CN109867722A

CN109867722A - Aiv h5亚型单克隆抗体、杂交瘤细胞和层析试纸条

Info

Publication number: CN109867722A
Application number: CN201810935731.3A
Authority: CN
Inventors: 王津津; 卢奕良; 孙洁; 蔡良语; 陈兵; 郑晓聪; 秦智锋
Original assignee: Shenzhen Academy of Inspection and Quarantine; Animal and Plant Inspection and Quarantine Technology Center of Shenzhen Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau
Current assignee: Shenzhen Academy of Inspection and Quarantine; Animal and Plant Inspection and Quarantine Technology Center of Shenzhen Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau
Priority date: 2018-08-16
Filing date: 2018-08-16
Publication date: 2019-06-11
Anticipated expiration: 2038-08-16
Also published as: CN109867722B

Abstract

本申请公开了一种AIV H5亚型单克隆抗体、杂交瘤细胞和层析试纸条。本申请的AIV H5亚型单克隆抗体由保藏号CCTCC NO.C2017262的杂交瘤细胞H5HA 25分泌产生。本申请的AIV H5亚型单克隆抗体具备良好的特异性和效价，制成的荧光微球标记快速免疫检测试纸，提高了检测速度和检测灵敏度，实现了AIV H5亚型的现场检测。本申请的AIV H5亚型单克隆抗体填补了AIV H5亚型荧光免疫层析检测的空白，为AIV H5亚型的免疫学研究奠定了基础。

Description

AIV H5亚型单克隆抗体、杂交瘤细胞和层析试纸条

技术领域

本申请涉及单克隆抗体领域，特别是涉及一种用于AIV H5亚型检测的单克隆抗体，分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞，以及基于AIV H5亚型单克隆抗体的层析试纸条。

背景技术

禽流感(Avian Influenz，缩写AI)，是由A型禽流感病毒(缩写AIV)引起的一种禽类的感染和/或疾病综合征，根据禽流感病毒对易感禽的致病性将其分为高致病性(HighlypathogenicAvian Influenza，HPAI)、低致病性(LPAI)和无致病性3种。H5NA亚型病毒株属于HPAI，其对养禽业的危害使得该亚型AIV 的快速诊断成为研究热点。

血凝素(Hemagglutinin,HA)为AIV的表面糖蛋白(75Ku)，是构成AIV 囊膜纤突的主要成分之一，直接参与了AIV的致病过程，编码HA的基因发生点突变引起抗原漂移是病毒HA发生抗原变异的主要原因之一。

目前，AI监测方法包括传统方法与分子生物学方法。传统方法主要有病毒分离培养鉴定和血清学诊断，其不足之处在于操作繁琐、耗时和结果重复性不佳。而分子生物学方法，如RT-PCR与基因芯片技术等被应用于检测AIV，具有特异、敏感、简便快捷等特点，但对实验条件要求高，所需仪器设备昂贵，对人员的操作技能水平也有要求，不易在基层兽医部门进行普及推广。因此，研究适用于基层实验室，研制H5亚型AIV现场快速准确检测的新型方法仍然是热点之一。

发明内容

本申请的目的是提供新的AIV H5的单克隆抗体，分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞，以及该单克隆抗体的应用。

为了实现上述目的，本申请采用了以下技术方案：

本申请一方面公开了一种AIV H5亚型单克隆抗体，该单克隆抗体由保藏号 CCTCCNO.C2017262的杂交瘤细胞H5HA25分泌产生。

其中，杂交瘤细胞H5HA25于2017年11月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO.C2017262。

需要说明的是，本申请在对高致病性的H5NA亚型禽流感病毒(缩写AIV H5 亚型)进行研究时，获得了多个阳性特异性杂交瘤细胞，并且，其中一个阳性杂交瘤细胞效价最高、特异性最强，且可稳定分泌抗AIV H5亚型特异性单克隆抗体，因此对其进行了保藏，即本申请的保藏号为CCTCC NO.C2017262的杂交瘤细胞。本申请率先研制了AIV H5亚型的单克隆抗体，为AIV H5亚型的免疫学检测以及后续研究奠定了基础；可以理解，本申请的AIVH5亚型单克隆抗体具备良好的特异性和效价，因此可以用于AIV H5亚型的检测。

本申请的另一面公开了一种分泌AIV H5亚型单克隆抗体的杂交瘤细胞，其保藏号为CCTCCNO.C2017262。

需要说明的是，本申请的杂交瘤细胞能够有效的分泌出特异性强、效价高的AIVH5亚型单克隆抗体，即本申请的AIV H5亚型单克隆抗体，为大批量生产本申请的AIV H5亚型单克隆抗体或含有该单克隆抗体的试剂盒奠定了基础。

本申请的再一面公开了本申请的AIV H5亚型单克隆抗体或本申请的杂交瘤细胞在制备AIVH5亚型检测试剂盒或装置中的应用。

需要说明的是，本申请中检测试剂或用于相关检测的设备或装置，包括现有的以免疫学为基础的各种检测试剂或装置，如与免疫层析技术相结合的快速检测试纸条或试纸卡等，在此不做具体限定；可以理解，本申请的AIV H5亚型单克隆抗体具备良好的特异性和效价，只要将现有试纸中的抗体替换成本申请的AIV H5亚型单克隆抗体，即可得到AIV H5亚型快速检测试纸，不仅可以提高AIV H5亚型的检测速度和检测效率，而且无需特殊设备，可以很方便进行现场诊断检测。

可以理解，本申请的试剂盒可以是简单的以试剂形式存在的AIV H5亚型单克隆抗体，以供实验室进行AIV H5亚型的免疫学研究；也可以是含有的AIV H5 亚型单克隆抗体的快速检测试纸，以方便检验检疫实践使用；在此不做具体限定。

本申请的再一面公开了一种AIV H5亚型免疫层析检测试纸条，该试纸条包括搭接在支撑材料上的样品垫和层析条；层析条上设置有检测线和质控线，检测线上固定有A型禽流感病毒通用单克隆抗体，质控线上固定有抗鼠IgG抗体；样品垫上喷涂有荧光微球标记、胶体金标记或量子点标记的本申请的AIV H5亚型单克隆抗体。

需要说明的是，本申请的AIV H5亚型免疫检测层析试纸条，其关键在于采用了本申请的AIVH5亚型单克隆抗体，至于检测线、质控线等可以参考现有的试纸条。对AIV H5亚型单克隆抗体的标记也可以采用常规的标记，例如荧光微球标记、胶体金标记或量子点标记等。

优选的，本申请的AIVH5亚型免疫检测层析试纸条中，层析条为硝酸纤维素膜。

优选的，本申请的AIVH5亚型免疫检测层析试纸条中，样品垫为玻璃纤维垫。

本申请的再一面还公开了本申请的AIV H5亚型免疫检测层析试纸条在制备AIVH5亚型检测试剂盒或装置中的应用。

由于采用以上技术方案，本申请的有益效果在于：

本申请的AIVH5亚型单克隆抗体具备良好的特异性和效价，其制成的快速免疫检测试纸，不仅能够提高检测速度、检测效率和检测灵敏度，而且能够实现AIV H5亚型的现场检测。本申请的AIV H5亚型单克隆抗体填补了AIV H5 亚型免疫层析检测的空白，为AIV H5亚型的免疫学研究奠定了基础。

本申请分泌AIV H5亚型单克隆抗体的杂交瘤细胞，即杂交瘤细胞H5HA 25，其微生物保藏号为：CCTCC NO.C2017262；分类命名为：杂交瘤细胞 hybridoma cell；保藏时间为：2017年11月29日；保藏单位是：中国典型培养物保藏中心；保藏地址是：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心。

附图说明

图1是本申请实施例中H5亚型禽流感病毒荧光微球检测试纸条的特异性检测结果；

图2是本申请实施例中H5亚型禽流感病毒荧光微球检测试纸条的灵敏度检测结果。

具体实施方式

AIV H5亚型是高致病性的A型禽流感病毒，目前尚未有适用于全部现有 AIV H5亚型的现场快速检测方案。为此，本申请研发了AIV H5亚型单克隆抗体，在此基础上，针对H5亚型禽流感病毒开创性的探索并提出基于荧光微球和胶体金的两种免疫层析检测技术，率先实现了H5亚型禽流感病毒现场快速检测技术方法。研究中发现，荧光微球免疫层析技术的灵敏度较胶体金免疫层析技术高10至100倍，既能实现现场检测，又能实现超敏准确检测，能够取代禽流感病毒的传统检测和分子生物学检测方法。本申请的AIV H5亚型单克隆抗体以及基于此研发的AIV H5亚型免疫检测层析试纸条，填补了我国禽流感现场快速检测技术空白，具有重大的意义。

下面通过具体实施例对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。

实施例

一、主要试验材料

1.免疫抗原

H5N1(Re-6)和H5N1(Re-7)购自哈尔滨兽医研究所；H5N2(疫苗株) 购自广东大华农动物保健品股份有限公司；H5N1(FJ)采集自福建，由深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中保存和提供；H5N1(HK)采集自香港，由深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中保存和提供。

2.实验动物和细胞

骨髓瘤SP2/0细胞，由深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中保存和提供；BALB/c小鼠，购自广东省医学实验动物中心。

3.试剂

弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、HAT选择培养基、HT培养基、胎牛血清、 DMEM高糖培养基，均购自Gibco公司；PEG(MW1500)购自默克公司；H5 亚型禽流感抗体酶联免疫反应试剂盒购自Kernel公司。

二、试验方法

1.动物免疫

超速离心纯化H5N1(Re-6)、H5N1(Re-7)、H5N1(FJ)、H5N2(HN)、H5N1 (HK)抗原，将6周龄、体重20g的BALB/c小鼠随机分组，每组小鼠8只。然后按表1所示进行各次免疫。

表1动物免疫流程

2.单克隆抗体检测方法的建立

(1)材料

a.包被缓冲液

碳酸盐缓冲液：取0.2mol/LNa₂CO₃8mL，0.2mol/LNaHCO₃17mL混合，再加75mL蒸馏水，调PH至9.6。

Tris-HCl缓冲液PH8.0，0.02mol/L：取0.1mol/L Tris 100mL，0.1mol/L HCl58.4mL混合，蒸馏水至1000mL。

b.洗涤缓冲液PH7.2的PBS：KH₂PO₄0.2g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g，NaCl8.0g，Tween-200.5mL，加蒸馏水至1000mL。

c.稀释液和封闭液：牛血清白蛋白(BSA)0.1g，加洗涤液至100mL

d.酶反应终止液2mol/L H₂SO₄：取蒸馏水178.3mL，滴加98％浓硫酸 21.7mL。

e.底物缓冲液，即PH5.0，磷酸盐-柠檬酸缓冲液：取0.2mol/L NaHPO₄ 25.7mL，0.1mol/L柠檬酸24.3mL，再加50mL蒸馏水。

f.底物使用液

TMB底物使用液，测450nm的OD值：1mg/mL的TMB 1.0mL，底物缓冲液10mL，1％H₂O₂25μL。

g.抗体对照：以骨髓瘤细胞培养上清作为阴性对照，以免疫鼠血清作为阳性血清。

h.可溶性抗原：H5HA纯化抗原

i.酶标抗鼠抗体

(2)操作步骤

a.将H5HA抗原用抗原包被稀释液稀释至1-20μg/mL

b.以100μL/孔量加入酶标板孔中，置4℃过夜或37℃吸附2小时。

c.弃去孔内的液体，同时用洗涤液洗3次，每次3-5分钟，拍干。

d.每孔加200μL封闭液4℃过夜或37℃封闭2小时。

e.洗涤液洗3次；此时包被板可-20℃或4℃保存备用。

f.每孔加100μL待检杂交瘤细胞培养上清，同时设立阳性对照、阴性对照和空白对照；37℃孵育1小时；洗涤，拍干。其中，阳性对照即小鼠处死前采集的血清，缩写P；阴性对照即小鼠免疫前采集的血清，缩写N；空白对照即骨髓瘤细胞培养上清，缩写B。

g.加酶标第二抗体，每孔100μL，37℃孵育1小时，洗涤，拍干。

h.加底物液，每孔加新鲜配制的底物使用液100μL，37℃10-30分钟。

i.以100μL 2mol/L H₂SO₄终止反应，在酶联免疫阅读仪上读取OD值。

j.首先判定阳性对照的P-B/N-B，如果(P-B/N-B)≧2.1，说明实验成立。

k.结果判定：以P/N≧2.1或P≧N+3SD为阳性。P代表阳性孔OD值，N代表一组阴性对照孔OD值的平均值，SD代表阴性对照标准差。若阴性对照孔无色或接近无色，阳性对照孔明确显色，则可直接用肉眼观察结果。

3.杂交瘤细胞株的建立

(1)饲养层细胞的准备

于融合前1天，将未经免疫的BALB/c小鼠眼球采血处死，分离血清作为阴性对照，-20℃保存备用，浸泡于75％酒精内5min，固定于超净工作台无菌托盘上。小心剪开腹部皮肤，分离皮肤，暴露腹膜。用无菌注射器吸取适量DMEM 培养基注入小鼠腹腔，轻轻震动小鼠腹壁，吸回营养液并加入无菌离心管内， 1000转离心10min。

沉淀用含1％HAT的营养液悬浮，混匀后加入两块96孔细胞培养板，100μL/ 孔，置于CO₂培养箱内培养备用。

(2)SP2/0细胞的准备

融合前24～48小时将SP2/0细胞分瓶扩大培养。融合当天，选择形态良好、呈对数生长的SP2/0细胞，将其从瓶壁上轻轻吹下，收集于50mL离心管内，1000 rpm离心10min，然后用DMEM培养基重新悬浮后计数备用。

(3)免疫脾细胞的制备

在强化免疫后第三天取免疫小鼠，眼球采血处死，分离血清作为阳性对照， -20℃保存备用。处死的小鼠置75％酒精中浸泡5min，转入超净台。无菌取出小鼠脾脏，放入盛有5～10mL DMEM培养基的平皿中，轻轻漂洗。将脾脏移入另一盛有约20mL DMEM培养基的平皿中，用灭菌注射器吸取营养液插入脾脏的一端，推注DMEM液，反复冲洗脾脏数次，直至脾脏颜色变白为止。将洗下的脾细胞移入50mL离心管内，1000r离心10min，弃上清，沉淀重悬浮计数备用。

(4)融合

分别吸取10⁸个脾细胞和2×10⁷个骨髓瘤细胞的悬液量，加入到一只50mL 离心管内，轻轻混匀。1000rpm离心8min，将上清尽量弃去。用手指轻轻弹击管底，使沉淀细胞松散混匀成糊状。吸取1mL DMEM液加入1g事先水浴融化的灭菌PEG2000中，并用7.5％NaHCO₃调pH值至7.5，混匀。一手均匀转动离心管，另一只手吸取1mL上述调好的PEG2000液，沿转动的离心管壁缓缓加入，控制在60s加完，静置60s。

加入25mL DMEM液终止PEG2000的作用，方法如下：第1min加入1mL DMEM液，第2min缓缓加入4mL DMEM液，然后在3min内缓慢加入剩余DMEM液。

将融合细胞800rpm离心5min，弃上清，加入40mL 1％HAT培养液轻轻吹吸，使沉淀细胞混合均匀。

将悬浮细胞液加入有饲养细胞的96孔板中，每孔100μL，置CO₂培养箱中培养。

每天记录细胞生长情况，融合后第四天用1％HAT选择培养液半量换液，第八天改用1％HT选择培养液全量换液。

(5)阳性杂交瘤细胞的筛选

待融合后的细胞生长到覆盖细胞孔底部1/4～1/3时，用禽流感病毒H5亚型抗体检测试剂盒对所有细胞生长的培养上清进行筛选。同时购置H5N2、H5N8、 H5N3重组HA蛋白，包被ELISA板再次进行阳性克隆的再筛选，选择针对各种H5亚型病毒抗体检测均为阳性的细胞H5HA9号、H5HA18号、H5HA21号和H5HA25号进行扩大培养，并进行细胞克隆。

(6)阳性杂交瘤细胞的克隆

采用有限稀释法。第一次有限稀释的前一天制备饲养细胞。将待克隆孔细胞用吸管轻轻吹吸使细胞悬浮并分散均匀，吸至1mL含20％胎牛血清的DMEM 液中，取少量悬液进行细胞计数。用1％HT选择培养液稀释阳性杂交瘤至20个 /mL、10个/mL、5个/mL，并分别加到有饲养细胞的96孔培养板中，100μL/孔，每一稀释度加32个孔。

每天观察并记录细胞生长情况。第四天，1％HT选择培养液半量换液，第八天，1％HT选择培养液全量换液，检测上清。选择仅有一个克隆生长的阳性孔进行第二次有限稀释、第三次有限稀释。第三次有限稀释的方法略作改变。将待克隆孔细胞用吸管轻轻吹吸使细胞悬浮并分散均匀，估计细胞数量后，大致稀释成每孔20个细胞左右，铺于一列8孔细胞孔中，显微镜下计数后得到每孔含有的平均细胞数，再根据该数将细胞悬液稀释成1个/孔，平均铺于未加饲养细胞的细胞板上。依次再进行第四次有限稀释、第五次有限稀释，确保此时所有长细胞的孔ELISA结果100％全部为阳性，才说明找到了纯化的杂交瘤细胞株。

将获得稳定分泌抗体的单克隆细胞株进一步亚克隆，并送往中国典型培养物保藏中心进行保藏。具体如下：

所需材料包括：96孔细胞培养板、HT培养基、活力强的杂交瘤细胞和小鼠腹腔细胞。

具体方法包括：

a、制备小鼠腹腔巨噬细胞，即饲养层细胞；

b、制备待克隆的杂交瘤细胞悬液，用含20％血清的HT培养基稀释至每毫升含2.5、15和50个细胞3种不同的稀释度；

c、按每毫升加入5×10⁴～1×10⁵细胞的比例，在上述杂交瘤细胞悬液中分别加入腹腔巨噬细胞；

d、每种杂交瘤细胞分装96孔板一块，每个稀释度32孔，每孔量为0.2mL，每孔的杂交瘤细胞数分别为0.5、3和10；

e、37℃、7.5％CO₂湿润培养7-10天，出现肉眼可见的克隆即可检测抗体；在倒置显微镜下观察，标出只有单个克隆生长的孔，取上清作抗体检测；

f、取抗体检测阳性的最大稀释倍数的阳性孔的细胞扩大培养，并冻存。

以上方法中b、c、d步骤也可简化为将计数后的杂交瘤细胞准确地进行系列稀释，直至每毫升含10个细胞，按每孔接种0.1mL细胞悬液，即每孔含1个细胞。然后及时扩大培养并冻存，即将获得杂交瘤细胞株在37℃、7.5％CO₂湿润培养的条件下，从96孔板中转移至24孔板，待长满后，再依次转移至12孔板、6孔板、细胞培养瓶。将处于对数生长期且处于良好状态下的杂交瘤细胞吹下，800rpm离心5min，弃上清并收集细胞沉淀，用含10％DMSO和90％FBS 的冻存液混匀，装入1.8mL细胞冻存液中，加盖密封，注明细胞代码、冻存代次和冻存日期。将冻存管放于-80℃的程序降温盒中，次日移入液氮罐中，然后送往中国典型培养物保藏中心进行保藏。

(7)单克隆抗体的大量制备

将已建立的杂交瘤细胞株刚开始加入胎牛血清扩大培养，待长满80％后更换不加血清的维护液，并持续培养直至细胞全部死亡。收集细胞培养上清，1000 rpm离心10min，收集上清液-20℃保存备用。

4.单克隆抗体的应用

(1)H5亚型禽流感病毒荧光微球检测试纸条制备

将上述方法获得的H5亚型禽流感单克隆抗体标记荧光微球后，渗入试纸条的样品垫中，同时将制备的A型流感通用单克隆抗体固定于硝酸纤维素膜的测试区带(即T线)，将抗鼠IgG抗体固定于硝酸纤维素膜的质控区带(即C线)。加入待测样品后，基于侧流免疫层析原理，样品中的H5亚型禽流感病毒，先与样品垫中已标记了H5亚型特异性单抗的荧光微球或胶体金结合，流向测试区，再与A型流感通用单抗结合，形成抗体-抗原-荧光微球或胶体金标记抗体免疫复合物；同时，过剩的标记了单抗的荧光微球或胶体金流一直往前侧流至质控区，与抗鼠IgG抗体结合，形成抗体-荧光微球或胶体金标记抗体复合物。荧光微球免疫层析检测试纸在紫外光激发下读取结果，在质控区出现荧光条带前提下，测试区出现荧光条带为阳性结果，未出现荧光条带为阴性结果。

本例具体的，单克隆抗体的应用是采用荧光微球作为标记材料，采用H5亚型禽流感特异性单克隆抗体作为检测试纸条识别检测目标的特异性包被物质，基于侧向流免疫层析原理，检测组织、拭子、粪便等样品中的禽流感病毒，并采用其他近似病毒或其他禽流感病毒作为阴性样品检测。待检样品不需要进行病毒富集操作，只需经简单处理后直接采用试纸条进行检测，检测时间只需15 分钟。荧光微球检测试纸可通过365nm紫外光源激发检测，也可被一种制造成本低、操作简便的荧光检测仪器检测。

(2)H5亚型禽流感病毒荧光微球检测试纸条灵敏性

以已测定EID₅₀的H5N1标准毒株为检测对象，将标准毒株按10倍梯度稀释，获得EID₅₀分别为10/0.1mL、10²/0.1mL、10³/0.1mL、10⁴/0.1mL、10⁵/0.1mL、 10⁶/0.1mL、10⁷/0.1mL、10⁸/0.1mL、10⁹/0.1mL的标准品进行灵敏度试验。

本例分别测试了两种方法的灵敏度，即基于本例的单克隆抗体的H5亚型禽流感病毒荧光微球检测试纸条和《H5亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》 (GB/T 19438.2-2004)国标方法。与此同时，采用鸡胚接种对梯度稀释样品进行验证。

(3)H5亚型禽流感病毒荧光微球检测试纸条特异性

采用所建立的H5亚型禽流感病毒荧光微球检测试纸条，对流感病毒标准抗原、传染性喉气管炎病毒、新城疫HI抗原和传染性法氏囊病病毒共计92个毒株，以及SPF尿囊液、细胞培养液、唾液和阴性鸡血清等阴性对照，和空白对照样品，以上毒株加阴性对照和空白对照总计122份样品进行检测；同时，对深圳检疫局近3年口岸送检的禽流感拭子、血清样品共6043份样品进行检测。同时，采用《H5亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》(GB/T19438.2-2004) 国标方法，对相同的样品进行检测，以验证本例的试纸条。

(4)H5亚型禽流感病毒荧光微球检测试纸条小规模田间试验

对采集田间试验样品531份，包括家禽棉拭子样品510份，全部同时进行 H5亚型禽流感病毒荧光微球检测试纸条的检测和《H5亚型禽流感病毒荧光 RT-PCR检测方法》(GB/T19438.2-2004)国标方法的荧光RT-PCR检测。同时，采用《H5亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》(GB/T 19438.2-2004)国标方法，对相同的样品进行检测，以验证本例的试纸条。

三、结果

1.H5亚型禽流感病毒单克隆抗体的制备

阳性杂交瘤细胞经过5次克隆纯化及ELISA筛选得到4株特异性强的杂交瘤细胞，分别为H5HA9、H5HA 18、H5HA21和H5HA25。采用ELISA方法测定培养上清液和腹水的H5单克隆抗体效价，结果如表1所示。表1的结果显示 H5HA25效价最高。

因此，选择H5HA25号细胞株进行分泌能力测定，即在液氮中冷冻保存后第3个月和第6个月分别复苏杂交瘤细胞H5HA 25，收集上清液，用ELISA方法检测上清液中的H5单克隆抗体效价，测定H5单抗杂交瘤细胞的抗体分泌能力。结果显示，冻存6个月后H5HA25号细胞株分泌的抗体ELISA效价由1.197 下降至1.187，说明这株H5单抗隆抗体细胞株分泌能力稳定性良好。将抗H5 亚型禽流感病毒特异性单克隆抗体的H5HA25杂交瘤细胞株，送细胞保藏于中国典型培养物中心，编号CCTCC NO.C2017262。

表1杂交瘤细胞株培养上清ELISA检测结果

检测样品	A值	结果判定
			H5HA9	1.087	+
H5HA18	1.165	+
			H5HA21	1.176	+
H5HA25	1.197	+
			SP2/O细胞	0.078	-
免疫小鼠血清	1.072	+

2.H5亚型禽流感病毒荧光微球检测试纸条制备结果

所有H5亚型禽流感病毒样品在检测卡中出现阳性显色条带，而其他亚型流感病毒样品、其他禽呼吸道疾病病毒样品、阴性对照和蒸馏水空白对照均没有出现显色条带，结果如图1所示。图1中，1为H5N1、2为H5N2、3为H5N6、 4为H5N3、5为H5N8、6为H5N9、7为NDV(即新城疫病毒)、8为H6N1、 9为H7N9、10为IBV(即传染性支气管炎病毒)、11为ILTV(即传染性喉气管炎病毒)、12为蒸馏水空白对照。

图1的结果显示，本例的检测试纸条对六个H5亚型都能够检出阳性显色条带，而对其他样品均没有；表明所建立的H5亚型禽流感病毒荧光微球检测试纸条能够在现场对H5亚型禽流感病毒进行现场检测。

3.H5亚型禽流感病毒荧光微球检测试纸条灵敏性结果

灵敏度检测结果如表2所示。

表2灵敏度检测结果

病毒含量(EID<sub>50</sub>/0.1mL)	本例试纸条	国标荧光RT-PCR	鸡胚接种
				10<sup>9</sup>	+	+	+
10<sup>8</sup>	+	+	+
				10<sup>7</sup>	±	+	+
10<sup>6</sup>	-	+	+
				10<sup>5</sup>	-	±	+
10<sup>4</sup>	-	-	+
				10<sup>3</sup>	-	-	+
10<sup>2</sup>	-	-	+
				10	-	-	+

表2中，“+”表示阳性，“-”表示阴性，“±”表示弱阳性。表2的结果显示，本例的试纸条检测下限是10⁷EID₅₀/0.1mL，国标荧光RT-PCR方法检测下限可达10⁵EID₅₀/0.1mL。

4.H5亚型禽流感病毒荧光微球检测试纸条特异性结果

特异性检测结果显示，所有H5亚型禽流感病毒标准抗原样品在检测卡中出现阳性显色条带，而其他亚型流感病毒样品、其他禽呼吸道疾病病毒样品、口岸送检样品、阴性对照和蒸馏水空白对照均没有出现显色条带，部分结果如图2 所示。图2中，1为H5N1、2为H5N2、3为H5N3、4为H5N6、5为H5N8、6 为H5N9、7为H1N1、8为H2N2、9为H1N1、10为H3N2、11为H4N6、12 为H1N1、13为H6N1、14为H7N9、15为H9N2。

本例的试纸条特异性检测结果与采用《H5亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》(GB/T 19438.2-2004)国标方法检测的结果一致。表明本例建立的H5 亚型禽流感荧光微球免疫层析快速检测试纸卡方法不受基质的影响，且检测特异性强。

5.H5亚型禽流感病毒荧光微球检测试纸条小规模田间试验结果

本例的试纸条对531份田间试验样品的检测结果与采用《H5亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》(GB/T 19438.2-2004)国标方法检测的结果完全一致。说明本例的试纸条能够替代国标方法，并且，本例的试纸条使用简单方便，能够满足现场检测使用需求，实用性强。

综上所述，本例成功研制了AIV H5亚型单克隆抗体，所制备的单克隆抗体具有良好的效价和特异性，能够用于AIV H5亚型检测。并且，本例基于该单克隆抗体成功研制了检测试纸条。虽然本例的试纸条灵敏度较国标荧光RT-PCR检测方法弱，但是，其特异性强，使用简单方便，能够满足AIV H5亚型的现场快速检测。本例的AIV H5亚型单克隆抗体或试纸条，尤其是试纸条，可以单独包装制成AIV H5亚型检测的试剂盒，用于检验检疫实践，其检测结果与国标荧光 RT-PCR检测方法一致，能够有效的对AIV H5亚型进行检测。

以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。

Claims

1.一种AIV H5亚型单克隆抗体，其特征在于：所述单克隆抗体由保藏号CCTCCNO.C2017262的杂交瘤细胞H5HA25分泌产生。

2.一种分泌AIV H5亚型单克隆抗体的杂交瘤细胞，其保藏号为CCTCC NO.C2017262。

3.根据权利要求1所述的AIV H5亚型单克隆抗体或权利要求2所述的杂交瘤细胞在制备AIV H5亚型检测试剂盒或装置中的应用。

4.一种AIV H5亚型免疫检测层析试纸条，其特征在于：包括搭接在支撑材料上的样品垫和层析条；

所述层析条上设置有检测线和质控线，所述检测线上固定有A型禽流感病毒通用单克隆抗体，所述质控线上固定有抗鼠IgG抗体；

所述样品垫上喷涂有权利要求1所述的AIV H5亚型单克隆抗体，并且，所述AIV H5亚型单克隆抗体具有荧光微球标记、胶体金标记或量子点标记。

5.根据权利要求4所述的AIV H5亚型免疫检测层析试纸条，其特征在于：所述层析条为硝酸纤维素膜。

6.根据权利要求4或5所述的AIV H5亚型免疫检测层析试纸条，其特征在于：所述样品垫为玻璃纤维垫。

7.根据权利要求4-6任一项所述的AIV H5亚型免疫检测层析试纸条在制备AIV H5亚型检测试剂盒或装置中的应用。