JP2675835B2 - 色素原基質 - Google Patents

色素原基質

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、加水分解酵素検出用色素原基質と、これら
色素原基質の製造方法および色素原基質の使用に関す
る。
加水分解酵素、いわゆるヒドロラーゼは動物において
多くの反応を担つている。その際、それらの特異性に従
つて様々な機能を有するハイドロラーゼ間で区別がなさ
れている： 1. カルボニルエステルを加水分解するエステラーゼ、
例えばアセチルコリンエステラーゼ、 2. 糖相互間または糖とアルコールとの０−グリコシド
結合を加水分解するグリコシダーゼ、例えばβ−Ｄ−ガ
ラクトシダーゼ、 3. 燐酸エステルを加水分解するホスフアターゼ、例え
ばアルカリ性ホスフアターゼ、および 4. 硫酸エステルを加水分解するスルフアターゼ、例え
ばイズロネートスルフアターゼ。ヒドロラーゼは動物の
最も重要な酵素に属する。それらの不存在、または減少
または増加がおこると、しばしば生物の重篤な病気を示
す。既知の例がムコ多糖類症（mucopolysaccharidosi
s）である；この劣性遺伝する病気には７つの異なる発
症形態が区別されているがこれは遺伝的に決定されるヒ
ドロラーゼ欠陥、例えばモルキオ病にあつてはβ−ガラ
クトシダーゼ、およびハンター病にあつてはイズロネー
トサルフエート（iduronate sulfate）スルフアターゼ
の欠陥に基づいている。例えばモルキオ病は線維芽細胞
または白血球のβ−Ｄ−ガラクトシダーゼレベルの測定
によりはつきりと診断できる。血中また尿中のもう一つ
のグリコシダーゼであるアミラーゼのレベルは、膵臓病
の診断に用いられる。更に加水分解酵素は診断助剤、い
わゆるマーカー、として例えば酵素免疫学的測定法に用
いられる。
診断目的のための加水分解酵素定量の条件は、低濃度
の酵素であつても正確に測定できるように感度および特
異性が高い検出系であることである。天然基質はこの検
出に向いていない。何故ならば、試験実施前であつても
検体中に加水分解生成物が存在し、あるいは加水分解生
成物の測定が極めて困難だからである。従つて従来技術
においては、合成基質が用いられ、その加水分解生成物
は、物理的または化学的に検出することができる。検出
は一般に、加水分解反応中に遊離された螢光または高吸
収性色素原物質の量を測定することにより行われる。ほ
ぼ普遍的に適用でき、従つてしばしば用いられる色素原
系はｐ−ニトロフエノールのそれである。しかしなが
ら、その極めてpHに左右される黄色の発色は、光度計に
よる評価に対してさえ問題なしとせず、また視覚による
評価にも適していない。螢光原検出系、例えばフルオレ
セイン類またはメチルウンベリフエロン類は視覚によつ
ては全く検出できず、機器を以つてしかできない。また
その他の色素原基質、例えば欧州特許156,347号に記載
されているようなフエノキサジン類および欧州特許157,
384号に記載されているようなフエノチアジン類は結合
状態で既に相当な固有吸収を有している。更に、その他
の基質、例えばフエノール誘導体およびナフトール誘導
体およびインドキシルも、その色素原分子基を着色化合
物に変えるには、加水分解反応後に更なる化学反応を必
要とする。更に、多くの色素原基質は、アルカリ性pH範
囲において加水分解酵素の測定に使用できるに過ぎな
い。
従つて本発明の目的は、それらの加水分解によりpH範
囲に拘らず高感度および高特異性の測定信号を与える加
水分解酵素を検出するための色素原基質を提供すること
にある。
本発明によると、この目的は、色素原基質を次の一般
式： Ａ−Ｎ＝Ｎ−Ｂ（OR） 〔ここで式中ＡはＮ、ＳおよびＯより成る群よりの３個
までのヘテロ原子を有する環状で５−または６−員の所
望によりベンゾ縮合しうるラジカルを表わし、そして該
ラジカルは所望によりハロゲン、ニトロ、アルキル、ア
ルコキシまたはスルホネート基により置換されていても
よく、Ｂは所望によりハロゲン、アルキル、アルコキ
シ、ジアルキルアミノまたはモルホリノ基により置換さ
れていてもよい芳香族または複素環系例えばフエニル、
ピリジニル、ナフチルまたはキノリニルであり、ハロゲ
ンとは塩素、臭素または沃素ラジカル、好ましくは塩素
または臭素ラジカルを表わし、またアルキルまたはアル
コキシ基とは１〜６個の炭素原子、好ましくは１〜３個
の炭素原子を有する鎖を含みそしてＲはカルボニルラジ
カルを除く酵素加水分解により遊離され得るラジカルで
ある〕 で示されるアゾ色素化合物によつて達成される。
特に好ましい態様においては、Ｒとしては修飾された
または未修飾の糖ラジカル、ホスフエートラジカルまた
はサルフエートラジカルが用いられる。
驚くべきことに、本発明によるアゾ色素化合物は、選
択されたラジカルＲに依存して様々な特異性を有するヒ
ドロラーゼと反応し、そしてアルカリ性および酸性pH範
囲において視覚的にも光度計的にも測定できる色の変化
を示し、また酸性pH範囲における色の変化はコンプレツ
クス形成により顕著に増感できることを見出した。
与えられた一般式の色素原アゾ色素化合物を白血球エ
ステラーゼ検出に用いることは既に西独特許出願公開2,
836,644において公知であるがそこでの基質は、専らカ
ルボニルエステラーゼに対するもので、ラジカルＲはカ
ルボン酸ラジカル、またはペプチド化学において慣用の
窒素保護基を備えたアミノ酸もしくはペプチドラジカル
を表わす。更に、これらアゾ色素化合物に対しては、ア
ルカリ性pH範囲における使用しか記載されていない。
次の一般式 Ａ−Ｎ＝Ｎ−Ｂ（OR） における基ＡおよびＢを適切に選択することにより、特
定の分析課題に対して註文生産の（tailor−made）基質
を用意することができる。ここでＡはＮ、ＳおよびＯよ
り成る群よりの３個までのヘテロ原子を有する環状で５
−または６員の、所望によりベンゾ縮合したラジカルで
あつてもよく、また該ラジカルは所望によりハロゲン、
ニトロ、アルキル、アルコキシまたはスルホネート基に
より置換されていてもよく、一方、Ｂは所望によりハロ
ゲン、アルキル、アルコキシ、ジアルキルアミノまたは
モルホリノ基により置換されていてもよい芳香族または
複素環系例えばフエニル、ピリジニル、ナフチルまたは
キノリニルであつてもよい。その際、ハロゲンラジカル
は塩素、臭素または沃素ラジカル、好ましくは塩素また
は臭素ラジカルであり；アルキルまたはアルコキシ基は
１〜６個の炭素原子、好ましくは１〜３個の炭素原子を
有する鎖を含む。基ＡおよびＢの選択に如何によつて遊
離色素原は高い色強度、すなわち高いモル吸光係数を有
し、従つて高感度酵素アツセイが可能となる。ここで特
に好ましいアゾ色素は色素原基質を表わす化合物、すな
わち結合された色素原は可及的にわずかな色しか有しな
いが、遊離色素原、すなわち加水分解によりアゾ色素化
合物から遊離されたアゾ色素は極めて濃く着色されたも
のである。例えば、加水分解反応により赤紫〜青色の遊
離色素原を与える無色〜クリーム色のガラクトシドを調
製することができる。本発明の好ましい色素原基質では
更に、結合色素原と遊離色素原の吸収スペクトルの重な
りを可及的に小さくする。色素原基質の溶解度は、基Ａ
およびＢの選択に大きく依存し、かつ色素原基質の使用
目的に応じて極めて異なる要件が課せられるもう一つの
パラメータである。このように、反応の定量が光度計に
よる場合には、色素原基質および遊離色素原の水性媒質
における良好な溶解度が要求されるのに対し、例えば紙
またはフイルムに固定後の担体結合色素原基質は、水性
溶液における色のにじみ出し（bleeding）を抑えるため
に、水性媒質中の溶解度が低い色素原を必要とする。
特に好ましいのは、加水分解後に、適当な金属イオン
とのコンプレックス形成による深色的色シフトを示す色
素原を与える色素原基質である。
特に適切な色素原基質は前記一般式〔ここで式中 Ａ−は、 （ここで式中、示された炭素原子はジアゾ基に結合した
Ａの構成分である）を含み、また −Ｂ（OR）は、 （ここで式中、示された炭素原子C1はジアゾ基に結合し
たＢの構成分である）を含み、そして Ａ、ＢおよびＲは特許請求の範囲の請求項１または２
に与えられた意味を有する〕で示される基質である。
コンプレックス形成による吸収の変化によつて、これ
らの基質は色素原基質の加水分解により達成され得る効
果を超える効果を有する。この効果は注目すべきこと
に、酸性およびアルカリ性pH範囲の両方において得られ
る。
特に好ましいアゾ色素は次のとおりである。
５−ニトロチアゾール−２−アゾ−４′−フエノール ベンゾチアゾール−２−アゾ−４′−フエノール ６−ニトロベンゾチアゾール−２−アゾ−４′−フエ
ノール チアゾール−２−アゾ−２′−ピリジン−３′−オー
ル 4,5−ジメチルチアゾール−２−アゾ−２′−ピリジ
ン−３′−オール ６−エトキシベンゾチアゾール−２−アゾ−２′−ピ
リジン−３′−オール ベンゾチアゾール−２−アゾ−２′−ピリジン−３′
−オール ５−ブロモチアゾール−２−アゾ−２′−ピリジン−
３′−オール ５−クロロチアゾール−２−アゾ−２′−（４′−メ
チルフエノール） チアゾール−２−アゾ−６′（２′−ブロモ−３′−
ヒドロキシピリジン） 4,5−ジメチルチアゾール−２−アゾ−６′−（２′
ブロモ−３′−ヒドロキシピリジン） ６−エトキシベンゾチアゾール−２−アゾ−６′−
（２′−ブロモ−３′−ヒドロキシピリジン ４′−シアノピラゾール−３−アゾ−２′−（４′−
メトキシフエノール） ５−ニトロフエニルスルホニルチアゾール−２−アゾ
−２′−（４′−メチルフエノール） 4,5−ジメチルチアゾール−２−アゾ−２′−（５′
−クロロ−３′−ヒドロキシピリジン） チアゾール−２−アゾ−２′−（４′−モルホリノフ
エノール）。
本発明による前記一般式の化合物を製造するには、所
望とする特定の基ＡおよびＢを有するアゾ色素をまず自
体知られた方法で文献に知られた方法により製造する。
慣用される製造方法の例および文献は、例えば、Ullman
ns Enzyklo−die der Technischen Chemie（ウルマ
ンの工業化学エンサイクロペデイア）、第４版、Verlag
Chemie,第８巻,244頁に見られる。
ホスフアターゼおよびスルフアターゼ検出用の色素原
基質は、相当するアゾ色素を適当な酸ハライドと反応さ
せることにより製造できる。ホスフアターゼ基質を製造
するにはアゾ色素を通常オキシ塩化燐と反応させ、一方
スルフアターゼ基質の製造にはアゾ色素をクロロスルホ
ン酸と反応させる。
グリコシドの製造には、これも同じく知られた方法に
よりアゾ色素をグリコシル化する。β−ガラクトシド
は、例えば相当するアゾ色素をα−Ｄ−アセトブロモガ
ラクトースと反応させ、次いで脱アセチルすることによ
り製造できる。グリコシル化方法は、例えば、Angewand
te Chemie98（1986）213〜236頁およびそこに引用され
ている文献に記載されている。前述の方法により得られ
るグリコシドの例は例えばα−およびβ−Ｄ−ガラクト
ピラノシド、α−およびβ−Ｄ−グルコピラノシド、お
よびそれらより誘導される２〜10、好ましくは３〜７単
糖類単位を有するオリゴ糖類誘導体である。
本発明による色素原基質は、様々な加水分解酵素、例
えばホスフアターゼ、スルフアターゼおよびグリコシダ
ーゼの検出に用いられる。酵素検出にあたつては、色素
原基質は、適切な場合には必要な緩衝物質、安定剤、活
性化剤、可溶化剤、補助酵素またはその他の補助薬品を
含んでいてもよい試薬混合物中に提供される。それらの
安定性および化学的相溶性が十分な場合、様々な個々の
薬品を溶液中に併存させてよいが、それらは検出反応直
前にはじめて相互に混合してもよい。次に、加水分解活
性酵素の実際の検出はその試薬混合物を検出されるべき
加水分解酵素または試験されるべき生物学的検体と合体
後に担当するアゾ色素化合物から、酵素触媒加水分解に
より遊離したアゾ色素の吸光度を測定することによつて
行われる。この場合、溶液中での反応が好ましく、また
適切な場合には、直接セル内で行い次いで透過光度測定
法（transmitted photometry）による信号の記録によつ
て直ちに評価することができる。反応が行われた後反射
光度測定法による信号の記録を可能にする繊維様または
フイルム様試薬担体に本発明の色素原基質を適用するこ
とも好ましい。いずれの場合にも、本発明による色素原
基質を用いるときは、 視覚による評価も可能である。
本発明による色素原基質は、様々な形態で提供するこ
とができる。本発明による色素原基質と試験に必要な付
加的試薬との組合せを既に含んでいる態様が好ましい。
これらの例としては、検出反応を後で溶液中で行う場合
には、溶液、試薬錠剤、凍結乾燥物の粉末混合物であ
る。あるいはまた色素原基質は、試験に必要な付加的試
薬と共に、吸収剤担体上に吸収させるかまたは水分を吸
収する親水性フイルムに取込むこともできる。
本発明を以下図面および実施例によつて説明する。
第１図は、色素原基質、すなちチアゾール−２−アゾ
−２′−ピリジン−３′−オール（tap）、の吸収極大
の変化を示している。
ここで376nmにおけるピーク（スペクトル１）はアゾ
色素ガラクトシドに相当し、468nmにおける吸収極大
（スペクトル２）は遊離色素原に相当し、そして最後
に、526nmにおける吸収極大（スペクトル３）は遊離色
素原の銅コンプレツクスに相当する。ガラクトシドおよ
び銅コンプレツクスのスペクトル比較は、相当する吸収
曲線が重なりあわないことをはつきりと示している。
実施例１ チアゾール−２−アゾ−２′−ピリジン−３′−オー
ル（tap）の製造 ジアゾ化： 5g（50ミリモル）の２−アミノチアゾールを75mlの1/
2濃塩酸に溶解した。30mlの亜硝酸ナトリウム溶液（117
g/＝1.7モル／）を０〜４℃で30分間かけて撹拌下
に滴下して加えた。添加終了後、反応混合物を30分間撹
拌した。
カツプリング： 4.3g（45ミリモル）の３−ヒドロキシピリジンを500m
lの0.1M NaOHに溶解し、そしてその溶液を角氷で０〜５
℃に冷却した。カツプリング終了までこの温度を保つ
た。
pHを調節しながら同様に冷却されたジアゾニウム塩を
ピリジノール溶液に滴下して加えた。10M水酸化ナトリ
ウム溶液を滴下しながら加えることによりカツプリング
中のpHをpH7〜pH10に保つた。
単 離： カツプリング終了後、その溶液を農塩酸でpH3とし、
そして形成された沈殿を吸引過しそして五酸化燐を用
いてデシケータ中で真空乾燥した。
精 製： 粉砕後に、乾燥粗生成物をソツクスレー装置中、１
のトルエンを用いて抽出した。フラスコ中に晶析したta
pを吸引去し、そして適切な場合には、トルエンおよ
び／または水から数回再結晶する。徐冷すると赤褐色針
状晶が形成された。
精製後の収量はtap約1.5gであつた。
確 認： 得られた生成物を薄層クロマトグラフイ、融点測定お
よびNMR分光法により確認した。
A:薄膜クロマトグラフイ：移動相クロロホルム／メタノ
ール（90/10）、メルク社製シリカゲルプレート;Rf値0.
38。
B:融点測定は分解を伴う170℃を超える融点を示した。
C:NMR分光法:NMRスペクトルは次のピークを有する。
1. 8.4ppmに５とカツプルしたダブレツト。
2. 8.2ppmに４とカツプルしたダブレツト。
3. 8.1/8.2ppmに５とカツプルしたダブレツト。
4. 7.9ppmに２とカツプルしたダブレツト。
5. 7.5/7.6ppmに１および３とカツプルしたクアドラプ
レツト。
6. 1.5〜5.5ppmにいくつかの個々のピーク。
積分曲線によれば、各位置は水素原子を表わす。
実施例 ２ ５−ニトロチアゾール−２−アゾ−４′−フエノール
（nitrotaph）の製造 ジアゾ化： 3.0g（20ミリモル）の２−アミノ−５−ニトロチアゾ
ールをゆるやかに加温しながら、40mlの50％強度硫酸に
溶解した。暗褐色溶液を温度制御可能な二重壁反応容器
中で−20℃に冷却した。この温度はジアゾ化の間保た
れ、また、約20分間を要する7g（20ミリモル）のニトロ
硫酸の添加中、−15℃より高くなつてはならない。ニト
ロソ硫酸添加後、その反応混合物を更に２時間−20℃で
撹拌した。
カツプリング： 1.8g（20ミリモル）のフエノールを温度調節可能な二
重壁反応容器中、約200mlの0.1M NaOHに溶解し、そし
てその溶液を０℃に冷却した。そのジアゾニウム塩をこ
の温度を保ちながら、その温度制御された反応容器から
フエノール溶液に滴下して加えた。
単 離： 沈殿した塩を吸引去しそして酢酸エチルで洗浄し
た。その水性母液を800mlの酢酸エチルと共に振盪する
ことにより抽出した。酢酸エチル相を合体し、硫酸ナト
リウムを用いて予め乾燥させ、そして回転蒸発器で蒸発
乾固した。
精 製： 乾燥粗生成物を還流下に２回、30分間の間、各50mlの
トルエンと共に煮沸した。冷却し過した後に、1.6gの
赤褐色生成物が残つた。この生成物を加熱しながら、15
0mlの酢酸エチルに溶解し、そしてその溶液を過し
た。その液をシリカゲルを有する１カラム（直径6c
m）に移し、そして酢酸エチル／氷酢酸（99/1）で溶出
した。
薄層クロマトグラフイコントロールの結果に従つて合
した画分を回転蒸発器で蒸発乾固した後の収量は、1.2g
の５−ニトロチアゾール−２−アゾ−４′−フエノール
であつた。
確 認： 得られた生成物は、薄層クロマトグラフイおよび融点
測定により確認した。
A. 薄層クロマトグラフイ：三つの異なる系を用いた薄
層クロマトグラフイ分析は得られた生成物が均質である
ことを示した。薄層クロマトグラフイは、 1. クロロホルム／メタノール（90/10） 2. 酢酸エチル／氷酢酸（99/1） 3. メチレンクロライド／氷酢酸（90/10） を用いて行つた。
Rf値はクロロホルム／メタノール系についてのみ測定
したところRf＝0.49であつた。
B. 融点測定は200℃を超える融点を示した。
前記の例のほかに、ナフトール類およびヒドロキシイ
ンドール類といつた物質群のヒドロキシル基を含有する
その他の誘導体もカツプリング成分として用いた。ジア
ゾ化に用いられるアミン成分は、次のリストにみること
ができる：アミノチアゾール類（特にアルキル、ハロゲ
ン（またはニトロ）フエニル基により置換されたも
の）、アミノベンゾチアゾール誘導体、アミノピリジン
誘導体、アミノチアジアゾール誘導体、アミノイソチア
ゾール誘導体、アミノオキサゾールおよびアミノイソオ
キサゾール誘導体、アニリン誘導体およびアミノナフタ
レン誘導体。
実施例 ３ ヒドロキシアゾ色素のコンプレツクス形成 様々な化合物のコンプレツクス形成特性を次のように
して検討した： 次のものを示された順序でセル内にピペツトで移し、
そして直ちに撹拌した： 2.960mlの0.1Mホスフエート緩衝液（pH7）、30μの
アゾ色素の10μＭメタノール溶液、および10μのコン
プレツクス形成金属イオンの0.1M水性溶液。
次のような定性的情報が得られた： 検討された化合物のメタノール溶液を0.1Mホスフエー
ト緩衝液（pH7）で予め含浸した指示紙に添加しそして
乾燥した。乾燥後、コンプレツクス形成金属イオンの0.
3mM溶液をその紙上にドリツプした。
第１図はコンプレツクス形成による色シフトの例を示
す。
ほかの例を第２表にまとめる。
実施例 ４ グリコシル化反応 A. チアゾール−２−アゾ−２′−ピリジン−３′−オ
ール（tap）のガラクトシル化 2.06g（0.01モル）のtap、4.1g（0.01モル）のアセト
ブロモガラクトース、1.15g（５ミリモル）のAg2Oおよ
び1.45g（0.01モル）の硫酸カルシウム・1/2H2Oを乾燥
装置中100mlの乾燥トルエン中で還流下に加熱した。
反応は、光および水分を排除し（凝縮器には塩化カル
シウム乾燥管を取り付ける）撹拌しながら行つた。
２時間の反応時間後、反応を薄層クロマトグラフイに
よりコントロールした。形成されたtapアセトガラクト
シドはtapのスポツトの上に黄色スポツトとして現われ
た。移動相：クロロホルム／酢酸エチル（4/1）および
クロロホルム／アセトン（4/1）。
反応が十分でないときは、アセトプロモガラクトース
およびAg2Oを再び添加し、そしてその混合物を再び還流
下に加熱した。
反応が生じたら、そのバツチ溶液を過し、フイルタ
をトルエンで洗浄し、そして洗浄トルエンと母液を合体
し、そして約70ミリバール下に40℃の最高浴温で回転蒸
発器で濃縮した。
残分を真空乾燥キヤビネツト中200ミリバール下に室
温で乾燥した。汚染された生成物をカラムクロマトグラ
フイにより精製した。（分離剤 シリカゲル40、0.06〜
0.2mm、移動相クロロホルム／酢酸エチル（4/1））。精
製されたtapテトラアセチルガラクトシドを乾燥しそし
てその純度を薄層クロマトグラフイによりチエツクし
た。
B.形成されたアセチルグリコシドの脱アセチル脱アセチ
ルは、無水メタノール中、ナトリウムメチラートを用い
て行つた。このために、そのアセチルグリコシドをメタ
ノールに2mg/ml濃度となるよう溶解し、そして少量のナ
トリウムメチラートを添加した。（５〜10μの30％強
度メタノール溶液）。脱アセチルの過程は薄層クロマト
グラフイによりモニターした。
移動相：クロロホルム／酢酸エチル（4/1）およびクロ
ロホルム／メタノール（3/1）。
反応完了後、その溶液をイオン交換樹脂Dowex50×８
を用いて中性〜弱酸性にした。
次にその溶液を濃縮しそして残部を乾燥する。tapβ
−ガラクトシドの収量は180mgであつた。
C. 3,5−ジメチルチアゾール−２−アゾ−２′−ピリ
ジン−３′−オール（dimetap）のグリコシル化 2.63g（0.01モル）のブリグル無水物（Brigl′s anhy
dride）および2.36g（0.01モル）のdimetapを撹拌しな
がらかつ水分を排除しながら100mlのトルエン中で還流
下に加熱した。
反応時間:24〜48時間。
反応は薄層クロマトグラフイによりチエツクした。
移動相：クロロホルム／酢酸エチル（4/1）。
脱アセチルはＢに記載されたとおりに行つた。収量は
200mgのdimetapβ−グルコシドであつた。
実施例 ５ 色素原ガラクトシドとβ−ガラクトシダーゼとの反応 チアゾール−２′−アゾ−２′−ピリジン−３′−β
−ガラクトシド（tap−gal）を大腸菌（E.coli）からの
β−ガラクトシダーゼ（EC 3.2.1.22、至適pH約7.2）お
よびアスペルギルス・オリゼ（Asp・oryzae）からのβ
−ガラクトシダーゼ（EC3.2.1.23、至適pH約4.5）（Cal
biochem GmbH社製）を用いて分解した。その分解を視覚
的におよび光度測定的にモニターした。比較のために、
既知のβ−ガラクトシダーゼ基質であるレゾルフイン
（resorufin）β−ガラクトシド（resgal）およびクロ
ロフエノールレツドβ−ガラクトシド（CPR−gal）の分
解速度も並行的に測定した。
光度測定方法 1mlの0.1M緩衝液（ホスフエート緩衝液（pH7）または
アセテート緩衝液（pH4.5））を0.1mlの特定の基質溶液
（2.5ミリモル／または10ミリモル／）を1cmの光路
を持つセル内で混合し、そして10μのβ−ガラクトシ
ダーゼ溶液（840U/）の添加により開始した。分解反
応を約10分間モニターした。pH4.5においてtap溶液はな
おも0.33ミリモル／の硝酸銅を含有し、そして他の二
つの基質はpH7に再緩衝後測定した。
視覚法 指示紙を0.1M緩衝液（ホスフエート緩衝液（pH6、pH7
またはpH7.8）またはシトレート緩衝液（pH4.5））で予
め含浸し、乾燥した後、特定の基質の1g/メタノール
溶液で含浸し、そして乾燥した。tap−gal用の紙は付加
的に緩衝液（pH4.5、pH6およびpH7）中に0.3ミリモル／
の硝酸銅を含有した。
このようにして得られたガラクトシダーゼ試験紙を漸
減ガラクトシダーゼ濃度の諸溶液に浸漬し、そして発色
をブランク値に対して比較した。第４表は、なおも検出
可能な酵素の最小濃度を含んでおり、前の反応がpH4.5
またはpH6で行われるres−galおよびCPR−galについて
は系をpH7に再緩衝してから読みを行つた。
実施例 ６ 4,5−ジメチルチアゾール−２−アゾ−２′−ピリジン
−３′−β−Ｄ−グルコピラノシド（dimetap−gluc）
とβ−グルコシダーゼ（EC 3.2.1.21）との反応 2.9mlの0.1Mホスフエート緩衝液（pH7）をdimetap−g
lucの1.0g/水性溶液および0.1mlの10mM硝酸ナトリウ
ム溶液と1cmの光路を有するセル内で混合し、そして0.1
mlのβ−グルコシダーゼ溶液（Calbiochem GmbH）を添
加することにより反応を開始した。15分間の反応時間
後、基質は完全に遊離色素原とグルコースに分解した。
（光度計によるコントロール）。
実施例 ７ ５−ニトロチアゾール−２−アゾ−４′−フエニルホス
フエート（nitrotaph−ホスフエート）の製造および反
応 製 造： 150mg（0.6ミリモル）のnitrotaphを2.5mlの乾燥ピリ
ジンに溶解し、そしてその溶液を氷冷した。200μ
（2.2ミリモル）のオキシ塩化燐を添加後、その混合物
を６時間氷冷しながら撹拌し、次いで冷蔵庫内に18時間
貯蔵した。
単 離： ピリジンを40℃の水浴中、回転蒸発器で留去した。5g
の氷を残部に添加した。氷が解けた後その溶液を2M水酸
化カリウム溶液でpH7とし、そして蒸発乾固した。
次に、10mlずつの分析級エタノールを更に２回、粗生
成物に添加し、そしてその混合物を濃縮乾固した。
精 製： 40mgの粗生成物を1mlの水／メタノール混合物に溶解
し、そして調製用シリカゲルプレート（Merck社）（移
動相：酢酸エチル／メタノール／水（20/5/5））上で精
製した。
アルカリ性ホスフアターゼ（EC.3.1.3.1.）との反応： 基質であるインドキシルホスフエートおよびnitrotap
hホスフエートをアルカリ性ホスフアターゼ測定のため
の至適化された光度測定法に用いた。第５表には試験条
件およびこの方法の結果が含まれる。
実施例 ８ ５−ニトロチアゾール−２−アゾ−４′−フエニルサル
フエート（nitrotaphサルフエート）の製造および反応 製 造： 0.84ml（12.5ミリモル）のクロロスルホン酸を撹拌し
ながら5mlのピリジンに徐々に滴下して加え、そしてそ
の際混合物を氷−塩化ナトリウム混合物で冷却した。50
0mgのnitrotaphを形成された懸濁液に導入し、そしてそ
の混合物を水浴中で40℃で撹拌した。25時間後、20mlの
水を反応混合物に添加し、そしてその混合物を2M水酸化
カリウム溶液で中和し、そして回転蒸発器で濃縮乾固し
た。
精 製： 150mgの粗生成物を水／メタノール混合物に溶解し、
そして調製用シリカゲルプレート（Merck社）上で分離
した。
移動相：酢酸エチル／水／メタノール（100/25/30）（R
f＝約0.4）。
アリールスルフアターゼ（EC.3.1.6.1.）との反応： nitrotaph−サルフエートをメタノール（溶出液）を
用いてシリカゲルから溶出した。紙を0.1Mアセテート
緩衝液（pH6.2）で含浸しそして乾燥した。溶出液の様
々な希釈液をその紙上に滴下し、そしてアリールスル
フアターゼ（Boehringer Mannheim社）と共にインキユ
ベートした。黄色から緑色への容易に目に見える色変化
が80U/に対して１分間以内に生じた。
【図面の簡単な説明】
第１図は色素原基質チアゾール−２−アゾ−２′−ピリ
ジン−３′−オール（tap）の吸収極大の変化を示す。

Claims (11)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】次の式 Ａ−Ｎ＝Ｎ−Ｂ（OR） （ここで上記式中、 Ａは、Ｎ、ＳおよびＯより成る群よりの３個までのヘテ
    ロ原子を有する環状で、５−または６−員の所望により
    ベンゾ縮合したラジカルを表わし、そして該ラジカルは
    所望によりハロゲン、ニトロ、アルキル、アルコキシま
    たはスルホネート基により置換されていてもよく； Ｂは、所望によりハロゲン、アルキル、アルコキシ、ジ
    アルキルアミノまたはモルホリノ基により置換されてい
    てもよいピリジニルであり、 Ｒはカルボニルラジカルを除く酵素加水分解により遊離
    され得るラジカルである） で示されるアゾ色素化合物である加水分解酵素検出用色
    素原基質。
  2. 【請求項２】Ｒが修飾されたまたは未修飾の糖ラジカル
    またはホスフェートラジカルまたはサルフェートラジカ
    ルである請求項１記載の色素原基質。
  3. 【請求項３】色素原基質の加水分解生成物が金属イオン
    とのコンプレックス形成に適している請求項１または２
    記載の色素原基質。
  4. 【請求項４】以下のアゾ色素： チアゾール−２−アゾ−２′−ピリジン−３′−オー
    ル、 4,5−ジメチルチアゾール−２−アゾ−２′−ピリジン
    −３−′オール、 ６−エトキシベンゾチアゾール−２−アゾ−２′−ピリ
    ジン−３′−オール、 ベンゾチアゾール−２−アゾ−２′−ピリジン−３′−
    オール、 ５−ブロモチアゾール−２−アゾ−２′−ピリジン−
    ３′−オール、 チアゾール−２−アゾ−６′−（２′−ブロモ−３′−
    ヒドロキシピリジン）、 4,5−ジメチルチアゾール−２−アゾ−６′−（２′−
    ブロモ−３′−ヒドロキシピリジン）、 ６−エトキシベンゾチアゾール−２−アゾ−６′−
    （２′−ブロモ−３′−ヒドロキシピリジン）、 4,5−ジメチルチアゾール−２−アゾ−２′−（５′−
    クロロ−３′−ヒドロキシピリジン） のうちの一つから選ばれたもののグリコシド、燐酸エス
    テルまたはサルフェートエステルである請求項１〜３の
    いずれかに記載の色素原基質。
  5. 【請求項５】次の式 Ａ−Ｎ＝Ｎ−Ｂ（OH） で示されるアゾ色素を酸ハライドと反応させることより
    成る請求項１〜４のいずれかに記載の色素原基質の製造
    方法。
  6. 【請求項６】酸ハライドがオキシ塩化燐である請求項５
    記載の色素原基質の製造方法。
  7. 【請求項７】酸ハライドがクロロスルホン酸である請求
    項５記載の色素原基質の製造方法。
  8. 【請求項８】次の式 Ａ−Ｎ＝Ｎ−Ｂ（OH） で示されるアゾ色素をアセトブロモガラクトース、次い
    でナトリウムメチラートと反応させることより成る請求
    項１〜４のいずれか一つに記載の色素原基質の製造方
    法。
  9. 【請求項９】請求項１〜４のいずれかに記載の一つまた
    はそれ以上の色素原基質、および適切な場合には次の物
    質： 緩衝物質、 活性化剤、 可溶化剤、 補助酵素、 他の補助薬品 のうちの少くとも一つを含有する加水分解酵素検出用試
    薬混合物。
  10. 【請求項１０】適切な場合には、試験に必要な、付加的
    試薬とともに、試薬錠剤として、粉末混合物としてまた
    は凍結乾燥物として溶液中で利用可能とした色素原基質
    の請求項９に記載の試薬混合物。
  11. 【請求項１１】色素原基質が吸収剤担体上に吸収される
    かまたは親水性フィルム中に取り込まれ、適切な場合に
    は試験に必要な付加的試薬と組み合わされた請求項９記
    載の試薬混合物。
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