KR0135714B1 - Pqq-의존성 탈수소화 효소에 의한 분석물의 비색결정방법 - Google Patents

Pqq-의존성 탈수소화 효소에 의한 분석물의 비색결정방법

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포우퀘트, 크나우어
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Abstract

본 발명은 전자가 풍부한 방향족 니토로조 화합물의 작용기로부터의 직접 전자 수용체의 존재하에서 산화 환원 효소에 의해 분석물을 효소산화시킴으로써 분석물을 비색결정하고, 분석물 양의 측정으로서 색깔 형성에 의해 환원된 전자 수용체를 정량하는 방법으로서, PQQ-의존성 탈수소 효소의 존재하에서, 부수되는 분석물의 산화에 의해 전자가 풍부한 방향족 니트로조 화합물의 이미노 화합물로 환원되며, 이것이 더 이상 방향족 아민으로 효소환원되지 않으면서 색깔이 형성됨으로써 검출되는 분석물 비색결정방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한, PQQ-의존성 탈수소화제, 전자가 풍부한 니트로조 화합물, 바람직하게는 이미노 화합물 검출제를 포함하는 분석물 비색결정 시약에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 환원시에 유색 퀴논 디이민을 형성하는 신규한 니트로조 아미노 화합물 및 분석물 비색 효소 결정방법에 그 화합물을 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

PQQ-의존성 탈수소화 효소에 의한 분석물의 비색결정방법
제1도 내지 제4도 및 제6도는 각각 본 발명에 따른 바람직한 실시예에 따라 흡광도에 대한 글루코스 농도를 나타내는 그래프.
제5도는 p-니트로조아닐린 및 퀴놀린 디이민의 스펙트럼.
제7도는 PQQ-의존성 탈수소화 효소의 효소활성을 나타내는 그래프이다.
본 발명은 전자가 풍부한 방향족 니트로조 화합물의 작용기로부터 전자 수용체의 존재하에서 PQQ-의존성 탈수소화제에 의한 효소 산화에 의해 분석물을 비색결정하고 분석물 양의 측정으로서 색깔형성에 의해 감소된 전자 수용체를 정량하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, PQQ-의존성 탈수소화제, 전자가 풍부한 방향족 니트로조 화합물 및 전자가 풍부한 방향족 니트로조 화합물로부터 환원시에 생성되는 이미노 화합물에 대한 색깔형성 비산화성 검출 시약을 포함하는 효소 산화에 의한 분석물 비색결정용 시약에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 분석물 비색 효소 결정방법에 상기 시약을 사용하는 방법에 관한 것이다.
분석에 있어서, 효소 산화는 다양한 샘플물질에서 물질을 검출 및 결정할 수 있다. 이 경우, 산화 효소는 산화반응의 전자를 수용하는 수용체의 존재하에서 적합한 효소물질에 작용한다. 전자 수용체의 환원은 효소 물질의 존재를 나타낸다. 이러한 조건에서, 값비싼 측정장치에 의해서만 가능하지는 않으면서 바람직하게 시각적으로 수행될 수 있기 때문에 색깔형성에 의해 환원된 전자 수용체가 검출될 수 있다.
산화작용을 하는 효소에 의한 물질의 공지된 비색결정방법에서는 산화 효소 또는 탈수소 효소를 사용한다. 두 효소 작용기는 산화환원 효소의 주작용기에 속하며, 그 구성은 고유 전자 수용체에 따라 구별될 수 있다(Roempps Chemielexikon, Francksche Verlagsbuchhandlung, Stuttgart, 8th Ed. 1985, Vol. 4, pages 2952 ; Lexikon Biochemie, Publisher H.D. Jakubke, Verlag Chemie, Weinheim, 2nd Edition, 1981, page 194).
산화 효소에 대한 고유 전자 수용체는 분자 산소이다(Roempps Chemielexikon, Francksche Verlagsbuchhandlung, Stuttgart, 8th Edition. 1985, 4th, Volume, page 2946). 분석물 결정에 있어, 분석물은 이러한 공정에서, 산화 효소 및 Q2에 의해 산화된다. 형성되는 H2O2는 과산화 효소의 첨가에 의해 류코 염료를 산화시키는데 사용된다. 분석물 비색결정을 위한 산화 효소의 사용에 있어 다음의 참고문헌이 대표적이다[A. Kunst et al. 효소분석방법, Publ. H.U. Bergmeyer, Verlag Chemie, Weinheim, 3rd Edition, 1984, Volume 6, page 178-185]. 이 참고문헌에 있어서, 글루코스가 혈청, 플라즈마 산소의 환원에 의한 반응에서 형성된 과산화수소가 과산화 효소의 존재하에서 환원되고 색깔을 형성하기 위해 반응 혼합물내에 존재하는 4-아미노페나존 및 페놀에 작용하는 수용액내의 대기산소 및 글루코스 산화 효소에 의한 반응에 의하여, 탈단백질화된 혈액내에서 검출된다. H2O2의 높은 산화 환원 전위 및 과산화제의 비선택성 및 불안정성은 흔히 이러한 시험의 한계가 된다. 예컨대, 혈액으로부터 유도된 샘플내에서 용이하게 전이 금속이온 또는 헴 또는 헴 단백질이 발명되는 바와 같이, 과산화수소를 분해하기 때문에 간섭한다. 빌리루빈과 같은 샘플 구성요소 및 혈액으로부터 유도된 샘플 및 유린내에서 사실상 일어날 수 있는 메틸도파와 같은 약체가 과산화수소 및 과산화제에 의해 색깔형성을 유도할 수 있으며, 따라서 이미 형성된 염료를 감소 및 탈색시킬 수 있다.
산화 효소의 산소요구는 고체 담체상, 소위 건식시험에서의 상기 결정방법을 수행할 때 특히 부가적인 결점을 갖는 것으로 나타났다. 공기로부터 반응매질로의 산소 확산은 특히 높은 농도의 효소 기질을 산화시키는데 많은 량의 산소가 필요한 경우, 비율 결정단계가 되며, 이는 반응시간을 길게 하고 열역학적 결정방법에서 특히 나쁜 결과를 나타낸다.
탈수소화 효소는 일반적으로 니코틴아미드 아데닌 뉴클레오티드(NAD) 또는 니코틴아미드 아데닌 뉴클레오티드 포스메이트(NADP)가 효소 기질의 산화에 대한 고유 직접 전자 수용체로서 필요한 것과 비-HAD 의존성 또는 비-NADP-의존성인 것으로 나뉘어지며, 따라서 효소 산화 반응에서의 본래 직접 전자 수용체로서 다른 물질을 사용한다. 특히, PQQ-의존성 및 플라빈-의존성 탈수소화 효소는 비-NAD-의존성 또는 비-NADP-의존성 탈수소화 효소 작용기 부분이다.
비색측정에 NAD-의존성 탈수소화 효소를 사용하는 것은 DE-A-2147466에 공지되어 있다. 이는 락트산염 탈수소화제가 락트산염 및 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드를 피루브산염 및 환원된 니코틴아미드 아데닌 디튜클레오티드로의 전환을 촉진함을 기재하고 있다. 예컨대, NAD 및 그 농도를 광학적으로 결정할 수 있는 유색의 포마잔을 형성하기 위해 효소 디아포르아제 존재하에서 테트라졸리움 염과 반응한다. N-메틸펜아지늄 메토술페이트도 NADH에서 테트라졸리움 염으로의 전자 전달을 위한 환원 촉매로서 디아포르아제 대신 언급될 수 있다.
이러한 방법의 단점은 NADH에 부가하여, 혈액, 혈청, 플라즈마 또는 유린과 같은 생물적 샘플내에서 일어날 수 있는 글루타티온과 같은 환원작용을 하는 다른 물질 또는 메틸도파 또는 도베실레이트와 같은 약제도 디아포르아제 또는 N-메틸펜아지늄 메토술페렌트와 같은 비특이성 환원촉매의 존재하에서 테트라졸리움 염을 해당 포마잔으로 전환시킬 수 있으며, 따라서 환원 촉매없이 테트라졸리움 염과 신속하게 반응하지 않음에도 불구하고 허위의 긍정적 결과를 유도한다.
전자가 풍부한 방향족 니트로조 화합물을 이용한 PQQ-의존성 탈수소화제와 같은 비-NAD-의존성 탈수소화제 또는 플라빈-의존성 산화 효소에 의한 분석물의 산화적 효소 검출방법이 EP-A-0 354 441에 공지되어 있다. 이 검출방법에 있어서, 방향족 니트로조 화합물이 해당 전자가 풍부한 방향족 아민으로 효소적으로 환원되고, 방향족 아민은 침전된 거의 불용성의 헤테로 폴리산을 이용하는 헤테로폴리블루우 형성에 의해 검출되거나 염료를 형성하는 산화제 존재하에서 커플링 시약과 커플링된다. 그러나, 헤테로폴리블루우 형성의 청회색 색조는 정확한 시각적 평가에 대해 매우 적합하지는 않다. 일반적으로 커플링 시약을 이용하여 색깔을 띠지 않거나 단지 매우 약간만 색까을 띠는 방향족 아민의 비색결정방법의 단점은 부가적으로 산화제를 필요로 한다는 것이다. 산화제가 방향족 니트로조 화합물을 방향족 아민으로의 효소환원에 의해 방해되기 때문에, 검출반응은 두 별도 단계에서 수행되어야 한다 : 제1단계에서, 방향족 니트로조 화합물이 방향족 아민으로 효소적으로 환원되고, 제2단계에서, 산화제가 방향족 아민과 발색 커플링제와의 산화 커플링을 위해 첨가된다.
이러한 검출방법의 단점은 방향족 아민으로 방향족 니트로조 화합물 1당량이 환원되는데 2당량의 분석물이 산화된다는 것이다. 이는 이러한 검출방법이 특히 낮은 분석물 농도에서 만족스럽지 못한 감도를 나타내게 한다.
따라서, 본 발명의 목적은 상기한 선행기술의 결점을 제거하며, 간섭에 대해 덜 예민하고 개선된 방식으로 선택적으로 평가되며, 특히 1단계로 수행될 수 있고 전 가시광선 범위에 걸쳐 시각적 수단에 의해 용이하게 평가될 수 있는 색깔을 얻는 분석물의 산화적 검출을 위한 보다 간단하고, 보다 감도가 높은 방법 및 제제를 제공한다.
본 발명의 목적은 첨부되는 청구범위를 특징으로 하는 본 발명에 의해 성취될 수 있다.
따라서, 본 발명은 전자가 풍부한 방향족 니트로조 화합물의 작용기로부터 직접 전자 수용체의 존재하에서 산화환원 효소에 의해 분석물을 효소 산화시키는 분석물 비색결정방법에 있어서, 환원된 전자 수용체가 PQQ-의존성 탈수소 효소의 존재하에서 전자가 풍부한 방향족 니트로조 화합물이 분석물의 부수적인 산화에 의해 아미노 화합물로 환원되고, 이 아미노 화합물이 방향족 아민을 형성하도록 더 이상 효소 환원시키지 않고 색깔이 형성됨으로써 검출되는 것을 특징으로 하는 분석물의 정량이 색깔 형성에 의해 결정되는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 특히, 분석물 량의 측정으로서 색깔형성에 의해 환원된 전자 수용체가 정량되는 전자가 풍부한 방향족 니트로조 화합물의 작용기로부터 직접 전자 수용체 존재하에서 산화환원 효소에 의해 분석물을 비색 결정하는 방법으로서, 전자가 풍부한 방향족 니트로조 화합물이 PQQ-의존성 탈수소 효소의 존재하에서 분석물을 부수적으로 산화시킴으로써 이미노 화합물로부터 환원되며, 이 이미노 화합물이 더 이상 방향족 아민으로 효소 환원되는 대신 발색성 비산화 검출반응이 일어나는 반응에 의해 비색결정된다.
또한, PQQ-의존성 탈수소화 효소 및 전자가 풍부한 방향족 니트로조 화합물의 작용기로부터 직접 전자 수용체를 포함하는 분석물의 효소 산화에 의한 분석물의 비색결정 시약으로서, 효소 환원시 유색의 이미노 화합물을 형성하는 전자가 풍부한 방향족 니트로조 화합물을 포함하거나 부가적으로 전자가 풍부한 니트로조 화합물의 환원에 의해 형성된 이미노 화합물에 대한 발색성 비산화 검출제를 포함하는 시약에 관한 것이다.
본 발명에 따라, 분석물은 효소적으로 산화되는 물질로 이해된다. 많은 경우에 있어서, 분석물은 직접 검출되는 것이나 시험되는 샘플내에서 정량적으로 결정되는 물질이다. 예컨대, 글루코스는 PQQ-의존성 글루코스 탈수소화 효소(글루코스 염료 산화환원 효소)에 의해 직접 산화될 수 있고 비색결정된다.
본 발명에 있어서의 분석물은 사용되는 PQQ-의존성 탈수소 효소에 대한 기질로서 사용되는 물질이다.
PQQ-의존성 탈수소 효소는 보조인자로서 피롤로퀴놀린 퀴논을 포함한다. 이러한 퀴노프로테인에 관한 고찰은 다음 참고문헌에 기재되어 있다[J.A. Jongejahn et al. in PQQ 및 퀴노프로테인, Kluver Academic Publ. Dordrecht, Netherlands 1989]. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 효소의 예에는 PQQ-의존성 글루코스 탈수소화 효소(글루코스 염료 산화환원 효소 E.C. 1.1.1.50/1.1.1.91/1.1.1.97), 알콜 탈수소화 효소 또는 락트산염 탈수소화 효소가 있다. 본 발명에 따른 방법에 있어서, 특히 PQQ-의존성 글루코스 탈수소화 효소는 글루코스의 비색결정에 유리하게 사용될 수 있다.
전자가 풍부한 방향족 니트로조 화합물은 산화효소 및 비-NADH의존성 탈수소화 효소에 대한 전자 수용체로서 EP-A-0 354 441 및 EP-A-0 441 222에 공지되어 있는 바와 같은 효소/보조인자 시스템 탈수소화 효소/PQQ로부터 전자를 수용하는 직접 전자 수용체로서 사용된다. 직접전자 수용체는 효소 촉매하에서 전자가 효소/보조인자 시스템으로부터 환원 촉매가 필요없이 직접 수용된다.
본 발명의 견지에서 사용될 수 있는 환원가능한 전자가 풍부한 방향족 화합물은 본 공정에서 이미노 화합물을 형성하고, 사용된 PQQ-의존성 탈수소화 효소에 대한 적합한 기질이 산화되는 동안 형성되는 효소로부터 전자를 수용하는 화합물이다. 해당 이미노 화합물은 이전에 방향족 핵에 이중결합을 통해 결합되고 그 이중결합 전자에 의해 컨쥬게이트된 이미노기 =NH를 포함한다. 전자가 풍부한 니트로조 화합물은 이전에 방향족 핵을 통해 하나 또는 수개의 전자 공여 잔기 또는 이미노기에 의해 전자방출됨으로써 컨쥬게이트됨에 의해 이미노 화합물 형성을 촉진하는 방향족 핵 또는 핵내의 작용기를 포함한다.
방향족 핵에서 +M 효과를 나타내는 치환체가 있다.
예. R-Ar-NOR'=Ar'=NH
방향족 핵에 결합된 +M 효과에 의해 잔기 R의 예에는 수산기, 알콕시, 아릴옥시, 알키티오, 아릴티오, 아미노, 모노알킬아미노, 모노아릴아미노, 디알킬아미노 및 디아릴아미노 잔기와 같은 치환체가 있다.
니트로조벤젠 유도체의 경우, 이러한 치환체는 니트로조 기에 대해 오르토 및/또는 파라 위치에 위치할 때 특히 그 효과를 나타낸다.
이민 구조 촉진효과 및 전자 공여기능을 갖는 작용기는 헤테로 방향족 고리 시스템의 성분이 될 수도 있다.
예컨대, 방향족 고리 시스템에 환원후, 외부 +M 치환체가 메소머리 안정화된 이민 작용기를 형성할 필요없는 정도로 전자가 풍부한 과량의 π-전자를 가지는 헤테로시클릭 방향족 니트로조 화합물이다. 과량의 π-전자는 고리 원자에 π-전자가 분포될 수 있는 것보다 더 많은 방향족 π-전자가 존재한 결과이다. 이러한 헤테로 고리가 기술분야의 숙련자에게 공지되어 있다.
이러한 방향족 헤테로 고리의 예에는 안티피린, 피라졸로 헤테로 고리 및 피라졸이 있다.
본 발명에 따라 사용된 전자가 풍부한 방향족 니트로조 화합물의 존자에 있어 그 풍부성은 이러한 니트로조 화합물이 케토-엔을 토오토머에 의한 등가의 옥심 공명 구조에 의한 평형상태의 특정 한계가 되는 부가적인 효과를 갖는다.
R-Ar-N=O ←→ R'=Ar'=N-OH
본 발명의 명세서내에서 본 발명에 따라 사용될 수 있는 물질로서 방향족 니트로조 화합물의 용어를 사용하며, 이는 토오토머 공명 구조를 모두 포함한다.
상기의 +M 치환체의 경우, 알콕시, 알킬티오, 모노알킬아미노 및 디알킬아미노 잔기는 알킬이 히드록시기, 바람직하게는 C1내지 C6의 알킬, PO3H2, SO3H 또는 CO2H에 의해 일회 또는 수회 치환된 아미노기에 의해 차례로 치환될 수 있는 C1내지 C6의 탄화수소 잔기를 나타낸다. 산성 잔기 PO3H2, SO3H 및 CO2H는 이러한 형태 또는 암모늄, 알칼리 또는 알칼리 토염과 같은 염의 형태로 제공될 수 있다.
알콕시 및 아릴티오 잔기는 페녹시 및 페닐티오 잔기가 특히 바람직한 C6내지 C10의 방향족 잔기를 포함한다.
암모늄 염은 암모늄 이온(NH4 +)을 포함한 것이거나 알킬, 아릴 또는 아르알킬 잔기에 의해 일회 또는 수회 치환된 암모늄 양이온을 포함한 것이다. 알킬 및 아르 알킬 잔기에서의 알킬은 C1내지 C6의 탄화수소 잔기를 나타낸다. 아릴 및 아르알킬 잔기에 있어서 아릴은 페닐이 바람직한 C6내지 C10의 방향족 고리 시스템이다. 바람직한 아르알킬 잔기는 벤질이다.
알카리 염은 바람직하게는 리튬, 나트륨 또는 칼륨이다. 알칼리토 염은 바람직하게는 마그네슘 또는 칼슘이다.
+M 치환체의 상기한 예는 예시적인 것이다. 당해 기술분야의 숙련자라면 주어진 잔기 R이 =M 치환체 인지 그리고 그 위치에서 방향족 시스템상에 이 효과가 나타나는지 또는 방향족 헤테로 고리가 고리 시스템내에서 해당 작용기를 포함하고 각 경우 모두 이러한 잔기가 본 발명에 따라 사용될 수 있는 방향족 니트로조 화합물로내의 치환체로서 가능한 것인지를 알 수 있을 것이다.
사용되는 방향족 니트로조 화합물의 염기성 방향족 구조물은 C5내지 C7의 바람직하게는 C5내지 C6의 전자가 풍부한 방향족 고리이며, 특히 바람직하게는 하나 또는 두 개의 방향족 및/또는 알리시클릭 고리로 아넬화될 수 있는 헤테로 원자를 나타낸다. 이러한 경우에 있어서, 각각 C6내지 C7, 바람직하게는 C5내지 C6또는 헤테로원자를 가지는 방향족 탄소 시스템 및 헤테로 방향족 시스템이 방향족 아넬화된 고리에 대해 고려된다.
알리시클릭 고리는 C5내지 C7원자 또는 헤테로 원자, 바람직하게는 C5내지 C6의 원자의 포화 또는 불포화 시클로 지방족을 의미한다. 헤테로 원자는 질소, 산소 또는 황이다.
본 발명에 따라 사용될 수 있는 바람직한 니트로조 화합물은 니트로조벤젠 유도체이다.
니트로조벤젠 유도체는 하나 또는 수개의 방향족 및/또는 알리시클릭 고리로 아넬화되는 니트로조벤젠을 포함하는 것이다. 이 경우, C5내지 C7, 바람직하게는 C5내지 C6고리 원자를 갖는 방향족 탄소 시스템 및 헤테로 방향족 화합물이 고리로서 시스템 및 헤테로 방향족 화합물이 방향족 고리로서 고려될 수 있다. 예는 아넬화 벤젠 또는 나프탈렌 고리 또는 아넬화 피리딘 고리이다.
화학식(Ⅰ)의 니트로조벤젠 유도체가 특히 바람직하다.
[상기 식에서, R1은 수소, 히드록시, 바람직하게는 히드록시, COOH, PO3H2또는 SO3H로 치환된 알킬, 알콕시, 알킬티오, 아릴옥시, 아릴티오, 할로겐 또는 바람직하게는 히드록시, PO3H2, 디알킬포스피닐, SO3H 또는 CO2H로 치환된 알킬에 의해 일회 또는 수회 치환된 아미노기를 나타내며; R2는 히드록시기, 알콕시, 아릴옥시, 아릴티오 또는 알킬기가 바람직하게는 히드록시기, 알콕시기 또는 바람직하게는 알킬, PO3H2, SO3H 또는 CO2H 또는 암모늄, 알칼리 또는 알킬리토염과 같은 염의 형태로 일회 또는 수회 치환된 아미노기에 의해 차례로 치환된 알킬티오기, 또는 아미노기 NR3R4를 나타내며, R3및 R4는 동일하거나 상이하며, 수소 또는 차례로 히드록시, 알콕시, 히드록시 알콕시, 또는 바람직하게는 히드록시, PO3H2, SO3H, COOH 또는 염의 형태로 치환되거나 바람직하게는 알킬에 의해 일회 또는 수회 치환된 아미노기에 의해 치환된 폴리알콕시기에 의해 치환될 수 있는 폴리알콕시알킬 잔기에 의해 치환될 수 있는 아릴 또는 알킬기이거나, R3및 R4는 바람직하게, 산소, 황 또는 질소에 의해 차단되며, 질소가 각각 바람직하게는 알킬 부분의 히드록시 잔기에 의해 차례로 치환될 수 있는 알킬, 히드록시알킬, 히드록시알콕시알킬, 알콕시히드록시알킬 또는 폴리알콕시알킬기에 의해 치환되는 알킬렌기이거나, 또는 R1이 NR3R4에 대해 오르토 위치인 경우, R3및 R4는 R1과 함께 알킬렌 잔기를 나타낸다.
이 경우, 할로겐은 불소, 염소, 브롬, 요오드를 나타낸다. 불소 및 염소가 특히 바람직하다.
알킬, 알콕시 또는 알킬티오내의 알킬은 C1내지 C6의 탄화수소 잔기를 나타내며, C1내지 C3의 잔기가 특히 바람직하다. 알킬에 대한 상기의 정의는 히드록시알킬, 디알킬아미노알킬, 히드록시알콕시알킬, 알콕시알킬, 폴리알콜시알킬, 알콕시히드록시알킬 및 디옥3산일일-알킬 잔기내의 알킬기에도 적용된다. 디옥산일일-알킬잔기는 디옥산 고리 시스템이 알킬 잔기에 결합된 잔기이다. 바람직하게는 1,4-디옥산 고리 시스템 즉,이다.
폴리알콕시알킬 잔기는 n이 1 내지 10인-알킬-(알콕시)-알콕시 잔기이다. 바람직하게는 n이 1 내지 3 이다. 알킬렌 잔기는 직쇄 또는 분지쇄, 바람직하게는 직쇄의 포화 또는 불포화, 바람직하게는 포화, C2내지 C5, 바람직하게는 C2내지 C4의 두 자유결합부분을 가지는 탄화수소 사슬이다.
알릴 및 아르알킬 잔기내의 아릴은 페닐이 바람직한 C6내지 C10의 방향족 고리 시스템이다.
암모늄 염은 암모늄 이온 NH4 +또는 알킬, 아릴 또는 아르알킬 잔기에 의해 일회 또는 수회 치환된 암모늄 양이온을 포함하는 것이다.
알칼리 염은 바람직하게는 리튬, 나트륨 또는 칼륨염이다. 알칼리로 염은 바람직하게는 마그네슘 또는 칼슘이다.
바람직한 잔기 R1은 수소 및 알킬, 특히 수소이다.
바람직한 잔기 R2는 알콕시 잔기 및 아미노 작용기 NR3R4이다.
화학식(Ⅰ)의 질소원자의 결합에 의해 형성된 모르폴린 또는 티오모르폴린 또는 피페라진 잔기는 산소, 황 또는 질소에 의해 방해받는 R1및 R3의 알킬렌 잔기를 의미하는 범위내에서 바람직하다. 피페라진 잔기가 특히 바람직하다.
화학식(Ⅰ)의 방향족 고리와의 결합에 의해 형성된 인돌린 또는 1, 2, 3, 4-테트라히드로퀴놀린 잔기가 R1및 R3로부터 형성된 알킬렌 잔기를 의미하는 범위내에서 바람직하다.
강산염 및 특히 염산, 황산, 질산 및 인산과 같은 광산이 본 발명에 따른 화학식(Ⅰ)의 니트로조아닐린 유도체의 염으로서 바람직하다. 염화수소, 즉, 염산염이 특히 바람직하다.
바람직한 화학식(Ⅰ)의 니트로조 화합물은 다음과 같다 :
N,N'-비스-(2-히드록시에틸)-p-니트로조아닐린
N,N'-디메틸-p-니트로조아닐린
N,N'-디에틸-p-니트로조아닐린
N-메틸-N'-(4-니트로조페닐)-피페라진
N-(2-히드록시에틸)-5-니트로조인돌린
2, 4-디메톡시-니트로조벤젠
N,N'-비스-(2-메톡시에틸)-4-니트로조아닐린
N-(4-니트로조페닐)-모르폴린
N-(2, 2-디에톡시-에틸)N'-(4-니트로조페닐)-피페라진
p-니트로조페놀
3-메톡시-4-니트로조페놀
방향족 고리 시스템이 니트로조/옥심 토우토머 또는 이민 형성에 외부 +M 치환체가 필요하지 않은 정도로 전자가 풍부한 헤테로 방향족 니트로조 화합물 중 본 발명에 따른 방법에 특히 적합한 것은 피라졸론, 피라졸 및 특히 하기 문헌에 기재된 바와 같은 니트로조 작용기에 의해 치환된 피라졸 화합물이다[Ullmann's Encyclopaedia of Industrial Chemistry 5th ed., Vol. A 20. pages 72 내지 74].
화학식(Ⅱ)의 3-니트로-피라졸 화합물이 이 경우 특히 바람직하다.
이러한 화합물의 대부분은 해당 3-아미노 피라졸 화합물의 제조합성을 위한 전구체로서 유럽 특허출원 EP-A-0 433 854호부터 공지되어 있다. 화학식(Ⅱ)에 있어서, X-Y는 NR5-CO 또는 N=CR6를 나타내며; R5는 수소, 바람직하게는 히드록시, 카르복시, SO3H, PO3H2, 디알킬포스피닐기에 의해 치환된 알킬을 나타내며, R6는 수소, 바람직하게는 히드록시, 디알킬포스피닐, 카르복시, SO3H, PO3H2, 이들 산성 잔기중 하나의 염 또는/ 및 알콕시카보닐에 의해 치환될 수 있는 알킬, 알케닐, 알콕시, 알킬티오, 아릴, 아릴티오, 아르알킬, 또는 하나 또는 수개의 히드록시, 카르복시 또는/ 및 알콕시카보닐 잔기를 수반하는 하나 또는 두 개의 알킬 잔기에 의해 치환되며, 아미노기가 두 개의 알킬기로 치환되는 경우, 아미노기의 N원자 이외에 바람직하게는 산소, 황 또는 더 이상의 질소원자에 의해 차단될 수 있는 고리를 형성하도록 결합될 수 있거나, 또는 바람직하게는 하나 또는 두 개의 아실기, 알콕시 또는/ 및 아르알콕시카보닐기, H2N-CO, 알킬, 아르알킬, 또는/ 및 아릴카바모일기에 의해 치환될 수 있는 아미노기, 또는 카르복시, 알콕시카보닐, 카르복스아미도 또는 할로겐을 나타내며; R7는 바람직하게는 히드록시, 카르복시, SO3H, 디알킬포스피닐 또는 PO3H2에 의해 치환되는 알킬, 티오알킬 또는 아르알킬, 또는 바람직하게는 히드록시, 카르복시, SO3H, 디알킬포스피닐 또는 PO3H2에 의해 차례로 치환될 수 있는 하나 또는 두 개의 알킬기에 의해 치환되는 아미노기를 나타내고, 적어도 R6및/또는 R7가 아미노기를 나타내며; R8는 바람직하게는 히드록시, 카르복시, SO3H 또는 PO3H2에 의해 치환될 수 있는 알킬 또는 아르알킬을 나타내며; 또는 R7및 R8은 바람직하게는 하나 또는 수개의 질소 또는 황원자의 질소원자 또는 탄소원자의 3 또는 4원 포화 또는 불포화 사슬, 바람직하게는 상기 해당 토오토머형 및 그들의 염을 나타내며; 이 경우, 탄소원자가 바람직하게는 알킬, 알콕시, 알킬티오, 히드록시, 아르알킬, 아릴, 카르복시, 카르복스아미도, 알콕시카보닐, 시아노, 할로겐, 바람직하게는 하나 또는 수개의 히드록시, 카르복시 또는/ 및 알콕시카보닐 잔기를 수반하는 하나 또는 두 개의 알킬 잔기에 의해 치환된 아미노기에 의해 치환되거나 아르알킬 또는 두 인접 사슬 치환체가 바람직하게는 차례로 바람직하게는 아릴에 의해 치환되거나 아넬화되는 알킬렌기를 형성한다.
이 경우, 알킬티오, 디알킬포스필, 알킬카바모일 및 아르알킬 잔기에서의 알킬은 C1내지 C6, 바람직하게는 C1내지 C4의 직쇄 또는 분지쇄 알킬 잔기를 나타낸다.
예컨대, 메틸, 에틸, 프로필, 이소부틸 또는 tert-부틸기가 있다.
아미노 작용기가 두 개의 알킬 잔기에 의해 치환되는 경우, 이러한 잔기는 질소원자에 의해 차단된 고리를 나타내는 식으로 고리를 형성하도록 형성될 수 있다. 이 경우, 아미노 작용기는 전제 5 또는 6의 원자수를 가지는 고리를 나타내며, 그 자체가 바람직하게는 산소, 황 또는 질소에 의해 차단되는 것이 바람직하다. 모르폴리노 잔기가 특히 바람직하다.
알콕시-알콕시 및 아르알콕시카보닐 잔기내의-는 C1내지 C6, 바람직하게는 C1내지 C4의 직쇄 또는 분지쇄 알콕시 잔기이다. 예컨대, 메톡시, 에톡시,프로필옥시, 이소부틸옥시 또는 tert-부틸옥시기이다.
아릴-아릴카바모일기내의-는 바람직하게는 6 내지 10고리 원자의 방향족 탄소 또는 헤테로 방향족 잔기이며, 특히 북사적으로 알킬, 알콕시 또는/ 및 할로겐에 의해 치환될 수 있는 페닐 및 나프틸기이다. 페닐잔기가 특히 바람직하다.
아르알킬 잔기-아르알킬카바모일기내의-는 상기한 알킬기가 상기의 아릴 잔기에 의해 치환되는 잔기를 나타낸다. 벤질기가 바람직하다.
아르알콕시 잔기-아르알킬카바모일기내의-는 상기한 알킬기가 상기의 아릴 잔기에 의해 치환되는 잔기를 나타낸다. 벤질기가 바람직하다.
아르알콕시 잔기-예컨대, 아르알콕시 카보닐기내의-는 상기의 알콕시기가 상기한 바와 같은 아릴 잔기에 의해 치환된 잔기를 나타낸다. 벤질옥시기가 바람직하다.
할로겐은 불소, 염소, 브롬 및 요오드를 나타낸다. 불소 및 염소가 바람직하다.
아실기는 알킬, 아르알킬 또는 아릴 잔기일 수 있는 카르복실산 잔기를 나타낸다. 아세틸, 페닐 아세틸 또는 벤조일 잔기가 바람직하다.
알킬렌기는 직쇄 또는 분지쇄, 포화 또는 불포화, 두 개의 자유 결합자리를 갖는 C3내지 C5, 바람직하게는 C3내지 C4의 탄화수소이다.
예컨대,-CH=CHCH=CH-이다.
부타디엔디일 잔기(-CH=CH-CH=CH-) 및 테트라메틸렌 잔기[-(CH2)4-]가 바람직하다.
알케닐 잔기는 적어도 하나의 이중결합을 갖는 C2 내지 C5의 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소 잔기이다. 비닐잔기가 바람직하다. 디알킬포스피닐 기는 하기와 같다.
상기 식에서, 알킬은 상기한 바와 같다. 디메틸포스피닐 잔기가 바람직하다.
SO3H, PO3H2및 카르복시 잔기 염으로서 알칼리 또는 알칼리토염 또는 암모늄염이 사용될 수 있다. 알칼리토염은 리튬, 나트륨, 칼륨, 루비듐 및 세슘염으로 이해되며, 리튬, 나트륨 및 칼륨염 및 상기한 모든 나트륨 및 칼륨염이 바람직하다. 알칼리토염은 바륨, 마그네슘, 칼슘, 스트론튬 또는 바륨이 될 수 있따. 마그네슘 및 칼슘염이 바람직하며, 칼슘염이 특히 바람직하다. 치환되지 않은 암모늄 이온 NH4 +의 염이 암모늄염으로 사용될 수 있다. 그러나, 암모늄 이온은 1 내지 4개의 알킬, 아릴 또는 아르알킬 잔기로 치환된 암모늄염이 사용될 수도 있다. 상기에 주어진 정의가 메틸, 에틸 및 n-프로필이 알킬 잔기로서 특히 바람직한 잔기로 적용되며, 아릴잔기로서 페닐기가 특히 바람직하고, 아르알킬 잔기로서 벤질기가 특히 바람직하다.
카르복스아미도 잔기는 CONH2로 이해되며, 아미노기가 바람직하게는 하나 또는 수개의 히드록시, 카르복시 또는/ 및 알콕시카보닐 잔기를 수반하는 하나 또는 두 개의 알킬 잔기에 의해 치환되는 잔기이다.
R7및 R8이 상기의 포화 또는 불포화 사슬인 본 발명에 따른 화학식(Ⅱ)의 니트로조 화합물로 사용되는 것이 바람직하다. 이와 관련하여, 이 사슬이 불포화이고 이중결합 전자 및 불포화 사슬의 자유질소 전자쌍이 화학식(Ⅱ)의 N원자를 다리걸침이나 이중결합에 의해 컨쥬게이트된 경우가 특히 바람직하다.
바람직하게는 토우토머형이 또한 화학식(Ⅱ)의 물질로 이용될 수 있다. 이는 화학식(Ⅱ)에 나타낸 것들을 포함한다.
화학식(Ⅲ) 내지 (ⅩⅡ)의 니트로조 화합물 및 해당 토오토머형 및 그의 염이 바람직하다.
상기 식에서, X-Y는 상기한 바와 같으며, R9, R10, R11및 R12는 동일하거나 상이하며, 수소, 히드록시, 알킬, 알콕시, 알킬티오, 아르알킬, 아릴, 카르복시, 알콕시카보닐, 카르복스아미도, 시아노, 바람직하게는 하나 또는 수개의 히드록시, 카르복시 또는/ 및 알콕시카보닐 잔기를 수반하는 하나 이상의 알킬 잔기에 의해 치환되는 아미노기 또는 할로겐을 나타내며, 두 인접 잔기가 바람직하게는 차례로 아릴에 의해 치환되거나 아넬화되는 알킬렌을 형성하며, R은 알킬 또는 바람직하게는 히드록시, 카르복시, SO3H, PO3H2또는 디알킬포스피닐에 의해 치환될 수 있는 아르알킬을 나타낸다. 잔기의 정의는 화학식(Ⅱ)의 물질에 대해 주어진 것에 해당한다.
화학식(Ⅲ),(Ⅳ),(Ⅴ),(Ⅶ),(Ⅷ) 및 (Ⅸ)의 물질 및 해당 토오토머형 및 그 염이 본 발명에 따른 용도에 특히 바람직하다. 특히, X-Y가 N=CR6를 의미하고 R가 화학식(Ⅱ)에서 기재한 바와 같은 물질이 특히 바람직하다.
화합물 3-니트로조-2-메틸-피라졸-[1.5a]-피리딘, 3-니트로-피라졸로-[1.5a]-피리딘 및 3-니트로조-피라졸로-[3.2c]-s-트리아졸 및 그 염, 특히 염화수소가 본 발명에 따른 용도에 매우 적합한 것으로 나타났다.
상기한 바와 같이, 방향족 니트로조 화합물은 시험되는 샘플 및 본 발명에 따른 방법을 위한 PQQ-의존성 탈수소 효소와 접촉한다. EP-A-0 354 441 및 EP-A-0 441 222에 발색 커플링 시약 및 산화제를 사용하는 산화 커플링에 의해 차례로 검출될 수 있는 전자가 풍부한 방향족 아미노 화합물로 방향족 니트로조 화합물을 환원시키는 산화효소 및 비-NAD-의존성 탈수소화제를 개시하고 있다.
퀴노이드 이미노 화합물 및 PQQ-의존성 탈수소화제에 대한 비산화성 색깔 형성 검출제의 존재하에서, 방향족 니트로조 화합물은 분석물의 부수적인 산화에 의해 전기자 풍부한 아민으로 PQQ-의존성 탈수소화 효소 촉매 환원에 의해 완전히 환원되지 않으나, 부분적인 효소 환원 후 형성된 이미노 중간 생성물 대신 비산화성 색깔형성 검출제에 의해 포획 및 검출될 수 있다.
또한, 이미 발색 잔기를 수반하는 특정 방향족 니트로조 화합물이 선택될 때, 이러한 방향족 니트로조 화합물이 PQQ-의존성 탈수소화 효소의 존재하에서 유색의 이미노 화합물로 환원되나, 색깔형성 검출제에 의한 반응이 필요없이 분석물의 양을 측정함으로써 유색의 이미노 화합물 자체가 결정될 수 있도록 방향족 환원이 더 이상 필수적이지 않다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 적합한 발색 니트로조 화합물은 다음과 같다.
적합한 전자가 풍부한 방향족 니트로조 화합물은 매우 많지만, PQQ-의존성 탈수소 효소에 의해 직접 전자 수용체로서 모두 수용된다. 니트로조 작용기만이 전자가 풍부한 방향족 잔기에 결합되는 것이 필수적인 것으로 나타났다.
반응은 예로서 니트로조아닐린을 사용하는 하기의 반응도식에 의해 제시될 수 있다.
방향족 니트로조 화합물(1)은 분석물이 부수적으로 산화되면서 방향족 히드록시아민(2)으로 환원되고 자발적으로 물이 떨어져 나가면서 퀴노이드 이미노 중간 생성물(3)을 형성한다. 이는 방향족 아민으로 더 이상 효소 환원되기 전에, EP-A-0 354 441 및 EP-A-0 441 222에 공지된 바와 같이, 예컨대 커플링 시약(HR)에 의해 포획되고 유색의 커플링 생성물(4)로서 비색결정될 수 있거나 이미 출발 화합물(5)내의 커플링 생성물의 발색 잔기를 포함하고 따라서 효소 환원 후 유색의 이미노 화합물(4)로서 직접 비색결정될 수 있다.
특히, PQQ-의존성 탈수소 효소를 사용하며, 이미노 중간체(3)는 특히 본 발명에 따라 검출시약에 의해 특히 포획되거나 직접 검출되며, EP-A-0 354 441로부터 공지된 바와 같이 아민을 형성하도록 더 이상 효소 환원되지 않는다. 플라빈-의존성 산화효소가 사용될 때 EP-A-0 354 441에 따라 방향족 니트로조 화합물을 환원시키기 때문에, 아미노 중간체의 작은 부분만을 검출할 수 있을 뿐이며, 이미노 중간체의 주요부분은 분석물이 부수적으로 산화됨과 동시에 방향족 아민으로 신속하게 효소 환원된다.
이미노 화합물은 고유 색상에 의해 본 발명에 따라 검출된다.
퀴노이드 이미노 검출은 발색 비산화제를 이용하여 본 발명에 따라 이루어질 수 있다. 발색은 유색물질이 색깔 형성제와 최대 흡광도가 사용된 니트로조 화합물과 반응전의 색깔 형성제가 상이한 니트로조 이미노 화합물과의 반응에 의해 얻어지는 것을 의미한다. 비산화성 발색 검출제는 검출제가 검축되는 화합물과 반응하고, 검출되는 화합물상에 산화효과를 갖는 검출시약 없이 색깔을 형성하는 것을 의미한다(예컨대, 검출시약에 존재하는 부가적인 산화제에 의함).
본 발명에 따른 방법에 있어 형성되는 이미노 화합물은 이미노 화합물과 색깔-형성 커플링 시약의 반응에 의해 얻어질 수 있다. 이 공정에 있어서, 유색 물질은 그 구조와 별개로 이미노 화합물을 포함하여 얻어진다. 그러나, 검축은 이미노 화합물이 루코 염료 분자를 유색분자로 산화시켜 얻어진다.
검출되는 이미노 화합물 한 분자를 커플링제와 커플링시킴에 의한 검출방법은 이미노 화합물의 더 이상의 분자가 염료를 형성함에 의해 산화되는 무색의 루코 염료 분자를 형성하도록 검출될 수 있다.
이미노 화합물에 대한 이러한 종류의 많은 색깔 형성 검출제가 공지되어 있다. 예컨대, 원칙적으로 색깔을 형성하는 산화된 p-페닐렌디아민 유도체와 반응하는 모든 물질이 고려된다.
색깔-형성 커플링 검출제의 예에는 방향족 화합물, 바람직하게는 페놀 및 나프톨 화합물이 있으며, 우수한 이탈기로 치환되어 이러한 이틸기가 용이하고 매우 신속하게 색깔형성에 의해 검출되는 이미노 화합물에 의해 치환될 수 있다. 바람직한 실시예는 1-나프톨-4-술폰산, 2,4,6-트리브로모-3-히드록시벤조산 2,4-디클로로-1-나프톨, 타트라진 또는 오렌지 1 이다.
이미노 화합물에 결합하지 않고 이미노 화합물이 아민으로 환원되는 동안 유색의 화합물을 형성하는 이미노 화합물의 검출을 위한 본 발명에 따른 방법에 검출시약이 사용될 수 있다. 이는 루쿄 염료의 이량체화에 의해 일어난다. 적합한 루코 염료는 H2O2또는 과산화제의 검출방법으로부터 기술분야의 숙련자에게 공지되어 있다. 이러한 루코 염료의 예에는 1-나프틸아미노술폰산, 트리아릴이미다졸 디아리-이미다졸, 아미노카바졸 옥사졸, 티아졸 이 있다.
산화 환원 전위가 이미노 화합물을 환원시킬 수 있는 루코 염료가 적합하다.
최종적으로, 해당 방향족 아민으로 환원되는 이미노 화합물의 제 2 분자에 의해 염료를 형성하도록 단지 산화되는 이미노 화합물에 대한 커플링 성분으로서 시약을 사용함에 의한 루코 염료 산화화 커플링제에 의한 커플링 검출방법과를 결합시킬 수 있다. 색광학 분야에서 매우 잘 알려진 소위 가장 일반적인 커플링제는 페놀, 나프톨, 아닐린, 나프틸아민 및 그 유도체 및 활성 메틸렌 화합물이다. 이러한 유형의 커플링제는 하기 문헌에 제시되어 있다[T.H. James in The Theory of the Photographic Process 3th ed., Mc Millan, New York, chapter 17 on pages 385-390].
본 발명에 따른 방법은 시험되는 샘플이 PQQ-의존성 탈수소화 효소, 상기의 하나 또는 수개의 전자가 풍부한 방향족 니트로조 화합물 및 이미노 화합물에 대한 검출시약이 동시에 접촉되는 방식으로 수행된다. 샘플이 PQQ-의존성 탈수소화제에 의해 산화되는 분석물을 포함하는 경우, 방향족 니트로조 화합물이 반응하여 효소 환원에 의해 해당 이미노 화합물을 형성한다. 이는 색깔-형성 검출시약과 반응하여 형성되는 색깔이 샘플내의 분석물의 농도와 상관관계를 나타내게 된다. 색깔 측정은 색채 기준을 사용하는 시각적 수단에 의해 또는 광학적으로 직접 이루어진다.
분석물의 산화적 검출을 위한 특히 간단한 방법은 방향족 니트로조 화합물의 환원에 의해 형성되는 이미노 화합물이 스스로 색깔을 띠고 색깔-형성 검출제와의 커플링 또는 루코 염료의 산화에 의해 1차적으로 검출되어야 할 필요가 없을 때 제공된다. 상기한 바와 같이, 유색의 이미노 화합물은 색채 광학 및 검출분석법 분야의 숙련자에게 사실상 공지되어 있다.
화학식(ⅩⅢ)의 니트로조아닐린 화합물이 유색의 이미노 화합물의 직접 측정에 의한 분석물의 산화 검출을 위한 본 발명에 따른 방법에 대해 직접 발색 전자 수용체로서 특히 적합한 것으로 나타났으며, 이는 화학식(ⅩⅣ)의 유색의 퀴놀린 디이민으로 환원된다.
상기 식에서, R1은 수소, 히드록시, 할로겐, 알콕시, 알킬티오, 아릴옥시 또는 아릴티올, 바람직하게는 히드록시, 카르복시, PO3H2또는 SO3H에 의해 치환되는 알킬, 또는 바람직하게 히드록시, PO3H2디알킬포스피닐, SO3H 또는 카르복시에 의해 차례로 치환될 수 있는 알킬에 의해 바람직하게는 일회 또는 수회 치환되는 아미노기를 나타내며; X-Y는 NR5-CO 또는 N=CR6를 나타내며; R5및 R6는 화학식(Ⅱ)에서 의미하는 바와 같다.
A는 질소 또는 황원자 및 두 개의 탄소원자 또는 두 개의 질소원자 및 하나의 탄소원자로 이루어진 3원 포화 또는 불포화 사슬, 바람직하게는 상기의 해당 토오토머형 및 그들의 염을 나타내고, 탄소원자가 바람직하게는 알킬, 알콕시, 알킬티오, 히드록시, 아르알킬, 아릴, 카르복시, 카르복스아미도, 알콕시카보닐, 시아노, 할로겐, 바람직하게는 하나 또는 수개의 히드록시, 카르복시 또는/ 및 알콕시카보닐기를 수반하는 하나 또는 두 개의 알킬 잔기에 의해 치환된 아미노기에 의해 치화되며, 이중결합을 통해 결합하지 않은 질소원자가 알킬 또는 아르알킬 또는 디알킬포스피닐에 의해 치환되거나 아르알킬 또는 두 인접 사슬 치환체가 바람직하게는 차례로 바람직하게는 아릴에 의해 치환되거나 아넬화되는 알킬렌기를 형성하며; 분석물의 양을 측정하는 유색의 퀴놀린 디이민을 형성하도록 효소적으로 반응한다.
각각의 치환체는 이 경우 화학식(Ⅱ)의 화합물에서와 동일하다.
이 경우 R으로 바람직한 잔기는 수소 및 알킬이며, X-Y에 대해서는 작용기 N=CR6이다.
특히, A는 인접 헤테로 고리와 함께 이미다졸, 트리아졸, 벤즈이미다졸, 티아졸 또는 디히드로이미다졸 고리를 형성하며, 그의 탄소원자는 A의 일반적 정의에 있어 언급된 치환체를 수반할 수 있다. 이 경우, 이미다졸 고리가 특히 바람직하다.
특히 바람직한 화합물은 다음과 같다.
1) (2,4-디메틸-피라졸로-[1.5a]-이미다졸-3-일-(4-니트로조페닐)-아민
2) (4-메틸-피라졸로-[1.5a]-이미다졸-3-일)-(4-니트로조-페닐)-아민
3) (4-(디메틸포스피닐메틸)-2-메틸-피라졸로-[1.5a]-이미다졸-3-일)-(4-니트로조페닐아민)
5) (5,6-디히드로-4-디메틸포스피닐메틸-2-메틸-피라졸로-[1.5a]-이미다졸-3-일)-(4-니트로조페닐)-아민
6) (4-(디메틸포스피닐메틸-2-메틸-피라졸로-[1.5a]-이미다졸-3-일)-(4-니트로조페닐)-아민
7) 2,6-디메틸-4-디메틸포스피닐메틸-피라졸로-[3.2c]-s-트리아졸-3-일)-(4-니트로조페닐)-아민
본 발명에 따른 방법이 화학식(ⅩⅦ)의 유색 퀴논 디아민 화합물이 방향족 니트로조 화합물의 환원에 의해 직접 형성되는 경우, 시험되는 샘플은 화학식(ⅩⅥ)의 하나 또는 수개의 전자가 풍부한 방향족 니트로조 화합물과 PQQ-의존성 탈수소 효소와 자발적으로 접촉한다. 발색 전자 풍부 피라졸 고리에 응축된 고리 A에 전자가 부가적으로 풍부한 것은 더 이상 해당 아민으로 효소 환원되지 않으며, 대신, 유색의 퀴논 디이민 화합물이 흡광도 측정형으로 직접 측정될 수 있다. 발색 방향종 니트로조 화합물의 신속한 효소 환원을 달성하기 위하여, 충분히 용해가능할 때 특히 유용하다. 화학식(ⅩⅢ)의 발색 니트로조 방향족을 이용할 때 본 발명에 따른 방법에 특히 유용하며, 용액내의 그 농도가 적어도 10-3mol/l, 바람직하게는 적어도 10-2mol/l가 바람직하다.
친수성 작용기를 가진 발색 니트로조 화합물을 제공함으로써 특히 우숫한 용해도가 얻어질 수 있다.
본 발명에 따른 방법에 특히 적합한 최적의 발색성 니트로조 화합물은, 예컨대 상기 화합물 3, 4 및 7이다.
본 발명에 따른 방법에 소위 습식 시험, 예컨대, 쿠벳 또는 소위 필요한 시험 시약이 시험 담체, 특히 흡착물질 또는 스웰링할 수 있는 물질에 존재한다. 이러한 시험 담체는 예컨대, DE-A-3 247 608, EP-A-0 262 445 또는 EP-A-0 256 806 에 의해 공지되어 있다.
부가적으로, 본 발명은 청구범위에서 기재한 바와 같이 효소 산화에 의해 분석물을 비색결정하는 시약에 관한 것이다. 이러한 시약은 부가적으로 결정되는 분석물의 효소 산화에 필요한 PQQ-의존성 탈수소화 효소와 별도로, 그리고 분석물의 효소 산화되는 동안 방출된 PQQ/탈수소화 효소 시스템으로부터 전자를 수용하는 직접 전자 수용체로서 적어도 하나의 방향족 니트로조 화합물과 별도로 이미노 화합물에 대한 색깔 형성 비-산화성 검출제를 포함한다.
PQQ 탈수소화 효소, 방향족 니트로조 화합물 및 퀴노이드 이미노 화합물에 대한 발색성 검출시약으로서 본 발명에 따른 방법에 대한 상기의 물질들이 사용된다. 화학식(ⅩⅢ)의 전자가 풍부한 방향족 니트로조 화합물이 미리 아닐린 질소에 결합된 발색성 잔기를 포함하는 본 발명에 따른 방법에 사용되는 경우, 환원반응중에 형성된 화학식(ⅩⅣ)의 퀴논 디이민이 이미 착색되기 때문에 이미노 화합물에 대한 색깔 형성 검출제를 포함하지 않는다.
특히, 사용된 효소 및 이미노 화합물에 대한 검출시약에 의존하는 과정에 대한 적합한 pH값을 유지하기 위하여, 본 발명에 따른 시약은 버퍼 시스템을 포함한다. 사약은 바람직하게는 4 내지 9의 시험용액내에서 pH를 설정하는 버퍼시스템을 포함한다. 5 내지 6.5의 약산성 pH값이 특히 바람직하다.
본 발명에 따른 시약은 흡수성 담체 또는 스웰링할 수 있는 것으로 되거나 용액형으로 존재할 수 있다. 용액형의 경우, 시약이 바람직하게는 본 발명에 따른 방법에 대해 필수적인 모든 시약을 포함한다. 물 및 예컨대 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 디메틸포름아미드와 같은 수용성 유기 용매와의 혼합물이 용매로서 고려 될 수 있다. 안정성 때문에 사실상 시험될 때까지 혼합되지 않는 두 개 또는 수개의 용액으로 시험에 필요한 시약을 분리하는 것이 바람직한 것이다. 그러나, 방향족 니트로조 화합물 및 이미노 화합물에 대한 검출시약이 시험이 시작되기전에 용액내에 존재하는 것을 주의하는 것이 합당하다. 사용되는 방향족 화합물의 농도는 측정된 분석물의 농도에 의존한다.
본 발명에 따른 방법에 있어서 측정되는 분석물의 전형적인 농도는 10-6내지 10-2mol/l 및 특히, 10-5내지 10-3mol/l 이다. 따라서, 사용된 니트로조 화합물의 전형적인 농도는 10-4내지 10-1mol/l이다. 발색성 니트로조 화합물의 농도 및 특히 10-3mol/l이상의 화학식(Ⅳ)의 발색성 니트로조 화합물이 충분히 신속한 효소 환원반응이 일어나기 위하여 특히 바람직하다. 사용되는 PQQ-의존성 탈수소화 효소는 활성 및 분석물의 농도에 의존한다. 쿠벳 시험에서의 효소농도에 대한 전형적인 값은 1mU/ml-1U/ml이다.
이미노 화합물에 대한 검출시약은 적어도 사용된 화합물에 대한 화학량론적인 비율, 바람직하게는 1.5-2배 초과량으로 사용된다.
본 발명에 따른 시약은 또한 시험 스트립형으로 존재할 수도 있다. 이러한 시험 스트립은 여러 실시예, 예컨대, EP-A-0 016 387, DE-A-3247608, EP-A-0 262 806 에 의해 공지되어 있다. 시험 스트립에 있어, 결정방법을 수행하기 위해 필요한 시약은 고체 담체층상에 존재한다.
흡수 및/또는 스웰링할 수 있는 물질이 시험될 샘플 액체에 의해 습윤되는 담체층으로써 고려될 수 있다. 예컨대, 젤라틴, 셀룰로오스 또는 건축용 섬유질 플리스가 있다. 시약은 이러한 운반체 물질상에 고체형으로 존재한다. 샘플 액체가 시험 스트립에 적용되고 시험 스트립이 샘플 액체내에 담지될 때, 액체 환경은 검출 반응이 일어나는 스트립내에 형성된다. 반응에 의해 발생된 색깔 형성은 가시적으로 또는 예컨대, 광학회절에 의해 광학적으로 평가된다.
시험 스트립상의 개별적인 시약의 바람직한 농도는 다음과 같다.
분석물 10-4내지 10-1M
니트로조 화합물 10-3내지 1M
비-산화성 검출제 10-3내지 1M
효소 시험 영역당 0.1 내지 100U
본 발명은 전자 수용체의 환원에 디아포르아제 또는 메틸펜아지움-메토술페이트와 같은 비특이성 환원촉매가 필요하지 않으며, 대신 그 환원반응이 특이성 분석물/효소 시스템에 의해 직접 이루어지는 이점을 갖는다. 전자 수용체로서 니트로조 화합물을 사용함으로서, 예컨대, 전자 수용체로서 산소가 사용되는 경우와 같이 너무 느린 확산에 의한 전자 수용체의 한계가 더 이상 발생하지 않는다. 검출되는 이미노 중간체 당량당 분석물 1당량만이 환원된다. 이는 분석물 검출의 감도를 높게한다. 색깔 형성제와의 반응에 더 이상의 산화제가 필요하지 않다. 따라서, 전제 검출반응은 같은 용액내에서 1단계로 방해없이 수행된다. 사용될 수 있는 광범위한 발색성 검출시약은 컬럼사진 분야에 공지되어 있는 것을 포함하며, 이는 측정이 수행되는 파장 및 측정의 감도를 결정하는 흡광 계수를 거의 자유롭게 선택할 수 있게 한다.
본 발명에 따른 방법은 특히 유색의 이미노 화합물이 직접 형성되고 발색제와의 반응이 불필요하게 돌 때 특히 용이하게 수행된다.
본 발명은 부가적으로 화학식(ⅩⅢ)의 신규한 발색성 니트로조아닐린 화합물에 관한 것이다.
[상기 식에서, R1은 수소, 히드록시, 할로겐, 알콕시, 알킬티오, 아릴옥시 또는 아릴티올, 바람직하게는 히드록시, 카르복시, PO3H2또는 SO3H에 의해 치환되는 알킬, 또는 바람직하게 히드록시, PO3H2, 디알킬포스피닐, SO3H 또는 카르복시에 의해 차례로 치환될 수 있는 알킬에 의해 바람직하게는 일회 또는 수회 치환되는 아미노기를 나타내며; X-Y는 NR5-CO 또는 N=CR6를 나타내며; R5는 수소, 바람직하게는 히드록시, 카르복시, SO3H, PO3H2, 디알킬포스피닐에 의해 치환된 알킬을 나타내며; R6는 수소, 알킬, 알케틸, 알콕시, 알킬티오, 아릴, 아릴티오, 아르알킬(각각이 바람직하게는 히드록시, 카르복시, SO3H, PO3H2,이러한 산성 잔기중 하나의 염 또는/ 및 알콕시카보닐로 치환될 수 있음), 또는 바람직하게는 하나 또는 수개의 히드록시, 카르복시 또는/ 및 알콕시카보닐기를 수반하는 하나 또는 두 개의 알킬 잔기에 의해 치환되며, 아미노기가 두 개의 알킬잔기에 의해 치환되는 경우, 이 잔기가 아미노기의 N원자 이외에 바람직하게는 산소, 황 또는 더 이상의 질소원자에 의해 차단될 수 있는 고리를 형성하도록 결합될 수 있거나, 또는 바람직하게는 하나 또는 두 개의 아실기, 알콕시 또는/ 및 아르알콕시카보닐기, H2N-CO, 알킬, 아르알킬 또는/ 및 아릴카바모일기에 의해치환될 수 있는 아미노기, 또는 카르복시, 알콕시카보닐, 카르복스아미도 또는 할로겐을 나타내며, A는 질소 또는 황 및 두 개의 탄소 또는 두 개의 질소 및 하나의 탄소로 이루어진 3 원 포화 또는 불포화 사슬, 바람직하게는 상기의 해당 토오토머형 및 그들의 염을 나타내며, 이 경우 탄소원자가 바람직하게는 알킬, 알콕시, 알킬티오, 히드록시, 아르알킬, 아릴, 카르복시, 카르복스아미도, 알콕시카보닐, 시아노, 할로겐, 바람직하게는 알킬, 알콕시, 알킬티오, 히드록시, 아르알킬, 아릴, 카르복시, 카르복스아미도, 알콕시카보닐, 시아노, 할로겐, 바람직하게는 하나 또는 수개의 히드록시, 카르복시 또는/ 및 알콕시카보닐기를 수반하는 하나 또는 두 개의 알킬 잔기에 의해치환된 아미노기에 의해 치환되며, 이중결합을 통해 결합하지 않은 질소원자가 알킬 또는 아르알킬 또는 디알킬포스피닐에 의해 치환되거나 아르알킬 또는 두 인접 사슬 치환체가 바람직하게는 차례로 바람직하게는 아릴에 의해 치환되거나 아넬화되는 알킬렌기를 형성한다.]
각 치환체의 의미는 화학식(Ⅱ)의 화합물에서와 동일한 의미를 갖는다.
바람직한 잔기 R1은 수소 및 치환 또는 치환되지 않은 알킬기이다. X-Y는 바람직하게는 N=CR6를 형성하며, R6는 바람직하게는 수소 또는 치환 또는 치환되지 않은 알킬이다.
인접하는 헤테로 고리와 함께 A가 이미다졸, 트리아졸, 벤즈이미다졸, 티아졸 또는 고리 치환체가 화학식(Ⅲ)에 해당하는 디히드로이미다졸을 형성할 때 특히 바람직하다.
A가 이미다졸 고리를 형성할 때 특히 바람직하다. 특히 바람직한 화합물은 다음과 같다 :
1) (2,4-디메틸-피라졸로-[1.5a]-이미다졸-3-일)-(4-니트로조페닐)-아민
2) (4-메틸-피라졸로-[1.5a]-이미다졸-3-일)-(4-니트로조-페닐)-아민
3) (4-(디메틸포스피닐메틸)-2-메틸-피라졸로-[1.5a]-이미다졸-3-일)-(4-니트로조페닐아민)
5) (5,6-디히드로-4-디메틸포스피닐메틸-2-메틸-피라졸로-[1.5a]-이마다졸-3-일)-(4-니트로조페닐)-아민
6) (4-(디메틸포스피닐메틸-2-메틸-피라졸로-[1.5a]-이미다졸-3-일)-(4-니트로조페닐)-아민
7) 2,6-디메틸-4-디메틸포스피닐메틸-피라졸로-[3.2c]-s-트리아졸-3-일)-(4-니트로조페닐)-아민
본 발명에 따른 화학식(ⅩⅢ)의 화합물은 하기 참고문헌에 의해 방법으로 제조된다[J.T. Hays et al., in J. Org. Chem. 32, 158(1967)]. 이를 위해 p-니트로조페놀 유도체의 에테르 및 바람직하게는 메틸 에테르가 수소 촉매하에서 적합한 3-아미노-헤테로 고리와 반응한다. 화학식(ⅩⅢ)의 2차 아민은 메톡시기의 치환에 의해 형성된다.
사용되는 헤테로 아릴아민은 참고문헌에 기재된 바와 같거나, 공지방법과 유사하게 제조된다. 특히, 기본 골격 블록으로서 피라졸로 헤테로 고리를 포함하는 아미노 화합물의 EP-A-0 433 854에 기재되어 있다.
중간 생성물로서 필요한 아미노 화합물은 안정성 때문에 강산염, 예컨대 광산염으로서 존재한다. 아미노 화합물의 자유 염기는 예컨대, 염을 물에 용해시키고 pH8내지 10 미만의 염기를 가하고, 에틸 아세테이트 또는 염화 메틸렌과 같은 유기 용매로 자유 염기를 추출하는 종래의 방법에 의해 얻어지는 p-니트로조아니졸과의 반응에 사용된다. 또는, 특히 아미노 화합물이 추출되기 어려운 경우, 하기의 과정을 사용할 수 있다 : 아미노 화합물을 메탄올에 용해시키고, NaHCO3용액, 트리에틸아민 등과 같은 염기가 메탄올 용액의 pH가 습식pH종이에서 약 5 내지 6이 될 때까지 가한다. 차례로 제 2의 반응 상대, p-니트로조아니졸을 가한다.
[실시예 1]
PQQ-의존성 글루코스-염료 산화환원 효소 및 커플링제로서 1-나프톨-술폰산을 사용하는 글루코스의 정량 하기의 화합물을 쿠벳내에서 혼합한다. :
시트르산염 버퍼/피로인산염 버퍼(50mM) pH 7.5 0.38ml
N,N-비스(2-히드록시에틸)-4-니틀조아닐린(버퍼내 5mM) 0.40ml
커플링제로서 1-나프톨-4-술폰산(H2O 내 10mM) 0.20ml
샘플 용액(0-40mM 글루코스) 0.01ml
시험은 0.01ml 효소 용액(글루코스 염료 산화환원 효소, EC 1.1.99.17, 900U/ml, 800U/ml)의 첨가에 의해 시작된다. 일정한 흡광도가 최대 5분 후에 얻어진다(제1도).
[실시예 2]
PQQ-의존성 글루코스 염료 산화환원 효소 및 검출제로서 2,4,6-트리브로모-3-히드록시벤조산을 사용하는 글루코스의 검출
측정 혼합물(최종 농도)
100mM 시트르산 버퍼 pH 5.8
10mM 2,4,6-트리브로모-3-히드록시벤조산
1mM N,N-비스-(2-히드록시에틸)-4-니트로조아닐린
10U/ml 글루코스 염료 산화환원 효소
0.1M 질산 나트륨
100-500mM 글루코스
녹색 염료의 증가하는 형성이 증가하는 농도로 나타났다(max.=700nm, 제2도).
[실시예 3]
표 1에 나타낸 아민에 대해 다른 커플링 시약을 동일한 방식으로 사용한다. 표 1은 나열된 커플링제에 의해 N,N-비스-(2-히드록시에틸)-p-퀴논디아민을 커플링시킨 후 얻어지는 최대 흡광도를 나타낸다.
[실시예 4]
표 2에 나열된 여러 전자가 풍부한 방향족 니트로조 화합물이 실시예 1과 유사하게 사용된다. 표 2는 1-나프톨-2-술폰산 또는 1-나프톨-4-술폰산과의 커플링후 얻어지는 색깔 및 최대 흡광도를 나타낸다.
[실시예 5]
PQQ-의존성 글루코스 염료 산화환원 효소와 글루코스 산화효소 사이의 환원 커플링에 의한 이미노 화합물 검출에 의한 글루코스 정량의 비교
하기 화합물을 쿠벳에 넣는다 :
100mM 인산염 버퍼 pH 7.5
1mM N,N-비스-(2-히드록시에틸)-4-니트로조아닐린
10mM 1-나프톨-4-술폰산
100U/ml 글루코스 염료 산화환원 효소
해당량의 색깔이 글루코스 첨가(0-60mM)에 의해 얻어진다(제 3 도).
글루코스 염료 산화환원 효소가 동일량의 글루코스 산화효소에 의해 대체되는 경우, 생성되는 색깔의 정도는 8배 더 낮으며, 이는 형성되는 퀴논 디이민 중간체가 글루코스 산화효소에 의해 더 환원되어 글루코스를 소비하면서 페닐렌디아민을 형성하기 때문이다(제4도).
[실시예 6]
유색의 이미노 화합물의 환원 형성에 의한 PQQ-의존성 글루코스 염료 산화환원 효소를 사용한 글루코스 정량
(3) 및 (3a)의 스펙트럼이 제5도에 나타나 있다.
측정 혼합물(최종 농도)
200mM 시트르산 버퍼 pH 6
1mM p-니트로조아닐린(표의 No.3)
1mM CaCl220U/ml 무타로타제
10U/ml 글루코스 염료 산화환원 효소
흡광도에서의 변화가 0 내지 50μM의 최종 농도의 다양한 량의 글루코스를 첨가한 후 5분을 측정한다(제6도).
표 3의 화합물이 유사하게 사용된다. 표 3은 사용된 니트로조 화합물 및 형성된 유색의 퀴논 디이민의 흡광도를 나타낸다.
[실시예 7]
방향족 니트로조 화합물로부터 유색의 이미노 화합물의 환원 형성에 의해 PQQ-의존성 글루코스 염료의 효소 활성 결정
실시예 6에 개시된 반응은 PQQ-의존성 탈수소화 효소의 효소 활성을 측정하는데 사용할 수 있다.
측정 혼합물(최종 농도)
200mM 시트르산 버퍼 pH 5.8
1mM 실시예 6으로부터 p-니트로조아닐린(3)
1mM CaCl2
30mM 글루코스
역학적 측정은 0-1mM 글루코스 염료 산화환원 효소에 의해 개시되며, 색깔에 있어서의 변화가 시간에 대해 측정된다(제7도)
[실시예 8]
4-(디메틸포스피닐메틸)-2-메틸-피라졸로-[1.5a]-이미다졸-3-일)-(4-니트로조페닐)-아민(3)
13.7g의 3-아미노-2-메틸-4-(디메틸포스피닐메틸)-피라졸로-[1.5a]-이미다졸 디히드로클로라이드롤 350ml의 메탄올에 용해시킨다. 용액을 약 5℃로 냉각시키고 농축된 중탄산 나트륨 수용액을 pH가 습식 pH 종이에서 약 6을 나타낼 때까지 가한다. 35ml 메탄올내의 p-니트로조아니졸 7.8g 용액을 30분내에 적가한다. 혼합물을 4시간동안 실온에서 교반시키고 더 많은 NaHCO3를 가하여 pH값을 6으로 유지시킨다.
반응 혼합물을 여과하고 약 150ml의 실리카 겔과 혼합한 후, 건조상태까지 증발시킨다. 실리카 겔을 실리카 겔 컬럼에 충전하고 생성물을 톨루엔/메탄올 2 : 1로 용리하여 분리한다. 10.3g의 흑갈색 부분을 얻어 염화 메틸렌/메탄올 12 :1로 실리카 겔에서 다시 크로마토그래피한다. 목적 화합물 4.9g이 얻어진다(분해 Fp. 204℃).
Rf(실리카 겔)톨루엔 메탄올 2 : 1=0.3
CH2Cl2/메탄올 12 : 1=0.21
출발 생성물의 생산
a) 4-디메틸포스피닐메틸-2-메틸-피라졸로-[1.5a]-이미다졸
2-메틸-피라졸로-[1.5a]-이미다졸(J. Het. Chem. 10, 441 91973) 37g을 건조한 디메틸포름아미드 370ml내에 용해시키고 54.2g의 클로로메틸디메틸포스판옥사이드 및 119g의 탄산 칼륨과혼합시킨다. 혼합물을 115℃에서 10시간동안 교반시킨다(반응조 온도). 침전물을 흡입여과시키고 여액을 증발에 의해 농축시킨다. 잔여물을 실리카 겔(유동상 용매 에틸 아세테이트/메탄올 2 : 1)에서 크로마토그래피시킨다. 전체 36.6g의 목적 화합물이 갈색 결정 및 갈색 오일로 얻어진다.
TLC(실리카 겔, 에틸 아세테이트/메탄올 2 : 1) Rf=0.2
b) 3-아미노-4-디메틸포스피닐메틸-2-메틸-피라졸로-[1.5a]-이미다졸×2HCl
상기에서 얻어진 화합물 18g을 농축 염산 25ml와 물 50ml에 용해시킨다. 25ml 물에 질산 나트륨 6.2g을 용해시킨 용액을 0℃에서 적가한다. 0℃에서 30분후 중탄산 나트륨 용액을 가하여 용액을 약 알칼리성으로 하고, 21.4g 디티온화나트륨을 부분적으로 가한다. 혼합물을 30분 더 교반시키고 100ml 디옥산내의디-tert-부틸디카보네이트 17g 용액과 혼합한다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반시키고 디옥산을 증류에 의해 제거하고 잔여물을 n-부탄올/에틸 아세트산염 3 : 1로 수회 추출한다. 유기상을 건조 및 증발시켜 남은 잔여물을 HCl로 포화된 320ml 메탄올에 용해시킨다. 2시간동안 더 교반시키고, 얼음조에서 냉각시키며, 침전된 결정을 여과시킨다. 전체 18.1g의 목적 화합물을 얻는다.
TLC(실리카 겔, 톨루엔/메탄올 3 : 1) Rf=0.1
[실시예 9]
(4-니트로조페닐)-2-메틸-(4-술포프로필-피라졸로-[1.5a]-이미다졸-3-일)아민(4)
3-아미노-4-술포프로필-피라졸로-[1.5a]-이미다졸을 실시예 7과 유사하게 메탄올내의 p-니트로조아닐린과 반응시킨다. 반응 혼합물을 여과시키고, 여과물을 증발에 의해 농축시킨다. 잔여물을 톨루엔/메탄올 2 : 1을 사용하여 실리카 겔에서 크로마토그래피한다. 생성물을 더 정제시키기 위해 흡수 수지 HP 20SS(미쯔비시 컴패니)에 의해 컬럼에 적용하고, 메탄올/물 1 : 9 내지 2 : 8의 단계적인 정도로 용리시킨다. 생성물을 포함하는 부분을 수집, 농축하고 소량의 에탄올에 취한 후, 에테르를 가하여 침전물을 침전시킨다. 갈색 분말형으로 목적 생성물이 얻어진다.
TLC(실리카 겔, 에탄올 : Rf=0.6, 이소프로판올/부틸 아세테이트/물 5 : 3 : 2 Rf=0.48)
출발 생성물의 제조
a) 2-메틸-4-술포프로필-피라졸로-[1.5a]-이미다졸
2-메틸-피라졸로-[1.5a]-이미다졸은 pH 2-5-에서 일반적인 디아조화에 의해 아닐린으로부터 제조된 페닐디아조늄염과 반응한다. 얻어진 2-메틸-3-페닐아조-피라졸로-[1.5a]-이미다졸(5.6g)을 60ml 디메틸포름아미드에 용해시키고 3.4g의 프로판술폰 및 7g의 탄산 칼륨과혼합한다.
혼합물을 110℃에서 6시간동안 교반시키고 프로판술폰 5g 및 탄산 칼륨 7g을 다시 가하며, 8시간동안 110℃에서 교반시킨다. 냉각후, 여과시키고 잔여물을 메탄올로 두번 세척한다. 용액을 농축시키고 잔여물을 실리카 겔에서 크로마토그래피하여 분리한다(유동 용매 : 에틸 아세테이트/메탄올/물 75 : 15 :10).
수율 : 5.3g 황갈색 결정
TLC(실리카 겔, 에틸 아세테이트/메탄올/물 75 : 15 : 10) Rf=0.3
b) 3-아미노-2-메틸-4-술포프로필-피라졸로-[1.5a]-이미다졸
상기와 같이 얻어진 아조 화합물 4.3g을 아세트산 40ml의 빙초산에 용해시키고, 4g의 아연 분말이 1시간 내에 부분적으로 가해진다. 혼합물을 30분동안 더 교반시키고 흡인여과시킨 후 증발시킨다. 잔여물을 30ml 에틸 아세테이트로 적정하고 흡입여과하며,여과액을 버린다. 더 처리하여 충분히 순수한 10.2g의 회갈색 분말을 얻는다.
TLC(실리카 겔, 에틸 아세테이트/아세톤/빙초산/물 5 : 2 : 2 : 1) Rf=0.14
[실시예 10]
표 4의 화합물은 실시예 8 또는 9와 유사하게 생성된다. 아미노 출발 화합물을 하기와 같이 수행한다.
a) 표 4의 5에 대한 출발 화합물을 제조 :
3-아미노-5,6-디히드로-4-디메틸포스피닐메틸-2-메틸-피라졸로-[1.5a]-이미다졸
2-메틸-피라졸로-[1.5a]-이미다졸린 3.9g, 아세트산 나트륨 2.7g 및 p-메톡시벤젠디아조늄 테트라플루오로보레이트 7.4g을 빙초산 40ml에 용해시키고 용액을 40-50℃로 1시간동안 가열한다. 반응 혼합물을 증발시키고, 잔여물을 NaHCO3용액 및 에틸 아세테이트에 취한다. 에틸 아세테이트로 추출하고 건조 및 증발 농축시킨다. 잔여물을 실리카 겔에서 크로마토그래피에 의해 정제한다(유동 용매：에틸 아세테이트/리그로인 1：1-2：1; 에틸 아세테이트; 에틸 아세테이트/메탄올 95：5). 이미다졸린 고리의 질소에 클로로 메틸 디메틸포스판옥사이드로 알킬화된 해당 3-아조 4.12g을 얻는다(TLC：실리카 겔, 에틸 아세테이트/메탄올 95：5; Rf=0.5). 3-아미노 화합물로의 전환은 아조기의 환원에 의해 실시예 8b와 유사하게 수행된다.
분리 및 정제를 위해, 조악한 아미노 화합물이 소량의 물에 용해되며, 고체 중탄산 나트륨과 혼합되며, 디옥산에서의 3배 몰량의 디-tert-부틸디카보네이트 용액이 가해진다. 혼합물을 밤새 교반시키고, 증발시키며, 부생성물을 제거하기 위해 에테르로 추출하며, 생성물을 분리하기 위해 염화 메틸렌으로 5번 추출한다. 얻어진 결정 t-부톡시카보닐 화합물(TLC：에틸 아세테이트/아세톤/빙초산/물 50：25：12：5：12：5, Rf=0.5)을 tert-부톡시카보닐기를 분해하기 위해 50ml 메탄올 염산에 용해시킨다. 실온에서 1시간 후, 부피가 반이 되도록 농축시키고 생성물을 에테르로 침전시킨다. 목적 화합물이 염화수소로서 얻어진다.
TLC：n-부탄올/빙초산/물 2：1：, Rf=0.3
b) 표 4의 6에 대한 출발 화합물의 제조：
3-아미노-4-디메틸포스피닐메틸-2-메틸-피라졸로-[1.5a]-벤즈이미다졸
목적 화합물은 2-메틸-피라졸로-[1.5a]-벤즈이미다졸( J. prakt. chem. 326, 829(1984)과 페닐디아조뉴 염의 반응, 클로로메틸-디메틸포스판옥사이드와의 N-알킬화 반응 및 빙초산에서의 아연과의 아조기의 환원반응에 의해 실시예 10과 유사하게 얻어진다. 목적화합물은 Fp. 192(분해)의 삼염화수소-이수화물로서 얻어진다.
TLC(실리카 겔, 이소프로판올/부틸 아세테이트/물 50：30：20) Rf=0.38
c) 표 4의 7에 대한 출발 화합물의 제조 :
3-아미노-2,6-디메틸-4-디메틸포스피닐-피라졸로-[3.2c]-s-트리아졸
6g의 2,6-디메틸-4-디메틸포스피닐-피라졸로-[3.2c]-s-트리아졸을 65ml 디메틸포름아미드내에 용해시키고 용액을 3.9g의 클로로메틸-디메틸포스판옥사이드 및 8g의 탄산 칼륨과 혼합한다. 혼합물을 100℃에서 2시간동안 교반시키고, 뜨거울 때 흡입여과시키고 여과물을 증발에 의해 농축시킨다. 잔여물을 실리카 겔에서 크로마토그래피한다(유동 용매：에틸 아세테이트/메탄올 4：1), 비누화 및 탈카르복실화를 위해 환류하에선 농축 염산으로 생성물을 7시간동안 가열시킨다. 반응 혼합물을 증발시킨다. 담갈색 오일이 얻어진다.
TLC(실리카 겔：에틸 아세테이트/메탄올 2：1) Rf=0.37
얻어진 생성물의 3-아미노 화합물로의 전환은 해당 3-아미노피라졸로-[1.5a]-이미다졸에 대해 실시예 8에서 기재한 방법(8b)와 유사하게 행해진다. 목적 화합물은 Fp. 225℃(분해)의 염화수소로서 얻어진다.
TLC(실리카 겔 에틸 아세테이트/메탄올 3：1) Rf=0.2

Claims (25)

  1. 전자가 풍부한 방향족 니트로조 화합물의 작용기로부터의 직접 전자 수용체의 존재하에서, 산화환원 효소에 의해 분석물을 효소산화시킴으로써 분석물을 비색결정하고, 분석물 양의 측정으로서 색깔 형성에 의해 환원된 전자 수용체를 정량하는 방법으로서, PQQ-의존성 탈수소 효소의 존재항서, 부수되는 분석물의 산화에 의해 전자가 풍부한 방향족 니트로조 화합물의 이미노 화합물로 환원되며, 이것이 더이상 방향족 아민으로 효소환원되지 않으면서 색깔이 형성됨으로써 검출되는 분석물 비색결정방법.
  2. 제1항에 있어서, 이미노 화합물이 비산화성 발색 검출제와의 반응에 의해 비색결정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 일반식(I)의 화합물이 방향족 니트로조 화합물로 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
    [상기 식에서, R1은 수소, 히드록시, 바람직하게는 히드록시, COOH, PO3H2또는 SO3H로 치환된 알킬, 알콕시, 알킬티오, 아릴옥시, 아릴티오, 할로겐 또는 바람직하게는 히드로시, PO3H2, 디알킬포스피닐, SO3H 또는 CO2H로 치환된 알킬에 의해 일회 또는 수회 치환된 아미노기를 나타내며; R2는 히드록시기, 알콕시, 아릴옥시, 아릴티오 또는 알킬기가 바람직하게는 히드록시기, 알콕시기 또는 바람직하게는 알킬, PO3H2, SO3H 또는 CO2H 또는 암모늄, 알칼리 또는 알칼리토염과 같은 염의 형태로 일회 또는 수회 치환된 아미노기에 의해 차례로 치환된 알킬티오기, 또는 아미노기 NR3R4를 나타내며; R3및 R4는 동일하거나 상이하며, 수소 또는 차례로 히드록시, 알콕시, 히드록시 알콕시, 또는 바람직하게는 히드록시, PO3H2, SO3H, COOH 또는 염의 형태로 치환되거나 바람직하게는 알킬에 의해 일회 또는 수회 치환된 아미노기에 의해 치환된 폴리알콕시기에 의해 치환될 수 있는 폴리알콕시알킬 잔기에 의해 치환될 수 있는 아릴 또는 알킬기이거나, R3및 R4는 바람직하게, 산소, 황 또는 질소에 의해 차단되며, 질소가 각각 바람직하게는 알킬 부분의 히드록시 잔기에 의해 차례로 치환될 수 있는 알킬, 히드록시알킬, 히드록시알콕시알킬, 알콕시히드록시 알킬 또는 폴리알콕시알킬기에 의해 치환되는 알킬렌기이거나, 또는 R1이 NR3R4에 대해 오르토 위치인 경우, R3및 R4는 R1과 함께 알킬렌 잔기를 나타낸다.]
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 일반식(II)의 화합물이 방향족 니트로조 화합물로서 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
    [상기 식에서, X-Y는 NR5-CO 또는 N=CR6를 나타내며; R5는 수소, 바람직하게는 히드록시, 카르복시, SO3H, PO3H2, 디알킬포스피닐기에 의해 치환된 알킬을 나타내며, R6는 수소, 바람직하게는 히드록시, 디알킬포스피닐, 카르복시, SO3H, PO3H2이들 산성 잔기중 하나의 염 또는/및 알콕시카보닐에 의해 치환될 수 있는 알킬, 알케닐, 알콕시, 알킬티오, 아릴, 아릴티오, 아르알킬, 또는 하나 또는 수개의 히드록시, 카르복시 또는/및 알콕시카보닐 잔기를 수반하는 하나 또는 두개의 알킬 잔기에 의해 치환되며, 아미노기가 두개의 알킬기로 치환되는 경우, 아미노기의 N워자 이외에 바람직하게는 산소, 황 또는 더 이상의 질소원자에 의해 차단될 수 있는 고리를 형성하도록 결합될 수 있거나, 또는 바람직하게는 하나 또는 두개의 아실기, 알콕시 또는/및 아르알콕시카보닐기, H2N-CO, 알킬, 아르알킬, 또는/및 아릴카바모일기에 의해 치환될 수 있는 아미노기, 또는 카르복시, 알콕시카보닐, 카르복스아미도 또는 할로겐을 나타내며; R7는 바람직하게는 히드록시, 카르복시, SO3H, 디알킬포스피닐 또는 PO3H2에 의해 치환되는 알킬, 티오알킬 또는 아르알킬, 또는 바람직하게는 히드록시, 카르복시, SO3H, 디알킬포스피닐 또는 PO3H2에 의해 차례로 치환될 수 있는 하나 또는 두개의 알킬기에 의해 치환되는 아미노기를 나타내고, 적어도 R6및/또는 R7가 아미노기를 나타내며; R8는 바람직하게는 히드록시, 카르복시, SO3H 또는 PO3H2에 의해 치환될 수 있는 알킬 또는 아르알킬을 나타내며; 또는 R7및 R8은 바람직하게는 하나 또는 수개의 질소 또는 황원자의 질소원자 또는 탄소원자의 3 또는 4원 포화 또는 불포화 사슬, 바람직하게는 상기 해당 토오토머형 및 그들의 염을 나타내며; 이 경우, 탄소원자가 바람직하게는 알킬, 알콕시, 알킬티오, 히드록시, 아르알킬, 아릴, 카르복시, 카르복스아미도, 알콕시카보닐, 시아노, 할로겐, 바람직하게는 하나 또는 수개의 히드록시, 카르복시 또는/및 알콕시카보닐 잔기를 수반하는 하나 또는 두개의 알킬 잔기에 의해 치환된 아미노기에 의해 치환되며, 이중결합을 통해 결합하지 않은 질소원자가 알킬 또는 아르알킬 또는 디알킬포스피닐에 의해 치환되거나 아르알킬 또는 두 인접 사슬 치환체가 바람직하게는 차례로 바람직하게는 아릴에 의해 치환되거나 아넬화되는 알킬렌기를 형성한다.]
  5. 제4항에 있어서, 방향족 니트로조 화합물로서 R7및 R8이 포화 또는 불포화 사슬을 형성하는 화합물이 이용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제3항에 있어서, 방향족 니트로조 화합물로서 일반식 III-XII의 화합물이 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
    [상기 식에서, R9, R10, R11및 R12는 동일하거나 상이하며, 수소, 히드록시, 알킬, 알콕시, 알킬티오, 아르알킬, 아릴, 카르복시, 알콕시카보닐, 카르복스아미도, 시아노, 바람직하게는 하나 또는 수개의 히드록시, 카르복시 또는/및 알콕시카보닐 잔기를 수반하는 하나 또는 두개의 알킬 잔기에 의해 치환되는 아미노기 또는 할로겐을 나타내며, 두 인접 잔기가 바람직하게는 차례로 아릴에 의해 치환되거나 아넬화되는 알킬렌을 형성하며, R13은 알킬 또는 바람직하게는 히드록시, 카르복시, SO3H, PO3H2또는 디알킬포스피닐에 의해 치환될 수 있는 아르알킬을 나타낸다.]
  7. 제2항에 있어서, 비산화성 발색 검출제가 이미노 화합물에 대한 커플링 시약으로 사용됨을 특징으로 하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 페놀, 나프톨, 아닐린 또는 나프틸아민 유도체가 커플링 시약으로 사용됨을 특징으로 하는 방법.
  9. 제7항에 있어서, 2,4,6-트리브로모-3-히드록시베조산, 2,4-디브로모-1-나프톨 또는 1-나프톨-4-술폰산이 커플링 시약으로 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제2항에 있어서, 류코 염료가 염료로 산화됨으로써 이미노 화합물이 검출되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 디아릴이미다졸, 트리아릴이미다졸 도는 나프틸아민이 류코 염로로 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1항에 있어서, 일반식(XIII)의 방향족 니트로조아닐린 화합물이 사용되며, 분석물의 양을 측정하는 유색의 퀴놀린 디아민을 형성하도록 효소반응하는 것을 특징으로 하는 방법.
    [상기 식에서, R1은 수소, 히드록시, 할로겐, 알콕시, 알킬티오, 아릴옥시 또는 아릴티올, 바람직하게는 히드록시, 카르복시, PO3H2또는 SO3H에 의해 치환되는 알킬, 또는 바람직하게는 히드록시, PO3H2다알킬포스피닐, SO3H 또는 카르복시에 의해 차례로 치환될 수 있는 알킬에 의해 바람직하게는 일회 또는 수회 치환되는 아미노기를 나타내며; X-Y는 NR5-CO 또는 N=CR6를 나타내며; R5는 수소, 바람직하게는 히드록시, 카르복시, SO3H, PO3H2, 디알킬포스피닐기에 의해 치환된 알킬을 나타내며, R6는 수소, 알킬, 알케닐, 알콕시, 알킬티오, 아릴, 아릴티오, 아르알킬(각각이 바람직하게는 히드록시, 카르복시, SO3H, PO3H2, 이러한 산성 잔기중 하나의 염 똔/및 알콕시카보닐로 치환될 수 있음), 또는 바람직하게는 하나 또는 수개의 히드록시, 카르복시 또는/및 알콕시카보닐기를 수반하는 하나 또는 두개의 알킬 잔기에 의해 치환되며, 아미노기가 두개의 알킬 잔기에 의해 치환되는 경우, 이 잔기가 아미노기의 N원자 이외에 바람직하게는 산소, 황 또는 더 이상의 질소원자에 의해 차단될 수 있는 고리를 형성하도록 결합될 수 있거나, 또는 바람직하게는 하나 또는 두개의 아실기, 알콕시 또는/및 아르알콕시카보닐기, H2N-CO, 알킬, 아르알킬, 또는/및 알릴 카바모일기에 의해 치환될 수 있는 아미노기, 또는 카르복시, 알콕시카보닐, 카르복스아미도 또는 할로겐을 나타내며; A는 질소 또는 황 및 두개의 탄소 또는 두개의 질소 및 하나의 탄소로 이루어진 3원 포화 또는 불포화 사슬, 바람직하게는 상기의 해당 토오토머형 및 그들의 염을 나타내며, 이 경우 탄소원자가 바람직하게는 알킬, 알콕시, 알킬티오, 히드록시, 아르알킬, 아릴, 카르복시, 카르복스아미도, 알콕시카보닐, 시아노, 할로겐, 바람직하게는 하나 또는 수개의 히드록시, 카르복시 또는/및 알콕시카보닐기를 수반하는 하나 또는 두개의 알킬 잔기에 의해 치환된 아미노기에의해 치환되며, 이중결합을 통해 결합하지 않은 질소원자가 알킬 또는 아르알킬 또는 디알킬포스피닐에 의해 치환되거나 아르알킬 또는 두 인접 사슬 치환체가 바람직하게는 차례로 바람직하게는 아릴에 의해 치환되거나 아넬화되는 알킬렌기를 형성한다.]
  13. 제12항에 있어서, A가 인접하는 헤테로사이클과 이미다졸, 트리아졸, 벤즈이미다졸, 티아졸 또는 디히드로이미다졸 고리를 형성하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 방향족 니트로조 화합물이 10-3mol/l 이상의 농도로 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제1항에 있어서, 클루코스 염료 산화환원 효소가 글루코스 정량을 위한 PQQ-의존 탈수소화제로서 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. PQQ-의존성 탈수소화 효소 및 전자가 풍부한 방향족 니트로조 화합물을 포함하는 분석물을 효소 산화시켜 분석물을 비색결정하는 시약으로, 부가적으로 색깔을 형성하는 이미노 화합물에 대한 비산화성 검출제를 더 포함하는 분석물 비색결정 시약.
  17. 제16항에 있어서, 일반식(I)의 니트로조 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 시약.
    [상기 식에서, R1은 수소, 히드록시, 바람직하게는 히드록시, COOH, PO3H2, SO3H, 알콕시, 알킬티오, 아릴옥시, 아릴티오, 할로겐 또는 바람직하게는 히드록시, PO3H2, 디알킬포스피닐, SO3H 또는 CO2H로 치환된 알킬에 의해 일회 또는 수회 치환된 아미노로 치환된 알킬기를 나타내며; R2는 히드록시기, 알콕시, 아릴옥시, 아릴티오 또는 알킬기가 바람직하게는 히드록시기, 알콕시기, 바람직하게는 알킬, PO3H2, SO3H 또는 CO2H 또는 암모늄, 알킬리 또는 알칼리토염과 같은 염의 형태로 일회 또는 수회 치환된 아미노기에 의해 차례로 치환된 알킬티오기 또는 아미노기 NR3R4를 나타내며; R3및 R4는 동일하거나 상이하며, 수소 또는 차례로 히드록시, 알콕시, 히드록시 알콕시, 또는 바람직하게는 히드록시, PO3H2, SO3H, COOH 또는 염의 형태로 치환되거나 바람직하게는 알킬에 의해 일회 또는 수회 치환된 아미노기에 의해 치환된 폴리알콕시기에 의해 치환될 수 있는 폴리알콕시알킬 잔기에 의해 치환될 수 있는 아릴 또는 알킬기이거나, R3및 R4는 바람직하게, 산소, 황 또는 질소에 의해 차단되는 알킬렌기를 나타내며, 질소가 각각 바람직하게는 알킬 부분의 히드록시 잔기에 의해 차례로 치환될 수 있는 알킬, 히드록시알킬, 히드록시알콕시알킬, 알콕시히드록시알킬 또는 폴리알콕시알킬기에 의해 치환되는 알킬렌기이거나, 또는 R1이 NR3R4에 의해 오르토 위치인 경우, R3및 R4는 R1과 함께 알킬렌 잔기를 나타낸다.]
  18. 제17항에 있어서, 일반식(II)의 니트로조 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 시약.
    [상기 식에서, X-Y는 NR5-CO 또는 N=CR6를 나타내며; R5는 수소, 바람직하게는 히드록시, 카르복시, SO3H, PO3H2, 디알킬포스피닐기에 의해 치환된 알킬을 나타내며, R6는 수소, 바람직하게는 히드록시, 디알킬포스피닐, 카르복시, SO3H, PO3H|2, 이들 산성 잔기중 하나의 염 또는/및 알콕시카보닐에 의해 치환될 수 있는 알킬, 알케닐, 알콕시, 알킬티오, 아릴, 아릴티오, 아르알킬, 또는 하나 또는 수개의 히드록시, 카르복시 또는/및 알콕시카보닐 잔기를 수반하는 하나 또는 두개의 알킬 잔기에 의해 치환되며, 아미노기가 두개의 알킬기로 치환되는 경우, 아미노기의 N원자 이외에 바람직하게는 산소, 황 또는 더 이상의 질소원자에 의해 차단될 수 있는 고리를 형성하도록 결합될 수 있거나, 또는 바람직하게는 하나 또는 두개의 아실기, 알콕시 또는/및 아르알콕시카보닐기, H2N-CO, 알킬, 아르알킬, 또는/및 아릴카바모일기에 의해 치환될 수 있는 아미노기, 또는 카르복시, 알콕시카보닐, 카르복스아미도 또는 할로겐을 나타내며; R7는 바람직하게는 히드록시, 카르복시, SO3H, 디알킬포스피닐 또는 PO3H2에 의해 치환되는 알킬, 티오알킬 또는 아르알킬 또는 바람직하게는 히드록시, 카르복시, SO3H, 디알킬포스피닐 또는 PO3H2에 의해 차례로 치환될 수 있는 하나 또는 두개의 알킬기에 의해 치환되는 아미노기를 나타내고, 적어도 R6및/또는 R7가 아미노기를 나타내며; R8는 바람직하게는 히드록시, 카르복시, SO3H, 디알킬포스피닐 또는 PO3H2에 의해 치환될 수 있는 알킬 또는 아르알킬을 나타내며; 또는 R7및 R8은 바람직하게는 하나 또는 수개의 질소 또는 황원자의 질소원자 또는탄소원자의 3 또는 4원 포화 또는 불포화 사슬, 바람직하게는 상기 해당 토오토머형 및 그들의 염을 나타내며; 이 경우, 탄소원자가 바람직하게는 알킬, 알콕시, 알킬티오, 히드록시, 아르알킬, 아릴, 카르복시, 카르복스아미도, 알콕시카보닐, 시아노, 할로겐, 바람직하게는 하나 또는 수개의 히드록시, 카르복시 또는/및 알콕시카보닐 잔기를 수반하는 하나 또는 두개의 알킬 잔기에 의해 치환된 아미노기에 의해 치환되며, 이중결합을 통해 결합하지 않은 질소원자가 알킬 또는 아르알킬 또는 디알킬포스피닐에 의해 치환되거나 아르알킬 또는 두 인접 사슬 치환체가 바람직하게는 차례로 바람직하게는 아릴에 의해 치환되거나 아넬화되는 알킬렌기를 형성한다.]
  19. 제16 내지 18항중 어느 한 항에 있어서, 아미노 화합물에 대한 비산화성 검출 시약으로서 이미노 화합물 또는 류코 염료에 대한 발색 커플링 시약을 포함하는 것을 특징으로 하는 시약.
  20. PQQ-의존성 탈수소화 효소 및 전자가 풍부한 방향족 니트로조 화합물을 포함하는 분석물을 효소 산화시켜 분석물을 비색결정하는 시약으로, 전자가 풍부한 방향족 니트로조 화합물로 일반식(XIII)의 방향족 니트로조아닐린 화합물이 사용되는 것을 특징으로 하는 시약.
    [상기 식에서, R1은 수소, 히드록시, 할로겐, 알콕시, 알킬티오, 아릴옥시 또는 아릴티올, 바람직하게는 히드록시, 카르복시, PO3H2또는 SO3H에 의해 치환되는 알킬, 또는 바람직하게 히드록시, PO3H2디알킬포스피닐, SO3H 또는 카르복시에 의해 차례로 치환될 수 있는 알킬에 의해 바람직하게는 일회 또는 수회 치환되는 아미노기를 나타내며; X-Y는 NR5-CO 또는 N=CR6를 나타내며; R5는 수소, 바람직하게는 히드록시, 카르복시, SO3H, PO3H2, 디알킬포스피닐기에 의해 치환된 알킬을 나타내며, R6는 수소, 알킬, 알케닐, 알콕시, 알킬티오, 아릴, 아릴티오, 아르알킬(각각이 바람직하게는 히드록시, 카르복시, SO3H, PO3H2, 이러한 산성 잔기중 하나의 염 또는/및 알콕시카보닐로 치환될 수 있음), 또는 바람직하게는 하나 또는 수개의 히드록시, 카르복시 또는/및 알콕시카보닐기를 수반하는 하나 또는 두개의 알킬 잔기에 의해 치환되며, 아미노기가 두개의 알킬 잔기에 의해 치환되는 경우, 이 잔기가 아미노기의 N원자 이외에 바람직하게는 산소, 황 또는 더 이상의 질소원자에 의해 차단될 수 있는 고리를 형성하도록 결합될 수 있거나, 또는 바람직하게는 하나 또는 두개의 아실기, 알콕시 또는/및 아르알콕시카보닐기, H2N-CO, 알킬, 아르알킬, 또는/및 아릴카바모일기에 의해 치환될 수 있는 아미노기, 또는 카르복시, 알콕시카보닐, 카르복스아미도 또는 할로겐을 나타내며; A는 질소 또는 황 및 두개의 탄소 또는 두개의 질소 및 하나의 탄소로 이루어진 3원 포화 또는 불포화 사슬, 바람직하게는 상기의 해당 토오토머형 및 그들의 염을 나타내며; 이 경우, 탄소원자가 바람직하게는 알킬, 알콕시, 알킬티오, 히드록시, 아르알킬, 아릴, 카르복시, 카르복스아미도, 알콕시카보닐, 시아노, 할로겐, 바람직하게는 하나 또는 수개의 히드록시, 카르복시 또는/및 알콕시카보닐기를 수반하는 하나 또는 두개의 알킬 잔기에 의해 치환된 아미노기에 의해 치환되며, 이중결합을 통해 결합하지 않은 질소원자가 알킬 또는 아르알킬 또는 디알킬포스피닐에 의해 치환되거나 아르알킬 또는 두 인접 사슬 치환체가 바람직하게는 차례로 바람직하게는 아릴에 의해 치환되거나 아넬화되는 알킬렌기를 형성한다.]
  21. 제20항에 있어서, A가 인접하는 헤테로사이클과 이미다졸, 트리아졸, 벤즈아미다졸, 티아졸 또는 디히드로이미다졸 고리를 형성하는 것을 특징으로 하는 시약
  22. 제16항 내지 제21항중 어느 한 항에 따른 시약을 포함하는 시험용 담체.
  23. 일반식(XIII)의 니트로조아닐린.
    [상기 식에서, R1은 수소, 히드록시, 할로겐, 알콕시, 알킬티오, 아릴옥시 또는 아릴티올, 바람직하게는 히드록시, 카르복시, PO3H2또는 SO3H에 의해 치환되는 알킬, 또는 바람직하게 히드록시, PO3H2디알킬포스피닐, SO3H 또는 카르복시에 의해 차례로 치환될 수 있는 알킬에 의해 바람직하게는 일회 또는 수회 치환되는 아미노기를 나타내며; X-Y는 NR5-CO 또는 N=CR6를 나타내며; R5는 수소, 바람직하게는 히드록시, 카르복시, SO3H, PO3H2, 디알킬포스피닐기에 의해 치환된 알킬을 나타내며, R6는 수소, 알킬, 알케닐, 알콕시, 알킬티오, 아릴, 아릴티오, 아르알킬(각각이 바람직하게는 히드록시, 카르복시, SO3H, PO3H2, 이러한 산성 잔기중 하나의 염 또는/및 알콕시카보닐로 치환될 수 있음), 또는 바람직하게는 하나 또는 수개의 히드록시, 카르복시 또는/및 알콕시카보닐기를 수반하는 하나 또는 두개의 알킬 잔기에 의해 치환되며, 아미노기가 두개의 알킬 잔기에 의해 치환되는 경우, 이 잔기가 아미노기의 N원자 이외에 바람직하게는 산소, 황 또는 더 이상의 질소원자에 의해 차단될 수 있는 고리를 형성하도록 결합될 수 있거나, 또는 바람직하게는 하나 또는 두개의 아실기, 알콕시 또는/및 아르알콕시카보닐기, H2N-CO, 알킬, 아르알킬, 또는/및 아릴카바모일기에 의해 치환될 수 있는 아미노기, 또는 카르복시, 알콕시카보닐, 카르복스아미도 또는 할로겐을 나타내며; A는 질소 또는 황 및 두개의 탄소 또는 두개의 질소 및 하나의 탄소로 이루어진 3원 포화 또는 불포화 사슬, 바람직하게는 상기의 해당 토오토머형 및 그들의 염을 나타내며; 이 경우, 탄소원자가 바람직하게는 알킬, 알콕시, 알킬티오, 히드록시, 아르알킬, 아릴, 카르복시, 카르복스아미도, 알콕시카보닐, 시아노, 할로겐, 바람직하게는 하나 또는 수개의 히드록시, 카르복시 또는/및 알콕시카보닐기를 수반하는 하나 또는 두개의 알킬 잔기에 의해 치환된 아미노기에 의해 치환되며, 이중결합을 통해 결합하지 않은 질소원자가 알킬 또는 아르알킬 또는 디알킬포스피닐에 의해 치환되거나 아르알킬 또는 두 인접 사슬 치환체가 바람직하게는 차례로 바람직하게는 아릴에 의해 치환되거나 아넬화되는 알킬렌기를 형성한다.]
  24. 제23항에 있어서, A가 인접하는 헤테로사이클과 이미다졸, 트리알졸, 베늦아미다졸, 티아졸 도는 디히드로이미다졸 고리를 형성하는 것을 특징으로 하는 니트로조아닐린.
  25. 제25항 또는 제24항에 따른 니트로조아닐린 화합물을 분석물 비색 효소 검출법에 사용하는 방법.
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