KR20070072945A - 신속 면역크로마토그라피법에 의한 ｈ5형 고병원성 및 일반조류인플루엔자 바이러스 항원 진단 스트립 및 그 제조방법 - Google Patents

신속 면역크로마토그라피법에 의한 ｈ5형 고병원성 및 일반조류인플루엔자 바이러스 항원 진단 스트립 및 그 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신속 면역크로마토그라피법 (rapid immunochromatography)에 의한 일반 조류인플루엔자 및 H5형 고병원성 조류인플루엔자 진단 스트립 및 그 제조 방법에 관한 발명으로 상세하게는 헤마글루티닌 항원이 H1형부터 H15형인 모든 조류 인플루엔자 바이러스에 공통적인 항체 및 헤마글루티닌 항원이 H5인 고병원성 조류인플루엔자에 특이적인 항체를 사용하여 신속 면역크로마토그라피법에 의해 조류 분변 또는 조직에서 일반 조류인플루엔자 바이러스 및 H5인 고병원성 조류인플루엔자 감염여부를 신속하고 감별적으로 검사할 수 있는 진단 스트립 및 그 제조 방법에 관한 것이다.
고병원성 조류 인플루엔자, 신속 면역크로마토그라피법, 헤마글루티닌, 뉴클레오프로테인

Description

신속 면역크로마토그라피법에 의한 Ｈ5형 고병원성 및 일반 조류인플루엔자 바이러스 항원 진단 스트립 및 그 제조 방법 {Diagnostic Strip for H5 Type Highly Pathogenic Avial Influenza Virus Antigen and General Avial Influenza Virus Antigen Using Rapid Immunochromatography and Method for Making thereof}
도 1은 본 발명에 따르는 돗트 면역검정법 (Dot Immunoassay)를 이용한 조류인플루엔자 항원 진단용 단일클론 항체의 특이성 검사.
도 2는 본 발명에 따르는 진단 스트립의 촬영한 사진.
도 3은 본 발명에 따르는 진단 스트립의 검체 적용후의 반응 결과 예를 촬영한 사진.
조류인플루엔자 (Pathogenic Avian Influenza)는 닭, 칠면조, 야생 조류 등 여러 종류의 조류에 감염되며, 주로 닭과 칠면조와 같은 가금류에 피해를 주는 급성 바이러스성 전염병으로서 전파가 빠르고 병원성이 다양한 질병이다. 한편, 같은 가금류 중에서도 오리는 감염되더라도 임상증상이 잘 나타나지 않는 것으로 알려져 있다. 조류인플루엔자는 병원성에 따라 고병원성, 약병원성 및 비병원성의 3종류로 구분되며, 그중 고병원성 조류인플루엔자 (HPAI; Highly Pathogenic Avian Influenza)는 국제수역사무국(OIE)에서 리스트 A질병으로, 국내에서는 제1종 가축 전염병으로 분류하고 있다.
국내에서는 고병원성 조류인플루엔자(H5N1)가 최근에 발생한 바 있으며(2003년 12월~2004년 3월), 저병원성 조류 인플루엔자(H9N2)는 1996년에 처음 발생하였다.
조류 인플루엔자의 원인체는 오소믹소바이러스과 (Orthomyxoviridae)의 A형 인플루엔자 바이러스 (Infuenza virus type A)로서, A형 인플루엔자의 혈청형은 두 가지 단백질인 헤마글루티닌(Hemagglutinin)과 뉴라미니다제(Neuraminidase)의 종류에 따라 구분되는 H 혈청형과 N 혈청형이 있다. 조류인플루엔자 바이러스의 혈청형은 각각의 H 혈청형과 N 혈청형으로 표시(예: H9N2) 하며, H혈청형이 15가지, N혈청형이 9가지 종류가 있으므로, 산술적으로 존재 가능한 인플루엔자 바이러스의 혈청형은 135가지이다. 예를 들어 조류인플루엔자 바이러스의 혈청형은 H9N2 등으로 나타내고 이러한 혈청형은 바이러스의 병원성과 중요한 연관성이 있다. 그리고 현재까지 발생한 고병원성 조류인플루엔자는 모두 H5 및 H7혈청형에 속하는 것으로 알려져 있다.
조류인플루엔자 바이러스는 비말, 물 등에 의하여 전파될 수 있으며(잠복기 3-14일) 가장 중요한 전파방법은 분변의 직접적 접촉이다. 분변속에 있는 바이러스 는 최소한 4℃에서 35일 이상 생존이 가능하며, 바이러스에 오염된 분변 1그램은 약 100만수의 닭을 감염시킬 수 있다.
조류인플루엔자 바이러스는 또한 사람의 발, 사료차, 기구, 장비, 계란표면에 분변이 묻어 다른 닭에게 직접적으로 전파가 된다. 오리(집오리, 철새), 거위, 메추리 등은 조류인플루엔자 바이러스에 감염되지만 임상증상은 잘 나타나지 않으면서 바이러스를 분변으로 배출한다. 계란을 통한 난계대 전염은 일어나지 않으나 난각에 오염된 분변을 통하여 전파될 수 있으므로 질병발생 종계에서 생산된 종란과 병아리의 이동은 질병을 전파시킬 수 있다. 임상증상은 바이러스의 병원성에 따라 다양하며 호흡기증상, 설사, 산란율의 급격한 감소, 벼슬 등 머리부위에 청색증을 보이며, 바이러스의 병원성에 따라 폐사율은 0~100%로 다양하며 산란율도 40%~50% 저하 또는 산란중지로 다양하다.
조류 인플루엔자의 예방대책으로서 현재 조류 인플루엔자 바이러스에 대한 생독, 사독백신을 개발할 수는 있지만 혈청형이 다양하고 서로 방어가 되지 않는 다는 점에서 생독백신은 효용성이 떨어지고 여러 혈청형을 혼합하여 만든 사독백신은 임상증상을 어느 정도 막을 수는 있지만 분변으로의 바이러스배출을 막을 수 없기 때문에 방역정책상 적극적인 사용이 되지 않고 있다. 따라서, 가장 중요한 것은 차단방역과 발생초기에 적극적인 살처분이다. 차단 방역을 위해서는 다른 질병과 마찬가지로 외부인, 외부차량의 출입을 통제하고 양계장에 비치된 장비, 기구 특히 난좌 등을 항상 깨끗이 세척을 하고 소독을 하여야 한다. 특히, 여러 농장을 방문하여야 하는 수의사는 자신의 차량이나 신발 등 직접적인 전파수단이 되는 요인에 대하여 항상 염두에 두어야 한다. 조류 인플루엔자 바이러스는 소독에 약하기 때문에 일반적인 소독약제로도 충분한 효과를 볼 수가 있다. 그러나, 고병원성 조류 인플루엔자가 발생되면 피해전파가 급속히 확산되므로 농장 출입차단 등 차단방역이 가장 중요하고, 발생시에는 사육하는 닭 전두수를 살처분 소각 매몰하여야 하며, 사육농장 내외를 계속적으로 소독 처리해야 한다.
현재 병원성이 약한 인플루엔자가 최근에도 각 지역에서 발생되어 양계농가의 피해가 많으므로 외부에서 병아리나 중병아리를 입식할 경우에는 사육지역에서의 피해여부를 확인한 후에 입수해야 한다. 농장소독 관리와 야생조류의 접촉이 없도록 해야 한다.
현재 조류인플루엔자 바이러스 감염의 진단은 바이러스의 분리 및 혈청학적 검사가 있다.
바이러스 분리는 감염된 닭의 분변, 기관, 맹장 편도와 기타 실질장기의 시료를 SPF (Specific Pathogen Free) 종란에 접종하여 혈구응집능 바이러스를 확인함으로서 바이러스를 분리하는 것이며, 분리된 바이러스를 감수성 닭에 접종하거나 유전자검사 (H항원 cleavage site의 아미노산 분석)를 통하여 병원성을 알 수 있다. 그리고 분리된 바이러스의 혈청형을 HI반응으로 동정할 수 있다.
혈청학적 검사로는 혈액을 이용한 혈구응집억제반응(HI) 및 한천내침강반응 (AGID)으로 계군의 감염여부를 판단할 수 있으며 대량검사가 가능하여 모니터링 검사방법으로 사용하고 있다.
최근에는 면역크로마토그라피법 (Immunochromatography)을 이용한 사람 인플 루엔자 바이러스 항원 래피드 검사 키트가 개발되어 주로 국내외 병원에서 사람 인플루엔자 바이러스 감염을 진단하는데 널리 이용되고 있으며 이러한 검사 키트는 모두 수입에 의존하고 있는 실정이다. 그러나, 현재까지 동물용 특히 조류 인플루엔자 바이러스에 대한 신속 면역크로마토그라피법 검사 키트는 전세계적으로 개발된 바가 없다.
본 발명의 목적은 헤마글루티닌 항원이 H1형부터 H15형인 모든 조류 인플루엔자 바이러스에 공통적인 항체 및 헤마글루티닌 항원이 H5인 고병원성 조류인플루엔자에 특이적인 항체를 사용한 신속 면역크로마토그라피법에 의해 조류 분변 또는 조직에서 일반 조류인플루엔자 바이러스 및 H5인 고병원성 조류인플루엔자 감염여부를 신속하고 감별적으로 검사할 수 있는 진단 스트립을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 조류인플루엔자를 특별한 검사 장비 없이도 현장에서 짧은 시간안에 손쉽게 조류인플루엔자 감염여부를 진단할 수 있는 진단 스트립 및 그 제조방법을 제공하는 것이다.
상기한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 헤마글루티닌 항원이 H1형부터 H15형까지의 모든 조류인플루엔자 바이러스에 공통적인 항체 및 헤마글루티닌 항원을 H5로하는 고병원성 조류인플루엔자 바이러스에 특이적인 항체를 사용하여 신속 면역크로마토그라피법에 의해 분변 또는 조직에서 일반 조류인플루엔자 바이러스 및 고병원성 조류인플루엔자 바이러스를 감별적으로 검출할 수 있는 진단 스트립을 제공한다.
그 구체적인 방법은 먼저 일반 조류인플루엔자 바이러스에 공통적인 반응하는 마우스 단일클론 항체 제조하고, 혈청형이 H5인 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스에 특이적인 대한 마우스 단일클론 항체를 각각 제조하였다.
면역크로마토그라피법으로 헤마글루티닌 항원이 H5인 고병원성 및 모든 조류인플루엔자 바이러스를 진단하기 위해서는 나이트로셀룰로우즈 멤브레인에 일반 조류인플루엔자 바이러스를 검출할 수 있는 항체 및 H5 조류인플루엔자 바이러스를 검출할 수 있는 특이적인 항체를 정해진 위치에 흡착시키고 금입자에 각각에 대한 항체를 접합시켜 패드에 건조시키다. 건조된 금접합체패드와 검체를 적용하는 패드를 중첩하여 나이트로셀룰로우즈 멤브레인 위에 덮고 반대편 위치에 흡습용 패드를 부착시켜 진단 스트립을 제조하였다.
도 2는 본 발명에 따르는 진단 스트립을 검체 적용홀과 결과 표시창이 표시된 플라스틱 디바이스에 넣어 제조한 것이다. 검체 적용홀에 조류 분변으로부터 얻어진 검액을 약 100㎕ (3 drops) 넣으면 검체 중에 존재하는 조류인플루엔자 바이러스가 금입자에 부착된 각각의 항체와 반응을 하면서 나이트로셀룰로우즈 멤브레인 위를 모세관 현상에 의해서 전개된다.
본 발명에 따르는 진단 스트립의 제조에 사용할 수 있는 멤브레인은 통상의 진단 스트립의 재료로 사용되는 것들을 이용할 수 있으며, 예를 들어 나이트로 셀 룰로우즈, 셀룰로우즈, 셀룰로우즈 아세테이트, 폴리에틸렌 등의 각종 합성 중합체를 사용할 수 있다.
멤브레인에는 일반 조류인플루엔자 바이러스를 검출할 수 있는 항체 및 헤마글루티닌 항원을 H5로 하는 고병원성 조류인플루엔자에 특이적인 항체를 일정한 위치에 흡착시켜 놓아 해당 바이러스 항원이 검체 중에 존재하는 경우에는 골드입자에 접합된 항체에 반응한 각각의 바이러스 항원이 멤브레인에 흡착된 항체와 다시 반응하여 해당 위치에 골드입자 색에 의한 보라색 밴드를 형성한다. 대조선 위치에는 항-마우스 IgG를 흡착시켜 마우스 IgG가 흡착된 골드입자가 검체중의 바이러스 항원의 존재여부에 관계없이 항상 반응하여 보라색 밴드를 나타내게 하였다. 반응하지 않은 내용물은 흡습패드에 스며들어 검사창의 멤브레인은 깨끗한 흰색으로 나타나 형성된 밴드를 쉽게 판독할 수 있다. 즉. 검체 중에 헤마글루티닌 항원을 H5로하는 고병원성 조류인플루엔자 바이러스가 일정량 이상 존재하면 일반 조류인플루엔자 바이러스 공통항원에 대한 단일클론 항체가 흡착된 위치와 고병원성 바이러스 항원에 특이적인 단일클론 항체가 흡착된 위치 및 대조선 위치에 보라색 밴드를 나타내고, H5형 고병원성 이외의 일반 조류인플루엔자 바이러스가 일정량 이상 존재하면 조류인플루엔자 바이러스 공통항원에 대한 단일클론 항체가 흡착된 위치와 대조선 부위에 보라색 밴드가 동시에 형성된다. 또한 검체 중에 조류 인플루엔자 바이러스가 존재하지 않으면 대조선 부위에만 보라색 밴드가 형성된다. 이하 실시예를 통해 본 발명에 따르는 진단 스트립 및 그 제조방법에 대하여 보다 상세하게 설명한다.
(실시예 1)조류인플루엔자 진단용 단일클론 항체 제조
1) 조류인플루엔자 항원 정제
조류인플루엔자 항원은 국내에서 발생한 고병원성 조류인플루엔자(A/CK/Korea/ES/03 (H5N1))로부터 준비하였다. 즉 37.6℃에서 2일간 9일령 SPF종란에서 2~3일간 배양한 조류인플루엔자 바이러스를 최종농도 0.2% 포르말린으로 불활화 시킨 후 농축 및 정제를 실시하였다. 불활화된 조류인플루엔자 바이러스를 1차로 4,000xg에서 30분간 원심분리한 후 상층액을 2차로 70,000xg에서 3시간 초원심분리(L8-70M, Beckman, USA) 하였다. 원심분리된 펠릿을 다시 재부유(sucrose양의 1/25배)하여 sucrose density gradient ultracentrifugation (100,000 xg, 90분) 하고 조류인플루엔자 바이러스 분획(fraction)을 분리하여 조류인플루엔자 단일클론 항체 생산용 항원으로 사용하였다.
상기의 방법으로 정제된 항원을 면역원으로 사용하여 Balb/c 마우스에 면역시켰다. 이후 비장 세포를 분리하여 골수종(myeloma)와 접합시켜 조류인플루엔자 바이러스 항원에 대한 단일클론 항체를 분비하는 잡종 세포주를 ELISA 방법으로 선별하고 한계희석 방법으로 여러 단세포군을 확립하였다. 이들 세포주를 대량 배양하여 Balb/c 마우스에 복강에 접종하여 항체가 다량 함유된 복수를 얻고 protein A/G gel을 이용하여 IgG 항체를 정제하였다.
정제된 항체를 이용하여 일반 조류인플루엔자 바이러스에 특이적으로 반응하는 항체와 H5형 조류인플루엔자 바이러스에 특이적으로 반응하는 항체를 도트 면역검정법(Dot Immunoassay)으로 재선별하고 진단용 항체로 사용하였다 (도 1A 내지 도 1D)
도트 면역검정법은 다음과 같은 과정에 따라 이루어졌다(참고문헌 : Song 등, Avian Diseases, 1998, 42:92-100) 즉, 각 혈청형(H1-H15형)의 조류인플루엔자 바이러스를 0.45um 나이트로셀룰로우즈 멤브레인에 96공 도트 매니폴드(96-well hybrid-dot manifold, GibcoBRL, Gaitherburg, MO)를 이용하여 흡착시켰다. 그후 3% 소태아 혈청 알부민 (BSA, bovine serum albumin)을 37℃에서 2시간 이상 반응시켜 비특이 반응을 억제시켰다. 정제된 각 항체(마우스 유래의 단크론성 항체)를 반응시킨 후 세척하고, 바이오틴이 라벨된 마우스 항체에 대한 2차 항체를 넣고 다시 37℃에서 30분 반응시킨 후 세척과정을 거쳤다. 마지막으로 바이오틴과 아비딘 복합체가 라벨된 페록시다아제(peroxidase)를 반응시키고, 발색제인 DAB (diaminobenzidine, Pierce, Rockford, IL)를 넣고 색깔반응이 나타나면 물로 씻어 반응을 정지시켰다. 결과적으로 모든 조류인플루엔자에 반응하는 정제된 항체는 H1-H15형의 조류인플루엔자가 흡착된 구멍에서 모두 양성으로 발색반응이 나타나고, H5형 조류인플루엔자에 특이적으로 반응하는 항체는 H5형 조류인플루엔자 바이러스가 흡착된 구멍에서만 발색반응을 나타내어, 이와같은 반응성을 나타내는 항체를 선별하여 진단킷트 제작에 사용하였다. 즉, 일반 조류인플루엔자 바이러스를 진단할 목적으로는 골드 결합용 항체는 #5 항체를(도 1A), 멤브레인 흡착용 항체는 #16항체를 이용하였으며(도 1B), H5 조류인플루엔자 바이러스를 진단할 목적으로는 골드 결합용 항체는 #20 항체를(도 1C), 멤브레인 흡착용 항체는 #51항체를 이용하였다 (도 1D).
도 1에서 각 멤브레인의 위쪽 왼쪽부터 항원의 순서는 H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8 및 아래쪽 왼편부터, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 및 H5 혈청형을 가진 조류인플루엔자 바이러스가 흡착되어있다.
(실시예 2)진단 스트립 및 진단 키트의 제조
1) 멤브레인 코팅공정
정제된 조류인플루엔자 바이러스 항원에 대한 항체 중 #16과 #51 항체를 0.75㎍/strip 농도로 PBS로 희석하여 나이트로셀룰로오스 멤브레인 검사선 위치에 코팅 용액으로 사용하였다. 즉, #16항체는 2번 검사선 위치(T2, 일반 조류인플루엔자 바이러스를 검출하는 선)에, #51항체는 1번 검사선 위치에 흡착하였다(T1, H5 조류인플루엔자 바이러스를 검출하는 선). 그리고 대조선(C) 위치에는 산양 항 마우스 항체 (0.75㎍/strip)를 각각 코팅하였다.
2) 금 접합체 제조 공정
정제된 조류인플루엔자 바이러스 항원에 대한 항체 중 #5(일반 조류인플루엔자 바이러스 검출용)와 #20 항체(H5 조류인플루엔자 바이러스 검출용)를 각각 금 콜로이드(gold colloid)와 결합시켰다. 즉 염화금을 시트로산 나트륨 용액으로 환원시켜 plain gold를 제조한 후 각각의 항체를 첨가하면서 40nm 크기의 항체가 결합된 골드입자를 532nm에서 흡광도가 10+/-1이 되게 제조하였다. 여기에 결합된 항체를 안정화시키기 위하여 PEG 용액으로 처리하였다. 상기의 금입자와 항체가 결합 된 각각의 금접합체를 각각 8.3㎕/strip씩 혼합하고, 폴리에스테르 또는 유리 섬유에 적셔 건조시켜 골드 패드를 제조하였다.
3) 흡습 패드 및 검체패드 제조
흡습패드 및 검체패드는 반응용액이 잘 흡수될 수 있도록 건조하여 제조하였다.
4) 디바이스 조립
상기에서 제조된 각각의 멤브레인, 패드들을, 오른쪽부터 검체패드, 골드패드, 나이트로셀룰로오스 멤브레인, 마지막으로 흡습패드를 각각 중첩되게 결합하고 4.45mm/스트립 크기로 절단하였다. 이렇게 절단된 스트립을 최종 디바이스의 하판에 넣고 상판을 덮어 진단용 키트를 제조하였다.
5) 제품 구성
상기에서 설명된 디바이스와 검체 채취용 면봉, 희석액 (50mM Tris, 0.01% Sodium azide, 0.1%triton X-100, pH8.0, 1회 시험시 1㎖사용)을 최종 제품으로 구성되도록 하였다(도 2).
(실시예 3)신속 면역크로마토그라피법에 의한 헤마글루티닌 항원을 H5로하는 고병원성 조류인플루엔자 및 일반 조류인플루엔자 진단시약의 검사원리
조류의 분변을 검체 희석액으로 희석하여 검체 적용홀에 적용한다.
이때 검체 중에 H5 조류인플루엔자 바이러스가 일정량 이상 존재하면 금접합체 패드의 금 입자에 접합되어 있는 H5 검출용 항체 및 일반 조류인플루엔자 바이러스를 검출할 수 있는 항체와 1차적으로 결합하게 되며, 이후 이 결합체는 면역크로마토그라피법 원리에 의해 멤브레인을 따라 이동하게 되면서 멤브레인의 특정위치에 있는 H5 조류인플루엔자를 검출할 수 있는 항체 및 일반 조류인플루엔자 바이러스를 검출할 수 있는 항체와 2차적으로 결합하면서 항체-항원-항체 복합체를 형성하면서 대조선 밴드와 함께 3개 보라색 밴드를 나타낸다. (도 3의 (A))
또한 검체 중에 일반 조류인플루엔자 바이러스가 일정량 이상 존재하면 금 접합체 패드의 금 입자에 접합되어 있는 일반 조류인플루엔자 바이러스에 공통적인 항체와 1차적으로 반응하게 되며 이후 멤브레인상의 일반 조류인플루엔자 바이러스에 공통적인 항체와 2차적으로 반응하게 되어 항체-항원-항체 복합체를 형성하면서 대조선 밴드와 함께 2개의 보라색 밴드를 나타낸다. (도 3의 (B))
그리고, 검체 중에 조류인플루엔자 바이러스가 없으면, 금 접합체 패드와 결합되는 바이러스가 없으며, 금 접합체만 멤브레인을 따라 이동하면서 대조선에 있는 항 마우스 항체와 결합하게 되어 대조선에서만 보라색 밴드를 나타낸다(금 접합체는 마우스 유래 단일클론 항체와 결합되어 있으므로, 대조선의 항 마우스 항체와 직접 결합하게 된다.(도 3의 (C))
(실시예 4)본 발명에 따르는 진단 스트립의 진단 효능 시험
1) 검출 한계 시험
본 발명에 따르는 진단 스트립의 측정 범위 및 검출한계를 시험하기 위해 혈구응집반응 역가 측정은 15개의 서브타입 별로 실시하였으며, EID 역가는 H5 서브타입과 H9 서브타입에 대하여 실시하였다.
혈구응집반응 역가 (Hemagglutination Titer)는 U buttom 96 well plate의 전 well에 PBS (pH7.2)를 50ul씩 첨가하고 각 1번 well에 서브타입별 조류 인플루엔자 바이러스를 50ul씩 첨가한 후 2진 희석하였다. 그 후 1% 닭 적혈구 부유액을 50ul 첨가하고 잘 흔들어 준 다음 실온에서 40분간 정치하였다. 혈구응집반응 역가는 적혈구를 응집시키는 최고 희석배수로 결정하였다.
란감염 용량 (Egg Infectious Dose: EID50)는 9-11일령의 SPF 부화란에 각 서브타입별 바이러스를 10진 희석하여 장요막강내로 0.1ml씩 접종한 후 37.6℃에서 3일간 배양하고, 다시 장요막강액을 5% 닭 적혈구 부유액과 혼합하여 평판 혈구응집반응을 하여 바이러스 감염 여부를 판정하였다. 역가의 계산은 Reed & Munch법으로 실시하였다.
본 발명에 따르는 진단 스트립의 측정 범위 및 검출한계를 검사한 결과 검사선 2(T2)의 일반 조류인플루엔자 바이러스에 대한 검출감도를 조사하였을 때, H 서브타입 별로 차이는 있으나 조류인플루엔자 바이러스 항원을 H5 서브타입은 0.13HAU까지, H9 서브타입은 0.25HAU까지 검출할 수 있어 혈구응집반응보다 높은 검출감도를 보였다. 또한 H5 서브타입은 105.6EID50/0.1㎖까지, H9 서브타입은 106.1EID50/0.1㎖까지 검출할 수 있었다.
그리고, H5 서브타입만을 검출할 수 있는 검사선 1(T1)은 H5 서브타입을 1 HAU까지, 그리고 106.5 EID50/0.1㎖까지 검출할 수 있었다. (표 1)
Figure 112006000196848-PAT00001
* ND : Not detected (검출되지 않음)
* NT : Not tested (시험을 실시하지 않음)
2) 교차반응성 시험
본 발명에 따르는 진단 스트립의 교차반응성을 조사하기 위하여 조류에게 병원성이 있는 여러 종류의 바이러스를 본 키트에 적용한 결과, 조류 인플루엔자 바이러스만 양성 반응을 보였으며, 그 이외의 바이러스는 모두 음성반응을 보였다. 또한 조류인플루엔자 바이러스 H9N2 바이러스는 검사선 2 (T2)에서만 양성을 보였으며, H5N1 바이러스는 검사선 1(T1) 및 검사선 2(T2)에서 모두 양성반응을 보였다(표 2).
Figure 112006000196848-PAT00002
3) 검출시기 및 검출 장기시료에서의 검출율 비교
저병원성 조류인플루엔자 바이러스(LPAI(H9N2) virus) 실험적 감염 닭에 대한 본 발명에 따르는 스트립의 분변에서의 검출율을 비교하기 위하여 SPF 닭 8수에 01310/2001(H9N2) 바이러스를 경구 감염시키고 일별로 총배설강으로부터 바이러스 검출을 위한 분변시료를 채취하여 검사에 사용하였다. 종란접종법의 경우 감염후 1일부터 50%의 검출율을 보였으며 3일에서 7일까지 100%의 검출율을 기록하였다. 유전자증폭법의 경우 접종후 3일부터 50%의 검출율을 보였으며 5일째의 검사시료에서는 100%의 검출율을 기록하였다. 본 키트에서는 양성의 경우 2번 검사선 위치(T2, 일반 조류인플루엔자 바이러스를 검출하는 선)와 대조선에서만 관찰되었으며, 감염 초기(1일 - 4일)에는 유전자 증폭법과 동일한 검출율을 기록하였으나 시간이 지나며 검출율이 급격히 떨어지는 결과를 보여 접종 10일째에 채취된 분변 시료에서는 바이러스를 검출할 수 없었다(표 3).
Figure 112006000196848-PAT00003
* 접종후 일수
또한, 고병원성 조류인플루엔자 바이러스 감염 닭에 대한 본 발명에 따르는 스트립의 검출율을 비교하기 위하여 마찬가지로 8마리의 SPF 닭에 고병원성 조류인플루엔자 바이러스(HPAIV) (A/CK/Korea/ES/03) 주를 비강접종한 후 장기를 채취하였다. 양성의 경우, 1번 (T1, H5조류인플루엔자 바이러스를 검출하는 선) 검사선과, 2번 검사선 위치(T2, 일반 조류인플루엔자 바이러스를 검출하는 선) 및 대조선에서 선이 관찰되었다. HPAIV를 접종의 경우 병증이 급속히 나타나게 되어 2일 내에 접종된 개체가 모두 폐사하였으며, 폐사 전 심한 설사 증상을 보이기 때문에 폐사체의 부검시 장내용물이나 분변이 남아있지 않아 분변을 검사시료로 사용하지 못하였다. 따라서 비장, 신장, 맹장편도 등의 장기를 채취하여 각 장기별 10% 유제액을 실험에 사용하였다. 실험결과 종란접종법이나 유전자증폭법 모두 각 장기에서 100% 검출율을 기록하였으며 일반 조류인플루엔자 바이러스를 검출하는 2번 검사선보다 검출한계에서 약 10배 정도 차이를 보이는 1번 검사선의 경우 비장과 신장에서 각각 62.3%, 37.5% 검출율을 보인 반면 맹장편도 시료의 경우 검출할 수 없어 시료에 따라 검출율에 차이를 보였다(표 4). 이러한 장기별 검출율의 차이는 접종한 바이러스의 장기내 분포의 특성 차이에 크게 좌우된다고 생각되나, 본 실험에서의 차이는 스트립의 성능 향상이 이루어질 때마다 새로운 스트립의 평가를 위하여 시료의 냉동해동이 반복적으로 이루어짐으로써 바이러스 역가가 감소하여 나타난 결과라고 생각되며, 시료의 신선도에 따라 검출율은 높아질 수 있을 것이라 생각된다.
Figure 112006000196848-PAT00004
4) HPAI 발생 농장 시료에서의 검출율 비교
본 발명에 따르는 스트립의 자연감염된 시료에서의 검출율을 확인하기 위하여 HPAI로 확진된 24개 농장(닭 17개농장, 오리 7개 농장)으로부터 분변, 장기 등의 시료를 채취하여 개체별, 농장별로 비교하여 보았다.
우선 HPAI 발생 닭농장(산란계 농장) 분변시료에서의 검출율은 종란접종법으로 농장별, 개체별 각 90.9%, 89.6% 였으며, 2번 검사선(T2, 일반 조류인플루엔자를 검출하는 선)의 경우 각각 45.5%, 50.0%를 기록하였다(표 5).
Figure 112006000196848-PAT00005
또한, HPAI 발생 닭 농장에서의 임상증상 발현계의 분변시료(cloacal swab)에서의 검출율을 측정한 결과 개체별로는 T2위치에서 78.6%의 검출율을 기록하였으나 농장별로는 검사를 실시한 7개 농장의 시료에서 모두 양성 반응을 확인할 수 있어 100%의 검출율을 기록하였다. 즉, T2위치의 일반 인플루엔자 바이러스를 검출하는 선에서는 농장별로 100% 검출할 수 있었다(표 6).
Figure 112006000196848-PAT00006
자연감염된 닭과 오리의 장기에서의 검출율을 비교하기 위하여 HPAI 발생 13개 닭농장과 7개 오리농장에서의 임상증상 발현개체의 신장 및 맹장편도 유제액에 대하여 종란접종법과 유전자증폭법과의 성적을 비교하였다. 닭의 경우 신장 및 맹장편도에서 종란접종법을 통해 100% 검출율을 기록하였으나, 유전자증폭법의 경우 각각 92.3%의 검출율 기록을 확인할 수 있었다. 동일 시료를 가지고 본 발명에 따르는 스트립에서 일반 조류인플루엔자를 검출하는 T2 위치에서는 신장, 맹장편도 모두 100%의 성적을 얻어 HPAIV 접종실험 시료에서와 동일한 성적을 얻을 수 있었으나, H5 고병원성 조류인플루엔자를 검출하는 T1 위치에서는 각각 15.4%, 7.7%의 결과를 보여 HPAIV 접종실험에서의 성적과는 차이를 보였다. 반면 오리 시료의 경우에는 종란접종법으로는 모든 시료에서 100%의 검출율을 기록하고 있으나 유전자증폭법의 경우 신장 및 맹장편도 시료에서 모두 71.4%의 검출율을 기록하여 종란접종법과의 차이를 보였으며, 본 발명에 따르는 스트립의 경우 14.3%와 0%의 저조한 성적을 관찰할 수 있었다(표 7).
Figure 112006000196848-PAT00007
* 신장 및 맹장편도는 3-5수를 합하여 약 20%(W/V) 장기유제액을 만들어 검사
Lee 등(2005, Journal of Virology, vol.79(6), 3692-3702)에 의하면 국내 분리 HPAIV는 실험적 접종실험에서 닭의 인후두부와 총배설강 swab 재료에서는 시료 1ml당 5.8~6.6 log10 EID50, 심장, 뇌, 폐 등의 장기 1g당 6.8~9.5 log10 EID50 정도의 높은 역가의 바이러스가 재분리됨을 보고하였으나 오리의 경우 인후두 및 총배설강 swab 재료에서 1.6~1.7 log10 EID50/ml이, 심장, 뇌, 폐 등의 장기에서 2.1~4.1 log10 EID50/g 의 상대적으로 낮은 역가의 바이러스가 재분리된다고 하여 본 발명에 따르는 스트립의 검출한계를 고려하여 볼 때 일치하는 결과를 얻을 수 있었다.
5) 특이도 시험
특이도 시험을 위해 경기도축산위생시험소에서 AGID검사 결과 음성 판정된 농장에서 수거한 직장 면봉 623건에 대하여 본 발명에 따르는 스트립의 특이도 시험을 실시하였다. 경기도축산위생시험소에서 조류인플루엔자 음성으로 판정된 농장에 대하여 본 발명에 따르는 스트립의 특이도를 확인한 결과 특이도 100% 임을 확인할 수 있었다(표 8)
Figure 112006000196848-PAT00008
이상에서 살펴본 바와 같이 본 발명에 따르는 H5형 고병원성 조류인플루엔자 및 일반 조류인플루엔자 진단 스트립은 분변을 검체로 사용하여 조류인플루엔자 및 H5형 고병원성 조류인플루엔자의 감염 여부를 현장에서 특별한 검사 장비 없이 간편하고 신속하게 진단할 수 있는 유용한 검사 방법을 제공할 수 있다.

Claims (9)

  1. 헤마글루티닌 항원이 H1 내지 H15인 일반 조류인플루엔자 바이러스에 공통적인 단일클론 항체 및 헤마글루티닌 항원이 H5인 고병원성 조류인플루엔자에 특이적인 단일클론 항체를 사용하여 닭의 분변 또는 조직에서 헤마글루티닌 항원이 H5인 고병원성 및 일반 조류 인플루엔자를 감별 진단하는 것을 특징으로 하는 진단 스트립.
  2. 헤마글루티닌 항원이 H5인 고병원성 조류인플루엔자 바이러스에 특이적인 단일클론 항체 및 일반 조류인플루엔자 바이러스에 공통적인 단일클론 항체를 각각 멤브레인에 흡착시키고, 금입자에 부착시켜 항체-금 접합체를 만들어 혼합한 후 모재에 함침시켜 건조시키는 것을 특징으로 하는 H5형 고병원성 및 일반 조류인플루엔자 바이러스 항원 진단 스트립.
  3. 헤마글루티닌 항원이 H5인 고병원성 조류인플루엔자 바이러스에 특이적인 단일클론 항체 및 일반 조류인플루엔자 바이러스에 공통적인 단일클론 항체를 각각 멤브레인에 흡착시키고, 금입자에 부착시켜 항체-금 접합체를 만들어 혼합한 후 모재에 함침시켜 건조시키는 것을 특징으로 하는 진단 스트립의 제조방법
  4. 제 3 항에 있어서, 항체-금 접합체의 제조는 염화금을 시트르산 나트륨 용액으로 환원시키고, 40nm 크기의 골드 입자를 532nm에서 흡광도가 10+/-1이 되게 제조한 다음, 여기에 정제된 헤마글루티닌 항원이 H5인 고병원성 조류인플루인제 바이러스에 특이적인 단일클론 항체 및 일반 조류인플루엔자 바이러스에 공통적인 단일클론 항체를 각각 0.75㎍/strip되게 부착시키고 PEG 용액으로 골드입자를 안정화시키는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 진단 스트립의 제조방법.
  5. 제 3 항에 있어서, 멤브레인은 나이트로 셀룰로우즈 멤브레인인 것을 특징으로 하는 진단 스트립의 제조방법.
  6. 제 3 항에 있어서, 항체-금 접합체를 함침시키는 모재는 폴리에스테르 또는 유리섬유인 것을 특징으로 하는 진단 스트립의 제조방법
  7. 제 3 항에 있어서, 진단 키트는 추가로 검체를 떨어뜨려 스트립 내부로 침투시키도록 하는 검체 패드와 반응하지 않은 시료들을 흡수하는 흡습패드를 적층시키는 것을 특징으로 하는 진단 스트립의 제조방법.
  8. 제 3 항에 있어서, 검체 패드 및 흡습 패드는 셀룰로우즈 패드인 것을 특징으로 하는 진단 스트립의 제조방법.
  9. 검체 패드, 헤마글루티닌 항원이 H5인 고병원성 조류인플루엔자 바이러스에 특이적인 단일클론 항체 및 일반 조류 인플루엔자 바이러스에 공통적인 단일클론 항체를 흡착시킨 멤브레인, 헤마글루티닌 항원이 H5인 고병원성 조류인플루엔자 바이러스에 특이적인 단일클론 항체 및 일반 조류 인플루엔자 바이러스에 공통적인 단일클론 항체를 골드 입자에 부착시켜 항체-금 접합체를 함침시켜 건조한 골드 패드, 흡습 패드를 적층시킨 스트립 및 검체 적용홀와 결과 표시창을 구비하며 상기 스트립을 내부에 삽입하여 검사 결과를 관찰할 수 있도록 하는 하우징으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 진단 키트.
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