JP5490696B2

JP5490696B2 - インフルエンザウイルスｈ５亜型またはｎ１亜型からのヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼに特異的なモノクローナル抗体ならびにそれらの使用

Info

Publication number: JP5490696B2
Application number: JP2010524824A
Authority: JP
Inventors: チャン，ホン・リャン; ヘ，ファン; クァン，ウェイ−シン
Original assignee: テマセック・ライフ・サイエンシズ・ラボラトリー・リミテッド
Priority date: 2007-09-13
Filing date: 2008-09-12
Publication date: 2014-05-14
Anticipated expiration: 2028-09-12
Also published as: EP2201039A1; US8540996B2; WO2009035420A8; SG183031A1; SG183032A1; CN101883789B; US8383121B2; WO2009035420A1; EP2947094B1; US20130004496A1; EP2201039A4; AU2008297594B2; EP2201039B1; AU2008297594A1; CN103214570A; CN103214570B; US20100266585A1; US20130004497A1; JP2010539162A; US8574581B2

Description

この発明は、トリインフルエンザウイルス（ＡＡＩＶ＠）の検出および処置のための抗体および関連する結合タンパク質に関する。より詳細には、この発明は、ＡＩＶの高病原性Ｈ５およびＮ１亜型の検出および処置に有用なモノクローナル抗体および関連する結合タンパク質に、ならびに動物およびヒトにおけるＡＩＶ感染症の診断、監視および処置のための方法および製品に関する。

Ｈ５Ｎ１トリインフルエンザウイルスは、次のインフルエンザの世界的流行（ｐａｎｄｅｍｉｃ）の原因になる可能性がある。インフルエンザＡ感染の例年の大発生は進行中の公衆衛生の脅威であり、ヒトがそれに対してほとんど免疫を持たず、結果として破壊的な世界的流行をもたらす新規のインフルエンザ株が周期的に発生する可能性がある。Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルスにより引き起こされた１９１８年のスペイン風邪（ＡＳｐａｎｉｓｈｆｌｕ＠）の世界的流行は、世界中で４０００万人を超える人々を殺した。Ｈ１Ｎ１の起源は直接トリからヒトへ至った可能性があり、またはそれは中間宿主、例えばブタもしくは別のまだ同定されていない動物宿主における潜伏（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）を含んでいた可能性がある（１）（参考文献一覧は開示の最後に提供する）。それぞれＨ２Ｎ２およびＨ３Ｎ２インフルエンザウイルスにより引き起こされた１９５７年の世界的流行および１９６８年の世界的流行は、両方とも、一方、または両方のヒトに適応したウイルス表面タンパク質がトリインフルエンザ株からのタンパク質により置き換えられた再集合（ｒｅａｓｓｏｒｔｍｅｎｔｓ）に由来していたようである（２）。

Ｈ５Ｎ１ウイルスは、肉食動物を含む前例のない範囲の宿主に感染する能力を有している。ＡＩＶＨ５Ｎ１がヒトに感染する最初に確認された例は、１９９７年に起きた。高病原性Ｈ５Ｎ１感染症が家禽およびヒトの両方において発生した。これがトリインフルエンザウイルスのトリからヒトへの直接の伝染が見つかった最初の時であった。その後、世界保健機構（ＷＨＯ）によると、ヒトのＨ５Ｎ１の症例の総数は２００３年に起きた東南アジアにおける最初の大発生以来２８１件に達しており、１６９件の死亡を伴っている。インドネシアは、２００５年の６月にＨ５Ｎ１ウイルスにより引き起こされたトリインフルエンザのその最初のヒトの症例を報告した。現在までに、それは２００７年における症例を報告している唯一の国であり、２００７年３月現在で確認されたヒトの症例は８１件で、その内の６３件が死に至った。

インフルエンザウイルスはそれらの核タンパク質およびマトリックスタンパク質の抗原特異性に従って分類される。これらのウイルスは主にＡ、ＢおよびＣ血清型に類別され、タイプＡは８個のＲＮＡ分節を有し、それは１０個のウイルスタンパク質をコードしている。全ての既知のタイプＡインフルエンザウイルスは鳥類に由来していた。このカテゴリーのウイルスは他の種、例えばウマ、ブタ、フクロウおよびアザラシに感染することができ、ヒトにも同様に脅威を与えている（２３）。インフルエンザＡウイルスはさらにエンベロープの糖タンパク質、ヘマグルチニン類（ＡＨＡ類＠）、Ｈ１〜Ｈ１６、およびノイラミニダーゼ類（ＡＮＡ類＠）、Ｎ１〜Ｎ９（２４、２５、２６）の抗原性の性質によって亜型へと分けられる。ＨＡタンパク質のＨＡ１−ＨＡ２接合部におけるタンパク質分解による切断はトリの株における病原性と関連しており、この切断部位周辺の疎水性アミノ酸の存在はＨ５亜型に特徴的であると信じられている。加えて、ＨＡタンパク質は宿主細胞のシアロシド受容体への付着およびそれに続く膜融合による侵入を仲介していると信じられており（２７）、ＨＡタンパク質は中和抗体のための主要な標的として機能していると考えられている（２６）。

急性呼吸器疾患の大発生の間の検査は、インフルエンザがその原因かどうかを決定することができる。インフルエンザの季節の間、インフルエンザと矛盾しない呼吸器の疾病を示す選択された患者の検査は、インフルエンザが特定の患者集団の中に存在するかどうかを確証するのを助け、医療提供者が呼吸器の疾病を診断および処置するために彼らの臨床判断をどのように使うかを決定するのを助けることができる。迅速なインフルエンザ検査は、抗ウイルス薬物療法を使うかどうかの決定における助けとなる。一部の検査、例えばウイルス培養、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）および血清検査は決まりきった方法であるが、結果が臨床家を助けるのに時宜を得た方式で得られない可能性がある（３）。現在、一般に用いられている迅速な診断検査法のほとんどはモノクローナル抗体を基にした免疫アッセイである（３、４、５）。免疫蛍光法（蛍光抗体染色）は迅速なインフルエンザ診断検査法の選べる手段であり、それは多くの病院の実験室で用いることができ、一般に２〜４時間で検査結果を出すことができる。とりわけ、特異的なモノクローナル抗体の生成は、ほとんどの一般に用いられている迅速、高感度で費用効果のある診断法の基礎となっている。

地域的に異なる亜系列（ｓｕｂｌｉｎｅａｇｅｓ）の同定は、Ｈ５Ｎ１ウイルスが地理的に幅広く、大きな遺伝的および抗原性の多様性を有していることを示した。インドネシアからの全てのウイルスがＨ５Ｎ１遺伝子型Ｚウイルスの異なる亜系列を形成していることを示す系統発生的分析は、この大発生が単一の導入に由来し、それが国中くまなく広がっていることを示唆している（１４、１５）。インドネシアインフルエンザ分離株を特異的に認識する利用可能なモノクローナル抗体があれば非常に有用であろう。さらに、ベトナムおよびシンガポールインフルエンザ分離株にも及ぶ利用可能なそのｍＡｂ類があれば有用であろう。

発明の目的
この発明の目的は、ＡＩＶのＨ５およびＮ１亜型に、特にＨ５およびＮ１インドネシアＡＩＶ分離株に特異的に結合するモノクローナル抗体（ＡｍＡｂ類＠）および関連する結合タンパク質を提供することである。モノクローナル抗体反応の特異性は、有効な診断試薬のための基礎を提供する。それらに由来するｍＡｂ類および結合タンパク質は、療法薬としても有用である可能性がある。

本発明に従って、Ｈ５亜型のヘマグルチニン糖タンパク質の線状および三次元（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ）エピトープまたはＮ１亜型のノイラミニダーゼ糖タンパク質の線状および三次元エピトープに特異的なモノクローナル抗体および関連する結合タンパク質を提供する。線状Ｈ５エピトープに対するｍＡｂ類は、変性した標本、例えばホルマリンで固定された組織標本においてＨ５Ｎ１および他のＨ５亜型ウイルス株を優れた特異性および感度で検出することができ、一方でＨ５またはＮ１の三次元エピトープを標的とするｍＡｂ類は、前処理されていない組織、例えば凍結された組織標本ならびに他の生物学的組織および流体においてＨ５Ｎ１および他のＮ１亜型ウイルスを検出するのに有用である。Ｈ５エピトープに対するｍＡｂ類およびＮ１エピトープに対するｍＡｂ類は、Ｈ５Ｎ１ウイルス分離株を特異的に診断するために組み合わせて用いることができる。

特に、５Ａ５と名付けられたｍＡｂはＨ５亜型ヘマグルチニンの線状エピトープを標的としている。５Ｃ５、２Ｄ９、４Ｆ８、１Ｃ１、３Ｂ６、２Ｆ１１、９Ｃ１および３Ｈ１１と名付けられた他のｍＡｂ類は、Ｈ５亜型ヘマグルチニンの三次元エピトープを標的としている。８Ｈ１２と名付けられたｍＡｂはＮ１亜型のノイラミニダーゼの線状エピトープを標的としており、６Ｃ６および３Ｄ４と名付けられた２種類のさらなる抗体は、Ｎ１亜型のノイラミニダーゼの三次元エピトープを標的としている。

従って、この発明は、実質的にｍＡｂ５Ａ５のそれらのような線状Ｈ５亜型ヘマグルチニンエピトープへの免疫学的結合特性を有する結合タンパク質および実質的にｍＡｂ８Ｈ１２のそれらのような線状Ｎ１亜型ノイラミニダーゼエピトープへの免疫学的結合特性を有する結合タンパク質を含む。本発明はさらに、実質的にｍＡｂ５Ｃ５、２Ｄ９、４Ｆ８、１Ｃ１、３Ｂ６、２Ｆ１１、９Ｃ１および３Ｈ１１のそれらのような三次元Ｈ５亜型ヘマグルチニンエピトープへの免疫学的結合特性を有する結合タンパク質を含む。本発明は、実質的にｍＡｂ６Ｃ６または３Ｄ４のそれらのような三次元Ｎ１亜型ノイラミニダーゼエピトープへの免疫学的結合特性を有する結合タンパク質も含む。

別の観点において、本発明は、標本においてＨ５亜型ＡＩＶを検出するための方法であって、ＡＩＶの、実質的にｍＡｂ５Ａ５、５Ｃ５、２Ｄ９、４Ｆ８、１Ｃ１、３Ｂ６、２Ｆ１１、９Ｃ１または３Ｈ１１の免疫学的結合特性を有するｍＡｂまたは結合タンパク質との結合を検出することを含む方法を含む。本発明は、標本においてＮ１亜型ＡＩＶを検出するための方法であって、ＡＩＶの、実質的にｍＡｂ６Ｃ６、３Ｄ４または８Ｈ１２の免疫学的結合特性を有するｍＡｂまたは結合タンパク質との結合を検出することを含む方法も含む。特に、本発明は、その結合タンパク質を利用する免疫蛍光アッセイ、免疫組織化学的アッセイおよびＥＬＩＳＡ法に関する。Ｈ５亜型ＡＩＶを認識する抗体は、Ｈ５Ｎ１ウイルスを検出するために、Ｎ１亜型ＡＩＶを認識する抗体と組み合わせて用いることができる。

別の観点において、本発明は、実質的にｍＡｂ５Ａ５、５Ｃ５、２Ｄ９、４Ｆ８、１Ｃ１、３Ｂ６、２Ｆ１１．９Ｃ１、３Ｈ１１、８Ｈ１２、３Ｄ４および／または６Ｃ６の免疫学的結合特性を有する結合タンパク質を含むＡＩＶの検出のためのキットに関する。

本発明はさらに、Ｈ５ＡＩＶ株、例えばＨ５Ｎ１ＡＩＶ株に感染した対象を処置する方法であって、その対象に有効量の実質的にｍＡｂ５Ｃ５、２Ｄ９、４Ｆ８、２Ｆ１１、９Ｃ１、３Ｈ１１、８Ｈ１２、３Ｄ４または６Ｃ６の免疫学的結合特性を有する１種類以上のモノクローナル抗体または結合タンパク質を投与することを含む方法に関する。

図１Ａ〜１Ｄは、ＡＩＶＨ５Ｎ１に感染したＭＤＣＫ細胞をウイルス感染無しのＭＤＣＫ細胞に対して比較した代表的なＩＦＡ画像である。図１Ａは、ＭＤＣＫ細胞においてＨ５Ｎ１が検出されている画像である。図１Ｂでは、紫外線と通常の光の合併が、感染していない細胞と比較した、ウイルスに感染した個々の細胞を示した。図１Ｃに示したように、ウイルス感染の無いＭＤＣＫ細胞には蛍光シグナルは無い。図１Ｄは、図１Ｃと同じ細胞における紫外線と通常の光の合併を示す。図２Ａおよび２Ｂは、ＭＤＣＫ細胞における、モノクローナル抗体のインフルエンザウイルスの中和活性を示す。図２Ａでは、ＭＤＣＫ細胞はモノクローナル抗体がＨ５Ｎ１ウイルス感染を中和した後ＦＩＴＣ蛍光で染色された。図２Ｂでは、ＭＤＣＫ細胞はモノクローナル抗体のＨ５Ｎ１ウイルス感染の中和無しにＦＩＴＣ蛍光で染色された。図３Ａおよび３Ｂは、ｍＡｂ類と線状にした組み換えＨＡ１の間の結合を確認するためのＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングを示す。図３Ａでは、ＨＡ１は約３７ｋＤであり、発現したＧＳＴタグを有するＨＡ１はＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて約６１ｋＤである。ＧＳＴ単独は２６ｋＤである。図３Ｂでは、ウエスタンブロッティングが組み換えＨＡ１がｍＡｂ５Ａ５と反応することを示した。６１ｋＤにある主要なバンド以外に、より小さいバンドが存在し、それはＧＳＴ−ＨＡ１をＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させた際の分解を示唆していた。レーン１、ＩＰＴＧに誘導される発現無しのＥ．ｃｏｌｉの試料；レーン２および３、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させたＩＰＴＧに誘導されるＧＳＴ−ＨＡ１；レーン４、精製したＧＳＴの試料。図４Ａおよび４Ｂは、ｍＡｂ５Ａ５の線状エピトープのマッピングを図説している。図４Ａはヘマグルチニンタンパク質ＨＡ１の概略図であり、様々な長さのＨＡ１断片の発現のためのクローンコンストラクトおよびそれらのｍＡｂ５Ａ５との反応性を示している。図４Ｂは変異体ヘマグルチニンＨＡ１断片の概略図であり、ＨＡ１断片上の様々な変異の発現のためのクローンコンストラクトおよびそれらのｍＡｂ５Ａ５との反応性を示している。図５Ａおよび５Ｂは、ｍＡｂ６Ｃ６または３Ｄ４と発現させた組み換えＮ１の間の典型的な反応を示す。図５Ａは、Ｓｆ９細胞において検出されている発現させた組み換えＮ１を示す。図５Ｂでは、紫外線と通常の光の合併が個々の細胞を示した。図６Ａおよび６Ｂは、発現させたＮＡを確認するためのＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングを示す。図７Ａ、７Ｂおよび７Ｃは、ＭＤＣＫ細胞における、モノクローナル抗体のインフルエンザウイルスの中和活性を示す。図７Ａでは、モノクローナル抗体がＨ５Ｎ１ウイルス感染を中和した後にＭＤＣＫ細胞を顕微鏡検査により観察した。図７Ｂでは、ＣＰＥ陽性対照として、モノクローナル抗体のＨ５Ｎ１ウイルス感染の中和無しにＭＤＣＫ細胞を顕微鏡検査により観察した。図７Ｃでは、ＣＰＥ陰性対照として、ＭＤＣＫ細胞をウイルスおよびｍＡｂ共に無しで示した。

本発明は、ＡＩＶのＨ５亜型のヘマグルチニン糖タンパク質またはＡＩＶのＮ１亜型のノイラミニダーゼ糖タンパク質に特異的に結合するｍＡｂ類および関連する抗原結合タンパク質に向けられている。特に、そのｍＡｂまたは関連する抗原結合タンパク質は、次のものの免疫学的結合特性を有する：２００７年７月１０日にアメリカ培養細胞系統保存機関（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）に寄託され、受け入れ番号ＰＴＡ−８５２８を割り当てられた、ハイブリドーマ５Ａ５により産生されるｍＡｂ５Ａ５、２００７年７月１０日にＡＴＣＣに寄託され、受け入れ番号ＰＴＡ−８５２９を割り当てられた、ハイブリドーマ５Ｃ５により産生されるｍＡｂ５Ｃ５、２００７年７月１０日にＡＴＣＣに寄託され、受け入れ番号ＰＴＡ−８５２６を割り当てられた、ハイブリドーマ６Ｃ６により産生されるｍＡｂ６Ｃ６、２００８年７月２９日にＡＴＣＣに寄託され、受け入れ番号ＰＴＡ−９３９６を割り当てられた、ハイブリドーマ２Ｄ９により産生されるｍＡｂ２Ｄ９、２００８年７月２９日にＡＴＣＣに寄託され、受け入れ番号ＰＴＡ−９３９７を割り当てられた、ハイブリドーマ４Ｆ８により産生されるｍＡｂ４Ｆ８、２００８年７月２９日にＡＴＣＣに寄託され、受け入れ番号ＰＴＡ−９３９８を割り当てられた、ハイブリドーマ１Ｃ１により産生されるｍＡｂ１Ｃ１、２００８年７月２９日にＡＴＣＣに寄託され、受け入れ番号ＰＴＡ−９３９９を割り当てられた、ハイブリドーマ３Ｂ６により産生されるｍＡｂ３Ｂ６、２００８年７月２９日にＡＴＣＣに寄託され、受け入れ番号ＰＴＡ−９３９５を割り当てられた、ハイブリドーマ３Ｄ４により産生されるｍＡｂ３Ｄ４、２００８年７月２９日にＡＴＣＣに寄託され、受け入れ番号ＰＴＡ−９３９４を割り当てられた、ハイブリドーマ８Ｈ１２により産生されるｍＡｂ８Ｈ１２、２００８年７月１６日にＡＴＣＣに寄託され、受け入れ番号ＰＴＡ−９３７３を割り当てられた、ハイブリドーマ２Ｆ１１により産生されるｍＡｂ２Ｆ１１、２００８年７月１６日にＡＴＣＣに寄託され、受け入れ番号ＰＴＡ−９３７２を割り当てられた、ハイブリドーマ９Ｃ１により産生されるｍＡｂ９Ｃ１、または、２００８年７月１６日にＡＴＣＣに寄託され、受け入れ番号ＰＴＡ−９３７４を割り当てられた、ハイブリドーマ３Ｈ１１により産生されるｍＡｂ３Ｈ１１。全ての寄託は、ブタペスト条約の規定に従ってなされた。本発明はさらに、これらのハイブリドーマを包含し、本発明のｍＡｂ類および結合タンパク質の継続的な源を提供する。

本発明はさらに、Ｈ５亜型ＡＩＶの感染の検出および診断のための方法ならびに本発明のｍＡｂ類または結合タンパク質を含むアッセイキットに関する。本発明はさらに、Ｈ５またはＮ１ＡＩＶ株に感染した対象の、有効量の本発明の１種類以上の抗体または関連する結合タンパク質の投与による処置の方法に関する。特に、この態様において、対象はＡＩＶのＨ５Ｎ１亜型のインドネシア分離株に感染している。この発明の抗体は、起こり得るインフルエンザの大発生の到来の際に予防策として対象に投与することもできる。この場合、投与される抗体の有効量は、Ｈ５またはＮ１ＡＩＶ感染症を処置するのに用いられる量の約半分である。

様々な用語が本明細書で用いられ、それは下記の意味を有する：
ｍＡｂまたは関連する結合タンパク質の”免疫学的結合特性”という用語は、その文法形式の全てにおいて、ｍＡｂまたは結合タンパク質のその抗原に対する特異性、親和性および交叉反応性を指す。

用語”線状エピトープ”は、抗体結合部位を形成する約４から約１２アミノ酸までの連続した配列を指す。この発明のｍＡｂ類の線状エピトープは、好ましくはＨＡ１ウイルス遺伝子によりコードされるヘマグルチニンタンパク質のおよそアミノ酸２６０からおよそアミノ酸２６９までの領域の中にある。ｍＡｂまたは結合タンパク質に結合する形の線状エピトープは、実質的に三次構造を失っている変性したタンパク質の中にあってよい。

用語：三次元エピトープ（Ａｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｅｐｉｔｏｐｅ＠）は、Ｈ５亜型ヘマグルチニン糖タンパク質またはＮ１亜型ノイラミニダーゼ糖タンパク質の中に、その未変性の三次元の形で存在する、ｍＡｂまたは関連する結合タンパク質の結合部位を指す。

用語：結合タンパク質（Ａｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ＠）は、本発明のｍＡｂまたは本発明のｍＡｂの免疫学的結合特性を有するｍＡｂの抗原結合部位を含むタンパク質を指し、下記で記述するそれらを含む。

本発明は好都合なことに、動物をＡＩＶ亜型Ｈ５Ｎ２（Ａ／ニワトリ／シンガポール／９８）で免疫することによりｍＡｂ５Ａ５の結合特性を有するモノクローナル抗体を調製する、動物をＡＩＶ亜型Ｈ５Ｎ２（Ａ／ニワトリ／シンガポール／９８）で免疫することによりｍＡｂ５Ｃ５の結合特性を有するモノクローナル抗体を調製する、または動物をＡＩＶ亜型Ｈ７Ｎ１（Ａ／ニワトリ／シンガポール／９４）で免疫することによりｍＡｂ６Ｃ６の結合特性を有するモノクローナル抗体を調製するための方法を提供する。本発明はさらに好都合なことに、動物をＡＩＶ亜型Ｈ５Ｎ２（Ａ／ニワトリ／シンガポール／９８）で免疫することによりｍＡｂ２Ｄ９の、およびｍＡｂ３Ｂ６の結合特性を有するモノクローナル抗体を調製するための方法を提供する。本発明は、動物をアミノ酸２０５におけるリシンからメチオニンへの変異を有する親トリインフルエンザウイルスＡ／ベトナム／１２０３／２００４／Ｈ５Ｎ１からの回避変異体で免疫することによりｍＡｂ２Ｆ１１もしくは９Ｃ１の結合特性を有するモノクローナル抗体を調製する、または動物をＡＩＶ亜型Ａ／インドネシア／ＣＤＣ６６９／２２０６／Ｈ５Ｎ１で免疫することによりｍＡｂ３Ｈ１１の結合特性を有するモノクローナル抗体を調製するための方法も提供する。加えて、本発明は、動物をＡＩＶ亜型Ｈ７Ｎ１（Ａ／ニワトリ／シンガポール／９４）で免疫することによりｍＡｂ３Ｄ４の、およびｍＡｂ８Ｈ１２の結合特性を有するモノクローナル抗体を調製するための方法、ならびに動物をＡＩＶ亜型Ｈ５Ｎ２（Ａ／ニワトリ／シンガポール／９８で免疫することによりｍＡｂ類４Ｆ８および１Ｃ１を調製するための方法を提供する。あらゆるその抗原は、望まれる免疫学的結合特性を有する抗体を生じさせるための免疫原として用いることができる。その抗体には、ｍＡｂ５Ａ５、５Ｃ５、２Ｄ９、４Ｆ８、１Ｃ１、３Ｂ６、２Ｆ１１、９Ｃ１、３Ｈ１１、８Ｈ１２、６Ｃ６または３Ｄ４の抗原結合配列を含むモノクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、およびタンパク質が含まれるが、それらに限定されない。

本発明のｍＡｂ類は、培養中の連続継代性細胞株（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｃｅｌｌｌｉｎｅｓｉｎｃｕｌｔｕｒｅ）による抗体分子の産生を提供するあらゆる技法により産生することができる。その方法には、元は１９７５年にＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎにより開発されたハイブリドーマの技法(Nature 256:495-497)、さらにトリオーマの技法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマの技法(Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72)、およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶ−ハイブリドーマの技法(Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96(1985)における)が含まれるが、それらに限定されない。ヒトの抗体を用いることができ、それはヒトのハイブリドーマを用いることにより(Cote et al., 1983, Proc. Nat ＝l. Acad. Sci. U.S.A., 80:2026-2030)、またはインビトロでヒトＢ細胞をＥＢＶウイルスを用いて形質転換することにより(Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, pp. 77-96における)得ることができる。さらに、本発明のマウス抗体分子、例えばｍＡｂ５Ｃ５、５Ａ５、６Ｃ６、２Ｄ９、４Ｆ８、１Ｃ１、３Ｂ６、３Ｄ４、８Ｈ１２、２Ｆ１１、９Ｃ１または３Ｈ１１からの配列を導入して適切な生物学的活性を有するヒト抗体分子からの遺伝子と一緒にすることによる”キメラ抗体”または”ヒト化抗体”の産生のために開発された技法(Morrison et al., 1984, J. Bacteriol. 159-870; Neuberger et al., 1984, Nature 312:604-608; Takeda et al., 1985, Nature 314:452-454)を用いることができる。キメラ抗体は、ヒトのＦｃ部分およびマウス（または他のヒト以外）のＦｖ部分を含む抗体である。ヒト化抗体は、マウス（または他のヒト以外）の相補性決定領域（ＣＤＲ）がヒト抗体の中に組み込まれた抗体である。キメラおよびヒト化抗体は共にモノクローナルである。そのヒトまたはヒト化キメラ抗体は、ヒトの疾患または障害のインビボ診断または療法における使用に好ましい。

本発明に従って、単鎖抗体の産生に関して記述された技法（米国特許第４，９４６，７７８号）を、本発明の単鎖抗体を提供するように適合させることができる。本発明の追加の態様は、Ｆａｂ発現ライブラリーの構築に関して記述された技法(Huse et al., 1989, Science 246: 1275-1281)を利用して、本発明の抗体、またはその誘導体、もしくは類似体に望ましい特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片の迅速かつ容易な同定を可能とする。

抗体分子のイディオタイプを含む抗体断片は既知の技法により生成することができる。例えば、その断片は次のものを含むがそれらに限定されない：抗体分子のペプシン消化により生成することができるＦ（ａｂ＝）_２断片；Ｆ（ａｂ＝）_２断片のジスルフィド架橋を還元することにより生成することができるＦａｂ＝断片、ならびに抗体分子をパパインおよび還元剤で処理することにより生成することができるＦａｂ断片。その抗体断片は、本発明のポリクローナルまたはモノクローナル抗体のいずれから生成することもできる。

抗体の産生において、望ましい抗体のスクリーニングは当分野で既知の技法、例えば放射性免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡ（酸素結合免疫吸着アッセイ）、”サンドイッチ”免疫アッセイ、免疫放射定量アッセイ、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、インサイチュ免疫アッセイ（例えば金コロイド、酵素または放射性同位体標識を用いる）、ウェスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ（例えばゲル凝集アッセイ、血球凝集アッセイ）、免疫蛍光アッセイおよび免疫電気泳動アッセイ等により成し遂げることができる。１態様において、抗体の結合は一次抗体上の標識を検出することにより検出される。別の態様において、一次抗体は二次抗体または他の試薬の一次抗体への結合を検出することにより検出される。さらに別の態様において、二次抗体は標識されている。免疫アッセイにおいて結合を検出するための手段は当分野で既知であり、本発明の範囲内である。

前述の抗体を、ＡＩＶのＨ５またはＮ１亜型の検出または位置測定に関して当分野で既知の方法、例えば、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、放射性免疫アッセイ、免疫蛍光アッセイ、免疫組織化学的アッセイ、および同様のものにおいて用いることができる。本明細書で開示される技法は、ＡＩＶのＨ５亜型の質的および定量的測定に、ならびにそのウイルスに感染した動物またはヒトの診断および監視に適用することができる。

本発明には、ＡＩＶのＨ５亜型の質的および／または定量的測定のためのアッセイおよび検査キットも含まれる。そのアッセイ系および検査キットは、例えば放射性原子、蛍光性の基または酵素を用いた標識、本発明のｍＡｂもしくは関連する結合タンパク質への、またはその結合パートナーへの標識のカップリングにより調製される標識された構成要素を含んでいてよい。そのアッセイまたは検査キットは、さらに使用のための免疫アッセイの技法の技術者に周知の試薬、希釈剤および説明書を含んでいてよい。

本発明の特定の態様において、そのキットは、選択された方法、例えば”競合的”、サンドウィッチ””、”ＤＡＳＰ”および同様のものに依存して、少なくとも本発明のｍＡｂまたは関連する結合タンパク質、生物学的試料中のＡＩＶへのそのｍＡｂまたは関連する結合タンパク質の免疫特異的結合の検出のための手段、および使用のための説明書を含むであろう。キットは陽性および陰性対照を含んでいてもよい。それらは自動化された分析器または自動化された免疫組織化学的スライド染色機器と共に使用されるように設計されてもよい。

本発明のアッセイキットはさらに二次抗体または結合タンパク質を含んでいてよく、それは標識することができ、または固体支持体への付着のために提供する（または固体支持体に付着させる）ことができる。その抗体または結合タンパク質は、例えば、ＡＩＶに結合するものであってよい。その二次抗体または結合タンパク質は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であってよい。

Ｈ５亜型ヘマグルチニンまたはＮ１亜型ノイラミニダーゼタンパク質に対するモノクローナル抗体は、動物をＡＩＶまたはＨ５もしくはＮ１タンパク質またはそれらの断片で免疫することにより調製することができる。Ｈ５亜型ヘマグルチニンタンパク質に対する抗体に関して好ましい方法には、Ｈ５亜型ＨＡ１遺伝子の増幅とそれに続く遺伝子の発現、Ｈ５亜型組み換えタンパク質の回収および精製ならびに精製したタンパク質の免疫原としての使用が含まれる。例えば、Ｈ５Ｎ１ＡＩＶを、ニワトリ胚にそのウイルスの利用可能な株を接種することにより増殖させ、続いてウイルスＲＮＡを分離する。ＨＡ１遺伝子を逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により増幅し、次いでバキュロウイルスベクターの中にクローン化することができ、それを昆虫細胞中でＨ５タンパク質を発現させるために用いる。そのように生成されたタンパク質を、次いでマウスまたは他のハイブリドーマの生成に適した種を免疫するのに用いることができる。類似の手順を用いてハイブリドーマ生成のためのＮ１タンパク質を得ることができる。

ハイブリドーマを、Ｈ５またはＮ１タンパク質に特異的に結合することができ、それらを他のＡＩＶ亜型から識別する高親和性ｍＡｂ類を産生するそれらの能力に関してスクリーニングする。本発明に従って、ウイルス中和能力を有する抗体はＨ５亜型ヘマグルチニンタンパク質中の三次元エピトープを認識することができることが見出だされた。この発見は、それぞれの中和ｍＡｂの存在下でのメイディン・ダービー・イヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞またはニワトリ胚における１〜２回の選択の後の、ウイルスの回避変異体の発生の結果であった。ＨＡ１遺伝子をこれらの中和回避変異体からＲＴ−ＰＣＲによりクローニングし、配列決定して点変異を同定した。このグループの抗体において、ｍＡｂ類５Ｃ５、２Ｆ１１、９Ｃ１および３Ｈ１１において中和エピトープが見つかった。中和回避能力は血球凝集阻害アッセイを用いて確認した。

ＨＡ１は、１６アミノ酸のシグナルペプチドを含めて３３８アミノ酸を含む。タンパク質上の線状エピトープの分布を研究するためには、切り詰めた（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）、および変異導入した断片を、ｍＡｂ類との結合に関して、例えばウェスタンブロットまたは類似の技法により試験するのが好都合である。線状エピトープは、変性したＨ５亜型タンパク質、例えばホルマリン固定された組織において生じる変性したＨ５亜型タンパク質の、免疫組織化学的染色法を用いた検出において優れた性能を示すｍＡｂ類の結合標的として同定することができる。Ｈ５亜型ｍＡｂ類のこの方式でのマッピングは、感染性Ｈ５Ｎ１ＡＩＶのさらなる研究およびより有効な臨床診断のためのプラットホームを提供する。

本発明はまた、ＡＩＶのＨ５ヘマグルチニンおよびＮ１ノイラミニダーゼ分子の抗原構造のよりよい理解を提供した。本発明のｍＡｂ類および関連する結合タンパク質は、凍結切片および生物学的標本においてこの高病原性ウイルスを検出するための手段を提供する。

パラフィン切片中でウイルスを検出する能力は非常に重要である。ほとんどの状況下では、感染した組織切片中のＡＩＶ抗原は固定の過程で破壊される。ホルマリンおよびエタノールは脂質のエンベロープおよびエンベロープの糖タンパク質を、ヘマグルチニンを含めて除去する可能性を有しており、従ってウイルス抗原の検出の難度を増大させる。従って、この形の診断は、ＡＩＶに感染した動物およびヒトの組織のより安全かつより正確な診断を提供する可能性を有する。

下記の実施例において説明するように、ｍＡｂ５Ａ５はホルマリン固定された組織中のウイルス抗原に対して非常に有効かつ感度が高い。この抗体は感染した領域を光学顕微鏡の下で容易に視認することを可能にする。抗体５Ａ５はヘマグルチニン阻害またはウイルス中和活性を持たない；しかし、それは免疫蛍光アッセイおよびウェスタンブロット分析において陽性の結果を示し、組み換えＨ５Ｎ１−ＨＡタンパク質（ＭＷ３６ｋＤａ）に対応する強いバンドが観察される。

ｍＡｂ８Ｈ１２もホルマリン固定された組織中のウイルス抗原に対して非常に有効かつ感度が高い。この抗体も、感染した領域を光学顕微鏡の下で容易に視認することを可能にする。

それに対し、ｍＡｂ類５Ｃ５、２Ｄ９、４Ｆ８、１Ｃ１、３Ｂ６、６Ｃ６、３Ｄ４、２Ｆ１１、９Ｃ１および３Ｈ１１は凍結組織切片に対して非常に有効であるが、ホルマリン固定された組織中の抗原は検出しない。これらの結果は、２個のグループのｍＡｂ類が異なるウイルスエピトープと反応していることを意味する。エピトープマッピングによって、ｍＡｂ類５Ａ５および８Ｈ１２は線状エピトープを標的としていることが明らかになった。それらは組織が強烈な熱処理を受けた場合にのみウイルス抗原を検出できた。そのきつい抗原回復法の下では、ウイルスの表面タンパク質は破壊され、ウイルスの核タンパク質が露出された。従って、線状エピトープを標的とするｍＡｂ類は、凍結組織切片に対しては同様には働かない。

モノクローナル抗体５Ｃ５、２Ｄ９、４Ｆ８、１Ｃ１、３Ｂ６、６Ｃ６、３Ｄ４、２Ｆ１１、９Ｃ１および３Ｈ１１は、Ｈ５Ｎ１ウイルスの三次元エピトープを標的としていることが決定された。ｍＡｂ５Ｃ５、２Ｄ９、４Ｆ８、２Ｆ１１、９Ｃ１および３Ｈ１１に関してこの決定をするのにはエピトープマッピングが用いられた；ｍＡｂ６Ｃ６および３Ｄ４についての決定は、その抗体がＳＤＳ−ＰＡＧＥからの変性したノイラミニダーゼを認識できなかったことに基づいてなされた。これらの抗体は、組織切片の事前の処理無しでウイルス抗原に結合し、認識することができた。

この発明は、ＡＩＶのＨ５およびＮ１亜型を検出するための便利で非常に特異的かつ感度の高い手段を提供する。その手段の１つはＥＬＩＳＡ形式である。好ましい態様において、ｍＡｂ類５Ａ５、５Ｃ５、２Ｄ９、４Ｆ８、１Ｃ１、３Ｂ６、２Ｆ１１、９Ｃ１および３Ｈ１１が、単独または組み合わせで、捕捉抗体として用いられる。ｍＡｂ類５Ａ５および５Ｃ５の組み合わせは、どちらかの抗体単独または本明細書で記述される他の組み合わせと比較してＨ５亜型ＡＩＶの検出において高い光学密度の読みを提供することが分かっている。理論に縛られるわけでは無いが、これらの結果のありうる説明は、その２種類の抗体はＨＡ１タンパク質上で異なるエピトープと反応し、およびそれらは異なる抗体のサブクラスに属しており、従って多数の結合部位を提供する、というものである。

もし抗体を単独で用いるのなら、選択された抗体を、例えば捕捉抗体として用いることができ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲートした同じ抗体を検出抗体として用いることができる。６Ｃ６、３Ｄ４および８Ｈ１２抗体を同様にＡＩＶのＮ１亜型株の検出のための捕捉抗体として用いることができる。

三次元エピトープに対するモノクローナル抗体は重要な生物学的機能、例えば血球凝集の阻害および中和活性を維持しており、一方線状エピトープに対するｍＡｂ類も診断における使用に都合がよい。従って、それぞれ線状ならびに三次元エピトープに対するものであるｍＡｂ５Ａ５の、ならびにｍＡｂ類５Ｃ５、２Ｄ９、４Ｆ８、１Ｃ１、３Ｂ６、２Ｆ１１、９Ｃ１および３Ｈ１１の適用は、高い感度のＥＬＩＳＡの手順に大きく貢献する可能性がある。同様に、それぞれＮ−１ノイラミニダーゼの線状ならびに三次元エピトープに対するものであるｍＡｂ８Ｈ１２の、ならびにｍＡｂ類６Ｃ６および３Ｄ４の適用は、高い感度のＥＬＩＳＡの手順に大きく貢献する可能性がある。２種類のｍＡｂ類を用いるアプローチは、Ｈ５およびＮ１ウイルスを検出するための、例えばドットブロットおよびインサイチュハイブリダイゼーション形式によるような他の免疫学的方法を開発するために用いられてもよい。

この発明の好ましいＥＬＩＳＡ検査は、Ｈ５Ｎ１ＡＩＶに感染しているインドネシアの家禽およびヒトからのＨＡ抗原を検出することが可能であり、これはトリおよびヒト両方のＨ５Ｎ１感染症の検出に本発明が有用であることを示す。

この発明のＨ５亜型およびＮ１亜型ｍＡｂ類は、診断の手段として他の一般に行われている方法に対して利点を有する。第１に、ｍＡｂ類５Ａ５、５Ｃ５、２Ｄ９、４Ｆ８、１Ｃ１、３Ｂ６、２Ｆ１１、９Ｃ１および３Ｈ１１は高感染性Ｈ５亜型ＡＩＶに高度に特異的であり、９Ｃ１以外の全てのｍＡｂはＨ５Ｎ１の全て、またはほぼ全ての既知のインドネシア株を認識することが示されている。加えて、ｍＡｂ類６Ｃ６、３Ｄ４および８Ｈ１２はＮ１亜型ＡＩＶに高度に特異的であり、Ｈ５Ｎ１の全て、またはほぼ全ての既知のインドネシア株を含むＮ１亜型ウイルスの感染症を診断するのに用いることができる。その高度に特異的なモノクローナル抗体は、トリインフルエンザの診断の分野における画期的躍進を表す。本発明の前に、全て、またはほぼ全てのインドネシアＨ５Ｎ１ウイルスを検出することができるモノクローナル抗体は報告されていなかった。本発明のモノクローナル抗体の１種類を除く全ては、この２年間以内にインドネシアにおいて集められたＨ５Ｎ１ウイルスの全て、または本質的に全てを認識することが示されている。ｍＡｂ６Ｃ６、３Ｄ４または８Ｈ１２は、特定の分離株がＨ５Ｎ１分離株であることを正確に示すために、ｍＡｂ５Ａ５、５Ｃ５、２Ｄ９、４Ｆ８、１Ｃ１、３Ｂ６、２Ｆ１１または３Ｈ１１と組み合わせて（一緒に、または連続して）用いることができる。加えて、そのｍＡｂ類の、Ｈ５ウイルス抗原を感染したホルマリン固定された組織において、ならびに血清検査、例えばＨＩおよびＩＦＡにおいて検出し、正確に位置を測定する能力は、異なる利点を表す。さらに、これらのｍＡｂ類は、Ｈ５およびＮ１ＡＩＶ感染症の検出に安全かつ便利な診断アプローチを提供する。凍結切片のスライドは、極低温で長期間保管することができ、感染症のさらなる診断および監視を容易にする。従って、この発明の抗体は、Ｈ５Ｎ１感染症の診断に有用である。下記で論じるように、この発明のｍＡｂ類はＨ５Ｎ１感染症の処置にも有用である。従って、この発明のｍＡｂ類は、可能性のあるインフルエンザの世界的流行の抑制における非常に有用な手段であろう。

本発明の別の態様は、Ｈ５トリインフルエンザの中和回避変異体に関する。用語：中和回避変異体（Ａｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎｅｓｃａｐｅｍｕｔａｎｔ＠）は、Ｈ５またはＮ１ウイルスにおいて抗原連続変異を引き起こし、中和エピトープに影響を及ぼす、ヘマグルチニンをコードする遺伝子における点変異により高められた（ｒａｉｓｅｄ）変異ウイルスを指す。中和回避変異体は、その親ウイルスを中和するのに有効な特定のモノクローナル抗体による中和を逃れることができる。回避変異体の手動のスクリーニングでは、親ウイルスを特定の中和抗体と共に保温し、宿主、例えばＭＤＣＫ細胞またはニワトリ胚の中に接種する。２〜３回のスクリーニングの後、その中和ｍＡｂに関する回避変異体をクローニングし、ＨＡ１遺伝子の配列決定を行う。変異したアミノ酸は親ウイルスの配列とのアラインメントにより決定され、変異した部位は中和ｍＡｂにより認識される中和エピトープを構成するアミノ酸の１個を正確に示す。本発明において、５Ｃ５回避変異体はＡ／インドネシア／ＣＤＣ６６９／Ｈ５Ｎ１ＡＩＶから、５Ｃ５中和モノクローナル抗体により生じる。変異部位を下記の実施例３、表４にリストする。２Ｆ１１回避変異体はＡ／ベトナム／１２０３／２００４／Ｈ５Ｎ１から、２Ｆ１１中和モノクローナル抗体により生じる。９Ｃ１回避変異体はＡ／ベトナム／１２０３／２００４／Ｈ５Ｎ１のＫ１８９Ｍ変異体から、９Ｃ１中和モノクローナル抗体により生じる。加えて、３Ｈ１１、２Ｆ９および９Ｃ１回避変異体はＡ／インドネシア／ＣＤＣ６６９／２００６／Ｈ５Ｎ１から生じる。変異部位を下記の実施例３、表４にリストする。

中和回避変異体は、それらが親ウイルスに特異的に結合する特定の中和抗体ではもはや認識することができない点においてそれらの親ウイルスと異なる。これゆえに、これらの変異体は上記の教えに従う新規モノクローナル抗体の産生のためにマウスを免疫するのに用いることができる。新規ｍＡｂ類の中から、変異したエピトープを正確に認識するモノクローナル抗体を選別することができ、次いでそれを用いて親ウイルス以外のトリインフルエンザウイルスへの相補的監視（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ）を提供することができる。この過程を数世代通して繰り返すことにより、さらなる回避変異体を見つけることができ、さらなる中和抗体を得ることができる。これらの抗体を本発明の方法において用いることができる。

本発明の別の態様において、本発明の抗体および関連する結合タンパク質は、Ｈ５ＡＩＶ感染症、特にＡＩＶのＨ５Ｎ１亜型からの感染症を患う対象を処置するために投与することができる。本発明の抗体および関連する結合タンパク質は、インフルエンザの世界的流行または世界的流行の前兆の場合に予防措置として対象に投与することもできる。抗体および関連する結合タンパク質は、１回量で、または繰り返しの投与で、場合により放出が遅い形で投与することができる。投与は処置される対象の体におけるその作用部位に抗体を到達させることのできるあらゆる手段により、例えば静脈内に、筋肉内に、皮内に、経口で、または鼻に、なされることができる。通常は、抗体は医薬的に許容できる希釈剤またはキャリヤー、例えば無菌の水溶液中で投与され、組成物はさらに１種類以上の安定化剤、抗原性補強剤、可溶化剤、緩衝液等を含むことができる。厳密な投与の方法、組成物および個別の投与量は、治療の時に、対象の個々の必要性に依存して、対象の年齢（ｓｕｂｊｅｃｔ＝ｓａｇｅ）、体重、全身の健康、ならびに彼のまたは彼女の症状の性質および程度、さらに与える処置の頻度のような要素を考慮して決定され、調整されるであろう。一般に、抗体がＨ５ＡＩＶ感染症を患う患者を処置するために投与される場合、投与される抗体の投与量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ体重の範囲内である。通常、予防措置として投与される場合、投与量は約半分、すなわち約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約０．５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲内に低減される。

本発明の単一の中和抗体または結合タンパク質を療法上の目的のために投与することができ、または２種類以上の組み合わせを投与することができる。もし１世代以上の中和回避変異体に対する抗体が産生された場合、その抗体および上記の本発明の抗体を治療用の抗体のカクテル（Ａｃｏｃｋｔａｉｌｓ．＠）として投与することができる。療法薬としての使用に好ましい抗体には、５Ｃ５、２Ｄ９、２Ｆ１１、９Ｃ１、３Ｈ１１および４Ｆ８ｍＡｂ類が含まれる。

下記の実施例を、本発明を実行する好ましい方式を説明するために提供する。本発明は実施例の詳細に限定されるのではなく、添付した特許請求の範囲の全範囲と等しい。

実施例１
ハイブリドーマの生成
Ｈ５Ｎ１／ＰＲ８以外の全ての生きた野生型Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルスをインドネシアから得た。Ｈ５Ｎ１／ＰＲ８は疾病対策センター（米国）から得た。それは非病原性組み換えウイルスであり、それはベトナムでヒトに感染したＡＩＶＨ５Ｎ１ウイルス（Ａ／ベトナム／１２０３／２００４）のＨＡおよびＮＡ遺伝子を含む。Ｈ５Ｎ２（Ａ／ニワトリ／シンガポール／９８）およびＨ７Ｎ１（Ａ／ニワトリ／シンガポール／９４）を、シンガポールの農産食品＆家畜管理局（ＡＶＡ）から得た。これらのウイルスストックを用いて９〜１１日齢の発育鶏卵（Ｃｈｅｗ＝ｓＰｏｕｌｔｒｙＦａｒｍ，シンガポール）に感染させ、２世代複製させた。次いで尿膜腔液を吸出し、ヘマグルチニンアッセイ（ＨＡ）を用いてウイルスの力価を測定した。不活化したＨ５Ｎ１（Ａ／ガチョウ／広東／９７）をＲＮＡ抽出のために用いて、ＲＴ−ＰＣＲによりＨＡ１遺伝子を増幅した。メイディン・ダービー腎臓細胞（ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣＣＣＬ３４）細胞は、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地中で、３７ＥＣ、５％ＣＯ_２において増殖させた。

ウイルスの精製は、ウイルスを含む尿膜腔液を１０，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して破片を除去し、続いて上清を４０，０００ｒｐｍで３時間超遠心することにより実施した。ウイルスのペレットをＰＢＳ中で懸濁した。

モノクローナル抗体を、透明になった流体から、プロテインＡ親和性カラム（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ；米国ミズーリ州セントルイス）およびＩｍｍｕｎｏｐｕｒｅ７ＩｇＭｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｋｉｔ（ＰｉｅｒｃｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；米国イリノイ州ロックフォード）を用いて、製造者の（ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｒ＝ｓ）説明書に従って精製した。抗体の濃度を、ＮＤ−１０００分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；米国デラウェア州ウィルミントン）を用いることにより測定した。

ＢＡＬＢ／ｃマウスを、０．２ｍｌの体積中の、オイルアジュバントＭｏｎｔａｎｉｄｅＩＳＡ５６３（Ｓｅｐｐｉｃ，フランス）と一緒の不活化したＨ５Ｎ２（Ａ／ニワトリ／シンガポール／９８）またはＨ７Ｎ１（Ａ／ニワトリ／シンガポール／９４）のトリインフルエンザウイルスを用いて免疫した。腹腔内注射を０、１４、２８および４２日目において行った。ＤｅＳｔ．ＧｒｏｔｈおよびＳｃｈｅｉｄｉｇｇｅｒが記述したように、免疫したマウスからの脾細胞および骨髄腫細胞（ＳＰ２／０）を集めて融合させてハイブリドーマを生成した（１６）。ピポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）培地を用いた選択の後、１４日後に有意な増殖を示しているハイブリドーマからの培地を、免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）により、Ｈ５Ｎ１／ＰＲ８に感染したＭＤＣＫ細胞に対する特異的な抗体の存在に関して検査した。選択されたハイブリドーマを限界希釈によりクローニングし、再同定し、二度目のクローニングを行い、ＩＦＡにより再検査した。一度確立されると、ハイブリドーマ株は組織培養で増殖され、将来の使用のために液体Ｎ_２中で凍結された。

本発明の特異的なモノクローナル抗体のそれぞれが得られるハイブリドーマはこれらの一般的な手順に従って作られた。
実施例２
ＩＦＡによるｍＡｂ類のスクリーニング
免疫蛍光アッセイを用いて、抗体と抗原標的の間の相互作用を確かめた。９６ウェルプレートにおいて、インフルエンザウイルス（Ｈ５Ｎ２（Ａ／ニワトリ／シンガポール／９８）またはＨ７Ｎ１（Ａ／ニワトリ／シンガポール／９４）で一夜感染させたＭＤＣＫ細胞をＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ中０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．４）ですすいだ。細胞を、あらかじめ冷却した１００％エタノール中でそれらを１０分間保温することにより固定した。細胞をＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、次いで１％ＢＳＡ、ＰＢＳ−Ｔ中で３０分間保温して抗体の非特異的な結合を遮断した。次いでそれらを９６ウェルプレートのウェル中で１００μｌのハイブリドーマ培養液と共に室温で２時間、または４ＥＣで一夜保温した。細胞をＰＢＳ−Ｔで洗浄し、１％ＢＳＡ、ＰＢＳ−Ｔ中１：１００希釈の二次抗体、蛍光標識したヤギ／ウサギ抗マウス抗体（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ，米国）と共に室温で６０分間保温した。ウェルをＰＢＳ−Ｔで洗浄した。ＰＢＳ−Ｔを除去し、ＰＢＳ中５０％グリセロールを添加した。蛍光シグナルを、顕微鏡下で紫外線を用いてチェックした。

感染していないＭＤＣＫ細胞を、陰性対照として用いた。不活化したＨ５Ｎ１ウイルスで免疫したマウスからの血清を陽性抗体対照として用いた。それぞれのハイブリドーマの上清と共に保温したＭＤＣＫ細胞を対照と比較することにより、陽性の染色結果を与えるハイブリドーマの上清を、限界希釈によるクローニングのために選択した。安定したｍＡｂ産生ハイブリドーマをこの手順により得た。

ｍＡｂ５Ａ５、５Ｃ５、２Ｄ９、４Ｆ８、１Ｃ１、２Ｆ１１および３Ｂ６と名づけられた抗体は、全ての２５種類のインドネシアからの分離株からのＨ５Ｎ１ヘマグルチニンに、さらにＨ５Ｎ１／ＰＲ８およびＨ５Ｎ２に結合することが分かった。ｍＡｂ３Ｈ１１は、２５種類のインドネシアの分離株のほぼ全てからのヘマグルチニンに結合するが、Ｈ５Ｎ１／ＰＲ８およびＨ５Ｎ２には結合しない。ｍＡｂ類６Ｃ６、３Ｄ４および８Ｈ１２はインドネシアからのＨ５Ｎ１分離株の全て、さらにＨ５Ｎ１／ＰＲ８およびＨ７Ｎ１からのノイラミニダーゼに結合することが分かった。ｍＡｂ９Ｃ１は、Ｈ５Ｎ１の特定のインドネシア株に結合することが示されている；この抗体は特定の株の回避変異体から生じたため、それはＨ５の２０５番目のアミノ酸がリシンではないＡＩＶクレード１の株に特異的に結合する。９Ｃ１ｍＡｂのこの独特の特性は、療法的使用においてウイルスの回避の心配無しにそれを他の２０５−リシン特異的ｍＡｂ類と組み合わせることを可能にする。

この発明のｍＡｂ類と反応するＡＩＶ株を、下記の表１にリストする。
代表的なＩＦＡ画像を図１に示す。
表１．

注釈：”＋”は陽性を意味し、”−”は陰性を示し、”Ｎ．Ｔ．”は検査が行われなかったことを意味する。
実施例３
Ｈ５およびＮ１亜型ｍＡｂ類の特性づけ
ｍＡｂ類のアイソタイプ同定。ｍｏｕｓｅｍＡｂｉｓｏｔｙｐｉｎｇｋｉｔ（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，イギリス）を用いて、キットと一緒に与えられたプロトコルに従ってアイソタイプ同定を実施した（データは示していない）。ｍＡｂ類５Ａ５、６Ｃ６、２Ｄ９、４Ｆ８、１Ｃ１、３Ｂ６、３Ｄ４、８Ｈ１２、９Ｃ１および３Ｈ１１は全てＩｇＧ１であると決定された。ｍＡｂ５Ｃ５はＩｇＧ２ａであると決定され、ｍＡｂ２Ｆ１１はＩｇＭであると決定された。

血球凝集阻害試験（ＨＩ）。一定量の血球凝集（ＨＡ）抗原を微量定量プレート（ＮＵＮＣ）中のそれぞれのウェルに添加した。次いで検査する抗体を１番目のウェル中に入れ、系列希釈した。プレートを１時間保温し、次いでニワトリの赤血球（ＲＢＣ）をそれぞれのウェルに添加した。もし抗体が検査血清中に存在したならば、ＲＢＣはＨＡ抗原と共に凝集しなかったであろう。ＨＩ陰性のウェルは、ウェルの底を覆う凝集したＲＢＣの広がったシートを有したであろう。ＨＩ陽性のウェルは、凝集していないＲＢＣの十分に境界を定められたボタン（ｗｅｌｌ−ｃｉｒｃｕｍｓｃｒｉｂｅｄｂｕｔｔｏｎ）を有したであろう。

培養液中のｍＡｂ類５Ｃ５、２Ｄ９、２Ｆ１１および４Ｆ８は全てのインドネシアのＨ５Ｎ１分離株について、およびＨ５Ｎ１／ＰＲ８について、１６から６４までのＨＩ活性を有していた。ｍＡｂ類９Ｃ１および３Ｈ１１はこれらのインドネシアのＨ５Ｎ１分離株のいくつかについてＨＩ活性を有していた。ｍＡｂ３Ｈ１１により標的とされる抗原エピトープに基づいて、その抗体は特異的かつ高感度にクレード２．１．３のＨ株を認識することができる。ｍＡｂ類５Ａ５、１Ｃ１および３Ｂ６はＨＩ活性を有していなかった。

ウイルスマイクロ中和アッセイ。ＭＤＣＫ細胞を、５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）の決定に用いた。２倍系列希釈した抗体を９６ウェル細胞培養プレートに入れた。希釈した抗体を、インフルエンザウイルスを１００ＴＣＩＳ_５０／ウェルで含む等体積の希釈液と混合した。５％ＣＯ_２の湿気のある雰囲気中で３７ＥＣにおいて２時間保温した後、１．５×１０^５/ｍｌのＭＤＣＫ細胞１００μｌをそれぞれのウェルに添加した。プレートを３７ＥＣおよび５％ＣＯ_２において１８時間保温した。単層をＰＢＳで洗浄し、１００％エタノール中で１０分間固定した。ウイルスタンパク質の存在を、インフルエンザＨ５Ｎ１に対するマウス血清を用いるＥＬＩＳＡにより検出した。

ＥＬＩＳＡを室温で実施した。固定されたプレートをＰＢＳ−Ｔ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で３回洗浄した。１％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ−Ｔ中で１／５００希釈したマウス血清抗体をそれぞれのウェルに添加し、室温で１時間保温した。プレートを洗浄緩衝液中で４回洗浄し、１／２０００希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウス免疫グロブリン（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ，米国）１００μｌをそれぞれのウェルに添加した。プレートを室温で１時間保温し、次いで洗浄緩衝液で６回洗浄した。１００μｌの新しく調製した基質（０．０３％過ホウ酸ナトリウムを含むｐＨ５．０の０．０５Ｍリン酸クエン酸緩衝液２０ｍｌにつき１０ｍｇのｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩）をそれぞれのウェルに添加し、プレートを室温でおおよそ５分間保温した。反応を５０μｌの２Ｎ硫酸で停止した。吸光度を４９０ｎｍにおいて（Ａ_４９０）、自動化されたプレート分光光度計（ＭｉｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）を用いて測定した。

表２

表２に示したように、ｍＡｂ５Ｃ５は感染したＭＤＣＫ細胞上でＨ５Ｎ１分離株を中和した。モノクローナル抗体の存在下で、ＥＬＩＳＡの読みの結果は、抗体の非存在下の細胞から得られたそれらの約２分の１まで減少しており、これはウイルス粒子が中和されていたことを示している。

ＥＬＩＳＡの読みが高いバックグラウンドを有していた一方でＩＦＡは視認できるので、モノクローナル抗体の中和能力を確証するため、ＩＦＡの検出法によりＭＤＣＫ細胞上で中和試験を行った。ｍＡｂ５Ｃ５は全てのＨ５Ｎ１分離株の感染を中和することができた。これらの結果はＩＦＡの試験結果と一致していた。

図２Ａおよび２Ｂは、ＡＩＶに感染したＭＤＣＫ細胞上でのｍＡｂの中和活性を図説している。図２Ａおよび２Ｂはそれぞれ、ｍＡＢのウイルス感染の中和の後に、およびｍＡｂの中和無しで、ＦＩＴＣ蛍光で染色したＭＤＣＫ細胞を示している。

ＭＤＣＫ細胞上での、およびニワトリ胚中でのウイルス中和の力価測定（Ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）。ＭＤＣＫ細胞および１０日齢の胚を、それぞれ５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ_５０）および５０％胚感染量（ＥＩＤ_５０）の測定のために用いた。ＭＤＣＫ細胞（２ｘ１０^４／ｍｌ）を、７０％〜９０％コンフルエンスまで増殖させた。

ニワトリ胚を、１０^−１から１０^−８までの一連の希釈比を用いて、それぞれのウイルスに感染させ、その後の尿膜腔液を、ＴＣＩＤ_５０およびＥＩＤ_５０に関して検査した。次いでそのウイルスを、それらの対数期（ウイルス感染に最も感受性が高い）にあるＭＤＣＫ細胞および１０日齢のニワトリ胚の両方に感染させるのに用いた。感染していないＭＤＣＫ細胞および尿膜腔液を陰性対照として用いた。細胞を３５ＥＣで培養し、ＣＰＥを観察した。ＲｅｅｄおよびＭｕｅｎｃｈの数学的技法（１７）を用いて、感染価をＴＣＩＤ_５０／１００μｌおよび１０００ＥＩＤ_５０／２００μｌとして表し、それぞれのウイルスを、それぞれ５０μｌおよび１００μｌ中に１００ＴＣＩＤ_５０および５００ＥＩＤ_５０を有するようにそれぞれ希釈した。

系列希釈したｍＡｂ５Ｃ５は、感染したＭＤＣＫ細胞および胚中で終濃度１００ＴＣＩＤ_５０および５００ＥＩＤ_５０のウイルス（例えばＡ／インドネシア／ＤＣＤ６６９／Ｈ５Ｎ１）を中和することができた。表３参照。表３における数は、感染したＭＤＣＫ細胞およびニワトリ胚中でウイルスの終濃度１００ＴＣＩＤ_５０および５００ＥＩＤ_５０において、ｍＡｂがウイルスをなお検出および中和することができた最も高いＨ５Ｎ１ウイルスの希釈率を表している。

表３

ｍＡｂ類２Ｄ９、３Ｈ１１、９Ｃ１、２Ｆ１１および４Ｆ８はｍＡｂ５Ｃ５に類似しており、Ｈ５の三次元エピトープを認識し、ＭＤＣＫ細胞上でインフルエンザウイルス感染を中和する能力を有している。ウイルスの中和および５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）の決定を、上記でｍＡｂ５Ｃ５に関して記述したように実施した。ＭＤＣＫ細胞（２ｘ１０４／ｍｌ）を７０％〜９０％コンフルエンスまで増殖させた。次いでウイルスＡ／インドネシア／ＣＤＣ６６９／Ｈ５Ｎ１を用いてそれらの対数期（ウイルス感染に最も感受性が高い）にあるＭＤＣＫ細胞を感染させた。感染していないＭＤＣＫ細胞を、細胞変性作用（ＣＰＥ）の陰性対照として、感染させた細胞をＣＰＥの陽性対照として用いた。細胞を３５度Ｃで培養し、ＣＰＥを毎日チェックした。結果を図７Ａ、７Ｂおよび７Ｃに示す。モノクローナル抗体の存在下ではＭＤＣＫ細胞はＣＰＥを示さず、従ってこれはそのｍＡｂが中和能力を有することを示している。

ｍＡｂ類１Ｃ１および３Ｂ６は、それらもＨ５の三次元エピトープを認識するが、類似の分析により、ＭＤＣＫ細胞上でインフルエンザウイルス感染を中和する能力を欠いていることが示された。

エピトープの特徴およびマッピング。
１ａ．ｍＡｂ５Ａ５の線状エピトープのマッピング。図４Ａおよび４Ｂに示したように、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）およびウェスタンブロッティングを用いてモノクローナル抗体５Ａ５の線上エピトープを同定し、位置測定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティングは、Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．により記述された（１８）ように実施した。ＧＳＴタグを有する、Ｈ５Ｎ１からの組み換えＨＡ１を発現させ、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで処理した。組み換えＨＡ１は約３２ｋＤであり、発現したＧＳＴタグを有するＨＡ１は約５７ｋＤである。タンパク質試料を試料緩衝液と混合することによりタンパク質試料を調製し、１００ＥＣで５分間加熱した。短時間の遠心分離の後、全細胞溶解産物をロードした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離されたタンパク質を、クマシーブルー（０．２５％クーマシーブリリアントブルーＲ−２５０、４０％メタノールおよび１０％氷酢酸）での３０分間の染色により可視化し、次いで脱染溶液（４０％メタノールおよび１０％氷酢酸）中で一夜脱染した。ウェスタンブロットのため、ＴｒａｎｓｂｌｏｔＣｅｌｌ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いてタンパク質をゲルからニトロセルロース膜に転写した。電気転写（ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｅｒ）の後、膜をＰＢＳ−Ｔ中５％脱脂乳（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）でブロッキングし、上記のドットブロットと同じ方式で処理した。膜を、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−ｔ）中５％脱脂乳（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，カナダ）で６０分間ブロッキングした。ブロッキングの後、希釈していないｍＡｂ類を含むハイブリドーマ培養液を膜と一緒に６０分間保温し、ＰＢＳ−Ｔで洗浄し、次いでヤギ抗マウスホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲート抗体（１：２０００希釈）（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）と一緒に６０分間保温した。膜を洗浄し、次いでＥＣＬＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇｄｅｔｅｃｔｉｏｎｒｅａｇｅｎｔ（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて現像し、ＫＯＤＡＫＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃｉｍａｇｉｎｇｆｉｌｍ（ＫＯＤＡＫＢｉｏＭＡＸ米国ミシシッピ州）に感光させた。

ｍＡｂ５Ａ５は変性した組み換えＨＡ１と反応し、それはｍＡｂ５Ａ５のエピトープが線状であることを示唆していた。ｍＡｂ５Ｃ５は変性した組み換えＨＡ１と反応することができず、それはこのｍＡｂのエピトープが三次元であることを示していた。

ｍＡｂ５Ａ５の線状エピトープの位置を見つけるため、Ｈ５亜型のＨＡ１をＰＣＲにより３種類の重なり合う断片に切り分け、６−ヒスチジンタグ融合タンパク質として発現させた。ｍＡｂ５Ａ５を用いたウェスタンブロットにより、そのエピトープは主に断片ＢおよびＣの重なり合う領域（ａａ２０１〜２７１）中に見出された。ウェスタンブロッティングによるさらなるマッピングのために５種類の切り詰めた断片を設計し（図４Ａ）、エピトープをアミノ酸２５８〜２７１に狭めた。線状エピトープの正確なアミノ酸配列を見出すため、別個のアミノ酸点変異を有する９種類の変異体を構築した。ＨＡ１上のアミノ酸２５９〜２６４および２６８〜２７１のそれぞれを、アミノ酸２６９を除いて、特定のプライマーにより、個別にアラニンに変えた；アミノ酸２６９はアラニンからプロリンに変えた（図４Ｂ）。図４Ｂに示したウェスタンブロッティングの結果から、ｍＡｂ５Ａ５により標的とされる線状エピトープの配列は、Ｈ５亜型のヘマグルチニン上のアミノ酸２６０〜２６９、ＡｓｎＧｌｙＡｓｎＰｈｅｌｌｅＡｌａＰｒｏＧｌｕＴｙｒＡｌａ（ＮＧＮＦＩＡＰＥＹＡ）である。

１ｂ．ｍＡｂ８Ｈ１２の線状エピトープの決定。上記の第１ａ節でｍＡｂ５Ａ５に関して述べた手順に従って、ドデシル硫酸ポリアクリルアミドナトリウムゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）およびウェスタンブロッティングを用いてｍＡｂ８Ｈ１２の線状エピトープを確かめた。Ｈ５Ｎ１からのＭＢＴタグを有する組み換えＮＡ１を発現させ、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで処理した。組み換えＮＡ１は約３６ｋＤであり、発現したＭＢＴタグを有するＮＡ１はおおよそ８２ｋＤである。ｍＡｂ８Ｈ１２は変性したＮＡ１と反応し、それはその抗体のエピトープが線状であることを示唆していた。

１ｃ．三次元エピトープ２Ｄ９、４Ｆ８、１Ｃ１、３Ｂ６、２Ｆ１１、９Ｃ１および３Ｈ１１の決定。上記の第１ａ節の手順を、ｍＡｂ類２Ｄ９、４Ｆ８、３Ｂ６、１Ｃ１、２Ｆ１１、９Ｃ１および３Ｈ１１のそれぞれを用いて実施した。これらの抗体で変性したＨＡ１と反応したものは無く、それはこれらのｍＡｂ類のエピトープが三次元であることを示していた。

１ｄ．ｍＡｂ６Ｃ６および３Ｄ４の三次元エピトープの決定。上記の第１ｂ節の手順を、ｍＡｂ６Ｃ６および３Ｄ４を用いて実施した。どちらの抗体も変性したＮＡ１とは反応せず、それはこれら２種類の抗体のエピトープが三次元であることを示していた。

２．Ｈ５亜型ｍＡｂ類の回避変異体の選択および三次元／中和エピトープのマッピング。
親ウイルスＡ／インドネシア／ＣＤＣ６６９／２００６（Ｈ５Ｎ１）の１０倍系列希釈液を等体積のｍＡｂと混合した。室温で１時間保温した後、混合物を２００μｇ／ｍｌのＴＰＣＫ処理トリプシン（Ｓｉｇｍａ）および０．００１％ＤＥＡＥ−デキストラン（Ｓｉｇｍａ）を含むＤＭＥＭ培地中のＭＤＣＫ細胞の単層の上に接種した。３５ＥＣにおいて７日間の後、ウイルス上清を集めてさらなる選択を行った。回避変異体はまた、親株を過剰量のｍＡｂと共に室温で少なくとも０．５時間保温する代わりの方法を用いて生成された。次いで混合物を１０日齢のニワトリ胚の中に接種した。３５℃において２または３日間の後、ウイルス上清を集めてさらなる選択を行った。いずれかの方法の後、回避変異体をクローニングし、ＲＮＡ抽出のために集めた。ｍＡｂによる中和に対する耐性の原因である点変異を、親ウイルスとの配列アラインメントにより決定した。変異体ウイルスがｍＡｂによる中和を逃れることを可能にするこの変異の能力を、中和アッセイおよびヘマグルチニン阻害アッセイにより確かめた。

中和ｍＡｂ５Ｃ５を用いていくつかの回避変異体を選択した。回避変異体をクローニングし、ＲＮＡ抽出のために集めた。配列によると、点変異はそれぞれＨＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋで入手可能な配列；ＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号ＣＹ０１４４８１；ＧｅｎＢａｎｋＧＩ＃１１３４９７１５５）上のヌクレオチド５２４、５０３および６０２において起きている。ヌクレオチド５２４ＡＣ＠はＡＴ，＠に変わっており、それは結果としてアミノ酸１７５におけるスレオニンからイソロイシンへの変異をもたらす。ヌクレオチド５０３”Ａ”は”Ｔ，”に変わっており、それは結果としてアミノ酸１６８におけるリシンからイソロイシンへの変異をもたらす。ヌクレオチド６０２”Ｃ”は”Ａ，”に変わっており、それは結果としてアミノ酸２０１におけるアラニンからグルタミン酸への変異をもたらす。その変異は、変異体ウイルスがｍＡｂ５Ｃ５からの抗体による中和を逃れることを可能にし、それは中和アッセイおよびヘマグルチニン阻害アッセイにより確かめられる。この結果は、ｍＡｂ５Ｃ５がヘマグルチニン上のアミノ酸１６８、１７５および２０１を含むエピトープを標的としていることを示した。結果を表４に示し、それはＡＩＶ（Ａ／インドネシア／ＣＤＣ６６９／Ｈ５Ｎ１）のヘマグルチニン分子上のｍＡｂ中和エピトープの位置を示す。

表４に示したように、他のｍＡｂ類に関する点変異を同様に決定した。
表４

ｍＡｂ類６Ｃ６、３Ｄ４および８Ｈ１はＨ５Ｎ１からのノイラミニダーゼを認識する。
１．バキュロウイルス／Ｓｆ９系において発現させた組み換えノイラミニダーゼを用いてｍＡｂ６Ｃ６およびノイラミニダーゼの間の反応を確かめた。

ウイルスのＲＮＡをウイルスに感染したＭＤＣＫ細胞から、ＬＳＴｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、製造業者により指定されるように単離した。逆転写およびＰＣＲを実施し、プライマーＮ１（エントリー）Ｆ（ＣＡＣＣＡＴＧＡＡＴＣＣＡＡＡＴＣＡＧＡＡＧＡＴＡＡＣＡＡＣＣ）およびＮ１（エントリー）Ｒ（ＣＴＴＧＴＣＡＡＴＧＧＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡ）を用いてノイラミニダーゼ遺伝子Ｈ５Ｎ１／ＰＲ８を増幅した。ＰＣＲ産物を、製造業者の（ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｒ＝ｓ）説明書に従ってｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙクローニングベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，米国ウィスコンシン州）の中にクローニングした。ノイラミニダーゼをコードする配列を含む組み換えプラスミドの配列を決定し、データベースの参照配列と一致していることを確認した。ノイラミニダーゼ遺伝子を一時的な工程としてｐＥＮＴＲ／ＴＥＶ／Ｄ−ＴＯＰＯのベクターの中にサブクローニングし、次いで供給者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，米国カリフォルニア州）からのＧａｔｅｗａｙＳｙｓｔｅｍガイドに従ってバキュロウイルスに挿入した。ノイラミニダーゼ遺伝子を有する組み換えバキュロウイルスを用いて、供給者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に教えられるようにＳｆ９昆虫細胞を形質移入し（ｔｒａｎｓｆｅｃｔ）、発現させた。上記で教えたＭＤＣＫ細胞に関するＩＦＡの手順で、発現したノイラミニダーゼを有するＳｆ９昆虫細胞を固定しｍＡｂ６Ｃ６を用いてＩＦＡを行った。

図５Ａおよび５Ｂは、ｍＡｂ６Ｃ６と発現させた組み換えＮ１の間の典型的な反応を示す。ｍＡｂ３Ｂ４と発現させた組み換えＮ１の反応は類似している。図５Ａは、Ｓｆ９細胞において検出されている発現させた組み換えＮ１を示す。図５Ｂにおいて、紫外線と通常の光の合併が個々の細胞を示した。

２．ｍＡｂ類６Ｃ６および３Ｂ４のエピトープは線状ではなく三次元である。
Ｓｆ９昆虫細胞を、ＮＡの挿入を有するバキュロウイルスにより感染させ、２８ＥＣで９６時間培養した。細胞を集め、試料緩衝液と混合し、それぞれクマシーブルーによる染色およびｍＡｂ６Ｃ６またはｍＡｂ３Ｄ４（の抗Ｈ５Ｎ１マウス血清）を用いるウェスタンブロッティングのために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードした。ウェスタンブロッティングはＳｆ９細胞における組み換えＮＡの発現を確かめた。ウェスタンブロッティングによるｍＡｂ６Ｃ６または３Ｄ４に関するシグナルバンドが無く、これはｍＡｂ類６Ｃ６および３Ｄ４のエピトープが三次元であることを示した。

図６Ａおよび６Ｂは、発現したＮＡを確かめるためのＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティングを示す。図６Ａは、ＮＡの分子量がＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で約４９ｋＤａであることを示している。図６Ｂでは、ウェスタンブロッティングが、組み換えＮＡが抗体としての抗Ｈ５Ｎ１マウス血清と反応することを示した。

予防および療法
ｍＡｂ５Ｃ５のＭＤＣＫ細胞およびニワトリ胚の両方においてＨ５Ｎ１を中和する能力ならびにそのＩｇＧ２ａイソ型に基づいて、ｍＡｂ５Ｃ５およびその抗体の可変領域を含む組み換え抗体は、予防および療法の両方に有用である。中和ＩｇＧ抗体は予防的および療法的能力の両方を有することが、マウスでの研究（１９、２０、２１）に基づいて、一般的に受け入れられている。

同様に、ｍＡｂ類２Ｄ９、２Ｆ１１、３Ｈ１１、９Ｃ１および４Ｆ８の、ＭＤＣＫ細胞上でＨ５Ｎ１を中和する能力およびそれらのＩｇＧ１またはＩｇＭイソ型を考慮すると、これらのｍＡｂ類およびそれらの抗体の可変領域を含む組み換え抗体は、予防および療法の両方に有用である。

以下の試験は、ｍＡｂ５Ｃ５の予防的および療法的特徴を説明する：
６匹のメスのＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜８週齢）のグループを動物モデルとして用いて、ｍＡｂ５Ｃ５を投与することによる、ウイルスの致死的負荷からの保護を試験した。マウスの接種および血液の採取は、バイオセーフティーキャビネット中で、電動式空気浄化呼吸装置（ｐｏｗｅｒｅｄａｉｒｐｕｒｉｆｙｉｎｇｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｓ）を着用した人員により行われた。インフルエンザに感染した動物は、バイオセーフティーレベル３（ＢＳＬ３）の動物施設の中に収容した。

モノクローナル抗体の予防薬としての（すなわちウイルス感染の前の）有効性を動物モデルにおいて評価するため、精製したｍＡｂ５Ｃ５を腹膜内に（ｉ．ｐ．）１０ｍｇ／ｋｇの用量でマウスの中に投与した。腹膜内投与の２４時間後、Ｈ５Ｎ１によるＨＩ力価の測定のためにマウスの血を抜き、次いで２０μｌ中１０ＬＤ_５０のＡ／インドネシア／ＣＤＣ６６９／Ｈ５Ｎ１で鼻腔内（ｉ．ｎ．）に負荷をかけた（ｃｈａｌｌｅｎｇｅｄ）。対照グループ（全部で６匹のマウス）は、細菌Ｃ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）に対して作られた社内のマウスモノクローナル抗体であるｍＡｂ５Ｃ４のＩｇＧ１を与えられた。マウスを１４日間毎日生存分析に関して観察した。対照グループでは、６匹のマウスの内の６匹が感染後１０日以内に死んだ。それに対し、ｍＡｂ５Ｃ５で処置したマウスは有意に保護されていた−−そのグループの６匹のマウス全てが１４日間の観察の期間が終わってもまだ生きていた。ｍＡｂ５Ｃ５を投与されたマウスからの血清は、Ａ／インドネシア／ＣＤＣ６６９／Ｈ５Ｎ１に関して６４を超えるＨＩ力価を有していた。これらのデータは、ｍＡｂ５Ｃ５のＩｇＧ２ａの投与はマウスの血液中に浸透して最終的にはマウスの体内におけるウイルスのクリアランスを促進することができることを示した。

ｍＡｂ５Ｃ５の療法的処置に関する有効性を評価するため、抗体をウイルス感染の後に投与した。致死量である２０μＬ中１０ＬＤ_５０のＡ／インドネシア／ＣＤＣ６６９／Ｈ５Ｎ１を６匹のマウスのそれぞれに投与した１日（２４時間）後、ｍＡｂ５Ｃ５を１０ｍｇ／ｋｇで腹腔内注射により投与した。対照グループ（６匹のマウス）はＣ．ジェジュニに対して作られた社内の抗体であるｍＡｂ５Ｃ４のＩｇＧ１を与えられた。対照グループでは、６匹のマウスの内の６匹が感染後１０日以内に死んだ。ｍＡｂ５Ｃ５のグループでは、１４日目において６匹のマウスの内の５匹がウイルス負荷を生き延びていた。

これらのデータは、ｍＡｂ５Ｃ５がウイルス感染の後の投与によってさえも有効であることを示し、これはその抗体が予防的および療法的な目的の両方に用いることができることを示している。

実施例４
Ｎ１亜型に対するｍＡｂ６Ｃ６およびＨ５亜型に対するｍＡｂ５Ｃ５の組み合わせを用いる、Ｈ５Ｎ１亜型ＡＩＶの同定のための抗原捕捉ＥＬＩＳＡ（ＡＣ−ＥＬＩＳＡ）
上記のように、Ｈ５Ｎ１ウイルスを含む試料は、ｍＡｂ５Ｃ５またはｍＡｂ５Ａ５を用いてＨ５亜型と、および別にｍＡｂ６Ｃ６を用いてＮ１亜型と同定することができる。試料は、前者の抗体の一方および後者の抗体の組み合わせの使用によりＨ５Ｎ１と同定することもできる。ＡＣ−ＥＬＩＳＡはＨ５Ｎ１ウイルスを検出するために設計された。ｍＡｂ５Ｃ５を、９６ウェルプレート（Ｕ９６ＭａｘｉＳｏｒｐＮＵＮＣ−ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ）中の１００μｌＰＢＳ中の、１００μｌ／ウェル中の０．５μｇ／ウェルで、４ＥＣにおいて一夜保温した。プレートをＰＢＳ−Ｔですすいだ後、コートしたプレートを１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で、室温において１時間ブロッキングした。次いでブロッキング溶液を除去し、１００μｌ中２０ＨＡ単位でＰＢＳ中で希釈した不活化したＨ５Ｎ１分離株をそれぞれのウェルに添加し、２時間保温した。

プレートを洗浄緩衝液ＰＢＳ−Ｔで４回洗浄し、１００μｌの１／５００希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼ標識ｍＡｂ６Ｃ６をそれぞれのウェルに添加した。プレートをさらに室温で１時間保温し、次いで洗浄緩衝液で６回洗浄した。１００μｌの新しく調製した基質（０．０３％過ホウ酸ナトリウムを含むｐＨ５．０の０．０５Ｍリン酸クエン酸緩衝液２０ｍｌにつき１０ｍｇのｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩）をそれぞれのウェルに添加し、プレートを室温でおおよそ５分間保温した。反応を５０μｌの２Ｎ硫酸で停止した。吸光度を４９０ｎｍにおいて（Ａ_４９０）、自動化されたプレート分光光度計（ＭｉｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）を用いて測定した。Ｈ５Ｎ１ウイルスは有意なＡ_４９０の読みを与え、一方でＨ７Ｎ１ウイルスは陰性対照と同じくらい低い読みを与えた。表５に示した結果は、ｍＡｂ５Ｃ５およびｍＡｂ６Ｃ６の組み合わせがＨ５Ｎ１ＡＩＶの同定に有用であることを示した。Ｈ５Ｎ１ＡＩＶを含む試料は、ｍＡｂ５Ｃ５およびｍＡｂ６Ｃ６を別々に用いて同定することができるが、抗体を組み合わせて用いることは、必要とされる試料の量を制限する手段を提供する。

同様に、ｍＡｂ５Ａ５およびｍＡｂ６Ｃ６の組み合わせ、またはこの発明のｍＡｂ類の他の適切な組み合わせも、Ｈ５Ｎ１ＡＩＶの同定に用いることができるであろう。
表５
Ｈ５Ｎ１を同定するための、ｍＡｂ５Ｃ５およびｍＡｂ６Ｃ６の組み合わせを用いるＡＣ−ＥＬＩＳＡの結果

実施例５
ｍＡｂ類２Ｆ１１、９Ｃ１および３Ｈ１１の活性
ｍＡｂ類２Ｆ１１、９Ｃ１および３Ｈ１１のそれぞれの結合活性を、Ｈ５Ｎ１−ＡＩＶに感染したＭＤＣＫ細胞を用いた間接的免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）、ウェスタンブロット（ＷＢ）、ヘマグルチニン阻害（ＨＩ）およびウイルス中和（ＶＮ）アッセイにおいて評価した。

アッセイの結果を下記の表６〜８に示す：
表６
Ｈ５Ｎ１ＡＩＶ（Ａ／ベトナム／１２０３／２００４／Ｈ５Ｎ１）からの回避変異体Ｋ２０５Ｍとの結合活性

表７
Ｈ５Ｎ１ＡＩＶ（Ａ／インドネシア／ＣＤＣ６６９／２２０６／Ｈ５Ｎ１）からの回避変異体Ｋ２０５Ｍとの結合活性

回避変異体Ｋ２０５Ｍは、Ｈ５Ｎ１ＡＩＶ（Ａ／ベトナム／１２０３／２００４／Ｈ５Ｎ１）から、２００７年３月２０日にアメリカ培養細胞系統保存機関にＡＴＣＣＣＲＬＰＴＡ−８２４６として寄託されたモノクローナル抗体ｍＡｂ６Ｂ８を用いたスクリーニングから生み出された。ｍＡｂ９Ｃ１および２Ｆ１１とこれらのＫ２０５変異体の特異的相互作用は、これらの２種類のｍＡｂ類の、ｍＡｂ６Ｂ８と一緒での回避変異体の発生の抑制における使用の可能性を示唆している。

実施例６
ｍＡｂ２Ｆ１１および９Ｃ１の療法的使用
２Ｆ１１および９Ｃ１は共にＨ５株Ａ／ベトナム／１２０３／２００４／Ｈ５Ｎ１のＫ２０５Ｍ回避変異体から生み出され、そのようなものとして、同じ変異体を標的とするが野生型の株に結合することができない、またはより低い活性で結合する別のモノクローナル抗体、例えばｍＡｂ６Ｂ８（ハイブリドーマ６Ｂ８により産生され、２００７年３月２０日にブタペスト条約に従ってＡＴＣＣに寄託され、受け入れ番号はＣＲＬＰＴＡ−８２４６である）、ＶＮ１２０３株中の野生型２０５Ｋ株を標的とするｍＡｂと、療法薬として組み合わせることができる。ｍＡｂ９Ｃ１はＫ２０５Ｍ変異体を認識するが、野生型の株ＶＮ１２０３には結合できず、それはそのｍＡｂが株ＶＮ１２０３の２０５メチオニンのエピトープを標的としていることを示している。ｍＡｂ類９Ｃ１および６Ｂ８を含むモノクローナル抗体カクテルはインビトロおよびインビボでＨ５Ｎ１の感染を効果的に抑制し、回避変異体が生じるのを妨げることができる。

表９：ｍＡｂ類６Ｂ８および９Ｃ１のＨＩ活性の比較

６Ｂ８および９Ｃ１ｍＡｂ類の活性を説明するため、１６ＨＡ単位のＡＩＶを下の表に示したようなｍＡｂ類と共に、室温で少なくとも３０分間保温した。混合物を１０日齢のニワトリ胚の中に接種した。胚のＨＡ力価および生存率を毎日評価した。結果を下の表１０に示す：
表１０

”−”はＨＡ試験における陰性またはニワトリ胚の死を示した。
”＋”はＨＡ試験における陽性またはニワトリ胚の生存を示した。
ｐ．ｉ．は感染後を示した。

参考文献

Claims

トリインフルエンザウイルスのＨ５亜型のヘマグルチニンエンベロープ糖タンパク質の三次元エピトープに特異的に結合する抗体であって、以下から成る群より選択される抗体：
（ａ）アメリカ培養細胞系統保存機関に受け入れ番号ＰＴＡ−９３９６で寄託されたハイブリドーマ２Ｄ９により産生されるモノクローナル抗体２Ｄ９；
（ｂ）アメリカ培養細胞系統保存機関に受け入れ番号ＰＴＡ−９３７４で寄託されたハイブリドーマ３Ｈ１１により産生されるモノクローナル抗体３Ｈ１１；および
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の単鎖抗体、抗体断片、キメラ抗体、またはヒト化抗体。
アメリカ培養細胞系統保存機関に受け入れ番号ＰＴＡ−９３９６で寄託されたハイブリドーマ２Ｄ９により産生されるモノクローナル抗体２Ｄ９。
アメリカ培養細胞系統保存機関に受け入れ番号ＰＴＡ−９３７４で寄託されたハイブリドーマ３Ｈ１１により産生されるモノクローナル抗体３Ｈ１１。
生物学的標本においてＨ５亜型トリインフルエンザウイルスを検出するための方法であって、標本を請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体と接触させ、抗体の結合を検出することを含む、前記方法。
標本をトリインフルエンザウイルスのＨ５亜型のエンベロープ糖タンパク質に特異的に結合する結合タンパク質と接触させることを更に含み、抗体は捕捉抗体であり、結合タンパク質は検出可能要素を含むかまたはそれにコンジュゲートした検出結合タンパク質である、請求項４に記載の方法。
抗体および結合タンパク質の少なくとも一方がモノクローナル抗体である、請求項５に記載の方法。
抗体および結合タンパク質の双方がモノクローナル抗体である、請求項５に記載の方法。
抗体が固体表面上に固定される、請求項５に記載の方法。
結合タンパク質が、放射性原子を含むか、蛍光性分子にコンジュゲートしているか、または酵素にコンジュゲートしている、請求項５に記載の方法。
生物学的標本においてＨ５亜型トリインフルエンザウイルスを検出するためのキットであって、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体を、その抗体のそのエンベロープ糖タンパク質への結合を検出するための少なくとも１種類の試薬と共に含む、前記キット。
トリインフルエンザウイルスのＨ５亜型のエンベロープ糖タンパク質に特異的に結合する結合タンパク質を更に含み、抗体は捕捉抗体であり、結合タンパク質は検出可能要素を含むかまたはそれにコンジュゲートした検出結合タンパク質である、請求項１０に記載のキット。
抗体および結合タンパク質の少なくとも一方がモノクローナル抗体である、請求項１１に記載のキット。
抗体および結合タンパク質の双方がモノクローナル抗体である、請求項１１に記載のキット。
抗体が固体表面上に固定される、請求項１１に記載のキット。
結合タンパク質が、放射性原子を含むか、蛍光性分子にコンジュゲートしているか、または酵素にコンジュゲートしている、請求項１１に記載のキット。
Ｈ５亜型トリインフルエンザウイルスに感染した対象を治療するための、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体。
Ｈ５亜型トリインフルエンザウイルスに感染した対象の治療用医薬を製造するための、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体の使用。
トリインフルエンザウイルス株Ａ／インドネシア／ＣＤＣ６６９／２００６（Ｈ５Ｎ１）の中和回避変異体であって、モノクローナル抗体３Ｈ１１により認識されるその株のＨＡ配列のエピトープ内部のアミノ酸１５５に、変異体ウイルスがその抗体で中和できなくなるような変異を含み、ここで、モノクローナル抗体３Ｈ１１は、アメリカ培養細胞系統保存機関に受け入れ番号ＰＴＡ−９３７４で寄託されたハイブリドーマ３Ｈ１１により産生される、前記変異体。
トリインフルエンザウイルス株Ａ／インドネシア／ＣＤＣ６６９／２００６（Ｈ５Ｎ１）の中和回避変異体であって、モノクローナル抗体２Ｄ９により認識されるその株のＨＡ配列のエピトープ内部のアミノ酸２３９；アミノ酸２０５および２３９；またはアミノ酸１５７および２３９に、変異体ウイルスがその抗体で中和できなくなるような少なくとも１つの変異を含み、ここで、モノクローナル抗体２Ｄ９は、アメリカ培養細胞系統保存機関に受け入れ番号ＰＴＡ−９３９６で寄託されたハイブリドーマ２Ｄ９により産生される、前記変異体。
トリインフルエンザウイルス株Ａ／ベトナム／１２０３／２００４／Ｈ５Ｎ１の中和回避変異体であって、モノクローナル抗体２Ｄ９により認識されるその株のＨＡ配列のエピトープ内部のアミノ酸２３４に、変異体ウイルスがその抗体で中和できなくなるような少なくとも１つの変異を含み、ここで、モノクローナル抗体２Ｄ９は、アメリカ培養細胞系統保存機関に受け入れ番号ＰＴＡ−９３９６で寄託されたハイブリドーマ２Ｄ９により産生される、前記変異体。