DE4406665A1 - Enzymsubstrate mit 2-(2-Thiazolylazo)-p-kresol als chromogener Gruppe - Google Patents

Enzymsubstrate mit 2-(2-Thiazolylazo)-p-kresol als chromogener Gruppe

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DE4406665A1
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Description

Die Erfindung betrifft Enzymsubstrate, die 2-(2-Thiazolylazo)-p-kresol als chromogene Gruppe enthalten, Verfahren zur deren Anwendung, sowie deren Verwendung zur Bestimmung der Aktivität von Hydrolasen.
Die Bestimmung von Enzymaktivitäten ist in der Klinischen Chemie und in der Diagnostik von großer Bedeutung (siehe z. B. Bergmeyer, Methods of Enzymatic Analysis, 3rd ed., Verlag Chemie, Weinheim 1983). Eine wichtige Rolle kommt dabei der Bestimmung der Hydrolasen zu. Üblicherweise wird dabei die enzymhaltige Probe mit einem geeigneten Substrat versetzt, welches bei der Spaltung eine gefärbte, UV-absorbierende oder fluoreszierende Substanz freisetzt, die spektroskopisch nachgewiesen wird. Als chromogene bzw. fluorogene Komponenten werden Hydroxyverbindungen wie Indoxyle, Nitrophenole, Umbelliferone, Hydroxychinoline, Phenolphthaleine, Resorufin und dergleichen eingesetzt.
Die bisher verwendeten Substrate besitzen jedoch Nachteile. So unterliegen Indoxylderivate nach ihrer enzymatischen Spaltung einer Reihe von chemischen Umwandlungen, und der letztlich gebildete Indigo ist, bedingt durch seine geringe Löslichkeit, für kinetische Analysen der Enzymaktivität schlecht geeignet.
Nitrophenylsubstrate wiederum ergeben nach der Spaltung nur gelb gefärbte Phenolatlösungen. Die Gelbfärbung wird jedoch oft durch die Eigenfärbung oder Trübung der Probe - wie bei Plasma- oder Urinuntersuchungen - leicht überdeckt, was besonders bei visuell auszuwertenden Tests von Nachteil ist.
Ferner sind einige Substrate - wie z. B. Resorufinderivate - nur in sehr aufwendiger Weise darzustellen und weisen eine mangelnde Stabilität auf. Dies erschwert eine längere Lagerung oder führt in Lösung auch bei Abwesenheit eines Enzyms zur langsamen Zersetzung.
Substrate mit fluorogenen Komponenten erfordern ihrerseits bei der Auswertung aufwendige Geräte wie z. B. Fluoreszenzspektrometer.
Die Thiazolylazoverbindung 2-(2-Thiazolylazo)-p-kresol (im folgenden als "TAC" abgekürzt) und strukturell verwandte Verbindungen werden in der Analytik als Komplexbildner zur photometrischen Bestimmung von Schwermetallen eingesetzt (Handbook of Organic Analytical Reagents, K.L. Cheng, Keihei Ueno, Toshiaki Imamura, CRC Press, Inc., 1982). Dabei zeigen die Metallkomplexe gegenüber dem Chelatbildner eine erhöhte Extinktion. Auch ähnliche Azoverbindungen bilden stark gefärbte Metallkomplexe. Ein Substrat, welches diese Chelatoreigenschaft nutzt, stellt das 2-(5-Chlorpyridylazo)- 5-diethylaminophenyl-N-acetyl-β-D-glucosaminid dar (K. Sasamoto und Y. Ohkura, Anal. Sci., 6, 505 (1990)). Die zu messende Farbreaktion erfolgt dabei durch Komplexierung des mittels Glucosaminidase freigesetzten Aglykons mit bereits in der abzubauenden Substratlösung vorliegenden Metallionen wie Fe (III), Co (II) oder Cu (II). Bei diesem Verfahren erweist sich jedoch als nachteilig, daß die Lösungen der Substrate in Gegenwart von Schwermetallionen nicht stabil sind und zur hydrolytischen Spaltung neigen; zusätzlich inhibieren die vorhandenen Metallionen die enzymatische Reaktion.
TAC wurde bisher nicht zur Herstellung von Enzymsubstraten eingesetzt. In der Literatur (C. van Hooidonk et al., Anal. Biochem., 48, 33-44 (1972)) wird ein Reaktionsprodukt des TAC mit Dimethylsulfat dazu benutzt, um in einer zweiten Stufe ein Esterasesubstrat in Form des Essigsäureesters zu erhalten (1-[2-Thiazolylazo]-2-acetoxy-p-kresol Dimethylsulfat). Dieses angeblich am Ringstickstoff methylierte Produkt weist jedoch gegenüber TAC gänzlich veränderte spektrale Eigenschaften auf.
Es besteht daher weiterhin ein Bedarf an Substraten zur Bestimmung der Aktivität von Hydrolasen, die nicht die oben erwähnten Nachteile aufweisen, und den schon lange und am häufigsten eingesetzten Nitrophenylsubstraten hinsichtlich ihrer Stabilität, Löslichkeit, Kostengünstigkeit und enzymatischer Abbaubarkeit entsprechen, jedoch zusätzlich eine deutlichere Farbreaktion - bevorzugt im roten Bereich des sichtbaren Spektrums - ergeben.
Es wurde nun überraschend gefunden, daß TAC aus der Gruppe der chelatbildenden Azoverbindungen die Eigenschaft besitzt, Substrate für Hydrolasen zu bilden, die auch ohne Zusatz von komplexierenden Metallen gute Meßergebnisse über Enzymaktivitäten erbringen, indem man die Indikatoreigenschaft des beim enzymatischen Abbaus abgespaltenen Chromophors nutzt.
Die obige Aufgabe wird daher durch neue Enzymsubstrate gelöst, die 2-(2-Thiazolylazo)-p-kresol (TAC) als chromogene Gruppe enthalten, und die von Hydrolasen gespalten werden können.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind demnach Glykoside (I) und Ester (II) von TAC (III) der allgemeinen Formel:
wobei R einen enzymatisch hydrolysierbaren Glykosidrest oder den Rest einer organischen oder anorganischen Säure darstellt.
Der Rest R in den TAC-Derivaten (I) und (II) ist nicht besonders beschränkt. Es können alle Glykoside und organische oder anorganische Säuren eingesetzt werden, die als Substrat für Hydrolasen verwendbar sind. Der Fachmann wird daher den Rest R im Hinblick auf die geplante Verwendung als Substrat in einem Enzymtest auswählen. So wird er eine Vielzahl von TAC-Substraten mit strukturell unterschiedlichen Resten R einsetzen, wenn die Substratspezifität des Enzyms bestimmt werden soll. Andererseits ist es vorteilhaft, bei der Überwachung der Anreicherung einer spezifischen Hydrolase über eine Reihe von Reinigungsstufen, oder für einen hochempfindlichen Test zur Bestimmung der Enzymaktivität in einer zu untersuchenden Probe, ein für das betreffende Enzym hochspezifisches Substrat zu verwenden.
Für die TAC-Derivate (I) sind als Rest R bevorzugt Mono-, Di- oder Oligosaccharide geeignet. Diese sind besonders bevorzugt ausgewählt aus Galactose, Glucose, Glucuronsäure, Cellobiose, Chitobiose, Maltoheptaose, Fucose, Mannose, Xylose, Lactose, Chitotriose, Galactose-6-phoshat, Galacturonsäure, N-Acetylglucosamin, N-Acetylgalactosamin und N- Acetylneuraminsäure.
Bei den TAC-Derivaten (II) wird R bevorzugt aus den Resten organischer oder anorganischer Säuren, ausgewählt aus Sulfat, Phosphat, 4-Guanidinobenzoat, Fettsäuren, und Salzen davon gebildet.
Ist der Rest R (II) eine Fettsäure, so sind Buttersäure, Hexancarbonsäure, Caprylsäure, Palmitinsäure und Stearinsäure besonders bevorzugt.
Die TAC-Substrate werden erfindungsgemäß in einem Test zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung der Aktivität von Enzymen aus der Klasse der Hydrolasen eingesetzt.
Dieser Test beruht im wesentlichen darauf, daß die Lösungen der TAC-Substrate (I) oder (II) im Bereich der Meßwellenlänge im wesentlichen ungefärbt sind. Das aus den Substraten nach enzymatischer Hydrolyse freigesetzte TAC bildet im neutralen pH Bereich gelb gefärbte Lösungen (λmax 373 nm; ε = 1,3 × 10⁴). Im alkalischen Bereich ist TAC in Form des Anions in Lösung violettrot gefärbt (λmax 544 nm; ε = 1,6 × 10⁴). Sein molarer Extinktionskoeffizient erreicht dabei die Werte, wie sie bei Nitrophenolsubstraten gefunden werden (p-Nitrophenolat-Ion: ε = 1,8 × 10⁴; o-Nitrophenolat-Ion: ε = 0,46 × 10⁴).
In einem typischen Enzymtest auf Hydrolasen werden die TAC- Substrate (I) und (II) durch die entsprechenden Enzyme hydrolytisch gespalten, worauf das freigesetzte TAC in Form des Anions photometrisch, bevorzugt im Bereich des Absorptions-Maximums bei 544 nm, vermessen oder anhand von Vergleichsproben visuell bewertet wird. Aus der Extinktionsänderung pro Zeiteinheit kann dann in üblicher Weise die in einer zu untersuchenden Probe enthaltene Hydrolase-Aktivität bestimmt werden.
Im allgemeinen erfolgt die enzymatische Umsetzung in einem enzymspezifischen wäßrigen Puffersystem. Die Substrate werden bevorzugt in wenig N,N-Dimethylformamid oder Wasser gelöst und in das wäßrige Medium eingebracht.
Vor der Messung erfolgt die Einstellung eines pH-Werts von größer 10 durch Zugabe eines alkalischen Puffers oder von Lauge, und es wird die der Enzymaktivität proportionale Extinktionsänderung pro Zeiteinheit ermittelt. Die Extinktionsmessung erfolgt vorteilhaft möglichst nahe am Absorptionsmaximum von TAC (544 nm im alkalischen Milieu), um die höchste Empfindlichkeit für den Test zu erreichen.
Bei der Untersuchung der alkalischen Phosphatase kann auf eine Zugabe von Alkali verzichtet werden, wenn der enzymatische Abbau bereits in einem alkalischen Puffersystem erfolgt.
Die Hydrolasen, für die die erfindungsgemäßen TAC-Derivate als Substrat fungieren können, sind nicht beschränkt. Da die Affinität eines Substrats für ein spezifisches Enzym im wesentlichen durch den Rest R bestimmt wird, wählt der Fachmann das geeignete Glycosid oder die Säure aus und setzt das entsprechende TAC-Derivat ein. Bevorzugt werden die erfindungsgemäßen Verbindungen als Substrate in Tests auf alkalische Phosphatase, β-Glucuronidase, β-Galactosidase und Sulfatase verwendet.
Für die praktische Anwendung in einem Hydrolase-Test stellt man ein Test-Kit bereit, das in geeigneter Form die erfindungsgemäßen Enzymsubstrate und geeignete Pufferlösungen zur Durchführung und Auswertung der Enzymreaktion enthält. So können die Substrate bereits als standardisierte Lösungen bereitgestellt werden, oder die Substratlösung wird erst vor der Messung mit geeigneten Puffern zubereitet.
Ein solches Kit wird regelmäßig neben den Reagenzien weitere Behälter, Küvetten, Probengläschen, Tropfflaschen und Pipetten, sowie Meßvorrichtungen zum Ermitteln des Testergebnisses umfassen. Für einen qualitativen oder halbquantitativen Test genügt als Meßvorrichtung im allgemeinen eine Karte mit mehreren aufgedruckten Farben, die jeweils einem bestimmten Extinktionswert entsprechen. Im Standardtest läßt sich so durch Vergleich der Farbe der Reaktionslösung mit der Farbkarte die Enzymaktivität oder Substratkonzentration in einer zu untersuchenden Lösung rasch bestimmen.
Für einen quantitativen Test wird die Extinktion in einem Photometer, wie oben beschrieben, gemessen und hieraus das Meßergebnis bestimmt.
Die Meßvorrichtung kann auch als sogenannter Teststreifen ausgebildet sein. Hierbei wird das erfindungsgemäße TAC- Derivat in einem saugfähigen Filz-, Fließ- oder Gewebestreifen oder -kissen eingebracht, das auf einem streifenförmigen Anfasser, der im allgemeinen aus hydrophobem Kunststoff besteht, befestigt ist. Der Teststreifen wird in die zu untersuchende Lösung eingetaucht, abgestreift, und es wird analog wie oben die sich nach einer bestimmten Zeit einstellende Farbänderung bestimmt.
Die erfindungsgemäßen Enzymsubstrate finden vor allem zur Bestimmung von Hydrolaseaktivitäten in der klinischen Chemie und Analytik Verwendung. So können Küvettentests oder Teststreifen zur raschen und kostengünstigen Untersuchung von Körperflüssigkeiten, wie Urin oder Serum eingesetzt werden. Ferner sind Anwendungen in der Histochemie, z. B. bei der Untersuchung von Gewebeschnitten, in der Mikrobiologie, z. B. beim Nachweis von bestimmten Bakterienstämmen oder der Lokalisation von enzymaktiven Zellteilen, und in der Molekularbiologie möglich. Hierbei werden die erfindungsgemäßen Substrate zum Nachweis und Identifikation gentechnisch veränderter Mikroorganismen eingesetzt: Gene, die für bestimmte Hydrolasen kodieren, können als Markergene zur Erfolgskontrolle für gentechnische Prozesse oder zur Überwachung der Freisetzung gentechnisch veränderter Microorganismen dienen. Besonders geeignet hierfür sind das gusA- und das lacZ-Gen, welche für die β-Glucuronidase bzw. β-Galactosidase kodieren, die ihrerseits das Glucuronsäure- oder das entsprechende Galactosidase-Derivat von TAC unter Ausbildung einer Farbreaktion spalten können. Eine Farbveränderung zeigt daher das Vorhandensein des Markergens im modifizierten Microorganismus an.
Die Darstellung der TAC-Glykoside (I) erfolgt nach den in der Literatur beschriebenen Methoden der Kohlenhydratchemie (Vergleiche z. B. Methods in Carbohydrate Chemistry, Academic Press, New York, 1962), die im wesentlichen auch für Reste R mit unterschiedlicher Struktur anwendbar sind.
Bevorzugt wird dabei TAC mit einem 1-Halogenosaccharid, bei dem jeweils alle Hydroxylgruppen mit einer in der Kohlenhydratchemie üblichen Schutzgruppe substituiert sind, zu dem geschützten Glykosid umgesetzt. Die Umsetzung kann dabei in wäßrig-acetonischer Lösung unter Einsatz einer Base wie Natronlauge als Säurefänger erfolgen. Die anschließende Abspaltung der Schutzgruppen führt zu den TAC-Glykosiden.
Die organischen und anorganischen TAC-Ester (II) werden üblicherweise durch Umsetzung von TAC mit einer aktivierten Säuregruppe erhalten. Beim TAC-Phosphat erfolgt die Synthese bevorzugt durch Phosphorylierung von TAC mittels Phosphoroxytrichlorid in Pyridin, wobei die als Zwischenstufe auftretende Dihalogenphosphonyloxy-Verbindung anschließend hydrolysiert und in ein Salz - bevorzugt in ihr Alkalisalz oder p-Toluidinsalz - überführt wird. TAC-Sulfat wird vorteilhaft durch Umsetzung von TAC mit einem Pyridin/Schwefeltrioxidkomplex dargestellt und in Form seines Kaliumsalzes isoliert.
Die neuen TAC-Substrate weisen gegenüber den bisher verwendeten Substraten eine Reihe von Vorteilen auf:
  • - Sie decken einen weiten Bereich der für die Untersuchungen von Hydrolasen benötigten Substrate ab. Es können sowohl Esterasesubstrate wie sie z. B. für den Test auf Phosphatase oder Sulfatase als auch Glycosidasesubstrate wie sie zur Bestimmung von Galactosidasen, Glucuronidasen, Glucosidasen usw. eingesetzt werden, dargestellt werden.
  • - TAC-Substrate werden von den entsprechenden Enzymen ebenso leicht wie die bislang gebräuchlichen Substrate gespalten.
  • - Besonders hervorzuheben ist der Umstand, daß bei der enzymatischen Reaktion eine intensive stabile rotviolette Farbe entsteht. Im Gegensatz zur Gelbfärbung, die sich beim Abbau von Nitrophenylsubstraten bildet, tritt sie auch bei schwach gefärbten oder trüben Proben deutlich hervor. Neben der photometrischen Vermessung bei der günstigen Wellenlänge von 544 nm kann deshalb auch gut ein visuelles Beurteilungsverfahren herangezogen werden.
  • - Die gute Löslichkeit des beim Abbau erhaltenen Farbstoffes (TAC) im Gegensatz zur Schwerlöslichkeit des aus Indoxylsubstraten entstehenden Indigos vereinfacht die Durchführung von Küvettentests.
  • - TAC-Substrate sind relativ einfach darzustellen und deshalb preisgünstig.
  • - Die neuen Substrate weisen sowohl bei der Lagerung als auch in Lösung eine hohe Stabilität auf.
  • - Die erfindungsgemäßen TAC-Substrate sind vorteilhaft in der klinischen Chemie zur Diagnostik, in der Histochemie, Mikrobiologie und in der Molekularbiologie einsetzbar.
Fig. 1 und 2 zeigen jeweils den enzymatischen Abbau unter Verwendung einer Verbindung gemäß Beispiel 2 oder 3 im Vergleich zum Abbau von p- Nitrophenyl-β-D-glucopyranuronsäure Natriumsalz bzw. p-Nitrophenyl-phosphat Dinatriumsalz.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung.
Beispiel 1 [2-(2-Thiazolylazo)-p-kresyl]-β-D-galactopyranosid (TAC-Galactosid)
Die Glycosylierung der phenolischen Hydroxylgruppe wurde über die Zwischenstufe der Tetraacetylverbindung nach folgendem Verfahren durchgeführt.
5,28 g (24 mmol) 2-(2-Thiazolylazo)-p-kresol (TAC) wurden zusammen mit 12 g (29 mmol) Bromotetraacetyl-α-D-galactose in 240 ml Aceton gelöst, und es wurden 96 ml deionisiertes Wasser zugegeben. Nach Zusatz von 24 ml (24 mmol) 1N Natronlauge wurde 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde das Aceton im Vakuum abdestilliert und die wäßrige Phase vom braunen Harz dekantiert. Letzteres wurde noch zweimal mit je 100 ml Wasser unter Aufrühren und Dekantieren gewaschen; Wasserreste wurden im Vakuum entfernt. Der harzige Rückstand wurde in 200 ml Essigsäureethylester gelöst und die Lösung mit 200 ml Toluol verdünnt. Nichtumgesetztes TAC wurde durch sechsmaliges Ausschütteln mit je 200 ml eisgekühlter 0,5N Natronlauge, gefolgt von 200 ml 0°C kaltem Wasser entfernt.
Die organische Phase wurde im Vakuum zu 8,27 g braunem Harz eingedampft, aus welchem nach Lösen in 400 ml Ethanol, Animpfen und eintägigem Stehenlassen bei 5°C die Acetylverbindung auskristallisiert war. Sie wurde abfiltriert, zweimal mit je 30 ml eisgekühltem Methanol gewaschen und bei Raumtemperatur im Vakuum getrocknet.
Ausbeute: 7,39 g oranges wattiges [2-(2-Thiazolylazo)-p- kresyl]-β-D-galactosid-tetraacetat.
6,27 g (11,4 mmol) [2-(2-Thiazolylazo)-p-kresyl]-β-D- galactosid-tetraacetat wurden in 150 ml absolutem Methanol am Siedepunkt gelöst und mit einer Lösung von 15 mg Natrium in 3 ml Methanol versetzt. Nach weiteren fünfminütigem Sieden wurde die erhaltene Suspension auf 25°C abgekühlt, und es wurden 0,15 ml Essigsäure zugegeben. Nach zweistündigem Rühren im Eis wurde der erhaltenen Feststoff abgesaugt, zweimal mit je 20 ml eisgekühltem Methanol gewaschen und danach bei Raumtemperatur im Vakuum getrocknet.
Ausbeute: 4,01 g oranges pulvriges [2-(2-Thiazolylazo)-p- kresyl]-β-D-galactopyranosid.
Elementaranalyse: C₁₆H₁₉N₃O₆S, Molekulargewicht 381,4
C (berechnet) : 50,4%, C (gefunden) : 50,3%
H (berechnet) : 5,0%, H (gefunden) : 5,0%
N (berechnet) : 11,0%, N (gefunden) : 11,0%
S (berechnet) : 8,4%, S (gefunden) : 8,5%.
Wassergehalt (gefunden K.F.): 0,4%.
Rf-Wert: 0,4 (DC auf Kieselgel Merck,
Fließmittel : Essigsäureethylester/ 2-Propanol/Ammoniaklösung 25%ig = 45 : 35 : 20 v/v/v).
UV/VIS (Wasser) : λmax = 378 nm.
Beim enzymatischen Abbau in einem Tris-Puffer pH 7,05 mit β- Galctosidase (Sigma Art. G-2513), anschließendem Einstellen des pH-Wertes auf 10,2 mit Natronlauge und photometrischen Vermessen bei 544 nm zeigte sich die Verbindung als Substrat für β-Galactosidase geeignet.
Beispiel 2 [2-(2-Thiazolylazo)-p-kresyl]-β-D-glucopyranuronsäure Natriumsalz (TAC-Glucuronid)
Die Darstellung der Verbindung erfolgte über die Zwischenstufe des [2-(2-Thiazolylazo)-p-kresyl]-β-D- glucopyranuronsäuremethylesters.
Zu einer Lösung von 1,38 g (60 mmol) Natrium in 120 ml Methanol wurden bei 20°C 13,14 g (60 mmol) 2-(2-Thiazoly­ lazo)-p-kresol gegeben und dann auf 0°C abgekühlt. Innerhalb von 15 Minuten wurden 24 g (60 mmol) Bromotriacetyl-β-D- glucopyranuronsäuremethylester eingetragen. Danach wurde noch 30 Minuten bei 0°C gefolgt von zwei Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Der ausgefallene Feststoff wurde abfiltriert, mit dreimal je 30 ml eisgekühltem Methanol gewa­ schen und im Vakuum getrocknet (11 g oranges Pulver) . Durch Umkristallisation aus heißem Ethanol wurden daraus 8,48 g reiner [2-(2-Thiazolylazo)-p-kresyl]-β-D- glucopyranuronsäuremethylester erhalten.
9,80 g (24 mmol) des oben angeführten Esters wurden in 100 ml Aceton und 69 ml destilliertem Wasser bei 3°C aufgeschlämmt, 31 ml 1N Natronlauge zugegeben und das Reaktionsgemisch danach 30 Minuten gegen Raumtemperatur gerührt. Nach Einstellen des pH auf 7 mittels Essigsäure wurde die Lösung im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde heiß aus einem Gemisch von 200 ml Methanol und 30 ml Wasser umkristallisiert.
Ausbeute: 8,44 g [2-(2-Thiazolylazo)-p-kresyl]-β-D- glucopyranuronsäure Natriumsalz als orangerotes Pulver.
Elementaranalyse: C₁₆H₁₆N₃O₇SNa, Molekulargewicht 417,4
C (berechnet) : 46,0%, C (gefunden) : 45,9%
H (berechnet) : 3,9%, H (gefunden) : 3,9%
N (berechnet) : 10,1%, N (gefunden) : 9,9%
S (berechnet) : 7,7%, S (gefunden) : 7,7%
Na (berechnet) : 5,5%, Na (gefunden) : 5,3%.
Rf-Wert: 0,65 (DC auf Kieselgel Merck, Fließmittel: 1-Butanol/Essigsäure/Wasser = 6 : 3 : 2 v/v/v).
UV/VIS (Wasser) : λmax = 379 nm.
Fig. 1 zeigt den enzymatischen Abbau von [2-(2-Thiazoly­ lazo)-p-kresyl]-β-D-glucopyranuronsäure Natriumsalz im Vergleich zum Abbau von p-Nitrophenyl-β-D-glucopyranuronsäure Natriumsalz.
Beide Substrate wurden in einer Konzentration von 0,48 mmol/l in einem Phosphatpuffer pH 6,8 bei 37°C durch 163 U/l (Sigma- oder modifizierte "Fishman"-Einheiten, Sigma Art. G-7369) β-Glucuronidase gespalten. Nach der Umsetzung wurde der pH- Wert der Probe durch Zugabe eines Glycinpuffers auf 10,4 gestellt und die Extinktion bei der entsprechenden Wellenlänge gemessen.
Beispiel 3 [2-(2-Thiazolylazo)-p-kresyl]-phosphat p-Toluidinsalz (TAC- Phosphat)
Die Darstellung erfolgte über die Zwischenstufen der freien Säure und des Dinatriumsalzes.
9 g (41 mmol) 2-(2-Thiazolylazo)-p-kresol wurden in 120 ml trockenem Pyridin gelöst und nach Abkühlen auf -20°C mit 7,9 g (51 mmol) Phosphoroxytrichlorid versetzt. Danach wurde das Reaktionsgemisch 6 Stunden bei 0°C gefolgt von 16 Stunden bei 5°C gerührt. Nach weiterem fünfstündigen Rühren bei Raumtemperatur wurde im Vakuum eingedampft und der Rückstand mit 150 g Eis zersetzt. Nach Stehen über Nacht bei 5°C wurde der abgeschiedene Feststoff abfiltriert, zweimal mit je 30 ml Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet.
Ausbeute: 11,69 g [2-(2-Thiazolylazo)-p-kresyl]-phosphorsäure als orangefarbenes Pulver.
Die rohe Säure wurde in 350 ml Wasser aufgeschlämmt und durch Zugabe von 78 ml 1N Natronlauge gelöst. Durch Zugabe von 1,6 1 Ethanol, gefolgt von 18 stündigem Stehen bei 5°C, Abfiltrieren, Waschen und Trocknen wurden 11,67 g [2-(2- Thiazolylazo)-p-kresyl]-phosphorsäure Dinatriumsalz Hydrat als hellorange Plättchen erhalten.
Zu 4,54 g des Dinatriumsalzes, gelöst in 41 ml Wasser, wurde bei 45°C eine auf 50°C erwärmte Lösung von 1,13 g p-Toluidin in 22,5 ml Wasser und 1,13 ml 32%iger Salzsäure gegeben. Nach Einstellen des pH-Wertes mit Salzsäure auf 3,5 wurde noch 30 Minuten gegen Raumtemperatur gerührt, abfiltriert und mit Wasser gewaschen. Die rohe Verbindung wurde anschließend noch zweimal mit je 40 ml Aceton fünf Minuten aufgekocht und jeweils abgesaugt. Nach Trocknung im Vakuum verblieben
Ausbeute: 3,09 g [2-(2-Thiazolylazo)-p-kresyl]-phosphat p-Toluidinsalz in Form eines orangefarbenen Pulvers.
Elementaranalyse: C₁₇H₁₉N₄O₄PS, Molekulargewicht 406,4
C (berechnet) : 50,2%, C (gefunden) : 50,6%
H (berechnet) : 4,7%, H (gefunden) : 4,9%
P (berechnet) : 7,6%, P (gefunden) : 7,9%
S (berechnet) : 7,9%, S (gefunden) : 7,5%.
Rf-Wert: 0,45 (DC auf Kieselgel Merck, Fließmittel: 2-Propanol/Ammoniaklösung 25%ig/Wasser = 7 : 1 : 2 v/v/v).
UV/VIS (Wasser) : λmax = 378 nm.
Fig. 2 zeigt den enzymatischen Abbau von [2-(2-Thiazylazo)- p-kresyl)-phosphat p-Toluidinsalz im Vergleich zum Abbau von p-Nitrophenyl-phosphat Dinatriumsalz.
Die enzymatische Umsetzung erfolgt nach dem Verfahren von Bo­ wers (Measurement of total alkaline phosphatase activity in human serum., G.N. Bowers et al., Clin. Chem., Vol. 21, No. 13, 1988 [1975]); es wurden hier jedoch geringere Substratkonzentrationen als in der Literatur beschrieben verwendet.
Der enzymatische Abbau beider Substrate erfolgte bei einer Konzentration von 0,058 mmol/l in einem 2-Amino-2-methyl-1- propanol-Puffer bei pH 10,33 mit einer Enzymkonzentration von 163 U/l (Alkalische Phosphatase, Sigma Art.P-5521) und bei einer Temperatur von 30°C. Die Extinktion wurde bei den jeweiligen Wellenlängen direkt aus der Probelösung bestimmt.
Beispiel 4 [2-(2-Thiazolylazo)-p-kresyl]-sulfat Kaliumsalz (TAC-Sulfat)
12,5 g (57 mmol) 2-(2-Thiazolylazo)-p-kresol wurden in 60 ml trockenem Pyridin gelöst und 10 g (62 mmol) Schwefeltrioxid- Pyridinkomplex (Fluka) zugegeben. Anschließend wurde das Reaktionsgemisch noch 20 Minuten bei Raumtemperatur, gefolgt von drei Stunden bei 60°C gerührt. Danach wurde im Vakuum zur Trockne eingedampft, der Rückstand in 150 ml Wasser aufgeschlämmt und der pH-Wert mit 5N Kalilauge auf 7 gestellt. Nach zweistündigem Rühren wurde der Feststoff abfiltriert, mit 40 ml Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet.
Zur weiteren Reinigung wurde das Rohprodukt in 100 ml Ethanol 30 Minuten bei 40°C gerührt, erneut abfiltriert und getrocknet (7,92 g). Die Endreinigung erfolgte durch Lösen in 300 ml Wasser und Ausschütteln mit 300 ml, gefolgt von 150 ml Essigsäureethylester, Eindampfen der wäßrigen Phase auf 100 ml, 18-stündigem Kühlen auf 5°C, Abfiltrieren, Nachwaschen mit wenig eisgekühltem Wasser und Trocknen. Aus der Mutterlauge wurde durch Eindampfen auf 50 ml eine weitere Fraktion gewonnen. Die Gesamtmenge (5,66 g) wurde nochmals in 25 ml Ethanol 20 Minuten aufgeschlämmt, abfiltriert, mit wenig Ethanol gefolgt von Petrolether gewaschen und dann getrocknet.
Ausbeute: 5,60 g [2-(2-Thiazolylazo)-p-kresyl]-sulfat Kaliumsalz als orangefarbenes Pulver.
Elementaranalyse: C₁₀H₈N₃O₄KS₂, Molekulargewicht 337,4
C (berechnet) : 35,6%, C (gefunden) : 35,6%
H (berechnet) : 2,4%, H (gefunden) : 2,4%
N (berechnet) : 12,5%, N (gefunden) : 12,4%
K (berechnet) : 11,6%, K (gefunden) : 11,0%
S (berechnet) : 19,0%, S (gefunden) : 19,0%.
Bei den gefundenen Werten wurde der Wassergehalt von 1,23% berücksichtigt.
Rf-Wert: 0,8 (DC auf Kieselgel Merck, Fließmittel : 2-Propanol/Essigsäure/Wasser = 4 : 1 : 1 v/v/v).
UV/VIS (Wasser) : λmax = 374 nm.
In einem Funktionstest mit Sulfatase (Sigma Art. S-9626) in einem Phosphat-Puffer pH 6,8 bei 37°C, gefolgt von anschließendem Einstellen des pH-Wertes auf 10,4 mit einem Glycinpuffer und Messen der Extinktion bei 544 nm erwies sich die Verbindung als Substrat zur Bestimmung von Sulfatase geeignet.

Claims (12)

1. Enzymsubstrat für Hydrolasen mit der allgemeinen Formel: worin R
  • (I) einen Glykosidrest, oder
  • (II) den Rest einer organischen oder anorganischen Säure darstellt.
2. Enzymsubstrat nach Anspruch 1, worin der Rest R (I) ausgewählt ist aus Mono-, Di- oder Oligosacchariden.
3. Enzymsubstrat nach Anspruch 2, worin der Rest R (I) ausgewählt ist aus Galactose, Glucose, Glucuronsäure, Cellobiose, Chitobiose, Maltoheptaose, Fucose, Mannose, Xylose, Lactose, Chitotriose, Galactose-6-phoshat, Galacturonsäure, N-Acetylglucosamin, N-Acetylgalactosamin und N-Acetylneuraminsäure.
4. Enzymsubstrat nach Anspruch 1, worin der Rest R (II) ausgewählt ist aus Sulfat, Phosphat, 4-Guanidinobenzoat, Fettsäuren und Salzen davon.
5. Enzymsubstrat nach Anspruch 4, worin der Rest R (II) eine Fettsäure ist, ausgewählt aus Buttersäure, Hexancarbonsäure, Caprylsäure, Palmitinsäure und Stearinsäure.
6. Verfahren zur Bestimmung von Hydrolase-Enzymaktivität in einer Probenlösung, wobei man
  • - in einem enzymspezifischen wäßrigen Puffersystem ein Enzymsubstrat nach einem der Ansprüche 1 bis 5 für einen bestimmten Zeitraum mit einem Aliquot der Probenlösung inkubiert,
  • - die Extinktion des freigesetzten 2-(2-Thiazolylazo)- p-kresols in Form seines Anions photometrisch oder visuell bestimmt, und
  • - aus der Extinktionsänderung pro Zeiteinheit die in der Probenlösung enthaltene Hydrolase-Aktivität bestimmt.
7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei man die Extinktion des 2-(2-Thiazolylazo)-p-kresols photometrisch bei einer Wellenlänge von 544 nm im alkalischen Milieu bestimmt.
8. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Hydrolase ausgewählt ist aus alkalischer Phosphatase, Sulfatase, β-Glucuronidase und β-Galactosidase.
9. Testkit für die Anwendung in einem Verfahren nach Anspruch 6, das in kompartimentierter Form die Enzymsubstrate nach einem der Ansprüche 1 bis 5, geeignete Pufferlösungen, weitere zur Durchführung des Enzymtest notwendige Behälter und eine Vorrichtung zum Ablesen der Farbveränderung umfaßt.
10. Testkit nach Anspruch 9, worin das Enzymsubstrat auf einem Teststreifen vorliegt.
11. Verwendung eines Enzymsubstrats nach einem der Ansprüche 1 bis 5 in der klinischen Chemie zur Bestimmung von Hydrolaseaktivitäten in einer Körperflüssigkeit, in der Histochemie zur Untersuchung von Gewebeschnitten, in der Mikrobiologie zum Nachweis bestimmter Bakterienstämme oder Lokalisation von enzymaktiven Zellteilen, und in der Molekularbiologie zum Nachweis von Markergenen.
12. Verwendung nach Anspruch 11, worin das Enzymsubstrat ausgewählt ist aus dem Galactose- oder dem Glucuronsäure- Derivat von 2-(2-Thiazolylazo)-p-kresol, und das Markergen für β-Galactosidase oder β-Glucuronidase kodiert.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1825264A2 (de) * 2004-12-03 2007-08-29 Idexx Laboratories, Inc. Verfahren und vorrichtungen zur erkennung pankreatischer lipase

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4296202A (en) * 1978-08-22 1981-10-20 Boehringer Mannheim Gmbh Diagnostic composition for the detection of leukocytes and chromogens useful therein
EP0061731A2 (de) * 1981-03-26 1982-10-06 Fuji Photo Film Co., Ltd. Phosphorsäureester und ein Verfahren zur quantitativen Analyse einer alkalischen Phosphatase unter Verwendung derselben als Substrat
DE3732871A1 (de) * 1987-09-30 1989-04-20 Behringwerke Ag Chromogene substrate

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4296202A (en) * 1978-08-22 1981-10-20 Boehringer Mannheim Gmbh Diagnostic composition for the detection of leukocytes and chromogens useful therein
US4442033A (en) * 1978-08-22 1984-04-10 Boehringer Mannheim Gmbh Azo dyestuff for use as a chromogen in detecting leukocytes
EP0061731A2 (de) * 1981-03-26 1982-10-06 Fuji Photo Film Co., Ltd. Phosphorsäureester und ein Verfahren zur quantitativen Analyse einer alkalischen Phosphatase unter Verwendung derselben als Substrat
DE3732871A1 (de) * 1987-09-30 1989-04-20 Behringwerke Ag Chromogene substrate

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
C. van Hooidonk et al: Anal. Biochemistry 48, (1972) S. 33 - 34 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1825264A2 (de) * 2004-12-03 2007-08-29 Idexx Laboratories, Inc. Verfahren und vorrichtungen zur erkennung pankreatischer lipase
EP1825264A4 (de) * 2004-12-03 2009-05-13 Idexx Lab Inc Verfahren und vorrichtungen zur erkennung pankreatischer lipase

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