HUT71703A - Method for determining analite with pqq-depending dehydrogenase - Google Patents
Method for determining analite with pqq-depending dehydrogenase Download PDFInfo
- Publication number
- HUT71703A HUT71703A HU9400995A HU9400995A HUT71703A HU T71703 A HUT71703 A HU T71703A HU 9400995 A HU9400995 A HU 9400995A HU 9400995 A HU9400995 A HU 9400995A HU T71703 A HUT71703 A HU T71703A
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- alkyl
- hydroxy
- optionally
- group
- carboxy
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D487/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00
- C07D487/02—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00 in which the condensed system contains two hetero rings
- C07D487/04—Ortho-condensed systems
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D513/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for in groups C07D463/00, C07D477/00 or C07D499/00 - C07D507/00
- C07D513/02—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for in groups C07D463/00, C07D477/00 or C07D499/00 - C07D507/00 in which the condensed system contains two hetero rings
- C07D513/04—Ortho-condensed systems
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
- C12Q1/32—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving dehydrogenase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/54—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving glucose or galactose
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
A találmány tárgya eljárás analitok enzimatikus oxidáció általi kolorimetriás meghatározására PQQ-függő (_ PQQ: 4,5-dihidro-4,5-dioxo-lH-pirrolo/2,3-f7kinolin-2,7,9-trikarbonsav /metoxanthin/_7 segítségével, elektronakceptor, mint elektrondus aromás nitrozovegyület jelenlétében, melynél a redukált elektronakceptort az analit mennyiségével arányos szinképződés utján határozzuk meg. A találmány továbbá analitok enzimatikus oxidációval történő meghatározához használható szerre vonatkozik, amely PQQ-függő dehidrogenázt, elektrondus aromás nitrozovegyületet, valamint szinképző, nem oxidáló reagenst tartalmaz az elektrondus aromás nitrozovegyület redukciójánál képződő iminovegyület kimutatásához. A találmány ezenfelül uj nitrozo-anilin-vegyületekre, ezek előállítására, valamint analitok kolorimetriás enzimatikus meghatározására való alkalmazására vonatkozik.
Az analitikában enzimatikus oxidációk utján a legkülönbözőbb próbaanyagok mutathatók ki és határozhatók meg. Ilyenkor egy oxidáló enzim egy az oxidációs reakció elektronjait felvevő akceptor jelenlétében megfelelő enzimszubsztrátra fejti ki hatását. Eddig különösen előnyösnek bizonyult, ha a redukált elektronakceptor szinképződés utján mutatható ki, minthogy ez nem igényel szükségszerűen drága mérőberendezéseket és az értékelés adott esetben vizuálisan is elvégezhető.
Anyagok oxidáló enzimekkel történő kolorimetriás
A - 3 f meghatározásához oxidázok és dehidrogenázok használatosak. Mindkét enzimcsoport az oxidoreduktázok főcsoportjába tartozik /Römpp, Vegyészeti Lexikon, Franksche kiadó, Stuttgart, 8. kiadás, 4, kötet, 2952 oldal; Lexikon Biochemie, Jakubke H.D. kiadó, Chemie kiadás, Weinheim, 2. kiadás, 1981, 194. oldal/, melynek tagjai természetes elektronakceptoraik alapján különböztethetők meg.
Oxidázoknál természetes elektronakceptor a molekuláris oxigén /Römpp, Vegyészeti Lexikon, Franksche kiadó, Stuttgart, 8. kiadás, 4. kötet, 2946. oldal/. Analit-meghatározásnál az analitot oxidázzal és oxigénnel oxidálják. A képződött hidrogén-peroxidot peroxidáz segítségével leukofestékké oxidálják.
Analitok oxidázok általi és a technika mai állásának megfelelő kolorimetriás meghatározását idézi Kunst A. és munkatársai munkája /Methods in Enzymatic Analysis, Bergmeyer H.O. kiadó, Chemie kiadóvállalat, Weinheim, 3. kiadás, 1984, 6. kötet, 178-185. oldal/. Eszerint szérum-, plazma- vagy fehérjementes vér-glükózt glükóz oxidázzal és levegő-oxigénnel reagáltatnak vizes oldatban, mialatt a reakcióban az oxigén redukciójából származó Hg02 peroxidáz jelenlétében redukálódik és a reakcióelegyhez hozzáadott fenolt és 4-amino-fenazont szinképzésre készteti. A nagy redoxpotenciálja és a nem szelektív peroxidáz instabilitása általában korlátozza az ilyen tesztet. Zavarólag hatnak például a vérpróbában jelenlevő átmenetifém-ionok, hem vagy hemoproteinek, minthogy elbontják a « MM * ···« ·· « · ♦ · ♦ · · • · · « ♦ «·» « · ····· « ·
Ml * · ·· ·
HgOg-öt. A vér- vagy vizeletmintákban előforduló anyagok, például bilirubin, de gyógyszerek is, mint például metil-dopa HgOg-dal és peroxidázzal szint képezhetnek és ezáltal hamis eredményt adhatnak; ugyanakkor a már kialakult festéket újra redukálhatják és igy elszínteleníthetik.
A fenti meghatározási eljárásokat szilárd hordozón un. szárazpróbában végrehajtva az oxidázok oxigénigénye további hátrányt jelent. Mindenekelőtt ha a nagy koncentrációjú enzimszubsztrát oxidációjához sok oxigénre van szükség, a levegőből a reakcióközegbe történő oxigén-diffúzió sebességmeghatározó lépéssé válik, és hosszú reakcióidőhöz és különösen kinetikus meghatározási eljárásoknál hamis eredményekhez vezethet.
A dehidrogenázokat általában két csoportba sorolják; egyikük az enzimszubsztrátok oxidációjához NAD-ot /nikotinamid-adenin-dinukleotid/ vagy NADP-t /nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfát/ igényel természetes közvetlen elektronakceptorként, másikuk pedig nem NAD- vagy NADP-függő, tehát természetes közvetlen elektronakceptorként más anyagokat használnak fel enzimatikus oxidációs reakcióknál. A dehidrogenázok utóbbi csoportjába tartoznak főként a PQQ-függő és flavin-függő dehidrogenázok.
Kolorimetriás mérésekhez a NAD-függő dehidrogenázok alkalmazása például a DE-A-2147466 számú szabadalmi leírásból ismeretes. Eszerint a laktátból laktát dehidrogenáz katalízis mellett, NAD jelenlétében piruvát és NADH /redukált nikotinamid-adenin-dinukleotid/ képződik. A NADH azután például dia♦ ··# .-5foráz jelenlétében tetrazoliumsókkal reagál NAD és színes formazánok képződése közben, melyeknek koncentrációja fotometriásan meghatározható. Redukciós katalizátorként diaforáz helyett N-metil-fenazinium-metoszulfát is használható a NADHelektronoknak a tetrazoliumsókra való átviteléhez.
A fenti eljárás hátránya, hogy NADH helyett a biológiai próbákban, mint vérben, szérumban, plazmában vagy vizeletben esetleg előforduló redukáló vegyületek, mint glutation, vagy gyógyszerek, mint metil-dopa vagy Dobesylat, aspecifikus redukciós katalizátorok, mint diaforáz vagy N-metil-fenazinium-metoszulfát jelenlétében a tetrazoliumsókat megfelelő formazánokká alakítják át és igy ál-pozitiv eredményekhez vezetnek, bár aspecifikus katalizátorok nélkül a tetrazoliumsókkal lassabban reagálnak.
Az EP-A-0 354 441 számú európai szabadalmi bejelentés szerint analitok oxidativ, enzimes kimutatására flavin-függő oxidázokat vagy nem NAD-függő dehidrogenázokat, mint PQQ-függő dehidrogenázokat használnak elektrondus aromás nitrozovegyületek jelenlétében. E kimutatási eljárásnál az aromás nitrozovegyület megfelelő elektrondus aromás aminná redukálódik, amely kicsapott, nehezen oldódó heteropolisav segítségével heteropolikék képződés utján kimutatható, vagy kapcsoló reagenssel oxidálószer jelenlétében festékanyaghoz kapcsolható. A heteropolikék képződés kék-szürke színárnyalatai pontos vizuális értékeléshez természetesen kevéssé alkal-
masak. Az általában színtelen, vagy csak gyengén megfestődött aromás amin szinképző kapcsoló reagenssel történő kolorimetriás kimutatása nem előnyös, ezért pótlólagos oxidálószer alkalmazására van szükség. Minthogy az ilyen oxidálószer zavarná az aromás nitrozovegyület aromás aminná történő átalakulását, a kimutatási reakciót két különálló lépésben kell elvégezni: az első lépésben az aromás nitrozovegyületet enzimatikusan aromás aminná redukálják és egy különálló második lépésben az aromás amint oxidativ utón szinképző reagenssel kapcsoják össze oxidálószer hozzáadásával.
E kimutatási módszer további hátránya, hogy az aromás nitrozovegyületek minden ekvivalensének aromás aminná történő redukciójához két ekvivalens analitot kell oxidálni. Emiatt különösen kis analitkoncentrációknál a kimutató eljárás érzékenysége nem lesz kielégítő.
Ezért találmányunk célkitűzése a jelenlegi technikák hátrányainak kiküszöbölése és egyszerűbb, zavarásra kevésbb hajlamos, érzékenyebb és optikailag jobban értékelhető eljárás és szer kimunkálása analitok oxidativ kimutatása számára; az eljárás előnyösen egy lépésben hajtható végre és a teljes látható hullámhossz-tartományban vizuálisan jól értékelhető szint ad.
E feladatot a találmány szerint az igénypontokban jellemzett módon oldottuk meg.
Eszerint eljárást fejlesztettünk ki analitok kolorimetriás meghatározására az analit oxidoreduktázzal történő enzimatikus oxidációja utján, elektrondus aromás nitrozovegyületek csoportjába tartozó közvetlen elektronakceptor jelenlétében, melynek során a redukált elektronakceptort az analit mennyiségével arányos szinképződés alapján határozzuk meg; az eljárásban az elektrondus aromás nitrozovegyület az analit oxidációja közben, PQQ-függő dehidrogenáz jelenlétében iminovegyületté redukálódik, melyet aromás aminná történő további enzimatikus redukció nélkül szinképződés alapján mutatunk ki.
A találmány fő célkitűzése eljárás kifejlesztése analitok kolorimetriás meghatározására az analit oxidoreduktázzal történő enzimatikus oxidációja utján, elektrondus aromás nitrozovegyületek körébe tartozó közvetlen elektronakceptor jelenlétében, melynél a redukált elektronakceptort az analit mennyiségével arányos szinképződés alapján határozzuk meg; az elektrondus aromás nitrozovegyület az analit oxidációja közben PQQ-függő dehidrogenáz jelenlétében iminovegyületté redukálódik, melyet aromás aminná történő további redukció helyett szinképző, nem oxidáló kimutató reagenssel kolorimetriásan határozunk meg.
Ezenfelül szert állítottunk elő analitok enzimatikus oxidációval történő kolorimetriás meghatározásához, amely PQQ-függő dehidrogenázt és elektrondus aromás nitrozovegyületek csoportjába tartozó közvetlen elektronakceptort tartalmaz; a használt szer enzimatikus redukciókor színes • · * • · · * · · « • ····· · · iminovegyületet képező elektrondus aromás nitrozovegyületet, vagy további szinképző, nem oxidáló kimutató reagenst tartalmaz az aromás nitrozovegyületből redukció utján képződő iminovegyület kimutatása számára.
A találmány szerint analit” alatt enzimatikusan oxidálható anyagot értünk. Sok esetben az analit olyan anyag, amelyet a vizsgálandó próbában közvetlenül mutatnak ki vagy mennyiségileg határoznak meg. Glükóz például közvetlenül PQQfüggő glükóz dehidrogenázzal /glucose-dye-oxidoreductase, gluc-DOR/ oxidálható és kolorimetriásan meghatározható. Az is lehetséges azonban, hogy az analitot előzetesen egy vagy több reakcióban valamely más anyagból állítják elő, úgyhogy az analit kolorimetriás meghatározása utján közvetett módon a kiindulóanyag koncentrációjára lehet következtetni.
Találmányunkban az analit az az anyag, amely az alkalmazott PQQ-függő dehidrogenáz számára szubsztrátként szolgál.
A PQQ-függő dehidrogenázok kofaktorként pirrol-kinolin-kinont tartalmaznak. Ilyen kinoproteinek-ről adnak áttekintést Jongejahn J.A. és munkatársai /PQQ and Quinoproteins, Kluver Academic Publ. Dordrecht, Hollandia, 1989/. A találmány szerint használható enzimekre példa a PQQ-függő dehidrogenáz /glucose-dye-oxidoreductase, EC 1.1.1.50/1,1,1,91/ 1.1.1.977, alkohol dehidrogenáz és laktát dehidrogenáz. A találmány szerinti eljárásban különösen a PQQ-függő glükóz • «
- 9 dehidrogenáz használható előnyösen a glukóz kolorimetriás meghatározásához.
Az enzim/kofaktor/PQQ-dehidrogenáz rendszer elektronjait átvevő közvetlen elektronakceptorként elektrondus aromás nitrozovegyületeket alkalmazunk, amelyeket az EP-A-0354 441 és ΞΡ-Α-0 441 222 számú európai szabadalmi bejelentés oxidázok és nem NADH-függő dehidrogenázok elektronakceptoraiként ir le, és amelyeknél egy nitrocsoport közvetlenül kapcsolódik egy elektrondus aromás maghoz. A közvetlen elektronakceptor kifejezés azt jelenti, hogy az enzim/kofaktor rendszer elektronjait enzimmel katalizálva közvetlenül, redukciós katalizátor használata nélkül veszi át az elektronakceptor.
A találmány szerint redukálható, elektrondus aromás nitrozovegyületékként olyanok használhatók, amelyek az alkalmazott PQQ-függő dehidrogenáz megfelelő szubsztrátjónak oxidációjakor képződő elektronokat az enzimtől átveszik és eközben iminovegyületek keletkeznek. A megfelelő iminovegyületek =NH iminocsoportot tartalmaznak, amely kettőskötésén át az eredeti aromás maghoz kötődik és e mag kettőskötés-elektronjaival konjugálódik. Elektrondus aromás nitrozovegyületek egy vagy több, elektront szolgáltató csoportot tartalmaznak az aromás magban vagy magon, amelyek elősegítik az iminovegyületek képződését, minthogy elektronleadás utján az eredeti aromás magon át az iminocsoporttal konjugációs kölcsönhatásba lépnek.
Ezek az elektronszolgáltató csoportok az aromás
- 10 magra +M-effektust /mezomer effektus/ fejtenek ki, például a következő reakcióvázlat szerint:
R-Ar-NO -^dukcio => R»-Ar’=NH
Aromás maghoz kötődő, +M-effektust kifejtő R szubsztituens például a hidroxil-, alkoxi-, aril-oxi-, alkil-tio-, aril-tio-, amino-, monoalkil-amino-, monoaril-amino-, dialkil-amino- és diaril-amino-csoport.
Nitrozo-benzol-származékok esetében e szubsztituensek például különösen akkor fejtik ki hatásukat, amikor a nitrozocsoporthoz képest orto- és/vagy para-helyzetet foglalnak el.
Az elektront szolgáltató és iminoszerkezetet elősegítő csoportok heteroaromás gyürürendszer alkotóelemei is lehetnek.
Példaként szolgálnak a T-elektronfelesleggel rendelkező heterociklusos aromás nitrozovegyületek, melyekben az aromás gyürürendszer elektronsűrűsége olyan nagy, hogy nincs szükség külső +M-szubsztituensre a redukció utáni stabil mezomer állapotú iminocsoport kialakulásához. A íT-elektronfelesleg onnan adódik, hogy több n-elektron van jelen, mint gyürübeli szénatom, amelyeken a ]f-elektronok el tudnak oszlani. Az ilyen heterociklusok a szakember előtt ismertek. Közéjük tartozik például az antipirin, pirazolo-heterociklusok és pirazol.
A találmány szerint alkalmazott elektrondus aromás
- 11 nitrozovegyületek elektronsűrűségének további hatása, hogy e nitrozovegyületek bizonyos része keto-enol tautomer átrendeződésen át az egyenértékű oxim-határszerkezettel van egyensúlyban :
R - Ar - N = 0 <-> R» = Ar’ = N - OH
A találmány keretében az aromás nitrozovegyületek fogalmába beletartozó mindkét tautomer határszerkezetü anyag használható.
A fentebb említett +M-szubsztituensek közé alkoxi-, alkil-tio-, monoalkil-amino- és dialkil-amino-csoportok tartoznak, ahol az alkilcsoport 1-6 szénatomos szénhidrogéncsoportnak felel meg, amelyet hidroxilcsoport, adott esetben 1-6 szénatomos alkilcsoporttal egy- vagy többszörösen helyettesített aminocsoport, PO^^, SO^H vagy CC^H csoport szubsztituálhat. A PO^H^, SO^H és COgH savmaradékok mint ilyenek, vagy sóformában ammónium-, alkáli- vagy alkáliföldfémsókként lehetnek jelen.
Az aril-oxi- és aril-tio-csoportok 6-10 szénatomos aromás csoportokat tartalmaznak; különösen előnyös a fenoxiés fenil-tio-csoport.
Az ammóniumsók NH^+ ammóniumiont, vagy alkil-, aril- vagy aralkilcsoporttal egy- vagy többszörösen szubsztituált ammóniumkationokat tartalmaznak. Az alkil- és aralkilcsoportok alkilrésze 1-6 szénatomos szénhidrogéncsoport. Az aril- és aralkilcsoportok arilrésze 6-10 szénatomos aromás « « «
« •« ♦« * « • «·
- 12 gyürürendszer; közülük előnyben részesítjük a fenilcsoportot. Előnyös aralkilcsoport a benzilcsoport.
Az alkálisók előnyösen lítium-, nátrium- vagy káliumsók. Az alkáliföldfémsók előnyösen magnézium- és kalciumsók.
Az +M-szubsztituensekre fentebb megadott példák nem jelentenek teljes felsorolást. Sajátos esetekben a szakember tudja, hogy egy adott R csoport +M-szubsztituensnek tekinthető-e és hogy az aromás rendszer mely részén fejti ki hatását, vagy a gyürürendszerben mely aromás heterociklusok tartalmaznak megfelelő csoportot, és mindezek a csoportok lehetséges szubsztituensekként mennyiben legyenek jelen a találmány szerint alkalmazhazó nitrozovegyületekben.
A használt aromás nitrozovegyületek aromás alapváza előnyösen 5-7» különösen előnyösen 5-6 szén- vagy heteroatomot tartalmazó elektrondus aromás gyűrű, amely egy vagy két aromás és/vagy aliciklusos gyűrűvel anellálódhat. Aromás anellált gyűrűkként úgy szénatomokból álló aromás rendszerek, mint 5-7, előnyösen 5-6 szén- vagy heteroatomot tartalmazó heteroaromás rendszerek is tekintetbe jönnek.
Aliciklusos gyűrűkként 5-7 szén- vagy heteroatomos, előnyösen 5 vagy 6 szénatomos, telitett vagy telítetlen cikloalifás csoportok jönnek szóba. Heteroatom alatt nitrogén-, oxigén- vagy kénatomot értünk.
A találmány szerint előnyösen használható nitrozo·♦ « ♦ · ·
-13vegyületek nitrozo-benzol-származékok.
Kitrozo-benzol-származékok alatt nitrozo-benzol is értendő, amely egy vagy több aromás és/vagy aliciklusos gyűrűvel anellálódik. Aromás gyűrűkként úgy szénatomokból álló gyűrűs rendszerek, mint 5-7, előnyösen 5 vagy 6 gyürübeli szénatomot tartalmazó heteroaromás gyűrűk is tekintetbe jönnek. Példaként szolgál az anellált benzol- vagy naftalingyürü, vagy anellált piridingyürü.
Különösen előnyben részesítjük azokat az /1/ általános képletü nitrozo-benzol-származékokat, ahol jelentése hidrogénatom, hidroxicsoport, adott esetben hidroxi-, karboxil-, PO^Hg vagy SO^H, alkoxi-, alkil-tio-, aril-oxi-, aril-tio« csoporttal vagy halogénatommal szubsztituált alkilcsoport, vagy aminocsoport, melyet adott esetben egy- vagy többszörösen alkilcsoport szubsztituál és az alkilcsoportot magát is adott esetben hidroxi-, PO^Hg, dialkil-foszfinil-, SO^H vagy COOH csoport helyettesíti, és
R jelentése hidroxi-, alkoxi-, aril-oxi-, aril-tio- vagy alkil-tio-csoport, ahol az alkilcsoportot magát adott esetben hidroxi-, alkoxicsoport, adott esetben alkilcsoporttal egyvagy többszörösen helyettesített aminocsoport, ·♦ 4 <·
PO-^Hg, SO^H vagy COgH csoport, vagy sóformában ammónium-, alkáli- vagy alkáliföldfémsó szubsztituálva, vagy
3 4
R -NR R általános kepletü csoportot jelent, melyben
R^ és R^ azonos vagy különböző lehet és jelentésük hidrogénatom, aril- vagy alkilcsoport, mely utóbbit magát hidroxi-, alkoxi-, hidroxi-alkoxi-csoport, adott esetben hidroxicsoporttal helyettesitett polialkoxicsoport, adott esetben sóformáju PO^Hg, SO^H, COOH csoport, vagy adott esetben alkilcsoporttal egy- vagy többszörösen helyettesitett aminocsoport szubsztituálhatja, vagy az
R^ és R^ szubsztituens alkiléncsoportot alkot, amelyet adott esetben oxigén-, kénvagy nitrogénatom szakit meg, és a nitrogénatomot alkil-, hidroxi-alkil-, hidroxi-alkoxi-alkil-, alkoxi-hidroxi-alkil-, alkoxi-karbonil-alkil-, dioxanilil-alkil- vagy polialkoxi-alkil-csoport szubsztituálhatja, ahol az alkilrészt magát adott esetben hidroxicsoport helyettesítheti, vagy ha
R1 orto-helyzetü NR-^R^ általános képletű csoportot jelent, az R^ vagy csoport az R1 csoporttal együtt alkiléncsoportot is alkothat.
A halogénatom fluor-, klór-, bróm- vagy jódatom lehet. Különösen előnyös a fluor- és klóratom.
Az alkil-, alkoxi- vagy alkil-tio-csoport alkilrésze 1-6 szénatomos szénhidrogéncsoportot jelent; különösen előnyösek az 1-3 szénatomos csoportok. Az alkilrész fenti meghatározása a hidroxi-alkil-, dialkil-amino-alkil-, hidroxi-alkoxi-alkil-, alkoxi-alkil-, polialkoxi-alkil-, alkoxi-hidroxi-alkil- és dioxanilil-alkil-csoport al^ilrészére is vonatkozik. A dioxanilil-alkil-csoport olyan csoport, ahol egy dioxángyürü-rendszer alkilcsoporthoz kötődik. Előnyösen /a/ általános képletű 1,4-dioxángyürü-rendszerről van szó.
Polialkoxi-alkil-csoport alatt
-alkil-/alkoxi/ -alkoxicsoportot értünk, ahol n értéke 1 - 10, előnyösen 1-4, különösen előnyösen 1 - 3.
Az alkiléncsoport egyenes vagy elágazó láncú - előnyösen egyenes láncú - , telitett vagy telítetlen - előnyösen telített - , 2 - 5, előnyösen 2-4 szénatomos, két szabad kötőhelyet tartalmazó szénhidrogénlánc.
Az aril- és aralkilcsoportok arilrésze 6-10 gyürübeli szénatomot tartalmazó aromás gyürürendszer; előnyben részesítjük a fenilgyürüt.
Az ammóniumsók NH^+ ammóniumiont, vagy pedig alkil-, aril- vagy aralkilcsoporttal egy- vagy többszörösen helyettesített ammóniumkationokat tartalmaznak.
Az alkálisók előnyösen lítium-, nátrium- vagy káliumsók. Az alkálifÖldfémsók előnyösen magnézium- és kalciumsók.
R1 előnyösen hidrogénatomot és alkilcsoportot, különösen hidrogénatomot jelent.
3 4R előnyösen alkoxicsoportot vagy -NR R általános képletü aminocsoportot jelent.
Ha R és R oxigén-, kén- vagy nitrogénatommal megszakított alkiléncsoportot jelent, az /1/ általános képlet nitrogénatomjának bevonása utján képezett morfolin- ill. tiomorfolin- ill. piperazincsoportot részesítjük előnyben; különösen előnyös a piperazincsoport.
Ha R és R alkiléncsoportot jelent, az /1/ általános képlet aromás gyűrűjének bevonása utján képezett indolinvagy 1,2,3,4-tetrahidrokinolincsoportot részesítjük előnyben.
Az /1/ általános képletü találmány szerinti nitrozo-anilin-származék sói közül különösen az erős savakkal, főként ásványi savakkal, mint sósavval, kénsavval, salétromsavval, foszforsavval képezett sókat részesítjük előnyben. Különösen előnyösek a hidrokloridok, a sósav sói.
Előnyös /1/ általános képletü nitrozovegyületek a következők:
- 17 Ν,Ν’-bisz/2-hidroxi-etil/-p-nitrozo-anilin
Ν,Ν’-dimetil-p-nitrozo-anilin
Ν, Ν’-dietil-p-nitrozo-anilin
N-metil-N’-/4-nitrozo-fenil/-piperazin N-/2-hidroxi-etil/-5-nitrozo-indolin
2,4-dimetoxi-nitrozo-benzol
N,N*-bisz/2-metoxi-etil/-4-nitrozo-anilin N-/4-nitrozo-fenil/-morfolin
N-/2,2-dietoxi-etil/-N’-/4-nitrozo-fenil/-piperazin p-nitrozo-fenol
3-metoxi-4-nitrozo-fenol.
Az elektrondus heteroaromás nitrozovegyületek közül, melyeknél az aromás gyürürendszer elektronsűrűsége olyan nagy, hogy külső +M-szubsztituensre nincs szükség a nitrozo/oxim tautomériához és iminképződéshez, különösen a nitrozocsoporttal szubsztituált pirazolonok, pirazolok és főként nitrozo-szubsztituált pirazolovegyületek alkalmasak a találmány szerinti eljárás számára; ilyeneket Írnák le például az Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry kézikönyv 5. kiadásának A 20 kötetében a 72-74. oldalon. Előnyösek a /11/ általános képletú 3-nitrozo-pirazolo-vegyületek is. E vegyületek nagyrészt az EP-A-0 433 854 számú európai szabadalmi bejelentésből ismertek a megfelelő 3-amino-pirazolo-vegyületek preparativ szintézisének elemeiként. A /11/ általános képletben • ♦·*♦ · ···· Α· • A < · · ν ·
A ♦ A · A · · • · ···· · · » »· · ♦ * · ♦ X-Y jelentése NR^-CO vagy N=CR^ általános képletű csoport,
R hidrogénatomot, adott esetben hidroxi-, karboxil-, SO^H, PO^H^, dialkil-foszfinil-csoporttal szubsztituált alkilcsoportot,
R& hidrogénatomot, alkil-, alkenil-, alkoxi-, alkil-tio-, aril-, aril-tio-, aralkilcsoportot jelent, amelyeket adott esetben hidroxi-, karboxil-, SO^H, PO3H2 csoport, e savmaradékok sója és/vagy alkoxi-karbonil-csoport helyettesit, vagy
R jelentése aminocsoport, melyet adott esetben egy vagy több hidroxi-, karboxil- és/vagy alkoxi-karbonil-csoportot hordozó, egy vagy két alkilcsoport szubsztituál, és ha az aminocsoportot két alkilcsoport helyettesíti, e csoportok gyűrűhöz is kapcsolódhatnak, amelyet az aminocsoport nitrogénatomján kívül adott esetben oxigén-, kénatom vagy egy további nitrogénatom szakíthat meg; vagy
R° olyan aminocsoportot jelent, amelyet adott esetben egy vagy két acilcsoport, alkoxiés/vagy aralkoxi-karbonil-csoport, H^N-CO-, alkáli-, aralkil- és/vagy aril-karbamoilcsoport szubsztituál; vagy • ··*· · ««·« ·* ·* · · · · · • * * · · ·· * · ·»··· · · ♦·· * · «« · karboxi-, alkoxi-karbonil-, karboxamidocsoportot vagy halogénatomot jelent, és y
R jelentése alkil-, tio-alkil- vagy aralkilcsoport, melyeket adott esetben hidroxi-, karboxi-, SO^H vagy PO^Hg csoport, vagy adott esetben egy vagy két alkilcsoporttal szubsztituált aminocsoport helyettesit, és magukat az alkilcsoportokat is hidroxi-, karboxi
SO^H, dialkil-foszfinil- vagy PO^Hg csoport helyet-
7 tesitheti, és az R és/vagy R csoportok közül legalább az egyik aminocsoportot jelent, és
Q
R jelentése adott esetben hidroxi-, karboxi-,
SO^H vagy PO^Hg csoporttal szubsztituált alkil- vagy aralkilcsoport, vagy
8
R' és R együtt 3- vagy 4-tagu, nitrogénatomokból vagy szénatomokból álló, adott esetben egy vagy több nitrogén- vagy kénatomot tartalmazó, telitett vagy telítetlen t
láncot jelent, ahol a szénatomokat adott esetben alkil-, alkoxi-, alkil-tio-, hidroxi-, aralkil-, aril-, karboxi-, karboxamido-, alkoxi-karbonil-, cianocsoport, nabogénatom vagy aminocsoport helyettesíti, mely utóbbit adott esetben egy vagy két, adott esetben egy vagy több hidroxi-, karboxi- és/vagy alkoxi-karbonil-csoportot hordozó alkil• · c • **·· ·· •4 · · « ·* • · » 4 ··· • * ♦····· * ··· 4 · ·«*
- 20 csoporttal szubsztituált és a nem kettőskötésen át kötődő nitrogénatomokat adott esetben hidroxi-, SO^H, PO^H^, karboxi- vagy dialkil-foszfinil-csőport tál helyettesített alkil- vagy aralkilcsoport szubsztituálja, vagy két szomszédos láncbeli szubsztituens adott esetben árucsoporttal helyettesített vagy anellált alkiléncsoportót képez, valamint adott esetben e vegyületek megfelelő tautomer formái és ezek sói is használhatók.
A használt alkil-csoport megjelölés magában, vagy az alkil-tio-, dialkil-foszfinil-, alkil-karbamoil- és aral^ilcsoportok részeként 1-6, előnyösen 1-4 szénatomos egyenes vagy elágazó alkilcsoportot jelent, például metil-, etil-, propil-, izobutil- vagy terc-butilcsoportót.
Ha egy aminocsoportot két alkilcsoport helyettesit, e csoportok úgy is kapcsolódhatnak valamely gyűrűhöz, hogy együttesen nitrogénatommal megszakított gyűrűt alkotnak. Előnyben részesítjük az összesen 5- vagy 6-tagu gyűrűt képező aminocsoportokat, ahol a gyűrűt magát is oxigén-, kén- vagy nitrogénatom szakítja meg. Különösen előnyös a morfolinocsoport.
Az ”alkoxi-csoport - az aralkoxi-karbonil-csoportok részeként is - 1-6, előnyösen 1-4 szénatomos egyenes vagy el• ·**· ·♦ • · * · • · , · I »t • · ··«·· · · ·»· · · ·« «
- 21 ágazó alkoxicsoportot, mint például metoxi-, etoxi-, propil-oxi-, izobutil-oxi- vagy terc-butil-oxi-csoportot jelent.
Az aril-csoport - az aril-karbamoil-csoportok részeként is - izociklusos vagy heterociklusos, előnyösen 6-10 gyürübeli szénatomot tartalmazó csoport, különösen fenilés naftilcsoport, amelyeket még alkil-, alkoxicsoport és/vagy halogénatom is szubsztituálhat. Különösen előnyös a fenilcsoport.
Az aralkil-csoport - aralkil-karbaraoil-csoportok részeként is - olyan csoport, amelynél egy fentebb meghatározott alkilcsoportot egy fentebb meghatározott arilcsoport szubsztituál. Előnyben részesítjük a benzilcsoportot.
A halogénatom fluor-, klór-, bróm- és jódatom lehet. Előnyös a fluor- és klóratom.
Az acilcsoport savgyököt jelent, amely alkil-, aralkil- vagy arilcsoportokat tartalmazhat. Előnyben részesítjük az acetil-, fenil-acetil- vagy benzoilcsoportot.
Alkiléncsoport alatt egyenes vagy elágazó láncú, telitett vagy telítetlen, 3-5, előnyösen 3 vagy 4 szénatomos, két szabad kötőhelyet tartalmazó szénhidrogénláncot értünk. Példaként szolgál a -CH2-CH=CH-, -CH=C-CH2-, -CH-CH=CH-, ch3 ch3
-/CH2/^- vagy - CH= CH-CH= CH- csoport.
Előnyben részesítjük a butadiéndiilcsoportót /CH=CH-CH=CH-/ és a tetrametiléncsoportot //CH2/^- 7.
Az alkenilcsoport egyenes vagy elágazó, 2-5 szén-
atomos, legalább egy kettőskötést tartalmazó szénhidrogéncsoport. Előnyös például a vinilcsoport. Dialkil-foszfinilcsoport alatt /b/ általános képletű csoportot értünk, ahol az alkilcsoportok jelentése a fenti. Előnyben részesítjük a dimetil—foszfinil—csoportot.
Az SO3H, P03H9 és karboxicsoportok sóiként alkálivagy alkáliföldfémsók vagy ammóniumsók használhatók. Alkálisók alatt lítium-, nátrium-, kálium-, rubidium- és céziumsókat értünk; előnyben részesítjük a lítium-, nátrium- és káliumsókat, de mindenekelőtt a nátrium- és káliumsókat. Az alkáliföldfémsók berillium-, magnézium-, kalcium-, stroncium- vagy báriumsók. Előnyben részesítjük a magnézium- és kalciumsókat, különösen előnyösek a kalciumsók. Ammóniumsókként a sabsztituálatlan ammóniumion /NH^+/ sói használhatók. Azonban olyan ammóniumsók is használhatók, amelyeknél az ammóniumiont 1-4 alkil-, aril- vagy aralkilcsoport helyettesíti. E csoportokra a fenti meghatározások érvényesek; alkilcsoportként a metil-, etil- és n-propilcsoportot, arilcsoportként a fenilcsoport és aralkilcsoportként a benzilcsoportot különösen előnyben részesítjük.
Karboxamidocsoport alatt a -CONHg csoportot értjük, de olyan csoportokat is, ahol az aminocsoportot egy vagy két, adott esetben egy vagy több hidroxi-, karboxi- és/vagy alkoxi-karbonil-csoportot viselő alkilcsoport szubsztituálja.
···· ·· • ·
- 23 A találmány szerint használt /11/ általános képletű nitrozovegyületek közül azokat részesítjük előnyben, ahol R' és R egy fentebb leirt telitett vagy telítetlen láncot képez. Különösen előnyös, ha ez a lánc telítetlen, és kettőskötés-elektronjai és szabad nitrogén-elektronpárjai konjugációt létesítenek a kettőskötéssel vagy a /11/ általános képletű vegyület gyürübeli nitrogénatomjával, úgyhogy anellált aromás gyűrű jön létre.
A /11/ általános képletű vegyületek adott esetben tautomer formákban is előfordulhatnak, amelyek szintén a /11/ általános képletű vegyületek körébe tartoznak.
A találmány szerint előnyben részesítjük a /111/ /XII/ általános képletű nitrozovegyületeket, valamint adott esetben a megfelelő tautomer formáikat és sóikat.
E vegyületekben X-Y a fentebb megadott jelentésű.
Q Ί η Ί 1 Ί o
Az azonos vagy különböző R , R , R és R csoport hidrogénatomot, hidroxi-, alkil-, alkoxi-, alkil-tio-, aralkil-, aril-, karboxi-, alkoxi-karbonil-, karboxamido-, cianocsoportot vagy adott esetben egy vagy két, adott esetben egy vagy több hidroxi-, karboxi- és/vagy alkoxi-karbonil-csoportot viselő alkilcsoporttal szubsztituált aminocsoportot, vagy halogénatomot jelent, és két szomszédos csoport adott esetben alkiléncsoportot képez, amelyet magát arilcsoport helyettesítheti vagy azzal anellálódhat, és R^ adott esetben hidroxi-, karboxi-, SO^H, PO^Hg vagy dialkil-foszfinil-csoporttal szub- 24
sztituált alkil- vagy aralkilcsoportot jelent. E csoportok definíciói megfelelnek a /11/ általános képletű vegyületekre megadottaknak.
A találmány szerint különösen előnyben részesítjük a /111/, /IV/, /V/, /VII/, /VIII/ és /IX/ általános képletű vegyületeket, adott esetben megfelelő tautomer formáikat és sóikat. Legelőnyösebbek azok a vegyületek, ahol X-Y jelentése felelhet a /11/ általános képletű vegyületre megadottnak.
A találmány szerinti alkalmazáshoz kiválóan alkalmas vegyületnek bizonyult a 3-nitrozo-2-metil-pirazolo/I.5a7piridin, 3-nitrozo-pirazolo/I.5a7piridin és 3-nitrozo-pirazolo/3.2-c7-s-triazol és sói, különösen a hidrokloridsó.
Mint fentebb kifej tettük,a találmány szerinti eljárásban aromás nitrozovegyületeket a vizsgálandó próbával és a PQQ-függő dehidrogenázzal hozzuk érintkezésbe. Az EP-A-0 354 441 és EP-A-0441 222 számú európai szabadalmi bejelentések leírása szerint oxidázok és nem NAD-függő dehidrogenázok aromás nitrozovegyületeket elektrondus aromás aminovegyületekké redukálnak, amelyek azután szinképző kapcsoló reagenssel és oxidálószerrel oxidativ kapcsolás utján mutathatók ki.
Meglepő módon azt találtuk, hogy kinoidális iminovegyületek kimutatására szolgáló szinképző, nem oxidáló kimutató reagens és PQQ-függő dehidrogenáz jelenlétében egy aromás nitrozovegyületet analit-oxidáció közben a PQQ-függő
dehidrogenáz-katalizálta enzimatikus redukció nem alakit át teljesen elektrondus aromás aminná, hanem a részleges enzimatikus redukció után keletkezett közbenső iminovegyület nem oxidáló szinképző reagenssel befogható és kimutatható.
Még meglepőbb volt, hogy ha már kromogén csoportot viselő bizonyos aromás nitrozovegyületeket alkalmazunk, ezek PQQ-függő dehidrogenáz jelenlétében színes iminovegyületté redukálódnak ugyan, de az aromás aminná történő további redukció lényegében elmarad, úgyhogy a színes iminovegyület maga is kimutatható anélkül, hogy az analit mennyiségével arányos szint adó kimutató reagenssel további reakciót hajtanánk végre. A megfelelő, találmány szerint használható kromogén nitrozovegyületekre az alábbiakban adunk meg példákat.
Noha az alkalmas elektrondus aromás nitrozovegyületek tartománya nagyon széles, mégis mindegyikük közvetlen elektronakceptorként szolgál a PQQ-függő dehidrogenázok számára. Lényegesnek csak az elektrondus aromás csoporthoz kötődő nitrozocsoport látszik.
Feltételezzük, hogy a reakció az 1. reakcióvázlat szerint megy végbe, melyet a nitrozo-anilin példáján mutatunk be. E reakcióvázlat szerint az /1/ képletü aromás nitrozovegyület az analit-oxidáció közben /2/ képletü aromás hidroxil-aminná redukálódik, melyről spontánul viz hasad le, és ezáltal képletü közbenső kinoidális iminovegyület képződik. Mielőtt e vegyületet a PQQ-függő dehidrogenáz enzimatikusan aromás :···< 4 ♦····»
Μ ·· γ » 9 9 9 999 · 9999 9 99
999 » « 999
- 26 aminná redukálná, amint ez az EP-A-03 54 441 és EP-A-0 441 222 számú európai szabadalmi bejelentésekből ismeretes, például egy kapcsoló reagenssel /HR/ befogható” és /4/ képletű szines kapcsolási termékként kolorimetriásan meghatározható, vagy a kapcsolási termék kromogén csoportját már az /5/ képletű kiindulási vegyületben tartalmazza és igy enzimatikus redukció után szines /4/ képletű iminovegyületként közvetlenül kolorimetriásan meghatározható.
Meglepő, hogy sajátosan PQQ-függő dehidrogenázok használatakor a /3/ képletű imino-köztitermék a találmány szerinti kimutató reagenssel befogható” vagy közvetlenül kimutatható, anélkül, hogy az aminná történő, az EP-A-0 354 441 számú európai szabadalmi bejelentésből ismert további enzimatikus reakció végbemenne. Mig flavin-függő oxidázok használatakor - amelyek az EP-A-0 354 441 számú európai szabadalmi bejelentés szerint szintén redukálnak aromás nitrozovegyületeket - a közbenső iminovegyületeknek csak kis részét sikerül kimutatni, . a közbenső iminovegyületek legnagyobb része analit-oxidáció közben enzimatikusan nagyon gyorsan tovább redukálódik aromás aminná.
A találmány szerint az iminovegyület saját színe alapján mutatható ki.
A találmány szerint a kinoidális iminovegyület szinképző, nem oxidáló reagenssel is kimutatható. A ”szinképző megjelölés azt jelenti, hogy a szinképző reagens és az iminovegyület reagáltatása utján szines anyagot kapunk, melynek « ···- V ···« ·* ♦ · · 4· · ♦ « « · ♦ 9·· * * 4··4 · «· ··· · · 4«*
- 27 abszorpciós maximuma különbözik a reakció előtt használt nitrozovegyületetői és a szinképző vegyületétó'l. Nem oxidáló, szinadó kimutató reagens alatt azt értjük, hogy a kimutató reagens a kimutatandó vegyülettel szinképződés közben reagál, anélkül,hogy a kimutató reagens a kimutatandó vegyületet oxidálná /például egy a kimutató reagensben jelenlevő további oxidálószer utján/.
A találmány szerinti eljárásban képződő iminovegyület úgy is kimutatható, hogy szinképző kapcsoló reagenst reagáltatunk az iminovegyülettel. Ekkor színes anyag képződik, amely az iminovegyületet részszerkezet formájában tartalmazza. A kimutatás azonban úgy is történhet, hogy az iminovegyület egy leukofesték molekulát színes molekulává oxidál.
A két kimutatási elv kombinációja is lehetséges, amikor egy kapcsoló reagenst a kimutatandó iminovegyület molekulájával nem színes leukofesték-molekulává kapcsoljuk, amelyet az iminovegyület egy további molekulája festékké oxidál.
Iminovegyületek kimutatására szolgáló számos szinképző reagens ismeretes. Elvileg minden olyan anyag tekintetbe jön, amely oxidált p-fenilén-diamin-származékokkal szinképződés közben reagál.
Szinképző kapcsoló kimutató reagensekre példák az aromás vegyületek, előnyösen fenol- és naftolvegyületek, amelyeket jó távozó csoportok szubsztituálnak és ezáltal e távozó csoportok könnyen és nagyon gyorsan, szinképződés közben he.: ···: ϊ ···: .*·, • · · · · ·«.
• · ·*<·· · · · lyettesitődhetnek a kimutatandó iminovegyülettel. Előnyös példa az 1-naftol-4-szulfonsav, 2,4,6-tribróm-3-hidroxi-benzoesav, 2,4-diklór-l-naftol, tatrazin vagy Orange 1.
A találmány szerinti eljárásban az iminovegyület kimutatására olyan reagensek is alkalmazhatók, amelyek nem az iminovegyülettel kapcsolódnak, hanem az iminovegyület aminná történő redukciója közben színes vegyületet képeznek. Ez gyakran a leukofesték dimerizációja közben következik be. A szakember alkalmas leukofestékeket ismer a HgOg vagy peroxidáz kimutatására szolgáló eljárásokból. Ilyen leukofestékek például az 1-naftil-amino-szulfonsavak, triaril-imidazolok /2735690 számú Német Szövetségi Köztársaság-beli nyilvánosságrahozatali irat/, diaril-imidazolok /4,919,890 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás/, amino-karbazolok /2205733 és 2338932 számú Német Szövetségi Köztársaság-beli nyilvánosságrahozatali irat/, oxazolok, tiazolok /EP-A-0 167 973 számú európai szabadalmi bejelentés/ és mások.
Alkalmas minden olyan leukofesték, amely redoxpotenciálja alapján iminovegyületek redukálására képes.
Végül a kapcsoló reagenssel való kapcsolás és leukofestékek oxidációjának kimutatási elvei kombinálhatok is, amikor az iminovegyületek kapcsolási komponenseként az iminovegyületekkel színtelen leukovegyületet képező reagenst alkalmazunk, amelyet a megfelelő aromás aminná történő redukciója közben csak egy második iminovegyület-molekula oxidál festékké.
A leginkább használatos, a színes fényképészetből jól ismert úgynevezett kapcsolók” közé fenolok, naftolok, anilinek, naftil-aminok és származékaik, valamint metilén-aktiv vegyületek tartoznak. Ilyen kapcsolókról áttekintést ad James T.H. a The Theory of the Photographic Process” kézikönyvben /3. kiadás, McMillan, Név/ York, 1966, 17. fejezet, 385-390 oldal/.
A találmány szerinti eljárást úgy hajtjuk végre, hogy a vizsgálandó próbát egyidejűleg egy PQQ-függő dehidrogenázzal, egy vagy több, fentebb leirt elektrondus aromás nitrozovegyülettel és iminovegyületek kimutatására szolgáló reagenssel hozzuk érintkezésbe. Ha a próba analitot tartalmaz, amelyet a PQQ-függő dehidrogenáz oxidálni fog, az aromás nitrozovegyület enzimatikus redukció közben megfelelő iminovegyületté alakul át. Az utóbbi a szinképző kimutató reagenssel reagál, úgyhogy a kialakult szín korrelálni fog a próba analitkoncentrációjával. A szinmérés szinösszehasonlitás utján közvetlenül vizuálisan történhet, vagy az értékelést fotometriásan hajtjuk végre.
Analitok oxidativ kimutatására szolgáló, különösen egyszerű eljárás akkor alkalmazható, ha az aromás nitrozovegyület redukciója utján képződő iminovegyület maga színes és nem kell először szinképző kimutató reagenssel kapcsolás utján, vagy egy leukofesték oxidációja utján kimutatni. Színes iminovegyületek, mint említettük, a szakember előtt a színes fényképészetből és analitikai kimutató eljárásokból ismertek.
Analitok színes kinoidális iminovegyület közvetlen
- 30 mérésén alapuló, találmány szerinti oxidativ kimutatásához különösen alkalmasnak bizonyultak a /XIII/ általános képletü nitrozo-anilin-vegyületek mint közvetlen kromogén elektronakceptorok, amelyek /XIV/ általános képletü színes kinondiiminné redukálódnak. A /XIII/ általános képletben r! jelentése hidrogénatom, hidroxicsoport, halogénatom, alkoxi-, alkil-tio-, aril-oxi- vagy aril-tio-csoport, adott esetben hidroxi-,
tál egy- vagy többszörösen szubsztituált aminocsoport, melynek alkil-szubsztituenseit is adott esetben hidroxi-, PO^Hg, dialkil-foszfinil-, SO^H vagy karboxicsoport helyettesítheti ,
X-Y jelentése NR^-CO vagy N=CR^ általános képletü csoport, ahol és R^ a /11/ általános kép letre megadott jelentésű és
A jelentése 3-tagu, egy nitrogénatomot vagy kénatomot és két szénatomot, vagy két nitrogénatomot és egy szénatomot tartalmazó telitett vagy telítetlen lánc, ahol a szénatomokat adott esetben alkil-, alkoxi-, alkil-tio-, hidroxi-, aralkil-, aril-, karboxi-, karboxamido-.
- 31 alkoxi-karbonil-, cianocsoport, halogénatom, adott esetben egy vagy két alkilcsoporttal helyettesített aminocsoport, melynek alkil-szubsztituensei adott esetben egy vagy több hidroxi-, karboxi- és/vagy alkoxi-karbonil-csoportot viselnek, és ahol a nem kettőskötésen át kötődő nitrogénatomokat hidrogénatom, adott esetben SO3H2 vagy dialkil-foszfinil-csoporttal szubsztituált alkilcsoport, vagy aralkilcsoport helyettesíti, vagy két szomszédos láncbeli szubsztituens adott esetben alkiléncsoportot képez, amelyet magát adott esetben arilcsoport szubsztituálhat vagy azzal anellálódhat, valamint . adott esetben a megfelelő tautomer formák és ezek sói.
Az egyes szubsztituensek jelentése azonos a /11/ általános képletre megadottakkal. R^ előnyös jelentése hidrogénatom és alkilcsoport, és X-Y előnyösen N=CR^ általános képletű csoportot jelent.
Különösen előnyös, ha az A szubsztituens a szomszédos heterociklussal imidazol-, triazol-, benzimidazol-, tiazol- vagy dihidroimidazolgyürüt képez, melynek szénatomjai az A szubsztituens általános definíciójában megadott szubsztituenseit hordozhatják. Rendkívül előnyös az imidazolgyürü.
Különösen előnyös vegyületek az alábbiak:
• ♦
- 32 1/ /2,4-dimetil-pirazolo/I.5a7iniidazol-3-il/-/4-nitrozo-fenil/-amin
2/ /4-metil-pirazolo/I.5a7imidazol-3-il/-/4-nitrozo-fenil/-amin
3/ /4-/dimetil-foszfinil-metil/-2-metil-pirazolo/I.5a7imidazol-3-il7-/4-nitrozo-f enil/-amin
5/ /5,6-dihidro-4-dimetil-foszfinil-metil/-/2-metil-pirazolo/T.5a7imidazol-3-il/-/4-nitrozo-f enil/-amin
6/ /4-/dimetil-f oszfinil-metil/-2-metil-pirazolo/I.5a7imidazol-3-il7-/4-nitrozo-f enil/-amin
7/ /2,6-dimetil-4-dimetil-foszfinil-metil-pirazolo/3.2-c7s-triazol-3-il/-/4-nitrozo-fenil/-amin.
Ha a találmány szerinti eljárást úgy hajtjuk végre, hogy az aromás nitrozovegyület redukciója utján közvetlenül /XVII/ általános képletü színes kinondiiminvegyület képződik, a vizsgálandó próbát egyidejűleg egy PQQ-függő dehidrogenázzal és egy vagy több /XVI/ általános képletü elektrondus aromás nitrozovegyülettel hozzuk érintkezésbe. Ha a próba a PQQ-függő dehidrogenáz által oxidálódó analitot tartalmaz,az elektrondus aromás nitrozovegyület megfelelő színes kinondiiminné alakul át. A kromogén elektrondus pirazolgyürüvel kondenzálódott A gyűrű további elektrongazdqepágának az a hatása, hogy a képződött kinondiiminvegyület meglepő módon már nem redukálódik tovább a megfelelő aminná, hanem a színes kinondiiminvegyület közvetlenül fényelnyelés-mérés utján határozható meg
- 33 és korrelációba hozható a minta analitkoncentrációjával. A kromogén aromás nitrozovegyület gyors enzimatikus redukciójának elérése szempontjából előnyös, ha a vegyület kielégítően oldódik. A /XIII/ általános képletű kromogén aromás nitrozovegyületek alkalmazásakor a találmány szerinti eljárás számára különösen előnyös, ha a vegyület koncentrációja az oldatban
-3 , , —2 legalább 10 mól/liter, előnyösen legalább 10 mól/liter.
Jó oldékonyság különösen azáltal érhető el, hogy a kromogén nitrozovegyületet hidrofil csoportokkal látjuk el.
Ennek megfelelően a találmány szerinti eljáráshoz rendkívül alkalmas kromogén nitrozovegyületek például a fent említett /3/, /4/ és /7/ általános képletű vegyületek.
Az eljárás un. nedves tesztben, például küvettában, vagy un. szárazpróbában megfelelő reagenshordozón hajtható végre, melynél a szükséges tesztreagensek teszthordozón, különösen szivóképes vagy duzzadásra hajlamos anyagon vannak jelen. Ilyen teszthordozók például a DE-A-3 247 608 számú Német Szövetségi Köztársaság-beli szabadalmi leírásból, az EP-A-0 262 445 vagy EP-A-0 256 806 számú európai szabadalmi bejelentésből ismertek.
A találmány további tárgyát analitok enzimatikus oxidáció általi meghatározására szolgáló szer képezi. Az ilyen szer a meghatározandó analit enzimatikus oxidációjához szükséges PQQ-függő dehidrogenázon és a nitrozovegyületen kívül, mely utóbbi közvetlen elektronakceptorként az analit enzimatikus
- 34 oxidációjánál felszabaduló elektronokat a PQQ/dehidrogenázrendszertől átveszi, az iminovegyület kimutatásához még további, nem oxidáló szinképző kimutató reagenst is tartalmaz.
PQQ-dehidrogenázokként, aromás nitrozovegyületekként és a kinoidális iminovegyületek kimutatására szolgáló szinképző reagensekként a fentebb leirt, találmány szerinti anyagok használhatók. Ha a találmány szerinti eljárásban az anilin nitrogénatomjához kötődő kromogén csoportot már tartalmazó /XIII/ általános képletü vegyületet alkalmazunk, úgy a szer előnyösen nem tartalmaz iminovegyületet kimutató reagenst, minthogy, a redukciónál képződő /XIII/ általános képletü kinondiimin már szines.
A találmány kivitelezéséhez alkalmas és a használandó enzimekhez és kimutató reagenshez igazodó pH-érték beállításához a találmány szerinti szer pufférrendszert tartalmaz, amely a tesztoldatban 4-9 pH-értéket tart fenn. Különösen előnyös az 5 és 6,5 közötti, enyhén savas pH-érték.
A találmány szerinti szer oldatként, vagy szivóképes vagy duzzadásra hajlamos hordozóra felvive lehet jelen. Oldat formájában a szer előnyösen a találmány szerinti eljáráshoz szükséges számos reagenst tartalmaz. Oldószerként előnyös a víz, de vizoldható szerves oldószerekkel, mint metanollal, etanollal, acetonnal vagy dimetil-formamiddal is elegyíthető. Tartóssági okokból előnyös lehet a próbához szükséges reagenseket két vagy több oldatra szétosztani, amelyeket csak a
- 35 tulajdonképpeni kísérletnél keverünk össze. Célszerű azonban arra ügyelni, hogy az aromás nitrozovegyület és az iminovegyületek kimutató reagense a próba elkezdése előtt oldatban legyen. A használt aromás nitrozovegyületek koncentrációja a mérendő analit koncentrációjához igazodik.
A találmány szerinti eljárásban a mérendő analit —fi —2 jellemző koncentrációja 10 -10 mól/liter, különösen
-5 -3 J - 10 mól/liter. Ennek megfelelően a használt nitrozovegyületek jellemző koncentrációja 10”^ - 10-3· mól/liter. Kielégítően gyors enzimatikus redukció elérése érdekében a nitrozovegyületek, különösen a /XIV/ általános képletü koromogén nitrozovegyületek koncentrációja előnyösen meghaladja a mól/litert. Az alkalmazott PQQ-függő dehidrogenáz koncent rációja aktivitásától és az analit koncentrációjától függ
Küvetta-próbánál az enzimkoncentráció jellemző értéke 1 mE/ml
E/ml.
Az iminovegyületek kimutatására szolgáló reagenseket a nitrozovegyületekhez viszonyítva legalább sztöchiometrikus arányban használjuk, előnyösen 1,5 - 2-szeres feleslegben.
A találmány szerinti szer tesztcsík formájában is alkalmazható. Az ilyen tesztcsíkok a legkülönbözőbb kiviteli formákban ismeretesek, például az EP-A-0 016 387 számú európai szabadalmi bejelentésből, a DE-A-3247608 számú Német Szövetségi Köztársaság-beli szabadalmi leírásból, az EP-A-0 262 445 vagy EP-A-0 256 806 számú európai szabadalmi bejelentésből
- 36 ismert formákban. A tesztcsíkban a kimutató eljárás végrehajtásához szükséges reagensek szilárd, hordozórétegeken vannak jelen. Hordozórétegekként különösen szívóképes vagy duzzadásra hajlamos anyagok jönnek tekintetbe, amelyeket a vizsgálandó próbafolyadékkal benedvesitünk. Alkalmas hordozó például a zselatin-, cellulóz- vagy müszálréteg. A hordozóanyagon vagy -anyagban a reagensek szilárd formában találhatók. Amikor a próbafolyadékot felvisszük a tesztcsíkra, vagy a tesztcsíkot a próbafolyadékba bemártjuk, a csikban folyékony közeg alakul ki, amelyben a kimutató reakció végbemegy. A reakcióban képződő szín vizuálisan vagy fotometriásan, például reflexiós fotométer segítségével értékelhető.
Az egyes reagensek előnyös koncentrációi a tesztcsíkon:
analit - jellemzően 10”^ - 10-^ M nitrozovegyület - 10 - 1 M nem oxidáló kimutató reagens - 10 - 1 M enzim - 0,1 - 100 E per tesztmező.
A találmány szerinti eljárás azzal az előnnyel jár, hogy az elektronakceptor redukciójához nincs szükség aspecifikus redukciós katalizátorokra, mint diaforázra vagy metil-fenazinium-metoszulfátra, hanem az elektronakceptor redukciója közvetlenül specifikus analit/enzimrendszeren át valósul meg. Ezáltal zavaró mellékreakciók elkerülhetők. Ha elektronakceptorként nitrozovegyületeket használunk, az elektronakceptort nem korlátozza
- 37 • ·
többé például a túl lassú diffúzió, amint ez oxigén-elektronakceptor esetében előfordul. A kimutatandó közbenső' iminovegyület ekvivalensére vonatkoztatva csak 1 ekvivalens analit oxidálódik, ami az analit kimutatását igen érzékennyé teszi. Ezenfelül nincs szükség oxidálószerekre a szinképzó' reagenssel történő' reakcióhoz. Ezért az egész kimutatási reakció zavar nélkül, egy lépésben és közös oldatban hajtható végre. A használandó szinképző kimutató reagensek - egyebek mellett a színes fényképészetből ismertek - nagy sávszélessége lehetővé teszi a méréshez használt hullámhossz és a mérés pontosságát meghatározó extinkciós koefficiens csaknem szabad megválasztását .
Különösen egyszerű a találmány szerinti eljárás, ha közvetlenül színes iminovegyület képzó'dik és szükségtelenné válik a szinképző reagenssel történő reakció.
A találmány további tárgyát uj /XIII/ általános képletű kromogén nitrozo-anilin-származékok képezik, ahol
R·1 jelentése hidrogénatom, hidroxicsoport, halogénatom, alkoxi- vagy alkil-tio-, aril-oxi- vagy aril-tio-csoport, adott esetben hidroxi-, karboxi-, alkil-, dialkil-foszfinil- vagy
SO^H csoporttal adott esetben szubsztituált alkilcsoport, adott esetben hidroxi-, karboxi-, PO3H2 vagy SO3H csoportot hordozó alkilcsoporttal egy- vagy többszörösen helyettesített amino♦♦ · • · * · ♦ * * »· * « **··· · 9 *♦· · 9 9 9 · ·
- 38 csoport,
X-Y jelentése NR^-CO vagy N=CR^ általános képletü csoport, ahol
R hidrogénatomot, adott esetben hidroxi-, karboxiSO^H, PO3H2 vagy dialkil-fősziinil-csoporttal szubsztituált alkilcsoportot,
R hidrogénatomot, adott esetben hidroxi-, dialkil-foszfinil-, karboxi-, SO^H, PO^H2 csoporttal, e savmaradékok sójával és/vagy alkoxi-karbonilcsoporttal helyettesített alkilcsoportot jelent, vagy r6 jelentése aminocsoport, melyet adott esetben egy vagy két hidroxi-, karboxi- és/vagy alkoxi-karbonil-csoportot hordozó, egy vagy két alkilcsoport helyettesit, és ha az arainocsoportot két alkilcsoport szubsztituálja, e csoportok gyűrűhöz is kapcsolódhatnak, amelyet az aminocsoport nitrogénatomján kívül adott esetben oxigén-, kénatom vagy egy további nitrogénatom szakíthat meg; vagy r6 olyan aminocsoportot jelent, amelyet adott esetben egy vagy két acilcsoport, alkoxiés/vagy aralkoxi-karbonil-csoport, I^N-CO-, alkil-, aralkil- és/vagy aril-karbamoil-csoport szubsztituál; vagy • · · · • · ♦ · 4 • · ♦·*· « ·*♦ · 9 *·
- 39 r6 hidrogénatomot, karboxi-, alkoxi-karbonil-, karboxamidocsoportot vagy halogénatomot jelent, és
A jelentése 3-tagu, egy nitrogénatomot vagy kénatomot és két szénatomot, vagy két nitrogénatomot és egy szénatomot tartalmazó telitett vagy telítetlen lánc, ahol a szénatomokat adott esetben alkil-, alkoxi-, alkil-tio-, hidroxi-, aralkil-, aril-, karboxi-, karboxamido-, alkoxi-karbonil-, cianocsoport, halogénatom, adott esetben egy vagy két alkilcsoporttal helyettesített aminocsoport szubsztituálja, melynek alkilszubsztituensei adott esetben egy. vagy több hidroxi-, karboxi- és/vagy alkoxi-karbonil-csoporto viselnek, és a nem kettőskötésen át kötődő nitrogénatomokat hidrogénatom, adott esetben 0H-, SO^H, COOH-, PO^H^ vagy dialkil-foszfinil-csoporttal szubsztituált alkilcsoport, vagy aralkilcsoport helyettesíti, vagy két szomszédos láncbeli szubsztituens adott esetben alkiléncsoportoi képez, melyet adott esetben arilcsoport szubsztituál vagy vele anellálódik, valamint adott esetben a megfelelő tautomer formák és sóik.
Az egyes szubsztituensek jelentése azonos a /11/ általános képletre megadottakkal.
*· · · ·· • · · · · • ♦ * ·« ···· · · , • · Λ ' ·
- 40 Ί
R előnyösen hidrogénatomot vagy szubsztituált vagy szubsztituálatlan alkilcsoportot jelent, X-Y előnyösen
6
N=CR általános képletü csoportot képez, ahol R előnyösen szubsztituált vagy szubsztituálatlan alkilcsoport.
Az A szubsztituens a szomszédos heterociklussal előnyösen imidazol-, triazol-, benzimidazol-, tiazol- vagy dihidroimidazolgyürüt képez, ahol a gyürübeli szubsztituensek jelentése azonos a /111/ általános képletre megadottal. Az A szubsztituens rendkívül előnyösen imidazolgyürüt képez. Különösen előnyös vegyületek az alábbiak:
1/ /2,4-dimetil-pirazolo/I.5a7imidazol-3-il/-/4-nitrozo-fenil/-amin
2/ /4-metil-pirazolo/I.5a7imidazol-3-il/-/4-nitrozo-fenil/-amin
3/ /4-/dimetil-foszfinil-metil/-2-metil-pirazolo/I.5a7imidazo1-3-il7~/4-nitrozo-fenil/-amin
5/ /5,6-dihidro-4-dimetil-foszfinil-metil/-/2-metil-pirazolo/I. 5a7imidazol-3-il/-/4-nitrozo-fenil/-amin
6/ /4-/dimetil-foszfinil-metil/-2-metil-pirazolo/I.5a7imidazol-3-il7~/4-nitrozo-fenil/-amin
7/ /2,6-dimetil-4-dimetil-foszfinil-metil-pirazolo/3.2-c7s-triazol-3-il/-/4-nitrozo-fenil/-amin.
A /XIII/ általános képletü vegyületeket önmagában ismert módon állítjuk elő, például Hays J.T. leírása szerint /J. Org. Chem. 32., 158 /1967//. Ehhez p-nitrozo-fenol-származékok »·»· » • 4 • · • · *··♦ ·· • 4« • ··· » · · · · »9 • ♦·'♦
- 41 étereit, előnyösen metil-éterét protonkatalizis közben megfelelő 4-amino-heterociklusokkal reagáltatunk. A metoxicsoport szubsztitúciója utján /XIII/ általános képletű szekunder aminok képződnek.
A használt heteroaril-aminok irodalmi leírások alapján ismertek, vagy ismert eljárásokkal előállíthatok. Az EP-A-0 433 854 számú európai szabadalmi bejelentésben különösen olyan aminovegyületeket Írnak le, amelyek építőelemként pirazolo-heterőciklusokat tartalmaznak.
A köztitermékként szolgáló aminovegyületek tartóssági okokból általában erős savak, például ásványi savak sóiként használatosak. p-Nitrozo-anizolokkal való reakcióhoz előnyösen az aminovegyületek szabad bázisait használjuk, amelyeket szokásos módszerekkel állítunk elő, például olymódon, hogy a sót vízben oldjuk, pH 8 - 10 eléréséig bázist adunk hozzá és a szabad bázist szerves oldószerrel, például etil-acetáttal vagy metilén-kloriddal kivonjuk. Különösen nehezen oldódó aminovegyületekné^ azonban úgy is eljárhatunk, hogy az aminovegyületet metanolban oldjuk, majd bázist, például NaHCO^oldatot, trietil-amint vagy hasonlót adunk hozzá, amíg nedves pH-papiron mintegy 5-6 pH-értéket kapunk. Végül hozzáadjuk a második reakciópartnert, a p-nitrozo-anizolt.
1. példa
Glükóz-meghatározás PQQ-függő glucose-dye—oxidorectase”—zal /Gluc-DOR/ és 1-naftolszulfonsav kapcsoló reagenssel
Küvettában összekeverjük az alábbi oldatokat:
Citrátpuffer/pirofoszfátpuffer /50 mM/ pH 7,5
N,N-Bisz/2-hidroxi-etil/-4-nitrozo
-anilin /5 mM, pufferben/
0,38 ml
0,40 ml
1-Naftol-4-szulfonsav /10 mM, vízben/ kapcsoló reagens
0,20 ml
Próbaoldat /0-40 mM glükóz/
0,01 ml
A próbát 0,01 ml enzimoldat /glucose-dye-oxidoreductase, EC 1.1.99.17, 900 U/mg, 800 E/ml7 indítjuk el és 606 nm-en lemérjül az extinkció-változásokat. Konstans extinkció értékeket legfeljebb 5 perc után érünk el /1. ábra/.
2. példa
Glükóz-meghatározás PQQ-függő glucose-dye-oxidoreductase-zal és 2,4,6-tribróm-3-hidroxi-benzoesav kimutató reagenssel
Tesztoldat /végkoncentrációk/
| 100 mM | Citrátpuffer pH 5,8 |
| 10 mM | 2,4,6-tribróm-3-hidroxi-benzoesav |
| 1 mM | N,N-bisz/2-hidroxi-etil/-4-nitrozo- |
| -anilin | |
| 10 E/ml | glucose-dye-oxidoreductase |
| 0,1 M | nátrium-nitrát |
| 100-500 mM | glükóz |
A glükózkoncentráció növelésekor a zöld festék fokozott képződése figyelhető meg /max = 700 nm, 2. ábra/.
3. példa
Az iminek kimutatásához hasonló módon használhatók az 1, táblázatban felsorolt kapcsoló reagensek is. Az 1. táblázat az N,N-bisz/2-hidroxi-etil/-p-kinondiiminnek a megadott kapcsoló reagensekkel való kapcsolása után kapott abszorpciós maximumokat mutatja.
1. táblázat
| Kapcsoló | Szin | nax:nm | Megjegyzés |
| N-fenil-N-metil-amino· | szürkészöld | 740 | |
| -metil-foszfonsav | |||
| N-metil-antranilsav | zöld | 720 | erős sávok |
| julolidin | türkiz | 710 | széles sávok |
| 2,4,6-tribróm-3- | zöld | 705 | |
| -hidroxi-benzoesav | |||
| 1-naftol-2-szulfonsav | kék | 640 | |
| 3,4,5-trimetoxi- | kékeszöld | 610 | |
| -benzoesav | |||
| 3-metil-l-fenil-2- | ibolya | 565 | |
| -pirazolin-5-on | |||
| acetecetsavanilid | narancs | 455 | széles sávok |
| 2,4-diklór-l-naftol | kék 600 | /670 rövid/ lassan fakul | |
| 4-bróm-2,6-dimetil- | kék | 600 | stabil |
| -fenol | |||
| 3-fenil-5-izozazolon | orgona | 565 | |
| benzoil-acetonitril | piros /ibolya/ 515 | inteziv, ragyogó | |
| cián-acetanilid | narancs-piros | 490 | |
| 1’ képletü vegyület | kék | 595 | ragyogó szin |
| 2* képletü vegyület | kékesszürke | 590 | sárgává halványul |
| 3’ képletü vegyület | kékesszürke | 605 szürke-vörösessé | |
| halványul | |||
| 4’ képletü vegyület | ibolya | 550 | gyenge festó'dés |
| Tartrazin | zöld | 610 | keverékszin |
| Orange 1 | kék | kb. 650 | |
| 5’ képletü vegyület | kék | kb. 600 |
·· *·*1 2 *♦·♦ ·· . . * · · • · · · · ·· ., · 1 ···· · · · ··* · * ·« ·
4. példa
Az 1. példához hasonlóan a 2. táblázatban felsorolt különböző elektrondus aromás nitrozovegyületeket alkalmazzuk.
A 2. táblázat az 1-naftol-2-szulfonsavval vagy l-naftol-4-szulfonsavval történő kapcsolás után kapott színeket illetve abszorpciós maximumokat tünteti fel.
2. táblázat
nm
Nitrozovegyület
Kapcsoló
Szín
| 6’ | képletű | vegyület | 1-naftol-2-szulfonsav | ibolya | 530 |
| 7’ | képletű | vegyület | 1-naftol-2-szulfonsav | bíbor | 530 |
| 8» | képletű | vegyület | 1-naftol-4-szulfonsav | ibolya- kék | 610 |
| 9» | képletű | vegyület | 1-naftol-4-szulfonsav | II | 610 |
| 10» | képletű | vegyület | 1-naftol-4-szulfonsav | II | 640 |
| 11» | képletű | vegyület | 1-naftol-4-szulfonsav | II | 550 |
| 12» | képletü | vegyület | 1-naftol-4-szulfonsav | II | 550 |
| 13’ | képletű | vegyület | 1-naftol-4-szulfonsav | II | 595 |
| 14’ | képletű | vegyület | 1-naftol-4-szulfonpav | II | 605 |
| 15’ | képletű | vegyület | 1-naftol-4-szulfonsav | II | 520 |
| 16’ | képletű | vegyület | 1-naftol-4-szulfonsav | II | 550 |
| 17’ | képletű | vegyület | 1-naftol-4-szulfonsav | II | 540 |
5. példa
Összehasonlító glükóz-meghatározás iminovegyületek kimutatása utján, PQQ-függő glucose-dye-oxidoreductase és glükóz-oxidáz reduktív összekapcsolásával
Küvettába bemérjük a következő vegyületeket:
100 mM foszfátpuffer pH 7,5 mM N,N-bisz/2-hidroxi-etil/-4-nitrozo-anilin mM 1-naftol-4-szulfonsav
100 E/ml glucose-dye-oxidoreductase
Glükóz /0 - 60 mM/ hozzáadása utján megfelelő festékmennyiségeket kapunk /3. ábra/.
Ha a glucose-dye-oxidoreductase-t azonos mennyiségű glükóz oxidázzal helyettesítjük, egy 8-as faktorral kisebb intenzitású szint mérünk, minthogy a képződött közbenső kinondiimint a glükóz oxidáz glükóz-fogyasztás közben fenilén-diaminná továbbredukálja /4. ábra/.
···· ·· • » * • ·♦ * · · * · β
6. példa
Glükóz-meghatározás PQQ-függő glucose-dye-oxidoreductasen-zal színes iminovegyületek reduktív képzése utján
Az 1. reakcióegyenlet szerinti reakció megy végbe.
A 3 és a 3a képletű vegyületek spektrumait az 5. ábra mutatja be.
Bemérés /végkoncentrációk/
200 mM citrátpuffer pH 6 mM p-nitrozo-anilin /a 3. táblázat 3. számú vegyülete/ mM CaClg és 20 E/ml mutarotáz
E/ml glucose-dye-oxidoreductase
Különböző' mennyiségű glükóz /0 - 50 uM végkoncentráció/ hozzáadása után 5 perc múlva meghatározzuk az extinkcióváltozásokat /6. ábra/.
Hasonlóan alkalmazzuk a 3. táblázat vegyületeit.
A 3. táblázat a használt nitrozovegyületek és a képződött színes kinondiiminek abszorpciós maximumait mutatja.
3. táblázat
| Szerkezet | Oldékonyság vízben | max p-Nitrozo- -anilin | /máz /ral/ Kinondiimin |
| 1 sz. vegy. | 1 mM | 420 | 615 |
| 2 sz. vegy. | 1 mM | 430 | 590 |
| 3 sz. vegy. | 10 mM | 430 | 620 |
| 4 sz. vegy. | 10 mM | 430 | 620 |
| 5 sz. vegy. | 0,1 mM | 420 | 630 |
| 6 sz. vegy. | 10 mM | 420 | 610 |
| 7 sz. vegy. | 10 mM | 420 | 617 |
| 8 sz. vegy. | 0,2 mM | 430 | 590 |
7« példa
PQQ-függő glucose-dye-oxidoreductase enzimaktivitásának meghatározása színes iminovegyület aromás nitrozovegyületből történő reduktív képzése utján
A 6, példában leirt reakció PQQ-függő dehidrogenázok enzimaktivitásának mérésére is felhasználható.
Bemérések /végkoncentráció/
200 mM citrátpuffer pH 5,8 mM p-nitrozo-anilin /3 sz. vegyület a 6. példából/ mM CaClg mM glükóz
A kinetikus mérést 0 - 1 mE glucose-dye-oxidoreductase'’-zal indítjuk el és a színváltozást időnként meghatározzuk /7. ábra/.
8. példa /4-/Dimetil-foszfinil-metil/-2-metil-pirazolo/1.5a7imidazol-3-il7-/4-nitrozo-fenil/-amin /3 sz. vegy./
13,7 g 3-amino-2-metil-4-/dimetil-foszfinil-metil/-pirazolo/I.5a7iniidazol-dihidrokloridot 350 ml metanolban oldunk. Az oldatot lehűtjük mintegy 5°C-ra és addig adunk hozzá tömény vizes NaHCO^-oldatót, amig a nedves pH-papir körülbelül pH 6-ot mutat. Az oldathoz 30 percen belül 35 ml metanolban oldott 7,8 g p-nitrozo-anizolt adunk. 4 órán át szobahőmérsékleten keverjük és további NaHCO^-oldat hozzáadása utján fenntartjuk a pH 6-értéket.
A reakciókeveréket leszűrjük, elkeverjük mintegy 150 ml szilikagéllel és szárazra pároljuk. A szilikagélt szilikagél-oszlopba töltjük és a terméket toluol/metanol 2:1 eleggyel izoláljuk. 10,3 g barnásfekete tömeget kapunk, melyet szilikagélen metilén-klorid/metanol 12:1 eleggyel ismét kromatografálunk. 4,9 g címben megadott terméket kapunk, melynek olvadáspontja 204°C /bomlás/.
R^ /szilikagél/ toluol/metanol 2:1 = 0,3
CH2C12/metanol 12:1 = 0,21 «·· •••S ι .· :.:. . ’ • * ·· *··· «· • · #
A kiindulóanyag előállítása a/ 4-/Dimetil-foszf inil-metil/-2-metil-pirazolo/r.5 a7imidazol g 2-metil-pirazolo/I.5a7imidazolt /J. Hét. Chem. 10, 441 /1973// 370 ml vízmentes dimetil-formamidban oldunk, és 54,2 g klór-metil-dimetil-foszfanoxidot és 119 g kálium-karbonátot adunk az oldathoz, majd 10 órán át 115°C-on /fürdőhőmérséklet/ keverjük. A csapadékot leszivatjük és a szürletet bepároljuk. A maradékot szilikagélen kromatografáljuk /eluens: etil-acetát/metanol 2:1/. Összesen 36,6 g címben megadott vegyületet kapunk barna kristályok és barna olaj keverékeként.
Vékonyréteg-kromatográfia /szilikagél, etil-acetot/metanol 2:1/ Rf = 0,2 b/ /3-Amino-4-dimetil-foszfinil-metil/-2-metil-pirazolo/I.5a7imidazol*2 HC1
A fentiek szerint kapott vegyület 18 g-ját ml tömény sósavoldat és 50 ml viz elegyében oldjuk. 0°C-on
6,2 g nátrium-nitrit 25 ml vízzel készült oldatát csepegtetjük hozzá. 30 perc múlva 0°C-on az oldatot NaHCO^-oldattal enyhén meglugositjuk, majd részletekben 21,4 g nátrium-ditionit-oldatot adunk hozzá. Az elegyet még 30 percen át keverjük, majd hozzáadunk 100 ml dioxánban oldott 17 g di-terc-butil-dikar« ·· ···
bonátot. A reakcióelegyet éjszakán át szobahőmérsékleten keverjük, a dioxánt lepároljuk és a maradékot n-butanol/etil-acetát 3:1 eleggyel többször extraháljuk. A szerves fázis szárítása és bepárlása után a maradékot sósavval telített 320 ml metanolban oldjuk. 2 órán át keverjük, jeges fürdőben lehűtjük és a kivált kristályokat leszűrjük. Összesen 18,1 g címben megadott vegyületet kapunk.
Vékonyréteg-kromatográfia /szilikagél, toluol/metanol 3:1/ Rf = 0,1.
9. példa /4-Nitrozo-fenil/-2-metil/4-szulfopropil-pirazolo/I.5a7imidazol-3-il/-amin /4 az. vegy./
A 7. példában leírtak szerint 3-amino-4-szulfopropil-pirazolo/I.5a7imidazolt metanolban p-nitrozo-anizollal reagáltatunk. A reakciókeveréket átszűrjük és a szürletet bepároljuk. A maradékot szilikagélen toluol/metanol 2:1 eleggyel kromatografáljuk. Ezután további tisztítás céljából a terméket HP 20SS tipusu gyanta-adszorbens /Mitsubishi/ oszlopra viszszük fel és metanol/viz 1:9 - 2:8 lépcsős gradienssel eluáljuk. A terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük, bepároljuk, felvesszük kevés etanolban és a terméket éter hozzáadása utján kicsapjuk. A címben megadott vegyületet barna por formájában kapjuk meg.
\&onyréteg-kromatográfia /szilikagé]/, etanol: Rf = 0,6 izopropanol/butil-acetát/viz 5:3:2 : Rf = 0,48 • 4 ·
A kiindulóanyag előállítása a/ 2-Metil-4-szulfopropil-pirazolo/I.5a7imidazol
2-Metil-pirazolo/I.5a7imidazolt pH 2-5 között fenil-diazóniumsóval - melyet anilin szokásos diazotálása utján állítunk elő - reagáltatunk. A kapott 2-metil-3-fenil-azo-pirazolo/I.5a7imidazolt /5,6 g/ 60 ml dimetil-formamidban oldjuk, és 3,4 g propánszultont és 7 g kálium-karbonátot adunk hozzá. Az elegyet 6 órán át 110°C-on keverjük, újra 5 g propánszultont és 7 g kálium-karbonátot adunk hozzá és 110°C-on 8 órán át tovább keverjük. Lehűlés után átszűrjük és a maradékot metanollal kétszer alaposan átmossuk. Az oldatot bepároljuk és a maradékot szilikagélen kromatográfálva izoláljuk /eluens: etil-acetát/metanol/viz 75:15:10/.
Kitermelés: 5,3 g sárgásbarna kristály.
Vékonyréteg-kromatográfia /szilikagél, etil-acetát/metanol/viz 75:15:107 R*. = 0,3.
b/ 3-Amino-2-metil-4-szulfopropil-pirazolo/I.5a/imidazol
A fentebb kapott azovegyület 4,3 g-ját 40 ml jégecetben oldjuk és 1 órán belül részletekben 4 g cinkport adunk hozzá. A keveréket még 30 percen át keverjük, leszivatjuk és bepároljuk. A maradékot eldörzsöljük 30 ml jégecettel, leszivatjuk és a szürletet elöntjük. 10,2 g szürkésbarna port • * · · · · · • ·«··· · · kapunk, melyet további tisztítás nélkül dolgozunk fel.
Vékonyréteg-kromatográfia /szilikagél, etil-acetát/aceton/jégecet/viz 5:2:2:1/: = 0,14.
10. példa
A 8. vagy 9. példa szerint állítjuk elő a 4. táblázatban felsorolt vegyületeket. A kiindulási aminovegyületet a következőképpen szintetizáljuk:
a/
A 4. táblázatban szereplő 5 sz. vegyület kiindulóanyagának előállítása:
3-amino-5,6-dihidro-4-Aimetil-foszfinil-metil/-
-2-metil-pirazolo/I.5a7imidazol
3,9 g 2-metil-pirazolo/I.5a7imidazolint, 2,7 g nátrium-acetátot és 7,4 g p-metoxi-benzol-diazonium-tetrafluoroborátot 40 ml jégecetben oldunk és az oldatot 1 órán át 40-50°C-on melegítjük. A reakciókeveréket bepároljuk és a maradékot felvesszük nátrium-hidrogén-karbonát-oldatban és jégecetben. Az oldatot etil-acetáttal extraháljuk, szárítjuk és bepároljuk. A maradékot szilikagélen kromatográfálva tisztítjuk /eluens: etil-acetát/ligroin 1:1 - 2:1; etil-acetát; etil-acetát/metanol 95:5/. 4,12 g megfelelő 3-azó.vegyületet kapunk /vékonyréteg-kromatográfia: szilikagél, etil-acetát/metanol 95:5; R^ = 0,5/, amelyet az imidazolgyürü nitrogénatomján klór-metil-dimetil-foszfanoxid segítségével alkilezünk. 3-Aminovegyületté történő átalakítás céljából az azocsoportot a 8b. példa szerint redukáljuk,
A nyers aminovegyület izolálása és tisztítása céljából a vegyületet kevés vízben oldjuk, majd szilárd NagCO^ot és dioxános oldat formájában 3-szoros moláris feleslegü di-terc-butil-dikarbonátot adunk hozzá. A keveréket éjszakán át keverjük, bepároljuk, a melléktermékek eltávolítása céljából először éterrel, majd a termék izolálása céljából ötször metilén-kloriddal extraháljuk. Kristályos terc-butoxi-karbonilvegyületet kapunk /vékonyréteg-kromatográfia: etil-acetát/aceton/jégecet/viz 50:25:12,5:12,5; Rj> = 0,5/, melyet a butoxi-karbonil-csoport lehasitása céljából metanolos sósavoldatban oldunk. 1 óra múlva szobahőmérsékleten térfogatának felére bepároljuk és a terméket éterrel kicsapjuk. A címben megadott vegyület hidrokloridsóját kapjuk.
Vékonyréteg-kromatográfia: n-butanol/jégecet/viz 2:1:1 Rf = 0,3.
b/
A 4. táblázatban szereplő 6 sz. vegyület kiindulóanyagának előállítása:
3-amino-4-/dimetil-foszfinil-metil/-2-metil-pirazolo^I.5a7benzimídazol
A címben megadott vegyületet a 10. példa szerint
- 56 állítjuk elő 2-metil-pirazolo/I.5a7benzimidazolt /J. prakt. Chem. 326, 829 /1984// fenil-diazóniumsóval reagáltatva, klór-metil-dimetil-foszfanoxiddal N-alkilezve és az azocsoportot jégecetben cinkkel redukálva. A címben szereplő vegyületet trihidroklorid-dihidrát formájában kapjuk meg, melynek olvadáspontja 192°C /bomlás/.
Vékonyréteg-kromatográfia: szilikagél, izopropanol/butil-acetát/viz 60:30:20/
Rf = 0,38 c/
A 4. táblázatban szereplő 7 sz. vegyület kiinulóanyagának előállítása:
3-Amino-2,6-dimetil-4-dimetil-foszfinil-pirazolo/J.2c7-s-triazol g 2,6-dimetil-pirazolo/3.2c7-s-triazolt 65 ml dimetil-formamidban oldunk és az oldathoz 3,9 g klór-metil-dimetil-foszfanoxidot és 8 g kálium-karbonátot adunk. Az elegyet 2 órán át 100°C-on keverjük, forrón leszivatjuk és a szürletet bepároljuk. A maradékot szilikagélen kromatografáljuk /eluens: etil-acetát/metanol 4:1/. Elszappanositás és dekarboxilezés céljából a terméket 7 órán át visszafolyatás közben forraljuk, majd a reakciókeveréket bepároljuk. Világosbarna olajat kapunk.
Vékonyréteg-kromatográfia /szilikagél, etilacetát/metanol 2:1/
Rf = 0,37 • ♦ ·
- 57 A fentebb kapott terméket a 3-aminovegyületté a
8. példa szerint alakítjuk át a megfelelő 3-amino-pirazolo£ .5a7iniidazolra leirt eljárással /8b/. A címben megadott vegyület hidrokloridsójához jutunk; olvadáspont 225°C /bomlás/.
Vékonyréteg-kromatográfia /szilikagél, etil-acetát/metanol 3:1/ R^ = 0,2.
4. táblázat
Szerkezet Olvadáspont /°C/ Megjegyzés
| 5 | sz. vegy. | 212-215 /bomlás/ | DC /szilikagél/ Rf = 0,5 Etil-acetát/aceton/jég- ecet/viz 50:25:12,5:12,5 |
| 6 | sz. vegy. | 222-224 | DC /szilikagél/ R^ = 0,19 Cl^Clg/metanol 20:1 |
| 7 | sz. vegy. | 132 felett /bomlás/ | DC /szilikagél/ R^ = 0,24 Etil-acetát/metanol 4:1 |
DC = vékonyréteg-kromatográfia
Claims (24)
- Szabadalmi igénypontok1. Eljárás analitok kolorimetriás meghatározására az analit oxidoreduktázzal történő enzimatikus oxidációja utján, elektrondus aromás nitrozovegyületek csoportjába tartozó közvetlen elektronakceptor jelenlétében, és a redukált elektronakceptor meghatározására az analit mennyiségével arányos szinképződés alapján, azzal j ellemezve , hogy az elektrondus aromás nitrozovegyület az analit oxidációja közben, PQQ-függő dehidrogenáz jelenlétében iminovegyületté redukálódik, melyet aromás aminná történő további enzimatikus redukció nélkül szinképzés utján mutatunk ki.
- 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jel 1 e m e z v e , hogy az iminovegyületet nem oxidáló szinképző kimutató reagenssel reagáltatva kolorimetriásan határozzuk meg.
- 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal j ellemezve, hogy aromás nitrozovegyületként /1/ általános képletű vegyületeket alkalmazunk, ahol jelentése hidrogénatom, hidroxicsoport, adott esetben hidroxi-, karboxi-, PO^Hg vagy SO^H, alkoxi-, alkil-tio-, aril-oxi-, aril-tio) csoporttal vagy halogénatommal szubsztituált- 59 alkilcsoport, vagy aminocsoport, melyet adott esetben egy- vagy többszörösen alkilcsoport szubsztituál és az alkilcsoportot magát is adott esetben hidroxi-, PO^Hg, dialkil-foszfinil-, SO^H vagy COOH csoport helyettesíti, ésR jelentése hidroxi-, alkoxi-, aril-oxi-, aril-tio- vagy alkil-tio-csoport, ahol az alkilcsoportot magát adott esetben hidroxi-, alkoxicsoport, adott esetben alkilcsoporttal egyvagy többszörösen helyettesített aminocsoport, PO^H2, SO^H vagy COOH csoport, vagy sóformában e savmaradékok ammónium-, alkáli- vagy alkálifoldfémsója szubsztituálja, vagy2 3 4R NIrR általános képletű aminocsoportot jelent, melyben és azonos vagy különböző lehet és jelentésükΜ'' hidrogénatom, aril- vagy alkilcsoport, melyet magát hidroxi-, alkoxi-, hidroxi' τ -alkoxi-csoport, adott esetben hidroxicsoporttal helyettesített polialkoxicsoport adott esetben sóformáju P0^H2, SO^H, COOH csoport, vagy adott esetben alkilcsoporttal egy- vagy többszörösen helyettesített aminocsoport szubsztituálhatja, vagy az- 60 iP és szubsztituens alkiléncsoportot alkot, /amelyet adott esetben oxigén-, kén- vagy nitrogénatom szakit meg, és a nitrogénz atomot alkil-, hidroxi-alkil-, hidroxi-alkoxi-alkil-, alkoxi-hidroxi-alkil-, z' alkoxi-karboml-alkil-, dioxanilil-alkilvagy polialkoxi-alkil-csoport szubsztituálhatja, ahol az alkilrészt magát adott esetben hidroxicsoport helyettesítheti, vagy ha17 orto-helyzetü NR^R^ általános képletü csoportot jelent, az R^ vagy R^ csoport az R1 csoporttal együtt is alkiléncsoportot alkothat.
- 4. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy aromás nitrozovegyületként egy /11/ általános képletü vegyületet használunk, aholX-Y jelentése NR^-co vagy N=CR^ általános képletü csoport, melyekbenR hidrogénatomot, adott esetben hidroxi-, karboxi-, SO^H, PO^Hg vagy dialkil-foszfinilcsoporttal szubsztituált alkilcsoportot, hidrogénatomot, alkil-, alkenil-, alkoxi-, alkil-tio-, aril-, aril-tio-, aralkilcsoportot jelent, melyeket adott esetben hidroxi-, dialkil-f oszf inil- , karboxi-, SO^H, P0^H2 csoport, e savmaradékok sója és/vagy alkoxi-karbonilcsoport helyettesit, vagy aminocsoportot jelent, melyet adott esetben egy vagy több hidroxi-, karboxi- és/vagy alkoxi-karbonil-csoportot hordozó, egy vagy két alkilcsoport szubsztituál, és ha az aminocsoportot két alkilcsoport helyettesíti, e csoportok gyűrűhöz is kötődhetnek, melyet az aminocsoport nitrogénatomján kívül adott esetben oxigén-, kénatom vagy egy további nitrogénatom is megszakíthat; vagyR& olyan aminocsoportot jelent, amelyet adott esetben egy vagy két alkilcsoport, alkoxiés/vagy aralkoxi-karbonil-csoport, HgN-CO-, alkil-, aralkil- és/vagy aril-karbamoil-csoport szubsztituál; vagyR hidrogénatomot, karboxi-, alkoxi-karbonil-, karboxamidocsoportot vagy halogénatomot jelent, é sR jelentése alkil-, tio-alkil- vagy aralkilcsoport, melyeket adott esetben hidroxi-, karboxi-, SO^H vagy PO^Hg csoPort, vagy adott esetben egy vagy két alkilcsoporttal szubsztituált aminocsoport helyettesit, ahol magukat az alkilcsoportokat is hidroxi-, karboxi-, SO^H, ·♦*» 4 ***( ·· *· · * ι ♦<• · · « n ·« * · · 4 · ♦ 4 ·4- 62 dialkil-fősziinil- vagy PO^Hg csoport helyetC7 tesitheti, és az R és/vagy R csoportok közül legalább az egyik aminocsoportot jelent, ésOR jelentése adott esetben hidroxi-, karboxi-,SO^H vagy PO^Hg csoporttal szubsztituált alkilvagy aralkilcsoport, vagy7 Q yR és R 3- vagy 4-tagu, nitrogénatomokból vagy szénatomokból álló, adott esetben egy vagy több nitrogén- vagy kénatomot tartalmazó telitett vagy telítetlen láncot jelent, ahol a szénatomokat adott esetben alkil-, alkoxi-, alkil-tio-, hidroxi-, aralkil-, aril-, karboxi-, karboxamido-, alkoxi-karbonil-, cianocsoport, halogénatom vagy aminocsoport helyettesíti, mely (egy vagy két, adott esetbeny utóbbit adott~esétbenVegy vagy Több hidroxi-, karboxi- és/vagy alkoxi-karbonilcsoportot hordozó arilcsoport szubsztituál, és a nem kettőskötésen át kötődő nitrogénatomokat adott esetben hidroxi-, SO^H, PO^Hg, karboxi- vagy dialkil-foszfinil-csőporttál helyettesített alkil- vagy aralKilcsoport szubsztituálja, vagy két szomszédos láncbeli szubsztituens adott esetben alkiléncsoportot képez,- 63 melyet magát adott esetben arilcsoport helyettesíti vagy vele anellálódik, valamint adott esetben e vegyületek megfelelő tautomer formáit és ezek sóit használjuk.
- 5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy aromás nitrozovegyületként olyan vegyü-7 fi letet alkalmazunk, ahol az R' és R szubsztituens telitett vagy telítetlen láncot alkot.
- 6. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy aromás nitrozovegyületként /111/ - /XII/ általános képletű vegyületeket használunk, aholR^, R1®, R11 és R·1,2 azonos vagy különböző és jelentésük hidrogénatom, hidroxi-, alkil-, alkoxi-, alkil-tio-, aralkil-, aril-, karboxi-, alkoxi-karbonil-, karboxamido-, cianocsoport, vagy adott esetben egy vagy két, adott esetben egy vagy több hidroxi-, karboxi- és/vagy alkoxi-karbonil-csoportot viselő alkilcsoporttal szubsztituált aminocsoport, vagy halogénatom, és két szomszédos csoport adott esetben alkiléncsoportot képez, melyet magát arilcsoport helyettesítheti vagy vele anellálódhat, ésR ' adott esetben hidroxi-, karboxi-, SO^H, PO^Hg vagy dialkil-foszfinil-csoporttal szubsztituált alkil- vagy aralkilcsoportot jelent.• · · Λ • ♦ ··«
- 7. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jel- 64 lemezve, hogy a nem oxidáló, szinadó kimutató reagens iminovegyületek kimutatására alkalmas kapcsoló reagens.A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal j e 1 1 e m e z v e , hogy kapcsoló reagensként fenol-, naftol-, anilin- vagy naftilszármazékokat használunk.
- 9. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jel- lemezve, hogy kapcsoló reagensként 2i,4,6-tribróm-3-hidroxi-benzoesavat, 2., 4-dibróm-l-naf tolt vagy l-naftol-4-szulfonsavat alkalmazunk.
- 10. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az iminovegyületet egy leukofesték szines” festékké történő oxidációja utján mutatjuk ki.
- 11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal j e 1-1 e m e z v e , hogy leukofestékként diaril-imidazolt, triaril-imidazolt vagy naftil-amint használunk.
- 12. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jel- lemezve, hogy egy /XIII/ általános képlett! aromás nitrozo-anilin-vegyületet alkalmazunk, aholR jelentése hidrogénatom, hidroxicsoport, halogénatom, alkoxi-, alkil-tio-, aril-oxi- vagy aril-tio-csoport, adott esetben hidroxi-, karboxi-, PO^Hg vagy SO^H csoporttal szubsztituált alkilcsoport, adott esetben alkilcsoport···♦ · • · ♦··· · * * ···· « ·· -·*- 65 tál egy- vagy többszörösen szubsztituált aminocsoport, melynek alkil-szubsztituenseit is adott esetben hidroxi-, PO^Hg, dialkil-foszfinil-, SO^H vagy karboxicsoport helyettesítheti,5 ' 6X-Y jelentése NR -CO vagy N=CR általános képletű csoport,R hidrogénatomot, adott esetben hidroxi-, karboxi-, SO^H, PO^Hg vagy dialkil-foszfinilcsoporttal szubsztituált alkilcsoportot,6 z CR hidrogénatomot, alkil-, alkenil-, alkoxi-, alkil-tio-, aril-, aril-tio-, aralkilcsoportot jelent, amelyeket adott esetben hidroxi-, karboxi-, SO^H, PO^Hg csoport, e savmaradékok sója és/vagy alkoxi-karbonil-csoport helyettesit, vagy fi aminocsoportot jelent, melyet adott esetben egy vagy több hidroxi-, karboxi- és/vagy alkoxi-karbonil-csoportot hordozó, egy vagy két alkilcsoport szubsztituál, és ha az aminocsoportot két alkilcsoport helyettesíti, e csoportok gyűrűhöz is kapcsolódhatnak, amelyet az aminocsoport nitrogénatomján kívül adott esetben oxigén-, kénatom vagy egy további nitrogénatom is megszakíthat; vagy • ···· · ·«·· ·· ·· » · ♦ · » • · · ♦ t ·♦ * · · · » · » · » ·♦· · · ·· *- 66 Ηθ olyan aminocsoportot jelent, amelyet adott esetben egy vagy két acilcsoport, alkoxiés/vagy aralkoxi-karbonil-csoport, HgN-CO, alkil-, aralkil- és/vagy aril-karbamoil-csoport szubsztituál; vagyR karboxi-, alkoxi-karbonil-, karboxamidocsoportot vagy halogénatomot jelent, ésA jelentése 3-tagu, egy nitrogénatómot vagy kénatomot és két szénatomot, vagy két nitrogénatomot és egy szénatomot tartalmazó telitett /.vagy telítetlen lánc, ahol a szénatomokat adott esetben alkil-, alkoxi-, alkil-tio-, hidroxi-, aralkil-, aril-, karboxi-, karboxamido-, alkoxi-karbonil-, cianocsoport, halogénatom, vagy adott esetben egy vagy két alkilcsoporttal helyettesített aminocsoport szubsztituálja, melynek alkilszubsztituensei adott esetben egy vagy több hidroxi-, karboxi- és/vagy alkoxi-karbonilcsoportot viselnek, és ahol a nem kettőskötésen át kapcsolódó nitrogénatomokat hidrogénatom, adott esetben SO^H, PO^I^, karboxi- vagy dialkil-foszfinil-csoporttal szubsztituált alkilcsoport, vagy aralkilcsoport helyettesíti, vagy két szomszédos láncbeli szubsztituens adott esetben alkiléncsoportot képez, melyet t· - '': . 3 • ··♦« · «··« ·· ·♦ ♦ · · β · ♦ ♦ · · * ·· ♦ * ···· » · · ·»·· · »· ' ·- 67 magát adott esetben arilcsoport szubsztituálhat vagy vele anellálódhat, valamint adott esetben a megfelelő tautomer formákat és sóikat, amelyek enzimatikusan színes kinondiiminné alakulnak át és az analit mennyiségével arányos szint kolorimetriásan határozzuk meg.
- 13. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az A általános képletű csoport a szomszédos heterociklussal imidazol-, triazol-, benzimidazol-, tiazolvagy dihidroimidazol-gyürüt képez.
- 14. A 12. vagy 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az aromás nitrozovegyületet _310 J mól/liter-nél magasabb koncentrációban alkalmazzuk.
- 15. Az 1 - 14. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy glükóz meghatározásához PQQ-függő dehidrogenázként glucose-dye-oxidoreductase-t használunk.
- 16. Analitok enzimatikus oxidáción alapuló kolorimetriás meghatározására szolgáló szer, amely PQQ-függő dehidrogenázt és elektrondus aromás nitrozovegyületet tartalmaz, azzal j ellemezve, hogy az iminovegyület kimutatásához szinképző, nem oxidáló kimutató reagenst is tartalmaz.
- 17. A 16. igénypont szerinti szer, azzal j e 1 -1 e m e z v e , hogy egy /1/ általános képletű nitrozovegyü- 68 letet tartalmaz, ahol rI jelentése hidrogénatom, hidroxicsoport, adott esetben hidroxi-, karboxi-, PO^Hg vagy SO^H, alkoxi-, alkil-tio-, aril-oxi-, aril-tiocsoporttal vagy halogénatommal szubsztituált alkilcsoport, vagy adott esetben hidroxi-, ΡΟ^Η2» dialkil-foszfinil-, SO^H vagy COgH csoporttal helyettesített aminocsoport, és oR jelentése hidroxi-, alkoxi-, aril-oxi-, aril-tio- vagy alkil-tio-csoport, ahol az alkilcsoportot magát adott esetben hidroxi-, alkoxicsoport, adott esetben alkilcsoporttal egyvagy többszörösen helyettesített aminocsoport, PO^Hg, SO^H vagy CC^H csoport, vagy sóformában e savmaradékok ammónium-, alkáli- vagy alkáliföldfémsója szubsztituálja, vagyR NRR általános képletü csoportot jelent, melybe/R^ és R^ azonos vagy különböző lehet és jelentésük hidrogénatom, aril- vagy alkilcsoport, mely utóbbit magát hidroxi-, alkoxi-, hidroxi-alkoxi-csoport, adott esetben hidroxicsoporttal helyettesített polialkoxicsoport, adott esetben sóformáju PO^Hg, SO^H, COOH csoport, vagy adott esetben alkilcsoporttal egy- vagy többt szőrösen helyettesített aminocsoport szubsztituálja, vagy az és szubsztituens alkiléncsoportot alkot, amelyeket adott esetben oxigén-, kén- vagy nitrogénatom szakit meg, és a nitrogénatomot alkil-, hidroxi-alkil-, hidroxi-alkoxi-alkil-, alkoxi-hidroxi-alkil-, alkoxi-karbonil-alkil-, dioxanilil-alkilvagy polialkoxi-alkil-csoport szubsztituálhatja, ahol magát az alkilrészt adott esetben hidroxicsoport helyetteitheti, vagy haR1 orto-helyzetü NR^R^ általános képletű csoportot jelent, az R^ vagy csoport az R1 csoporttal együtt is alkiléncsoportot alkothat.
- 18. A 17. igénypont szerinti szer, azzal jellemezve, hogy egy /11/ általános képletű nitrozovegyületet tartalmaz, aholR hidrogénatomot, alkil-, alkenil-, alkoxi-, alkil-tio-, aril-, aralkilcsoportot jelent, amelyeket adott esetben hidroxi-, dialkil-foszfinil-, karboxi-, SO^H, PO^Hg csoport, e savmaradékok sója és/vagy alkoxi-karbonil- csoport helyettesit, vagy aminocsoportot jelent, melyet adott esetben • ·**» 9 »«|4 ·· ·· · ♦ · · « • · · ♦ · ·ν ,* * ·<·· · · * ··♦ · · a« .- 70 egy vagy két hidroxi-, karboxi- és/vagy alkoxi-karbonil-csoportot hordozó, egy vagy két alkilcsoport szubsztituál, és ha az aminocsoportot két alkilcsoport helyettesíti, e csoportok gyűrűhöz is kapcsolódhatnak, melyet az aminocsoport nitrogénatomján kívül adott esetben oxigén-, kénatom vagy egy további nitrogénatom is megszakíthat; vagy gR olyan aminocsoportot jelent, amelyet adott esetben egy vagy két acilcsoport, alkoxiés/vagy aralkoxi-karbonil-csoport, HgN-CO, alkil- vagy aril-karbamoil-csoport szubsztituál; vagy gR hidrogénatomot, karboxi-, alkoxi-karbonil-, karboxamidocsoportot vagy halogénatomot jelent, ésR jelentése alkil-, tio-alkil- vagy aralkilcsoport, melyeket adott esetben hidroxi-, karboxi-, SO^H vagy PO^Hg csoport, vagy adott esetben egy vagy két alkilcsoporttal szubsztituált aminocsoport helyettesit, és az alkilcsoportokat magukat hidroxi-, karboxi-, SO^H, dialkil-foszfinil- vagy PO^Hg csoport helyetg 7 tesitheti, és az R° és/vagy R csoportok közül legalább az egyik aminocsoportot jelent, és- 71 QR jelentése adott esetben hidroxi-, karboxi-, SO^H vagy PO^H2 csoporttal szubsztituált alkil- vagy aralkilcsoport, vagy7 HR és R 3- vagy 4-tagu, nitrogénatomokból vagy szénatomokból álló, adott esetben egy vagy több nitrogén- vagy kénatomot tartalmazó telitett vagy telítetlen láncot jelent, ahol a szénatomokat adott esetvalamint ben alkil-, alkoxi-, alkil-tio-, hidroxi-, aralkil-, aril-, karboxi-, karboxarnido-, alkoxi-karbonil-, cianocsoport, halogénatom vagy aminocsoport helyettesíti, mely tegy vagy két, adott esetben, utóbbib'áciotí ésetbenTegy vagy több hidroxi-, karboxi- és/vagy alkoxi-karbonilcsoportot hordozó alkilcsoport szubsztituál, és a nem kettőskötésen át kapcsolódó nitrogénatomokat adott esetben hidroxi-, SO^H, PO^rz,, karboxi- vagy diai kil-fos zfinil-cso porttal helyettesített alkil- vagy aralkilcsoport szubsztituálja, vagy két szomszédos láncbeli szubsztituens adott esetben alkiléncsoportot képez, melyet magát adott esetben arilcsoport helyettesíti vagy vele anellálódik, adott esetben e vegyületek megfelelő tautomer formáit ···♦ · • ♦ és ezek sóit.
- 19. A 16 - 18. igénypontok bármelyike szerinti szer, azzal jellemezve, hogy iminovegyületek nem oxidáló kimutató reagenseként kromogén kapcsoló reagenst vagy leukofestéket tartalmaz.
- 20. Analitok enzimatikus oxidáción alapuló kolo- rimetriás meghatározására szolgáló szer, amely PQQ-függő dehidrogenázt és elektrondus aromás nitrozovegyületet tartalmaz, azzal jellemezve, hogy az elektrondus aromás nitrozovegyület egy /XIII/ általános képletű nitrozo-anilinszármazék, ahol r! jelentése hidrogénatom, hidroxicsoport, halogénatom, alkoxi-, alkil-tio-, aril-oxi- vagy aril-tio-csoport, adott esetben hidroxi-, karboxi-, csoport, adott esetben alkilcsoporttal egyvagy többszörösen szubsztituált aminocsoport, melynek alkil-szubsztituenseit is adott esetben hidroxi-, PO^Hg, dialkil-foszfinil-, SO^H vagy karboxicsoport helyettesítheti,X-Y jelentése NR^-CO vagy N=CR^ általános képletű csoport,R hidrogénatomot, adott esetben hidroxi-, karboxi-, SO^H, PO^Hg vagy dialkil-foszfinil- 73 csoporttal szubsztituált alkilcsoportot, hidrogénatomot, alkil-, alkenil-, alkoxi-, alkil-tio-, aril-, aril-tio-, aralkilcsoportot jelent, melyeket adott esetben hidroxi-, karboxi-, dialkil-foszfinil-, SO^H, PO^^ csoport, e savmaradékok sója és/vagy alkoxi-karbonilcsoport helyettesit, vagyR aminocsoportot jelent, melyet adott esetben egy vagy két hidroxi-, karboxi- és/vagy alkoxi-karbonil-csoportot hordozó, egy vagy két alkilcsoport szubsztituál, és ha az aminocsoportot két alkilcsoport helyettesíti, e csoportok gyűrűhöz is kötődhetnek, amelyet az aminocsoport nitrogénatomján kívül adott esetben oxigén-, kénatom vagy egy további nitrogénatom is megszakíthat; vagy olyan aminocsoportot jelent, amelyet adott esetben egy vagy két acilcsoport, alkoxiés/vagy aralkoxi-karbonil-csoport, HgH-CO, alkil-, aralkil- és/vagy aril-karbamoil-csoport szubsztituál; vagyR karboxi-, alkoxi-karbonil-, karboxamidocsoportot vagy halogénatomot jelent, ésA jelentése 3-tagu, egy nitrogénatomot vagy kénatomot és két szénatomot, vagy két nitrogén.1 ··«· *· —::• * 9 • ··»» • *- 74 atomot és egy szénatomot tartalmazó telített vagy telítetlen lánc, ahol a szénatomokat adott esetben alkil-, alkoxi-, alkil-tio-, hidroxi-, aralkil-, aril-, karboxi-, karboxamido-, alkoxi-karbonil-, cianocsoport, halogénatom, adott esetben egy vagy két alkilcsoporttal helyettesített aminocsoport szubsztituálva, ahol az alkil-szubsztituensek adott esetben egy vagy több hidroxi-, karboxi- és/vagy alkoxi-karbonil-csoportot viselnek, és a nem kettőskötésen át^kapcsolódó nitrogénatomokat hidrogénatom, adott esetben SO^H, PO^Hg, karboxi- vagy dialkil-foszfinil-csoporttal szubsztituált alkilcsoport, vagy aralkilcsoport helyettesíti, vagy két szomszédos láncbeli szubsztituens adott esetben alkiléncsoportot képez, melyet magát adott esetben arilcsoport szubsztituálhat vagy vele anellálódhat, valamint adott esetben a megfelelő tautomer formák és sóik.
- 21. A 20. igénypont szerinti szer, azzal j e 1 -1 e m e z v e , hogy az A általános képletű csoport a szomszédos heterociklussal imidazol-, triazol-, benzimidazol-, tiazol- vagy dihidroimidazol-gyürüt képez.
- 22. A 16-21. igénypontok bármelyike szerinti ···« I ♦ · ♦ ••»4 4 · • ·· >«·· ··- 75 szert tartalmazó teszthordozó.
- 23. A /XIII/ általános képletű nitrozo-anilinvegyület, ahol r! jelentése hidrogénatom, hidroxicsoport, halogénatom, alkoxi- vagy aril-tio-csoport, adott esetben hidroxi-, karboxi-, PO^Hg, alkil-, dialkil-foszfinil- vagy SO^H csoporttal szubsztituált alkilcsopcrt, adott esetben alkilcsoporttal egy- vagy többszörösen helyettesített aminocsoport, melynek alkil-szubsztituenseit adott esetben hidroxi-, PO^Hg, SO^H vagy karboxicsoport helyettesítheti, ésX-Y jelentése NR^-CO vagy N=CR^ általános képletű csoport, aholR hidrogénatomot, adott esetben hidroxi-, karboxi-, SO^H, PO^Hg vagy dialkil-foszfinilcsoporttal szubsztituált alkilcsoportot,R^ hidrogénatomot, alkil-, alkenil-, alkoxi-, alkil-tio-, aril-, aralkilcsoportot jelent, melyeket adott esetben hidroxi-, karboxi-, SO^H, PO^Hg csoport, e savmaradékok sója és/vagy alkoxi-karbonil-csoport helyettesit;vagyR^ aminocsoportot jelent, melyet adott esetben ··♦* ζ *··· ·· • · _ · · · * · · · ·· • ·«·· · · φ • · ·· * λegy vagy több hidroxi-, karboxi- és/vagy alkoxi-karbonil-csoportot hordozó, egy vagy két alkilcsoport szubsztituál, és e csoportok gyűrűhöz is kapcsolódhatnak, amelyet az aminocsoport nitrogénatomján kívül adott esetben oxigén-, kénatom vagy egy további nitrogénatom szakíthat meg; vagyR.6 olyan aminocsoportot jelent, amelyet adott esetben egy vagy két acilcsoport, alkoxiés/vagy aralkoxi-karbonil-csoport, HgN-CO, alkil-, arailkil- és/vagy aril-karbamoilcsoport szubsztituál; vagyR^ hidrogénatomot, alkoxi-karbonil-, karboxamidocsoportot vagy halogénatomot jelent, ésA jelentése 3-tagu, egy nitrogénatomot vagy kénatomot és két szénatomot, vagy két nitrogénatomot és egy szénatomot tartalmazó telített vagy telítetlen lánc, ahol a szénatomokat adott esetben alkil-, alkoxi-, alkil-tio-, hidroxi-, aralkil-, aril-, karboxi-, karboxamido-, alkoxi-karbonil-, cianocsoport, halogénatom, adott esetben egy vagy két alkilcsoporttal helyettesített aminocsoport szubsztituálja, ahol az alkil-szubsztituensek adott esetben egy vagy több hidroxi-, karboxi- és/vagy *···· 99- 77 alkoxi-karbonil-csoportot viselnek, és ahol a nem kettőskötésen át kapcsolódó nitrogénatomokat hidrogénatom, adott esetben SO^H, PO^Hg, karboxi- vagy dialkil-foszfinil-csoporttal szubsztituált alkilcsoport, vagy aralkilcsoport helyettesíti, vagy két szomszédos láncbeli szubsztituens adott esetben alkiléncsoportot képez, melyet magát adott esetben arilcsoport szubsztituálhat vagy vele anellálódhat, valamint adott esetben a megfelelő tautomer formák és sóik.
- 24. A 23. igénypont szerinti nitrozo-anilinvegyületek, azzal j ellemezve , hogy az A általános képletü csoport a szomszédos heterociklussal imidazol-, triazol-, benzimidazol-, tiazol- vagy dihidroimidazol-gyürüt képez.
- 25. A 23. vagy 24. igénypontok szerinti nitrozo-anilin-vegyületek alkalmazása analitok kolorimetriás enzimatikus meghatározására.ÜmcÍLÍ 7 íll (n‘ )' / - d meghatalmazott
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4311464A DE4311464A1 (de) | 1993-04-08 | 1993-04-08 | Verfahren zur kolorimetrischen Bestimmung eines Analyten mit einer PQQ-abhängigen Dehydrogenase |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU9400995D0 HU9400995D0 (en) | 1994-06-28 |
| HUT71703A true HUT71703A (en) | 1996-01-29 |
Family
ID=6484983
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9400995A HUT71703A (en) | 1993-04-08 | 1994-04-07 | Method for determining analite with pqq-depending dehydrogenase |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5484708A (hu) |
| EP (1) | EP0620283B1 (hu) |
| JP (1) | JP2825754B2 (hu) |
| KR (1) | KR0135714B1 (hu) |
| CN (1) | CN1098745A (hu) |
| AT (1) | ATE171220T1 (hu) |
| AU (1) | AU674385B2 (hu) |
| CA (1) | CA2120453A1 (hu) |
| DE (2) | DE4311464A1 (hu) |
| ES (1) | ES2124333T3 (hu) |
| HU (1) | HUT71703A (hu) |
| NZ (1) | NZ260248A (hu) |
| RU (1) | RU2114914C1 (hu) |
| ZA (1) | ZA942384B (hu) |
Families Citing this family (24)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4311460A1 (de) * | 1993-04-08 | 1994-10-13 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur kolorimetrischen Bestimmung eines Analyten mittels Benzylalkoholdehydrogenase und einem chromogenen Redoxindikator |
| DE19521019A1 (de) * | 1995-06-13 | 1996-12-19 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren und Mittel zur gleichzeitigen kolorimetrischen und elektrochemischen Messung eines Analyten |
| US6011052A (en) * | 1996-04-30 | 2000-01-04 | Warner-Lambert Company | Pyrazolone derivatives as MCP-1 antagonists |
| US5902731A (en) * | 1998-09-28 | 1999-05-11 | Lifescan, Inc. | Diagnostics based on tetrazolium compounds |
| US6656697B1 (en) * | 1998-09-28 | 2003-12-02 | Lifescan, Inc. | Diagnostics based on tetrazolium compounds |
| US6420128B1 (en) * | 2000-09-12 | 2002-07-16 | Lifescan, Inc. | Test strips for detecting the presence of a reduced cofactor in a sample and method for using the same |
| EP1332216B1 (en) | 2000-10-27 | 2011-08-17 | Roche Diagnostics GmbH | Variants of soluble pyrroloquinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase |
| US6703216B2 (en) | 2002-03-14 | 2004-03-09 | The Regents Of The University Of California | Methods, compositions and apparatuses for detection of gamma-hydroxybutyric acid (GHB) |
| DE10303265A1 (de) | 2003-01-28 | 2004-07-29 | Roche Diagnostics Gmbh | Fluorimetrische Bestimmung von Analyten durch ein intramolekulares Quencher-Fluorophor-Konjugat |
| DE10304448A1 (de) | 2003-02-04 | 2004-08-12 | Roche Diagnostics Gmbh | Fluorimetrische Bestimmung von Analyten durch Amin-N-Oxide als Redoxindikatoren |
| CA2455669A1 (en) * | 2003-02-04 | 2004-08-04 | Bayer Healthcare, Llc | Method and test strip for determining glucose in blood |
| DE10346863A1 (de) * | 2003-10-09 | 2005-05-04 | Roche Diagnostics Gmbh | On-Board-Kontrolle für Analyseelemente |
| US20060003400A1 (en) * | 2004-06-30 | 2006-01-05 | Byrd Patricia A | Methods and compositions for characterizing a redox reagent system enzyme |
| US7547524B2 (en) | 2004-07-20 | 2009-06-16 | Roche Diagnostics Operations, Inc. | Genetically engineered pyrroloquinoline quinone dependent glucose dehydrogenase comprising an amino acid insertion |
| JP4782138B2 (ja) | 2004-10-15 | 2011-09-28 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー | ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼの熱安定性変異体 |
| US20060199242A1 (en) | 2005-03-01 | 2006-09-07 | Ching-Ying Cheung | Chemical probe compounds that become fluorescent upon reduction, and methods for their use |
| US20070155738A1 (en) * | 2005-05-20 | 2007-07-05 | Alantos Pharmaceuticals, Inc. | Heterobicyclic metalloprotease inhibitors |
| KR20080087070A (ko) * | 2005-05-20 | 2008-09-30 | 알란토스 파마슈티컬즈 홀딩, 인코포레이티드 | 피리미딘 또는 트리아진 융합된 비시클릭 메탈로프로테아제억제제 |
| US7955484B2 (en) * | 2005-12-14 | 2011-06-07 | Nova Biomedical Corporation | Glucose biosensor and method |
| MX2008013001A (es) | 2006-04-13 | 2008-10-17 | Hoffmann La Roche | Mutantes mejorados de glucosa deshidrogenasa soluble dependiente de pirroloquinolina quinona. |
| EP2636750A1 (en) | 2012-03-06 | 2013-09-11 | Roche Diagniostics GmbH | Compatible solute ectoine as well as derivatives thereof for enzyme stabilization |
| WO2014180939A1 (en) | 2013-05-08 | 2014-11-13 | Roche Diagnostics Gmbh | Stabilization of enzymes by nicotinic acid |
| KR102372113B1 (ko) | 2016-10-05 | 2022-03-07 | 에프. 호프만-라 로슈 아게 | 다중 분석물 진단 테스트 엘리먼트들을 위한 검출 시약들 및 전극 배열들, 그리고 그것을 사용하는 방법들 |
| CN113030343B (zh) * | 2021-04-14 | 2021-12-28 | 中国药科大学 | 一种血浆中吡咯喹啉醌的液相色谱串联质谱检测方法 |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB354441A (en) * | 1930-05-28 | 1931-08-13 | Ig Farbenindustrie Ag | Improvements in the manufacture and production of high quality lubricating oils |
| DE2147466C3 (de) * | 1971-09-23 | 1980-06-26 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | 5- (4-N-trimethyl-ammonium-phenyl) tetrazoliumsalze |
| JPS60251895A (ja) * | 1984-05-29 | 1985-12-12 | Ube Ind Ltd | ピロロキノリンキノンの製造方法 |
| US4746607A (en) * | 1985-02-07 | 1988-05-24 | Eastman Kodak Company | Use of substituted quinone electron transfer agents in analytical determinations |
| US4828983A (en) * | 1986-07-10 | 1989-05-09 | Eastman Kodak Company | Use of phenols and anilines to increase the rate of peroxidase catalyzed oxidation of leuco dyes |
| US4879243A (en) * | 1987-05-26 | 1989-11-07 | Eastman Kodak Company | Use of substituted ortho-quinones as electron transfer agents in analytical determinations |
| DE3826922A1 (de) * | 1988-08-09 | 1990-02-22 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur kolorimetrischen bestimmung eines analyten mittels enzymatischer oxidation |
| DE3940010A1 (de) * | 1989-12-02 | 1991-06-06 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verwendung eines schwer loeslichen salzes einer heteropolysaeure zur bestimmung eines analyts, entsprechendes bestimmungsverfahren sowie hierfuer geeignetes mittel |
| DE3942357A1 (de) * | 1989-12-21 | 1991-06-27 | Boehringer Mannheim Gmbh | 3-aminopyrazolo-heterocyclen, deren verwendung zur bestimmung von wasserstoffperoxid, wasserstoffperoxid-bildenden systemen, peroxidase, peroxidatisch wirksamen substanzen oder von elektronenreichen aromatischen verbindungen, entsprechende bestimmungsverfahren und hierfuer geeignete mittel |
| DE4003194A1 (de) * | 1990-02-03 | 1991-08-08 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren und sensorelektrodensystem zur elektrochemischen bestimmung eines analyts oder einer oxidoreduktase sowie verwendung hierfuer geeigneter verbindungen |
| FI905324A (fi) * | 1990-10-29 | 1992-04-30 | Valtion Teknillinen | Enzymatiskt bestaemningsfoerfarande foer aldoser. |
| DE4311460A1 (de) * | 1993-04-08 | 1994-10-13 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur kolorimetrischen Bestimmung eines Analyten mittels Benzylalkoholdehydrogenase und einem chromogenen Redoxindikator |
-
1993
- 1993-04-08 DE DE4311464A patent/DE4311464A1/de not_active Withdrawn
-
1994
- 1994-03-31 ES ES94105141T patent/ES2124333T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-03-31 CA CA002120453A patent/CA2120453A1/en not_active Abandoned
- 1994-03-31 EP EP94105141A patent/EP0620283B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-03-31 DE DE59406904T patent/DE59406904D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-03-31 AT AT94105141T patent/ATE171220T1/de not_active IP Right Cessation
- 1994-04-05 AU AU59232/94A patent/AU674385B2/en not_active Ceased
- 1994-04-06 NZ NZ260248A patent/NZ260248A/en unknown
- 1994-04-06 JP JP6068577A patent/JP2825754B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1994-04-06 RU RU94011574A patent/RU2114914C1/ru active
- 1994-04-07 HU HU9400995A patent/HUT71703A/hu unknown
- 1994-04-07 KR KR1019940007441A patent/KR0135714B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1994-04-08 ZA ZA942384A patent/ZA942384B/xx unknown
- 1994-04-08 CN CN94103578A patent/CN1098745A/zh active Pending
- 1994-04-08 US US08/224,869 patent/US5484708A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE59406904D1 (de) | 1998-10-22 |
| EP0620283A1 (de) | 1994-10-19 |
| ZA942384B (en) | 1995-10-09 |
| US5484708A (en) | 1996-01-16 |
| CN1098745A (zh) | 1995-02-15 |
| KR0135714B1 (ko) | 1998-04-22 |
| AU5923294A (en) | 1994-10-27 |
| JP2825754B2 (ja) | 1998-11-18 |
| HU9400995D0 (en) | 1994-06-28 |
| ES2124333T3 (es) | 1999-02-01 |
| DE4311464A1 (de) | 1994-10-13 |
| JPH06340822A (ja) | 1994-12-13 |
| CA2120453A1 (en) | 1994-10-09 |
| ATE171220T1 (de) | 1998-10-15 |
| NZ260248A (en) | 1995-03-28 |
| RU2114914C1 (ru) | 1998-07-10 |
| EP0620283B1 (de) | 1998-09-16 |
| AU674385B2 (en) | 1996-12-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HUT71703A (en) | Method for determining analite with pqq-depending dehydrogenase | |
| US5445943A (en) | Method for the colorimetric determination of an analyte by means of benzyl alcohol dehydrogenase and a chromogenic redox indicator | |
| US5457200A (en) | 3-aminopyrazolo heterocyclic derivatives, and use for colorimetric determinations | |
| US5286362A (en) | Method and sensor electrode system for the electrochemical determination of an analyte or an oxidoreductase as well as the use of suitable compounds therefor | |
| US8574896B2 (en) | Colorimetric method and reagent used for the same | |
| IE910343A1 (en) | Method and sensor electrode system for the electrochemical¹determination of an analyte or an oxidoreductase as well as¹the use of suitable compounds therefor | |
| US5858691A (en) | Method and agent for the simultaneous colorimetric and electrochemical measurement of an analyte | |
| JPS6258718B2 (hu) | ||
| JPS5813398A (ja) | 過酸化水素もしくは過酸化水素を形成する基質またはペルオキシダ−ゼもしくはペルオキシダ−ゼのように作用する物質を検出するための剤および方法 | |
| EP0251297B1 (en) | Urea derivatives and colorimetric determination using the same as chromogen | |
| JP2009072136A (ja) | 還元系色素を用いた安定な測定方法、およびその試薬 | |
| EP0488756B1 (en) | Oxidizable color producing reagent | |
| FI59245B (fi) | 9-substituerade 3-aminokarbazolderivat anvaendbara som indikatorer vid maetning av enzymatiska reaktioner | |
| EP2138483B1 (en) | Oxidative color-developing compounds, salts thereof, process for production of the same, reagent compositions and test tools made by using the same | |
| JP2007289097A (ja) | 総分岐鎖アミノ酸／チロシンモル比測定用液状試薬 | |
| US5164512A (en) | Oxidizable color producing reagent | |
| US5792619A (en) | Assay using oxidative chromogenic reagent | |
| JPS59106476A (ja) | 水溶性テトラゾリウム化合物、およびその化合物を用いて還元性物質を測定する方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| DFC4 | Cancellation of temporary protection due to refusal |