ加え、酵素・基質溶液を１５０μＬ加えた。シェイキングインキュベータを用いて、３７℃、７００ｒｐｍで１０秒間撹拌した後、３７℃で１０分間遮光し、恒温静置した。１Ｍ硫酸水溶液を１８０μＬ加えて反応を終了させた後、マイクロプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で波長４５０ｎｍの吸光度を測定した。
結果を図９に示す。この結果、室温（１０℃～３０℃）で１年間保存していたＴＭＢ溶液を用いて作成した検量線は、調製直後のＴＭＢ溶液を用いて作成した検量線は重なっており、ベタイン５を含むＴＭＢ溶液では、１年間保存していても酸化を受けず、酵素の基質として機能することが示された。
試験例１０：ペルオキシダーゼを用いた過酸化水素濃度の検出限界に及ぼす影響の評価
一般式（１）に示すベタイン誘導体は、低濃度では標識酵素の活性化にも寄与することが明らかとなっている（特開２０１２－１００６５４号公報）。そこで、難水溶性の基質溶液に含まれるベタイン誘導体が、最終的に酵素反応溶液に添加され、希釈された際に酵素反応の促進にも寄与するか評価するために、西洋わさび由来ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ、和光純薬工業製、カタログ番号：１６５－１０７９３）の過酸化水素濃度に対する検出限界を比較した。基質溶液としては１．０ｍｇ／ｍＬのＴＭＢ及び１０００ｍＭのベタイン４を含むＴＭＢ溶液を使用した。また、比較例として、酢酸緩衝溶液にＴＭＢを溶解させたＴＭＢ溶液（組成及び調製法は、試験例６に記載の通り）についても基質溶液として使用した。
一般式（１）に示すベタイン誘導体は、低濃度では標識酵素の活性化にも寄与することが明らかとなっている（特開２０１２－１００６５４号公報）。そこで、難水溶性の基質溶液に含まれるベタイン誘導体が、最終的に酵素反応溶液に添加され、希釈された際に酵素反応の促進にも寄与するか評価するために、西洋わさび由来ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ、和光純薬工業製、カタログ番号：１６５－１０７９３）の過酸化水素濃度に対する検出限界を比較した。基質溶液としては１．０ｍｇ／ｍＬのＴＭＢ及び１０００ｍＭのベタイン４を含むＴＭＢ溶液を使用した。また、比較例として、酢酸緩衝溶液にＴＭＢを溶解させたＴＭＢ溶液（組成及び調製法は、試験例６に記載の通り）についても基質溶液として使用した。
１０００ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．０）３００μＬ、ＨＲＰ溶液（０．２４ｍｇ／ｍＬのＨＲＰを含有）３００μＬ、ＴＭＢ溶液１５０μＬ、及び蒸留水２２５０μＬを混合し、酵素・ＴＭＢ溶液（［ＨＲＰ］＝０．０２４ｍｇ／ｍＬ、［ＴＭＢ］＝０．０５ｍｇ／ｍＬ、［ベタイン４］＝５０ｍＭ含む）、１００ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．０））を得た。９６穴マルチプレートに、酵素・ＴＭＢ溶液を１７９μＬ加えた。各ウェルの淵へ過酸化水素水溶液（反応液中での過酸化水素の最終濃度が０～２０μＭとなるように設定）を１μＬ付着させ、シェイキングインキュベータを用いて７００ｒｐｍで１０秒間、過酸化水素と酵素・ＴＭＢ溶液を混合、撹拌後、３７℃で１０分間遮光し、恒温静置した。次いで、１Ｍ硫酸水溶液を１８０μＬ加え、反応を終了させ、マイクロプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で波長４５０ｎｍの吸光度を測定し、以下の式に従って過酸化水素の検出限界を算出した。
求められた検量線を図１０に示す。この結果、酢酸緩衝溶液を使用したＴＭＢ溶液とベタイン４を含むＴＭＢ溶液では、いずれも、良好な直線関係の検量線が得られ、誤差（９回の測定より算出、グラフに記載）も小さい値であった。一方、過酸化水素の検出限界は、酢酸緩衝溶液を使用したＴＭＢ溶液では１６８ｎＭ、ベタイン４を含むＴＭＢ溶液では８６ｎＭであり、ベタイン４を含むＴＭＢ溶液は、酢酸緩衝溶液を使用したＴＭＢ溶液に比べて、検出限界が１／２低濃度になっていた。
試験例１１：溶液の粘度の評価
界面活性剤を利用した可溶化では、溶液の泡立ちや粘性が生じ、溶液をはかりとる際には取り扱いに注意が必要となる。一方で、本発明で使用されるベタイン誘導体は、界面活性が低く、粘度も低い。そこで、最も高い溶解性を示したベタイン５水溶液（１０００ｍＭ）と界面活性剤として、ＳＤＳ水溶液（１０００ｍＭ）を調製し、その溶液の粘度を比較した。各溶液の粘度は、音叉型振動式粘度計（エーアンドディー社、ＳＶ－１０）を用い、溶液を２０℃に恒温して測定した。その結果、ベタイン５水溶液の粘度は６．５６ｍＰａ・sであったのに対し、ＳＤＳ水溶液では、その３倍高い２１．０ｍＰａ・sとなった。基質溶液とした際に、本発明で使用されるベタイン誘導体水溶液の方が扱い易いことが示された。
界面活性剤を利用した可溶化では、溶液の泡立ちや粘性が生じ、溶液をはかりとる際には取り扱いに注意が必要となる。一方で、本発明で使用されるベタイン誘導体は、界面活性が低く、粘度も低い。そこで、最も高い溶解性を示したベタイン５水溶液（１０００ｍＭ）と界面活性剤として、ＳＤＳ水溶液（１０００ｍＭ）を調製し、その溶液の粘度を比較した。各溶液の粘度は、音叉型振動式粘度計（エーアンドディー社、ＳＶ－１０）を用い、溶液を２０℃に恒温して測定した。その結果、ベタイン５水溶液の粘度は６．５６ｍＰａ・sであったのに対し、ＳＤＳ水溶液では、その３倍高い２１．０ｍＰａ・sとなった。基質溶液とした際に、本発明で使用されるベタイン誘導体水溶液の方が扱い易いことが示された。
試験例１２：ＴＭＢ以外の難溶性基質に対する溶解性の評価
試験例１～１１で示したように、一般式（１）に示すベタイン誘導体は難水溶性基質に対して高い溶解性を示した。標識酵素として汎用されるペルオキシダーゼでは、難水溶性の発色基質として、ＴＭＢ、ＡＥＣ、及びＤＡＢが広く使用されており、標識酵素として汎用されるアルカリホスファターゼでは、難水溶性の発色基質として、ＢＣＩＰ、及びＮＦが広く使用されている。これらの難水溶性の発色基質は、難水溶性の点で共通性質があるが、構造上の類似性は見当たらない。ＴＭＢについては、試験例１～１１において、一般式（１）に示すベタイン誘導体、及び一般式（２）に示すテトラアルキルアンモニウム塩による溶解性の向上効果を示したので、本試験例では、ＡＥＣ、ＤＡＢ、ＢＣＩＰ、及びＮＦについて、一般式（１）に示すベタイン誘導体、及び一般式（２）に示すテトラアルキルアンモニウム塩による溶解性の向上効果を評価した。ベタイン誘導体としてはベタイン５を、テトラアルキルアンモニウム塩としてはテトラペンチルアンモニウムクロライドを使用し、それぞれ１０００ｍＭの濃度で使用した。
試験例１～１１で示したように、一般式（１）に示すベタイン誘導体は難水溶性基質に対して高い溶解性を示した。標識酵素として汎用されるペルオキシダーゼでは、難水溶性の発色基質として、ＴＭＢ、ＡＥＣ、及びＤＡＢが広く使用されており、標識酵素として汎用されるアルカリホスファターゼでは、難水溶性の発色基質として、ＢＣＩＰ、及びＮＦが広く使用されている。これらの難水溶性の発色基質は、難水溶性の点で共通性質があるが、構造上の類似性は見当たらない。ＴＭＢについては、試験例１～１１において、一般式（１）に示すベタイン誘導体、及び一般式（２）に示すテトラアルキルアンモニウム塩による溶解性の向上効果を示したので、本試験例では、ＡＥＣ、ＤＡＢ、ＢＣＩＰ、及びＮＦについて、一般式（１）に示すベタイン誘導体、及び一般式（２）に示すテトラアルキルアンモニウム塩による溶解性の向上効果を評価した。ベタイン誘導体としてはベタイン５を、テトラアルキルアンモニウム塩としてはテトラペンチルアンモニウムクロライドを使用し、それぞれ１０００ｍＭの濃度で使用した。
１．５ｍＬのプラスチックチューブに予め乳鉢ですり潰しておいた難水溶性基質（ＤＡＢ、ＡＥＣ、ＢＣＩＰ、ＮＦのいずれか）を所定量量り取り（所定量とは一般的に標識酵素に使用される基質濃度の１０倍、ＤＡＢ：２０ｍｇ／ｍＬ、ＡＥＣ：２０ｍｇ／ｍＬ、ＢＣＩＰ：１２ｍｇ／ｍＬ、ＮＦ：１００ｍｇ／ｍＬ）、１０００ｍＭのベタイン５を含むベタイン誘導体水溶液、１０００ｍＭのテトラペンチルアンモニウムクロライドを含むテトラアルキルアンモニウム塩水溶液、又は蒸留水を０．５ｍＬずつ加え、ボルテックスミキサーで１分間混合、撹拌した。その後、不溶物を遠心分離（ＫＵＢＯＴＡ３７４０（Ｋｕｂｏｔａ社製）、１５，０００ｒｐｍ、１２０分間）によって取り除き、マイクロプレートリーダー（Ｖａｒｉｐｏｓｋａｎ（サーモサイエンティフィック社製））でそれぞれの色素の極大吸収波長（ＤＡＢ：２８０ｎｍ、ＡＥＣ：２７０ｎｍ、ＢＣＩＰ：２９２ｎｍ、ＮＦ：５５４ｎｍ）の吸光度を測定した。吸光度が高すぎる場合は、水：エタノール＝１：９の組成で希釈した。希釈した場合の吸光度は、希釈溶液の吸光度に希釈倍率を掛けた値としている。吸光度が高いほど、より多くの難水溶性基質が溶解していることを意味する。
結果を図１１に示す。この結果、全ての難水溶性基質に対してベタイン５及びテトラペンチルアンモニウムクロライドが共に高い溶解性を示すことが明らかとなった。吸光度で換算したところ、ベタイン５を使用した場合には、蒸留水に対してＤＡＢで３０倍、ＡＥＣで４９１倍、ＢＣＩＰで４１倍、ＮＦで１３１倍であった。また、テトラペンチルアンモニウムクロライドを使用した場合には、蒸留水に対してＤＡＢで２７倍、ＡＥＣで６３０倍、ＢＣＩＰで２４倍、ＮＦで８１倍であった。以上の結果から、一般式（１）に示すベタイン誘導体、及び一般式（２）に示すテトラアルキルアンモニウム塩、特にアルキル基にｎ－ペンチル基をもつものは、実際の臨床試薬として使用される構造の異なる様々な難水溶性基質の可溶化剤として使用可能であることが示された。
試験例１３：マウス切片を用いた組織染色実験
試験例１～１２で示したように、一般式（１）に示すベタイン誘導体、及び一般式（２）に示すテトラアルキルアンモニウム塩は、難水溶性物質に対して高い溶解性を示した。本発明に従って調製される基質溶液が実際の免疫染色についても有効に機能しうることを確かめるために、マウスの切片を使った免疫染色実験を行った。染色対象としたのは、ミトコンドリア内に局在するＭｎ ＳＯＤ（Ｍｎスーパーオキシドディスムターゼ）である。一次抗体として、抗Ｍｎ ＳＯＤ抗体（ｒａｂｂｉｔ）（ＳｔｒｅｓｓＭａｒｑ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製、カタログ番号：ＳＰＣ－１１７）をブロッキングワン（ナカライテスク製、カタログ番号：０３９５３－９５）で４０倍に希釈したものを用い、二次抗体として、ＨＲＰ標識抗ｒａｂｂｉｔ抗体（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｑｕａｌｅｘ製、カタログ番号：Ａ１０２ＰＳ）を超純水で２０００倍に希釈したものを用いた。
試験例１～１２で示したように、一般式（１）に示すベタイン誘導体、及び一般式（２）に示すテトラアルキルアンモニウム塩は、難水溶性物質に対して高い溶解性を示した。本発明に従って調製される基質溶液が実際の免疫染色についても有効に機能しうることを確かめるために、マウスの切片を使った免疫染色実験を行った。染色対象としたのは、ミトコンドリア内に局在するＭｎ ＳＯＤ（Ｍｎスーパーオキシドディスムターゼ）である。一次抗体として、抗Ｍｎ ＳＯＤ抗体（ｒａｂｂｉｔ）（ＳｔｒｅｓｓＭａｒｑ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製、カタログ番号：ＳＰＣ－１１７）をブロッキングワン（ナカライテスク製、カタログ番号：０３９５３－９５）で４０倍に希釈したものを用い、二次抗体として、ＨＲＰ標識抗ｒａｂｂｉｔ抗体（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｑｕａｌｅｘ製、カタログ番号：Ａ１０２ＰＳ）を超純水で２０００倍に希釈したものを用いた。
コントロールとなる発色基質溶液として、ＤＡＢ１ｍｇを酢酸２０μＬに溶解させ、ＰＢＳ２ｍＬを加えた。発色反応の直前に３０％過酸化水素水溶液１μＬを加え、最終濃度がＤＡＢ０．０５％、過酸化水素０．０１５％となるように調製した。
一方、本発明に従う発色基質溶液として、２０００ｍＭのベタイン５にＤＡＢを２０ｍｇ／ｍＬの濃度で可溶化させたストック溶液を５０μＬはかりとり、ＰＢＳ２ｍＬを加えた。発色反応の直前に３０％過酸化水素水溶液１μＬを加え、最終濃度がＤＡＢ０．０５％、ベタイン５０ｍＭ、過酸化水素０．０１５％となるように調製した。
パラフィンにより固定化したマウス皮膚組織をマイクロトームで１０μｍにスライスし、カバーガラス上に接着させた。そのカバーガラスをキシレン溶液に浸漬させ（１０分間×２回）、パラフィンを除去した。続いて、カバーガラスを９９．５％エタノール（１０分間×２回）、７０％エタノール（１０分間×１回）、ＰＢＳ（１０分間×３回）の順に浸漬させ、洗浄した。一次抗体の溶液に１時間浸漬させた後、ガラス基板をＰＢＳ（１０分間×２回）で洗浄し、二次抗体の溶液に１時間浸漬した。ガラス基板をＰＢＳ（１０分間×２回）で洗浄し、発色基質溶液へ２分間浸漬後、ＰＢＳ（１０分間×２回）で洗浄し、エンテランニュー（メルク製、カタログ番号：１０７９６１）でスライドガラス上に封入、固定した。得られた切片は、偏向顕微鏡（オリンパス製、ＢＸ-５１）で観察した。
結果を図１２に示す。この結果、無染色のものと比較して、酢酸緩衝溶液で調製したＤＡＢとベタイン５水溶液で調製したＤＡＢとでは、同等の染色度（図中の丸い細胞内で茶色に染まっている）を示すことが明らかとなった。
Claims (4)
- 緩衝剤を含まない水性溶媒中で難水溶性基質を可溶化させるために使用され、
一般式（１）に示すベタイン誘導体を含む、難水溶性物質の可溶化剤。
- 前記難水溶性基質が、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン、３－アミノ－９－エチルカルバゾール、３，３’－ジアミノベンジジン、５－ブロモ－４－クロロ－２－インドリルホスフェート、及びニューフクシンよりなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１に記載の可溶化剤。
- 請求項１又は２のいずれかに記載の可溶化剤と、難水溶性基質とを水性溶媒（但し、緩衝剤を含む場合を除く）中で共存させる、難水溶性物質の可溶化方法。
- 請求項１又は２のいずれかに記載の可溶化剤と、難水溶性基質とを含み、緩衝剤を含まない、基質溶液。
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