CN1104907C - 霍乱弧菌01(cvd111)和非01(cvd112和cvd112rm)血清型疫苗菌株, 其制造方法 - Google Patents

Abstract

01(CVD111)和非01(CVD112和CVD112RM)血清型的无毒力霍乱弧菌菌株，其具有被缺失的霍乱毒素核心的DNA和霍乱毒素基因座的RSI序列，并进一步具有重新被插在染色体中的编码抗汞抗性的DNA，及编码霍乱毒素B亚基的DNA或其足以赋予免疫原性的部分。制造本发明的无毒力霍乱弧菌01和非01菌株的方法，及使用这些菌株的霍乱疫苗。

Description

霍乱弧菌01(CVD111)和非01(CVD112和CVD112RM) 血清型疫苗菌株，其制造方法

本申请是1993年10月8日提交的美国专利申请08/133,438和08/133,439的部分后续申请，两者均列为本文参考文献。美国专利申请08/133,438和08/133,439是1992年8月12日提交的美国专利申请07/931,943的部分后续申请，两者1992年1月16日提交的申请人的美国专利申请07/821,872的部分后续申请，该申请又是1990年6月5日提交的申请人的美国专利07/533,315的部分后续申请，各专利申请均并入本文作为参考文献。美国专利申请07/533,315是1984年2月17日提交的申请人的美国专利申请06/581,406的部分后续申请，后者是1983年3月4日提交的美国专利申请06/472,276的部分后续申请，各申请均掺入本文作为参考。美国专利申请07/533,315也是1989年6月5日提交的并于1989年12月12日批准的申请人的美国专利申请07/363,383的部分后续申请，该申请是1986年5月27日提交的美国专利申请06/867,633的后续申请，后者又是1983年3月4日提交的美国专利申请06/472,276的后续申请，各申请均并入本文作为参考。本申请中详述的研究得到国家卫生研究院的支持和马里兰生物技术研究所医学生物技术中心的部分支持。

霍乱弧菌(V.cholerae)是一种并不穿透小肠粘膜表面的非侵染性肠道病原体。因此粘膜表面上局部Siga介导的免疫作为保护性机制卷入其中。病原性霍乱弧菌01产生并加工一种蛋白质肠毒素(也称为霍乱肠毒素，或霍乱肠菌素，或霍乱毒素)，该毒素负责诱导小肠大量分泌而导致水性腹泻这样的霍乱感染的临床后果。负责表达霍乱肠毒素的基因是ctx基因(也称为tox基因)。霍乱腹泻可能是异常严重的并导致体内水份和盐的丢失，如不及时治疗会导致脱水、酸中毒、休克及死亡。已知在霍乱弧菌染体含有ctx基因的区域中可发现称为RS1之2700碱基对序列的多拷贝(重复序列)(Mekalanos，Cell 35，253-263(1983))。

申请人也发现了由霍乱弧菌产生的被称为紧密连接毒素的第二种肠毒素Fasan等人，Vibrio cholerae Produces a Second Entero-toxin Which Affects Intestinal Tight Junctions，Proc.Natl.A-cad，Sci(USA)88，5246(1991)。

已开发的霍乱疫苗可大致分为两类；一类旨在刺激抗毒性免疫，一类倾向于诱导抗细菌免疫。用动物模型所作的实验支持抗毒素和/或抗细菌免疫的保护性作用。已表明当两种类型的免疫一同发挥作用时可具有协同效应(Holmgren，J.et al.，J.Infect.Dis.136Suppl.，S 105-S1122(1977)；Feterson.J.W.Infect.Immun.，26，594(1979)；Resnick，I.G.et al，Infect.Immun.13，375(1980)；Svennerholm，A.-M.et al.，Infect.Immun.13，735(1976)。但似乎在人体内没有这种协同作用，也就是说可通过抗毒素免疫或抗细菌免疫赋予人体以保护性免疫。

                    死细胞疫苗

1.胃肠外全细胞疫苗

近一个世纪来一直将杀死的霍乱弧菌作为胃肠外疫苗；市场仍在出售这类疫苗。Joo，I.(“Cholera Vaccines”，In Cholera.(BaruaD.and Burrows W.，eds)，Saunders，Philadelphia，pp.333-355(1974)和Feeley，J.D.等人(In Cholera and Related Diarrheas43rd Nokel Symp.，Stockholm1978(O.Oucherlong，J.Holmgren，eds.)Karyer，Basel，pp.204-210(1980)已评述了使用胃肠外全细胞疫苗的经验。这类疫苗刺激产生高滴度的血清杀弧菌抗体。当将这疫苗注射巴基斯坦人而不是瑞典人时，它们也刺激小肠抗霍乱弧菌菌体U抗原之Siga抗体增加(Svennerholm，A.-M.et al.，In-fect，Immun.30，427(1980)；Svennerholm，A.-M.et al.Scan.J.Immun.6，1345(1977))。有人认为巴基斯坦人疫苗接受者之所以发生上述反应是由于他们在抗原接触前已经被免疫致敏，而生活在非流行地区的人(如瑞曲人)则没有这种反应。在现场试验中显示胃肠外死全细胞疫苗赋予显著的抗同源霍乱弧菌血清型的保护作用，但通常时间不超过一年(Joo，I.supra；Feeley，J.C.supra；Sven-nerholm，A.-M.et al supra(1980)；Svernnerholm，A.-M.etal.supra(1977)；Mosley，W.H.et al.Bull.Wld，Hlth.Org.49，13(1973)；Philippines Cholera Committee，Bull.Wld.Hlth.Org.49，381(1973))。有证据表明，胃肠外全细胞Inaba疫苗提供良好的、短期抗Ogawa，以及抗Inaba霍乱的保护作用，而Ogawa疫苗则只对Ogawa有效。

经使用佐剂，已有可能使胃肠道外疫苗的效力在长达1年半时间里保持约70％(如参见Sarose，J.S.et al.Bull.Wld.Hlth Org.56，619(1978))。但接种加佐剂疫苗的部位常常出现不良反应(包括无菌溃疡)，以致严重到不能再常规使用这样的加佐剂疫苗。

2.口服全细胞疫苗

经口投用死的全弧菌刺激局部小肠抗弧菌抗体的出现(Freter，R.J.Infect.Dis，111，37(1972)；Freter R.et al.J.Immunol.91，724(1963)；Ganguly，R.et al.Bull.Wld.Hlth.Org.52，323(1975)。其他一些研究者证明了疫苗的实质性效力，但其中很大一部分疫苗使用者在继后用病原弧菌攻击后发生了腹泻(Cash，R.A.et al.J.Infect.Dis.130，325(1974)。

                      类毒素

借助刺激抗毒素免疫用于预防霍乱的免疫制剂包括：

1)甲醛处理的霍乱类毒素；

2)戊二醛处理的霍乱类毒素；

3)纯化的B亚单位；和

4)前霍乱原样蛋白(Procholeragenoid)(用或不用甲醛处理)。

1.甲醛处理的霍乱类毒素

体外用甲醛处理纯化的霍乱毒素以消除其毒性，产生一种在生物学活性上毒性较小，但经胃肠道外免疫动物后或刺激抗毒素抗体产生的类毒素。然而，当将这种类型的第一种类毒素作为胃肠道外疫苗投用于猴或人时，该类毒素回复部分毒性即在接种部位引起不可接受的局部不良反应(Northrup，R.S.et al.，J.Infect.Dis.125，471(1972)。已将加铝佐剂的甲醛化的霍乱类毒素经胃肠道外途径投用于包括授乳母亲在内的孟加拉人自愿者，但没有用这种疫苗进行现场试验(Merson，M.H.et al.LancetI，931(1980)。也已经胃肠道外途径试用了在甘氨酸存在下制备的甲醛化的霍乱类毒素，但没有证据显示该疫苗的效力(Ohtomo，N.，In Proceedings of the12th Joint Conference on Cholera，U.S.-Japan CooperativeMedical Science Program，Sapporo(Fukumi H.，Zinnaka Y.，eds.)pp.286-296(1976)；Noriki，H.，In Proceedings of the12th Joint Conference On Cholera U.S.-Japan CooprativeMedical Science Program，Sapporo(Fukumi H.，Zinnaka Y.，eds)pp.302-310(1976)。

2.戊二醛处理的霍乱类毒素

已经发展了大批量制备基本上没有污染菌体抗原的戊二醛处理的霍乱类毒素的方法(Reppaport，E.S.et al，Infect.Immun.14，687(1976)。希望能够用于以“纯的”方式估计单一抗毒素免疫性的作用。1974年在孟加拉人中进行了给用这种作为胃肠道外疫苗的类毒素的大范围现场试验(Curlin，G.et al.，In Proceedings of thellth Joint Coference on Cholera U.S.-Japan Cooperative Medi-cal Science Program，pp.314-329，New Orleans(1975)。该类毒素在孟加拉人接受者体内刺激了高度的循环抗毒素。霍乱的两次突然爆发，即E1 Tor Inada和其后的E1 Tor Ogawa，冲击了可能得以准确估疫苗效力的现场地区。只在一个年龄组中可证明保护作用并且只限于Inada流行期间，以致作为胃肠道外疫苗单独给用戊二醛处理的霍乱类毒素只提供小的保护作用，并且实质上低于用胃肠道外死全细胞疫苗在同一人群进行的相似现场试用效果。

已基于这样的假设研究了戊二醛处理的霍乱类毒素作为口服疫苗的应用，即根据刺激肠抗毒素抗体的产生以这种使用类毒素可能是更为有效的(Levine M.M.et al.，Trans.Roy.Soc.Trop.Med.Hyg.73，3(1979)。以每月间隔用三次2.0mg或三次8.0mg剂量的类毒素直接注入小肠腔(通过肠管)免疫两组自愿者。然注疫苗者和未免疫的对照组均参予实验性霍乱攻击研究。注疫苗组与对照组相比，在攻击研究中腹泻发作率和严重程度均没有明显降低。口服戊二醛处理的霍乱类毒素缺乏效力可能是由于作为用戊二醛类毒素化的后果，大大降低了B亚基与GM1神经节苷脂结合的能力。

3.纯化的B亚基

霍乱肠毒素由两个ctx AB操纵子编码的称为A和B的亚基组成。A亚基诱导导致液体分泌的酶促改变，而非毒性的B亚基是与肠上皮细胞上毒素受体(GM1神经节苷脂)结合的免设原性部分(Holmgren，J.，Nature 292，413(1981))。已表明，经口服或胃肠道外途径给孟加拉人使用纯化的B亚基，由于在霍乱多发地区的免疫学引发，而在自愿者肠液中刺激产生了Siga抗毒素(Svennerholm，A.-M.et al Lancet I，305(1982)。

B亚基刺激抗毒素免疫的主要优点包括它的完全安全性(没有其他类毒素的逆转为毒素的潜在可能性)，和保留其与肠细胞上的毒素受体粘着的能力。但动物研究表明，在刺激抗毒素抗体方面纯化的B亚基比天然全毒素效力小(Pierce，N.F，supra(1982))。

纯化的B亚基与例如口服死弧菌结合作组合口服疫苗以刺激抗细菌和抗毒素的抗体将会得到人们的承认。

4.前霍乱原样蛋白(Procholeragenoid)

前霍乱原样蛋白是将霍乱肠毒素于65℃加热至少5分钟时得到的大分子量类毒素(约1,000,000MW)(Finkelstein，R.A.etal.J.Immunol.107，1043(1971)。虽然只保留亲本毒素之生物学毒性活性的不到5％，但它有免疫原性。加热更长时间(如25分钟)将产生更小的生物学毒性(Germanier，R.et al.，Infect.Immun.13，1692(1976)，并且继后用甲醛处理会完全消除残留的生物学毒性。用所得到的甲醛处理前霍乱原样蛋白免疫兔后，在刺激血清抗毒素上至少有如亲本毒素一样的效力。在用10、30或100μg剂量的甲醛处理的前霍乱原样蛋白经胃肠道外免疫后，瑞典人自愿者发展了旺盛的血清抗毒素反应(Germanier，R.et al.，J.Infect.Dis.135，512(1977))。没有观察到显著的不良反应。

用为口服抗原，当以没有经甲醛处理的形式使用时，前霍乱原样蛋白有更强的免疫原性。在狗体内，未经处理的前霍乱原样蛋白可如口服疫苗一样被耐受；口服剂量(用NaHCO₃载体)高达500μg没有发生腹泻。42天内给予5次500μg剂量可在狗体内产生明显的对抗病原霍乱弧菌攻击的保护性反应。分别以50μg和200μg的剂量(加NaHCO₃)给予6个和4个成年人的两组自愿者，结果没有引起不良反应。

将会理解到，可以将前霍乱原样蛋白与例如活疫苗、死霍乱弧菌或能够刺激抗细菌免疫的其他抗原合用，从而提高由前霍乱原样蛋白诱导的抗毒素免疫。

                    组合疫苗

非活的口服霍乱疫苗的主要优点是它的安全性。由于下述原因，一种意蚊用来刺激抗细菌和抗毒素免疫的由组合抗原构成的口服疫将很可能获得成功；刺激纯抗毒素免疫的类毒素疫苗虽然可能在实验动物模型具有保护作用，但在保护人对抗霍乱中却未显示其效力。另外，虽然效力维持时间短，但口服或胃肠道外使用的刺激非抗毒素免疫的死全细胞疫苗在人体内可提供显著的抗霍乱保护作用。再者，合用刺激抗毒素和抗细菌免疫的抗原(如粗制霉乱毒素，或毒素加脂多糖)，可产生协同保护作用。

迄今已用许多组合疫苗进行了两项研究。第一项研究中，对九名摄入了戊二醛处理的霍乱类毒素(每周2mg共4周)加死E1 TorInada弧菌(每周两次10¹⁰个弧菌，共4周)的自愿者，连同六名未免疫的对照组自愿者，于一个月后用10⁶个病原E1 Tor Inada弧菌进行攻击。结果在九名接受疫苗者中只有两个发生腹泻，相对的六名对照者中有4人发生腹泻(疫苗效率为67％)，并且两名得病的接种疫苗者病情明显较轻。也许更贴切的是观察到可以只从其中两名接受疫苗者，并且相对的从所有六名对照组自愿者的粪便中直接培养出霍乱弧菌。这一事实证明免疫机制阻碍了弧菌的增殖。

在另一项研究中，给参于疫苗效力攻击研究的成年自愿者投用三剂量B亚基/死全细胞组合疫苗。于第0、14和28天给用组合疫苗。

三剂疫苗的每一剂含有0.5mg纯化的B亚基和2×10¹¹个死霍乱弧菌(5×10¹⁰个典型Inaba，5×10¹⁰典型Ogawa，和1×10¹¹个E1Tor Inaba)。

在最后一剂免疫后一个内10⁶个病原性霍乱弧菌E1 Tor Ina-da对未用这种组合疫苗免疫过的一组11名自愿者，连同7名对照组自愿者。在7名对照组自愿者中有7名，但在11名疫苗免疫自愿者中只有4名发生了腹泻(p＝0.01)。4名疫苗接种自愿者的病情显然较轻。

因此，用口服类毒素/死全细胞疫苗组合物进行的研究证明了可检测程度的效力。但保护性设苗效力只是中度的(55-65％)、并且为诱导保护作用需要多次接种。

                减毒的霍乱弧菌疫苗

两种传统的弧菌和E1 Tor临床霍乱感染在北美自愿者体内刺激了至少保持三年的高度保护性免疫(Cash，R.A.et al.，supra(1974)；Levine，M.M.et al，supra(1979)；Levine，M.M.etal.，“Volunteers studies in development of vaccines against choler-a and enterotoxigenic Escherichia coli：a review”，Acute EntericInfections in Children：New Prospects for Treatment and Pre-vention.(T.Holm，J.Holmgren，M.Merson，and R.Mollby，eds.)Elsevier，Amsterdam，pp.443-459(1981)；andLevine，M.M.etal.，J.Infect.Dis.，143，818(1981))。基于对自愿者进行的这些观察，也许对霍乱进行免疫学控制的最有希望的方法是使用减毒的非产毒素的霍乱弧菌菌株作为口服疫苗。

1.天然存在的霍乱弧菌01菌株

已在自愿者身上估计了作为潜在疫苗候选者的从印度和巴西的环境来源中分离的非产毒素霍乱弧菌01血清型菌株，但结果令人失望。它们没有群集于人的肠内，或者群集能力很小；杀弧菌抗体反应很差，并且在实验性攻击研究中没有提供保护作用(Cash，R.A.et al.，Infect.Immun.10，762(1974)；Levine M.M.et al.，J.Infect.Dis.，145，296(1982))。如经与放射活性DNA探针杂交所测知的，其中许多菌株似乎缺少毒素基因(Kapper，J.B.et al.，Infect.Immun.32，661(1981)。

2.经过诱变的减毒菌株

已用亚硝基鸟苷(NTG)诱变了典型的Inaba 569B并分离了低产毒素突变体(Finkelstien，R.A.et al，J.Infect.Dis.129，117(1974)；Holmes，R.K.et al.，J.Clin.Invest.55，551(1975)。给自愿者投用该突变菌株MB。没有出现腹泻但该菌株在肠道定居很差。攻击研究证明，某些保护性效力是经多剂免疫而提供的(Woodward，E.et al，Develop.Biol.Stand.33.108(1976)。

也已诱变了E1 Tor Ogawa 3083(Honda，J.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.76，2052(1979)。强力选择和分析数千个集落，得到了一个继续产生免疫原性B亚基而不产生可检测的A亚基或全毒素的分离物。这一个称为Texas Star-SR的分离物满足了这些标准。TexasStar-SR产生正常或增加量的B亚基但在全毒素活性或A亚基活性试验中呈阴性反应。

已在自愿者身上充分估价了Texas Star-SR(如参见LevineM.M.et al.，Acute Enteric.，supra(1981))。5名自愿者的实验组以1周间隔接受2×10⁹个细菌，15名以上自愿者以1周间隔摄入两剂各2×10个细菌。在68名接种疫苗者中有16人可见有某种程度的腹泻(24％。只有一个人总粪便体积超过了1.0升(1464ml)。一般由疫苗诱发的腹泻包含两或三次小量的、松散的粪便，总体积不到400ml。从大约一半疫苗接受者的共同预培养物中回收疫苗生物体。培养空肠液时(剂量为10⁸个或更多个疫苗生物体的接受者)，在46名疫苗接胺者中有35人的培养物为阳性(76％)。用敏感性Y-1肾上腺细胞检测法检查从共同预培养物和空肠液培养物中回收的几百个Texas Star克隆中的霍乱全毒素。

在仅有29％疫苗接种者中检测到血清抗毒素明显升高；但93％表现出血清杀弧菌抗体明显升高并且滴度基本上接近于用病原霍乱弧菌感染后出现的抗体滴度。在对自愿者进行的实验性攻击研究中，发现Texas Star-SR可提供显著的对抗EL Tor Ogawa和E1 Tor Inaba弧菌攻击的保护作用。一或两剂Texas Star-SR减毒口服疫苗可提供好的对抗E1 Tor霍乱的保护作用。

很明显，使用减毒菌株具有其固有的优点，因为这些菌株模拟感染产生的抗霍乱免疫性。但Texas Star-SR菌株也有某些缺点。首先，诱变(如用亚硝基鸟苷)导致多种不同的突变。这些突变未必都被识别。此外，不知道那些推测可能对Texas Star-SR的减毒负责的精确遗传损伤。再者，如同用亚硝基鸟导致突变的病原体一样，Texas Star-SR可能逆转成有毒性的，

3.天然存在的霍乱弧菌非01菌株

01血清型霍乱弧菌一般是流行性霍乱的致病菌。非01血清型主要是与胃肠炎及肠道外感染的散在病历有关，但以前尚未见有流行趋势。但在最近，已得到了从典型的霍乱样暴发中分离的几个霍乱弧菌菌株(Ramamurthy et al.，The Lancet，Vol.341，703-704(1993)，其内容并入本文作为参考)。对从最近这次暴发流行中分离的多数病株进行的血清学鉴定显示，它们没有与01抗备清凝集，也没有与已试验过的抗霍乱弧菌01血清型之因子A、B或C的任何一种单克隆抗体凝集。因此，已将这些弧菌鉴定为非01血清型菌株。

此外，除了如上述试验过的一个非01菌株外，日本国家卫生研究院(Japanese National Institutes of Health)所有在一次特定新的暴发中试验的其他非01菌株未能在开发霍乱弧菌非01血清型的一批138种抗原中被分型，这表明与这次新的暴发相关联的菌株属于以前未被认识的，或最近出现的，非01血清型能够引起流行性霍乱。

经DNA杂交分析，这次暴发中得到的所有菌株均与ctx-和zot-特异性探针杂交，但未与对霍乱弧菌非01菌株(NAG-ST)之热稳定性肠毒素特异的DNA探针杂交。另外，用酶联免疫吸附检测法明显地检测到了霍乱毒素的产生。已报导由这些新的分离菌株产生的肠毒素的量与霍乱弧菌01的临床菌株中产生肠毒素量相似。也已报导其中大多数菌株是对例如链霉素和furazolidone有抗性的，但对其他通常使用的抗生素包括四环素敏感。没报导对氨苄青霉素或其衍生物的抗性。

在另一次最近暴发中，虽然霍乱发病总数没有增加，但所筛选的霍乱所致腹泻病人的大多数霍乱弧菌分离物都是非01，并且如以前分离物一样，也未能用标准分型试验分型。

在另一已报导的非01相关病例中，报导了主要影响到成年人的可能地流行性暴发(Albert.et al.，The Lancet，Vol.341，704(1993)，文章的内容并入本文作为参考)。该报告中得到的直肠拭子中，经标准试验检测约有67％产生了霍乱弧菌非01，但没报导有试验为霍乱弧菌01菌株者。

已报导引起这次暴发的霍乱弧菌在生物化学和集落形态学上相似于霍乱弧菌01，但没报导凝集霍乱弧菌抗血清。已试验的霍乱弧菌菌株是与霍乱弧菌01之A因子特异性单克隆抗体无反应性的。

在该第二次最近报导的暴发中，所试验的所有非01菌株都在敏感性Y-1肾上腺细胞检测法检测为产生霍乱毒素的阳性菌株，并且报导这些毒素均可被抗霍乱毒素的兔多克隆抗体中和。还报导了使用霍乱毒素特异性引物进行聚合酶链反应分析以扩增霍乱毒素序列。另外用兔回肠袢检测法分析选择的分离并报导在逆转回肠袢结中灌注水样腹泻与由于霍乱弧菌01产生的情况相似。

据报导该第二次暴发的霍乱弧菌菌株对某些抗生素如四环素敏感，但对其他一些制菌则有抗性。这样一个结果与在该地区最近流行的菌株的敏感性相对照，其大部分离物是对四环素有抗性的。

由霍乱弧菌非01菌株的这些暴发流行，非常期望能制得对这些生物体特异的疫苗。另外，还非常期望产生对01和非01生物体均有效的，特别是适于在那些遭遇到两种霍乱弧菌血清型之强毒力菌株的地区使用的组合疫苗。

发明概要

本发明的发明人已用新的方法制得并分离了01和非01血清型霍乱弧菌之强毒株的突变株，所说的突变株适于用作在强毒霍乱弧菌菌株攻击后对抗霍乱病症的疫苗。用于制造本发明之一个突变株的起始菌株是霍乱弧菌菌株1837，其为0139亚清族的非01菌株。突变体在霍乱弧菌内毒素核心区中包含有缺失，使用新鉴定的限制性核酸内切酶造成这样的缺失、鉴定和克隆了起始菌株之ctx座位的核心区，但也可以使用本领域已知的其他适当的缺失方法。

为了诱导免疫原性，将编码霍乱毒素B亚基的序列重新导入疫苗菌株中。另外被导入突变菌株中的是编码抗重金属如汞抗性的序列，该序列允许在没有使用可能在治疗上有用的抗生素标志的情况下鉴定疫苗菌株的存在。

因此已通过使用重组DNA技术特异性地改变了本发明的霍乱弧菌非01疫苗菌株，使这些菌株无毒力同时没有影响产生免疫性所需的其他成分。

本发明的一个无毒力非01霍乱弧菌菌株是霍乱弧菌CVD112(cep^-，zot^-，ace^-，orfu^-，ctxA^-，ctxB、mer，hylA^-，attRS1^-，RS1^-)。本发明的另一个无毒力非01菌株是霍乱弧菌CVD112RM(cep^-、zot、ace^-、orfu^-、ctxA^-、ctxA^-、ctxB^-、mer、hylA^-、recA^-、at-tRS1^-、RS1^-)。

对无毒力霍乱弧菌非01 ctx位座进行性质鉴定，结果新发现所分离的菌株含有两个核心区和四个重复序列(RS1序列)。构建一质粒，其中有完全的或实质上完全的霍乱毒素核心区缺失，但在ctx座位保留霍乱弧菌染色体的延伸长度的侧翼DNA重复序列(即ctx基因元件)。将该质粒的接合基因转移到无毒力霍乱弧菌01中，然后经同源重组和第二重组过程得到只有单一核心序列和单一RS1重复元件的霍乱弧菌非01。

使用新克隆的，并且其后缺失的0139染色体DNA除去其余的核心序列和RS1元件。然后经同源重组将编码霍乱毒素B亚基和编码抗重金属抗性的序列重新导入突变体霍乱弧菌染色体中。

本发明的非01、不产毒素缺失突变体能够定居于小肠并刺激局部的抗细菌细胞保护性免疫。暂时定位后，疫苗即可保护性对抗继后强毒力产毒素霍乱弧菌非01菌株的感染。

本发明还提供制造无毒力霍乱弧菌非01菌株，由这些菌株得到的疫苗，包括组合疫苗。

已克隆了编码霍乱弧菌01血清族霍乱毒素的基因(Pearson，G.D.N.et al.，Proc.Nat.Acad.Sci.79，2976(1982)；Kaper，J.B.et al.Amer.Soc.Microbiol.Abstr.Annu.Meeting Atlanta.Geor-gia，36(1982)；Kaper，J.B.et al，Symposium on Enteric Infec-tions in Man and in Animals：Standardization of ImmunologicalProcedures，Dublin，Ireland，Abstract No.2.5(1982))。已分离了霍乱弧菌的毒素结构基因缺失突变体，但只有用诱变弧菌噬菌体感染才能够在随机位点整合到染色体中(Mekalanos，J.J.et al.，Proc.Nat.Acad.Sci.，79，151(1982)。已报导了在霍乱弧菌中的重组，但并未为疫苗接种目的将其用于分离ctx基因的缺失突变(Parker，C.et al.，J.Bact，112，701(1972)；Johnson，S.R.et al.，Molec.Gen.Genet.，170，93(1979)；Sublett，R.D.et al.，Lnfect.Immun.32.1132(1981)和Thomson，J.A.et al.，J.Bact.148，374(1981))。

本文描述了经突变而缺失了一段染色体DNA区域而赋予无毒力并保留定居于宿主动物之肠道中的能力，同时仍提供免疫原性的0139血清型的无毒力霍乱弧菌菌株。缺失的DNA片段包含所有的，或基本上所有与霍乱毒素核心区。一个分离的缺失突变体包括所有与ctx座位相关联的元件，并因此而没有核心或重复序列(RS1)元件。将编码霍乱毒素B亚基的序列和编码抗重金属抗性的序列重新导入该缺失突变体。还描述了另一个recA基因的突变体。灭活该菌株中的recA基因产物的除去该疫苗菌株中潜在的同源重组机制。

描述了缺失非01霍乱弧菌之霍乱毒素核心和RS1序列的第一个无毒力非01霍乱弧菌缺失突变体，该霍乱弧菌的制造方法包括以下步骤：

(a)将霍乱弧菌霍乱毒素核心区和促成可检测体内重组之足够长度的侧冀序列的与编码抗选择试剂的第一个选择标记基因连接在一起，构建成第一质粒，其中所说的第一质粒在霍乱弧菌中不能进行染色体外复制；

(b)使非01血清型的强毒力霍乱弧菌菌株与携带第一个质粒的第一微生物接合；

(c)选择并分离表达第一可选择标志的霍乱弧菌；

(d)在没有所说的选择试剂条件下培养步骤(c)中分离的霍乱弧菌；

(e)筛选步骤(d)中不表达第一选择标记的霍乱弧菌；

(f)将侧接霍乱毒素座位，缺失了霍乱毒素核心和RS1序列之霍乱弧菌非01染色体序列与编码抗第二种选择试剂的第二个外源选择标记基因连接在一起，构建成第二质粒；

(g)使步骤(e)的选择的产物与携带所说的第二种质粒的第二微生物接合；并

(h)选择表达第二个可选择标志的霍乱弧菌；

(g)在没有第二种选择试剂的条件下培养步骤(g)的选择的产物；

(h)筛选步骤(g)不表达第二选择标记的霍乱弧菌；以及

(i)分离步骤(h)的经筛选的产物。

本发明第一种方法的产物是缺失了与ctx座位相关联之所有霍乱毒素核心序列及RS1元件的非01霍乱弧菌。

还描述了根据本发明的第二个无毒力的非01霍乱弧菌，该菌株缺失了霍乱毒素核心和RS1序列，但表达是以提供免疫原性的重新被插入的霍乱毒素B亚基序列或其部分，以及编码赋予抗重金属抗性之产物的序列，同时描述制造该第二个非01疫苗菌株的方法。本发明的该第二种方法包括以下步骤：

(a)提供包含连接到编码赋予抗选择试剂抗性之外源可选择标志基因上的，霍乱弧菌霍乱毒素核心区及为促成可检测体内重组而有足够长度的侧翼序列的DNA的第一种质粒，其中所说的质粒不能在霍乱弧菌中进行染色体外复制；

(b)使非01血清型霍乱弧菌的强毒力菌株与携带第一质粒的第一微生物接合；

(c)选择并分离表达第二可选择标志的霍乱弧菌；

(d)在没有所说的选择试剂条件下培养步骤(c)中分离的霍乱弧菌；

(e)筛选步骤(d)不表达第一种选择标记的霍乱弧菌；

(f)提供包含连接到赋予抗第二种选择试剂之第种外源可选择标志上的，侧翼缺失了霍乱毒素核心和RS1序列之霍乱毒素座位的霍乱弧菌非01染色体序列的第二个质粒；

(g)使步骤(e)的经筛选的产物与携带所说第二个质粒的第二微生物接合；

(h)选择表达第二个可选择标志的霍乱弧菌；

(g)在没有第二种选择试剂的条件下培养步骤(h)的经过选择的产物；

(i)分离步骤(h)的经过筛选的产物；

(j)提供包含侧接有足可赋予免疫原性之霍乱毒素B亚基序列，编码赋予抗重金属抗性之产物的序列，并连接到第二个外源可选择标志上的长度足以促成检测体内重组之霍乱弧菌染色体序列的第三质粒，其中所说的第三个质粒不能在霍乱弧菌中进行染色体外复制；

(k)使步骤(h)的经筛选的产物与携带所说第三质粒的第三微生物接合；

(l)选择表达第三个可选择标志的霍乱弧菌，以及

(m)分离步骤(l)的被选择的产物。

本发明的第二种方法得到的非01霍乱弧菌缺失了在染色体座位上的所有霍乱毒性核心和RS1序列，但表达是可赋予免疫原性的霍乱毒素B亚基的序列和赋予抗重金属抗性的序列。

还描述了本发明的第三个无毒力非01霍乱弧菌菌标，该菌株具有非01霍乱弧菌的霍乱毒素核心和RS1序列的缺失，但可表达重新插入的足以提供免疫原性的霍乱毒素B亚基的序列和编码赋予抗重金属抗性之产物的序列。本发明该第三个非01霍乱弧菌突变株还是具有另一附加缺失的重组缺陷菌株，其中recA座位的产物被失活或不存在。

本发明的该第三种方法包括以下步骤：

(a)提供包含连接到编码赋予抗选择试剂抗性之第一个外源可选择标志基因上的，霍乱弧菌霍乱毒素核心区及有足可促成检测体内重组之长度的侧接序列的第一质粒，其中所说的第一质粒不能在霍乱弧菌中进行染色体外表达；

(b)使非01血清型霍乱弧菌的强毒力菌株与携带第一质粒的第一微生物接合；

(c)选择和分离表达第一个可选择标志的霍乱弧菌；

(d)在没有所说的选择试剂的条件下培养步骤(c)中分离的霍乱弧菌；

(e)筛选步骤(d)不表达第一种选择标记的霍乱弧菌；

(f)提供包含侧接霍乱毒素座位之霍乱弧菌非01染色体序列的第二质粒，所说序列缺失了霍乱毒素核心和RS1序列的DNA，并连接到赋予抗第二种选择试剂抗性的外源第二个可选择标志上；

(g)使步骤(e)的经筛选的产物与携带所说第二质粒的第二微生物接合；并

(h)选择表达第二个可选择标志的霍乱弧菌；

(g)在没有第二种选择试剂的条件下培养步骤(h)的经选择的产物；

(h)筛选步骤(g)没有表达第二种选择标记的霍乱弧菌；

(i)分离步骤(h)的经筛选的产物；

(j)提供包含侧接足可提供免疫原性之霍乱毒素B亚基序列，和编码赋予抗重金属抗性之产物的序列，并连接到第三个外源可选择标志上的有足够长度以促使可检测体的重组之霍乱染色体序列的第三质粒，其中所说的第三质粒不能在霍乱弧菌中进行染色体外复制；

(k)使步骤(h)的经筛选的产物与携带所说的第三质粒的第三微生物接合；

(l)选择表达第三个可选择标志的霍乱弧菌；

(m)分离步骤(l)的经选择的产物；

(n)提供含有连接到第四个可选择标志上的，侧接被删除以失活recA基因产物之recA基因序列的有足够长度以促成在霍乱弧菌recA座位上可检测之重组的侧接序列的第四质粒，其中所说的第四质粒不能在霍乱弧菌中进行染色体外复制；

(n)使步骤(m)的分离的产物与携带所说第四质粒的第四微生物接合；

(o)选择表达第四个可选择标志的霍乱弧菌，以及

(p)分离步骤(o)的选择的产物。

本发明的霍乱弧菌缺失突变体可用于疫苗接种以免于在对非01霍乱弧菌反应中产生霍乱病症，以及用于生产霍乱疫苗的方法中。

本发明的一个称为CVD112的霍乱弧菌菌株为人体提供在继后接触相似的非01血清型之后防止出现霍乱病症的实质性保护作用。本发明的由第三培养指定的，称为CVD112RM的其他霍乱弧菌菌株可为人体提供当由相似的非01血清型的菌株攻击时对抗霍乱病症的实质性保护作用，并且也不能发生recA介导的同源重组。公开的另一个霍乱弧菌菌株称为CVD111。霍乱弧菌CVD111菌株含有足可提供免疫原性的霍乱毒素B亚基的序列，以及有用的汞抗性可选择标志。

附图的简要描述

图1：霍乱弧菌N16961(PJBK55)(Ap^r)。

图2：交换和结合基因转移以构建霍乱弧菌JB59的方法。

图3：霍乱弧菌JBK56。

图4：构建JBK21的方案。

图5：构建pJBK54的方案。

图6：构建霍乱弧菌JBK56的方案。

图7：经交换和消除ctx基因进行体内重组。

图8：构建pJBK51的方案。

图9：构建pCVD14和pCVD15的方案。

图10：构建pJBK108的方案。

图11：构建pJBK107的方案。

图12：XbaI和ClaI位点的DNA序列(上方序列)，其决定O-gawa 395中被删除之A亚基XbaI-ClaI 550bp片段的末端，并在缺失该片段和插入XbaI接头后在CVD101中连接(下方序列)。

图13A和13B：霍乱弧菌培养物上清液对回流短路电流(Isc)和组织离子导电性(Gt)的影响。数值是6只动物在各时间点上的平均值；括号是一个标准误。a、霍乱弧菌395上清液对Isc(实线)和Gt(虚线)的影响。b、霍乱弧菌395(实线)、CVD101(长虚线)和395N1(点线)上清液对Gt的影响。培养基对照(短虚线)由未接种的培养基组成。

图14：定量暴露于培养物上清或培养基对照的组织中的ZO复杂性。

图15：由霍乱弧菌395上清诱导的Gt变异的可逆转性。加入霍乱弧菌的培养物上清(三角)和未接种的培养基(正方形)，并在由箭头指示的时间除去之。

图16：构建CVD109的方案。zot和ctx基因在霍乱弧菌染色体上彼此邻近并且是在含有称为RS1之2700序列的多拷贝(重复序列)的染色体区域中。在强毒力霍乱弧菌菌株E7946(E1 Tor生物型，Ogawa血清型)中RS1元件是在zot和ctx基因的两侧。zat和ctx基因由大的空心并混到标记的箭头指示。RS1序列则由细而实心的箭头表示。

图17(共2页)：紧密连接毒素之zot基因的从核苷酸1至1428的DNA序列。DNA序列上方字母表示zot基因编码之zoT蛋白质的推断的氨基酸序列。

图18：构建质粒pCVD621和质粒pCND622.2B的方案。

图19：构建CVD110的方案。

附图中限制性核酸内切酶位点的缩写字如下：

A＝AccI限制性核酸内切酶位点

B＝BglII限制性核酸内切酶位点

C＝ClaI限制性核酸内切酶位点

E＝EcoRI限制性核酸内切酶位点

H＝HindIII限制性核酸内切酶位点

P＝PstI限制性核酸内切酶位点

S＝SalI限制性核酸内切酶位点

X＝XbaI限制性核酸内切酶位点

K＝KpnI限制性核酸内切酶位点

附图中包括的其他缩写字还包括：

Ap＝氨苄青霉素抗性基因

Ap^r＝氨苄青霉素抗性表型

Ap^s＝氨苄青霉素敏感性表型

Chrom＝染色体

Cm＝氯霉素抗性基因

CT＝霍乱毒素

ctx＝霍乱毒素基因

CTA＝霍乱毒素的A亚基

ctxA＝霍乱毒素A亚基的基因

CTB＝霍乱毒素的B亚基

ctxB＝霉乱毒素B亚基的基因

hylA＝溶血素的基因

Kb＝千碱基

mer＝汞抗性的基因

P＝质粒

Su＝磺胺

Su^r＝磺胺抗性表型

Tc＝四环素

Tc^s＝四环素敏感性表型

Tp＝三甲氧苄二氨嘧啶

Zot＝紧密连接毒素的基因

ace＝霍乱毒素座位辅助蛋白质的基因

cep＝推断的，尚未证实的编码菌毛蛋白之核心的潜在编码序列

图20：显示ctx、zot和ace基因、orfu和RS1侧接序列之相对位置的基因图谱(RS1由大箭头显示)。有垂直条的两个方框相等于两个开放阅读框架，其中首先定位了ACE活性。现在认为ACE活性被定位于邻近Zot基因的开放阅读框架。并显示了该片段在克隆pCVD630中的位置。

图21：霍乱弧菌菌株CVD110和含pCVD630之CVD110菌株Using小室活性。左边的图21A显示诱导的短路电流(1SC)的改变，右边的图21B显示电势差(PD)的改变。

图22：含ACE活性的2.9kb EcoRV片段的DNA序列(在序列开始和末端处的序列GATATC是EcoRV位点)。显示典型菌株395的完整DNA序列(SEQ ID No：1)在395序列下方显示的序列是来自E1 Tor菌株E7946的这个区域的序列(SEQ ID No.：4)一其中只给出E7946的那些不同于所示的395中的碱基。如两个菌株的序列是完全相同的，则只显示395序列(在碱基236-239处的虚线显示E7946有3个不存在于395中的碱基插入(AGT))。一级DNA序列上方一行显示从395序列推断的氨基酸序列(以单字母代码表示)。翻译出两个阅读框(URF)；典型395 orfu跨越碱基1034至2218(SEQ ID No.：3)；典型395 ace跨越碱基2221至2508(SEQ ID No.：2)；E1 Tor orfu跨越碱基1037至2221(SEQ IDNo.6)；且E1 Tor ace跨越碱基2224至2511(SEQ ID No.：5)。

图23：描绘霍乱弧菌非01菌株1837之霍乱毒素染色体基因座位的排列。

图24：描绘霍乱弧菌菌株1837(第一行)、菌株1837.1(第二行)、菌株1837.2(第三行)和菌株CVD112(第四行)之霍乱毒素基因座位的排列。

图25：质粒pLC13、pLC14、pLC15和pLC16的构建图。

图26：霍乱毒素B亚基编码序列和汞抗性编码序列在hylA基因座位插入霍乱弧菌0139菌株1837.2染色体中的程序。

图27：显示在菌株CVD112 RM产生中发生于霍乱弧菌rceA基因座位上的重组过程。图28A、28B、28C和28D：对暴露于不同的霍乱弧菌菌株之培养物上清液的兔回肠组织进行的麦胚凝集素一辣根过氧化物酶(WGA-MRP)通透试验。a、培养基对照；b、霍乱弧菌395；c、霍乱弧菌395N1；d、霍乱弧菌CVD101。

图29A和29B：对暴露于霍乱弧菌培养物上清液的兔回肠组织进行的冷冻断裂研究。a、在连接链M、微绒毛间存许多交叉(箭头)的完整20。b、来自与霍乱弧菌395接触之回肠组织的受影响的ZO；由于大大增加了链交叉的发生率而简化了网状结构外观。

发明的详细描述

本发明包括霍乱弧菌菌株、其生产方法及其使用方法。本发明的霍乱弧菌菌株可用作疫苗菌株，并通过重组DNA技术使之被改变成无毒力株，但基本上没有影响诱导免疫性所需的其他成分。这种减毒过程是经用限制性核酸内切酶消化携带适当的霍乱弧菌序列的质粒，以特定地删除编码霍乱毒素的基因或其部分而完成的。将携带经删除之霍乱毒素的基因的这些质粒接合转移到强毒力宿主霍乱弧菌中，然后选择体内重组体，得到没有毒素基因或其部分的菌株.可以理解到，本发明的方法也适用于分离强毒力霍乱弧菌的其他缺失突变体、或分离具有重新导入霍乱弧菌细胞中的所有或部分这种缺失之序列的菌株。

疫苗的起始材料是产毒素霍乱弧菌01 N16961。已证明菌株N16961在典型腹泻病症和抗继后感染的强的保护性免疫中产生(Levine，M.M.et al.，Acute enteric，supra，(1981))。在内大肠杆菌热不稳定性肠毒素基因探针筛选霍乱弧菌DNA的Hind HI消化产物中，将发现为负责产生霍乱毒素的细菌染色体的区域克隆到质粒克隆载体pBR325中(Kaper et al.，Amer.Soc.，supra；Kaperet al.，Symposium，supra)。发现霍乱弧菌Hind III染色体片段含有毒素产生所必需的所有基因。然后，分析该染色体区域并绘制含毒素基因之准确部分的基因图(Kaper，J.B.et al，Lancet II，1162(1981))。使用限制酶切掉含这些基因的DNA片段并通过连接插入编码可选择标志(如抗氨苄青霉素抗性)的DNA片段。然后将氨苄青霉素抗性基因和侧翼连接的霍乱DNA克隆在pRK290的衍生物中，该质粒能够将大肠杆菌的DNA转移到霍乱弧菌中。通过接合将所得到的质粒pJBK55从大肠杆菌K-12转移到霍乱弧菌N16961中。

所得到的菌标即霍乱弧菌N16961(pJBK55)(Ap^r)在其染色体中含有带完整毒素基因的区域，并且在染色体外状态下，包含一个含此同一区域，同时毒素基因被删除且氨苄青霉素抗性基因被取代了的质粒(参见图1)。以低频率，也许是以10⁶之一至10⁸之一的频率，侧接染色体毒素基因和染色体外(质粒)氨苄青霉素抗性基因的该同一区域将发生交换或经受体内重组，从而使含有抗性基因的DNA区域取代染色体上的毒素基因(图2)。检验不能够作为容入不相容性质粒之宿主的个别细胞的突变和未突变细胞的混合物，以选择这一稀有过程(RuvKun，G.B.et al.，Nature 289，85(1981)。将质粒分成指定为A至W的几个组，各组成员不能彼此稳定地共同存在。例如，不相容性组P的质粒不能稳定地保留在如另一个P组(Inc P)质粒的同一细胞。这样，指定有抗磺胺抗性的IncP质粒如P702不能保留在有另一IncP质粒如pRK290、pJBK40或pJBK55的细胞中。因此，P702可保留在某中氨苄青霉素抗性已组合到其染色体中的菌株内，但不能保留在其中IncP质粒(如pJBK55)于染色体外进行复制的菌株内。通过使含有Inc P R702的大肠杆菌菌株(磺胺抗性的)与霍乱弧菌pJBK55(氨苄青霉素抗性的)接合并选择对氨苄青霉素和磺胺均有抗性的霍乱弧菌，即可分离出其中由P702染色体外介导磺胺抗性，并通过由氰苄青霉素抗性基因取代毒素基因而在染色体上介导了氨苄青霉素抗性的菌株(图3)。分离了这样一个称为霍乱弧菌JBK59的菌株，并当检验毒素产生时发现其为不产生毒素的。

经用抗汞抗性取代抗氨苄青霉素(一种治疗上有用的抗生素)抗性以产生疫苗菌株JBK70的最后变体。这一取代是通过将汞抗性基因直接克隆pJBK55的氨苄青霉素抗性基因中，从而失活氨苄青霉素抗性并赋予汞抗性而完成的。所得到的质粒pJBK55也是与R702不相容的，并被转入霍乱弧菌JBK56中。使用IncP质粒R702选择其中汞抗性被组合到染色体中的突变性并选择有氨苄青霉素敏感性、汞抗性和磺胺抗性的霍乱弧菌.然后选择清除了pR702的自发4衍生株。最后的突变体JBK70是不产生毒素的并且是只对汞有抗性的。

疫苗菌株霍乱弧菌JB70是一个Inaba血清型的菌株。霍乱弧菌的其他主要血清型是Ogawa血清型。期望从一个血清型制备的疫苗将能对抗其他血清型(34)。从Ogawa血清型中制备活的疫苗，并在自愿者体内产生保护作用的情况是不可能发生的。(Levine，M.M.等，Acute enteric，supra(1981)。通过由P(霍乱弧菌的性因子)介导的遗传重组，将含有取代毒素基因之氨苄青霉素抗性基因的染色体区域转入E7946中，而在菌株E7946中重新造成已在霍乱弧菌菌株InabaJBK56中产生的准确突变(Parker，C.et al，supra)。将不同于Inc P质粒的P因子转入JBK56中，然后与E7946的利福平抗性突变株接合。选择对氨苄青霉素和利福平均有抗性的突变株，分离出Ogawa血清型的并且完全缺失了毒素基因的疫苗菌株。

如果抗菌免疫所发挥的保护作用不足，可经反加产生霍乱毒素B而不是A亚基的基因以增加抗毒素成分.为此，可将B亚基基因克隆到克隆载体pMS9中。所得到的质粒pJBK51产生高水平的B亚基并被重新导入非毒性疫苗菌株霍乱弧菌JBK70中以制得不能产生A亚基的减毒疫苗菌株JBK70(pJBK51)。

本发明的疫苗菌株本身衍生于具有Inaba血清型的霍乱弧菌N16961。将会理解到，可以使用其他菌株或其他生物型和血清型取代N16961以产生在ctx基因或在沿着霍乱弧菌染色体的其他位置中有特定缺失的疫苗菌株。因为分离这种疫苗菌株的目的是模拟没有相关病理学现象的感染过程，所以按照本申请所述的方法对强毒力菌株进行定点诱变，使抗霍乱的预防性疫苗接种具有实质上的可能性。

例如，申请人已生产出另一个特征在于在ctx基因的2个拷贝中缺失大部分A亚基基因的霍乱弧菌疫苗菌株CVD101。总体上按照上文所述的例如构建JBK70的原则构建CVD101，不同的是所得到的CVD101已没有质粒清除所需的抗性基因。分离第二个和最后一个体内重组体的最后步骤包括选择抗抗生素和敏感性，例如四环素敏感性菌株，而亲代菌株已在CT的A基因位置插入了一个四环素抗性基因。可以理解到，这样的抗生素敏感性是可选择标志的另一个例子。

可用包括下述方法在内的多种方法生产疫苗菌株：将霍乱弧菌的贮存培养物继代培养在肉脑/心灌注琼脂(BHIA)中并于37℃培养过夜。用族和类型特异性抗血清试验同一性并将20至30个菌落悬浮在BHI肉肠中。用BHI悬液接种预保温的BHIA平板。保温5至6小时后，用5mlPH调到7.2+0.1的无菌生理盐水收获各平板上的微生物。在低温下将收获的微生物750g离心10分钟，重新悬浮并4倍原体积盐水中洗两次。经分光光度检测使悬浮浓度标准化并稀释到接近疫苗接种所需的微生物数目(约10⁶个，依据对自愿者所作研究的结果而异)。通过再次定量接种前和攻击之后平板上微生物的数量以确定接种物的大小。用革兰氏染色检查最终接种物，并在接种前用同源抗血清凝集之。

本发明的霍乱弧菌菌株可经口服途径投用。将2克NaHCO₃溶解于5盎司蒸馏水中。自愿者饮入4盎司NaHCO₃/水；1分钟后自愿者摄入悬浮于其余/盎司NaHCO₃/水中的霍乱弧菌。接种90分钟前如接种后自愿者的反应均为NPO。

就安全性而言，主要关注的该疫苗菌株没有回复可引起疾病的产毒性(即产生完整无损的霍乱毒素)。检验毒素的两个主要方法是(Y-1肾上腺细胞检测法Sack，D.A.et al.，Infect.Immun.，11，334(1975)和酶联免疫吸附法(ELISA)(Sack，D.A.et al.，J.Clin.Micro.，11，35(1980)。已用这两种检测法反复试验了疫苗菌株(JBK70)并发现各次都是阴性。但更为重要的是进行基因检测以确定是否存在毒素基因。可按照Southern，E.M.J.Mol.Bio.，98，503(1975)的方法，对霍乱毒素基因的DNA进行放射活性标记并用作鉴定菌株中其他霍乱毒素基因。当用这种方法试验时，本发明所述的疫苗菌株不具有能包括霍乱毒素基因的遗传材料。还已按照Baselski V.et al.，Infect Immun.，15，704(1977)所述的方法在幼鼠模型体内试验了疫苗。反复(共十次)系列传代后，未发现流体积聚(即疾病证据)。如所预计的，发现JBK70群集在幼鼠肠中。

为了避免疫苗菌株不良付作用，如腹泻和恶心、腹绞痛及其他症状，疫苗菌株可进一步包括已被删除的编码紧密连接毒素(ZOT)之DNA的第二个限制核酸内切酶片段。

霍乱弧菌的培养物包括具有被删除的第一个DNA限制性核酸内切酶片段以赋予无毒性并保留群集于宿主动物肠内的能力、以及具有被删除的编码紧密连接毒素(ZOT)之第二个DNA限制性核酸内切酶片段以减少宿主动物之残留腹泻的霍乱弧菌菌株。被删除的第一个DNA片段可编码霍乱弧菌毒素或其蛋白质如A1亚基。一个分离的缺失突变体包括如由AceI限制性核酸内切酶位点限定ctx基因的缺失，和zot基因中的缺失。另一个分离的缺失突变体包含如由XbaI和ClaI限制性核酸内切酶位点限定的ctx基因的缺失，以及如由StuI和AccI限制性核酸内切酶位点限定的Zot基因的缺失。

分离这些霍乱弧菌缺失突变体的方法包括以下步骤：

(a)构建包含一个或多个被删除之限制性核酸内切酶片段的霍乱弧菌侧接序列及连接到所说侧接序列以置换或将取代所说被删除片段的外源可检测标志基因的第一质粒，其中所说的序列有为促成可检测的体内重组所需的足够长度；

(b)使霍乱弧菌的强毒力菌株与携带第一质粒的第一微生物接合；

(c)选择表达第一个可选择标志的霍乱弧菌；

(d)使步骤(c)的选择的产物与携带连有第二个可选择标志之第二质粒的第二微生物接合，所说的第二质粒是与第一质粒不相容的；

(e)选择表达第一个可选择标志和第二个可选择标志的霍乱弧菌；

(f)构建含有一个或多个被删除之限制性核酸内切酶片段的霍乱弧菌侧接序列的第三质粒，其中所说的片段与步骤(a)中所述者同源但不同在于没有外源可选择标志；

(g)使步骤(e)的选择的产物与携带步骤(f)中所述第三质粒的第三微生物接合；并

(h)选择不再表达第一个可选择标志的霍乱弧菌。

该方法可只用于ZOT^-菌株或用于制取已删除了霍乱毒素基因之菌株的ZOT^-衍生物。

霍乱弧菌的另一个培养物包括具有编码霍乱毒素和删除了紧密连接毒素之染色体DNA区域的霍乱弧菌菌株。分离这样的霍乱弧菌缺失突变体的方法包括以下步骤：

(a)构建包含编码霍乱毒素和紧密连接毒素的霍乱弧菌序列及外源可选择标志基因的质粒，其中所说的质粒不能在霍乱弧菌中进行染色体外复制；

(b)使携带所说质粒的微生物与含有所说序列以促成可检测之体内重组的霍乱弧菌强毒力菌株接合；

(c)选择表达所说可选择标志的霍乱弧菌；

(d)在没有选择试剂条件下培养步骤(c)的选择的产物；

(e)选择不再表达选择标志并因此缺失了编码霍乱毒素和紧密连接毒素之染色体DNA区域的霍乱弧菌。步骤(b)可包括：(b)使携带所说质粒的微生物与含有插入于第二序列如RS1元件之侧接相同拷贝之间的所说序列的霍乱弧菌强毒力菌株接合，其中所说的序列有促成可检测的体内重组的足够长度。

本发明的霍乱弧菌缺失突变株适用于抗霍乱疫苗接种。

本文报导的是由霍乱弧菌加工产生的新的毒性因子，该因子通过影响细胞间紧密接合或紧密结合(ZO)的结构(离子运输的细胞旁途径)而增加小肠粘膜的通透性。霍乱弧菌产生该因子与自愿者的腹泻发生有关。通过细胞旁途径扰乱小肠的正常吸收过程，该因子可导致由ctx缺失突变株诱发的残留性腹泻，并可造成严重腹泻这一霍乱区别于其他腹泻性疾病的症状。

检查由三个霍乱弧菌菌株、即一个野生型和两个减毒的疫苗菌株诱导的肠功能的改变。典型生物型、Ogawa血清型霍乱弧菌菌株395是已在Center for Vaccine Development于自愿者体上进行了广泛定性研究的高毒力菌株。该菌株在摄入10⁶个微生物的90％以上自愿者中导致平均粪便体积为5.5升(0.3至44升范围)之腹泻的菌株(Levine，M.M.et al.，Infect.Immun，56，161-167(1988)；Levine，M.M.，Cholera and Related Diarrheas，195-203)(Karager，Basel.1980)。霍乱腹泻基本上是由于CT的A亚基对肠粘膜的酶促影响所致。由ctx编码的CTA亚基刺激腺苷酸环化酶并导致液体向肠腔内的净分泌(Gill，D.M.，Adv.Cyclic Nu-cleotide Res.，8，85＝118(1977))。霍乱弧菌疫苗菌株CVD101是395的ctx缺失突变株，其中编CT的A1肽的94％序列已被除去。令人惊奇的是，虽然CVD101不再产生活性CT，但该菌株可在摄入这一生物体的54％自愿者中引起轻度至中度腹泻(平均粪便体积为0.9升，范围为0.3至2.1升)。据申请人计算，由Mekalanos等人(Nature 306，551-557(1983))构建的第二个395衍生株即疫苗菌株395N1缺少约77％编码A1肽的序列。与CVD101相比，395N1只在21名自愿者中的1人身上诱发了很轻的腹泻(0.3升粪便)(与摄入CVD101后24名自愿者中12出现腹泻相比P＝0.002)(Hevrington，D.A.et al.，J.Exp.Med.，168，1487-1492(1982))。因为这些菌株在群集于小肠的能力上是相似的，所以申请人假想CVD101产生由395N1微弱表达或完全不表达的分泌发生因子，并且该因子是引起摄入CVD101之自愿者腹泻的原因。

使用固定于Ussing小室中的兔肠组织，以一种用于研究跨越肠组织之运输过程的传统技术研究这些菌株。将霍乱弧菌培养肠的上清加到小室内并检测电势差(PD)和短路电流(Isc)。PD是在对着组织浆膜侧的粘膜侧上测得的电压差，Isc是清除PD所需的电流量。根据这些检测结量，使用欧姆定律Isc＝PDXGt计算组织电导率(Gt)。申请人使用同一动物相匹配回肠组织中加入的未接种培养基作为阴性对照，首先研究了野生型菌株395的上清液对这些参数的影响。图13A显示所得到不同的Isc和Gt。出现阴性对照和试验样品中的Isc和PD初始峰值很可能是由于存在于培养基中的Na和营养素共同运输所致。在阴性对照中，约1小时后Isc和PD回复到基线值，并在实验的其余时间里Isc、PD和Gt保持不变。相反，暴露于菌株395上清液的组织则表现Gt值显著增加，并在保温2小时后达到最大值。在这些样品中，Isc从未回复到基线，但在40和60分钟之间记录到Isc的稳态期间。因为Isc等于PDXGt并且60分钟后观察到的PD相似于初始值(数据未示出)，所以在该时间点上395处理的组织中的Isc显著增加可能只是由于Gt的增加所致(参见图13A，时间60分钟)(12)。60分钟后，在395处理的组织中Isc随PD一起开始再次增加。此第二个峰可能反映霍乱毒素对离子流的影响，因为只是在滞后时间至少40分钟之后纯化的CT引起兔回肠组织中Isc的增加。这些数据提示有两种由霍乱弧菌395表达的因子，其可改变ussing小室中的离子运输。一个因子即霍乱毒素在加入培养物上清后的60分钟开始诱导Isc和PD增加，而第二个因子则诱导组织电导率的中度增加，此可在加入培养物上清后20分钟内观察到。

然后研究由减毒霍乱弧菌CVD101和395N1的培养物上清诱导的Gt变化。CVD101诱导了Gt的中度增加，其可以区别于用395诱导的Gt增加(图13B)。相反、395N1则未诱导Gt的中度增加；395N1处理的组织中的Gt变化相似于阴性培养基对照，并明显低于差不多保温100分钟的用395和CVD101处理的组织的检测结果。这个期间之后，暴露于395、CVD101和395N1的组织中的Gt改变是相似的。这些结果表明395N1产生较低量或较小活性形式的负责Gt的这种增加因子。

跨上皮电导性的变化反映通过细胞间隙时组织通透性的改变，因为质膜抗性是相当高的。由于ZO代表该特殊途径中的主要屏障而且Gt的变化是ZO功能的最敏感的检测手段，所以检查由霍乱弧菌395、CVD101和395N1上清液诱导的ZO的形态学改变。如果向上皮片的粘膜侧上加一低分子量电子密度标记物如麦胚凝集素一辣根过氧化物酶(WGA-HRP)，它通常不通向ZO(Alberts，B.et al.，Molecular Biology of the Cell，2nd eds.(1989)。用395、CVD101、395N1的培养物上清液或未接种的培养液对照物处理60分钟的肠组织的粘膜侧加入WGA-HRP。如图14中所示，用未接种的培养基处理的组织不能透过WGA-HRP，而395和CVD101处理的组织则显示染料进入细胞旁间隙。暴露于395N1上清液的组织未受影响，因为细胞间隙仍很紧密而足以阻止WGA-HRP通过(图14)。使用冷冻断裂电子显微镜进一步证实并扩展了这些结果，其中平行伸展于ZO上的丝条数目与跨上皮电子电导率有关。暴露于培养物上清的组织显示为未改变的ZO和改变的ZO混合物，同时降低了丝条复杂性。与ZO的长轴垂直排布的丝条似乎优先丢失，导致增加了丝条交叉的数目。暴露于各菌株上清液之ZO的复杂性可通过检测丝条交叉的密度而得到定量表达。如在图14中看到的，与用未接种的培养液或395N1的上清液处理的组织相比，用395或CFD101的培养物上清液处理的组织明显地增加了丝条的数目和ZO网状结构的复杂性。

由395和CVD101诱导的ZO形态学的改变与由这些菌株诱导的组织电导率的增加相一致。肠ZO的功能是调节细胞旁途径并限制或阻止水溶性分子通过细胞间隙反向扩散到肠腔中。这种扩散是由跨上皮运输过程造成浓度梯度驱动的。由于细胞旁途径的改变，肠粘膜通透性变大，使水、Na和Cl渗透到肠腔中而引起腹泻。由霍乱弧菌395和CVD101诱导的细胞旁途径的改变是对小肠物特异的；用兔盲肠组织代替回肠组织没有导致由395上清液诱导的Gt变化(数据未示出)。这是第一次报导能够加强完整肠组织中紧密接合的细菌因子，并且可能代表细菌性腹泻的新机制。已显示艰难梭菌(Clostridium difficile)毒素A、流感病毒和水泡性口炎(VSV)病毒可加强组织培养物单层中的紧密接合，但尚未报导完整组织中的这种活性或与腹泻间的相互关系。

因此可见，霍乱弧菌395和CVD101产生一种可以引起摄入霍乱弧菌ctx缺失突变株之自愿者腹泻的因子。由这些ctx突变株诱发的腹泻等同于由许多产肠毒素大肠杆菌菌株诱发的腹泻。这种申请人称为ZOT(紧密结合毒素)的分泌发生因子诱导与CT对离子流动的影响无关的Isc和组织电导性的早期增加。这种Gt的增加与加强紧密接合(一种在除去上清液后将很快逆转的作用)有关(图15)。这种作用的很快逆转是与CT的花时间持续作用相反的。这些结果并没有说明以前Fields等人(J.Clin.Invest.，51，796-804(1972))报导的未加解释的观察结果—他们记录了由粗制的、但未经纯化的CT制品诱导的Isc的中度增加，并可能解释Nishibuchi等人(Infect.Immun.，40，1083-1091(1983)的观察结果—他们曾报导喂饲霍乱弧菌的哺乳小鼠中早期液体积聚(FA)与延迟的CT诱导的FA无关。CT阴性霍乱弧菌在自愿者体内诱发腹泻的能力与衍生于同一亲代菌株的两个减毒菌株产生ZOT相互关联；CVD101(产生腹泻的)产生ZOT，而395N1(不产生腹泻的)产生很小或不产生ZOT活性。

霍乱弧菌的另一个培养物包括有一个被删除的编码霍乱毒素和紧密连接毒素之染色体DNA区域、并有被插入的汞抗性基因和编码霍乱弧菌毒素B亚基之DNA的霍乱弧菌菌株。还描述了分离这样的缺失突变株的方法，该方法包括以下步骤：

(a)构建包含编码霍乱毒素和紧密连接毒素之霍乱弧菌序列和外源可选择标志基因的质粒，其所说的质粒不能在霍乱弧菌中进行染色体外复制；

(b)使携带上述质粒的微生物与含有上述编码霍乱毒素和紧密连接毒素之序列的霍乱弧菌强毒力菌株接合，其中上述的编码毒素的序列被插入在有促成可检测的体内重组所需之足够长度的第二序列的侧接相同拷贝之间；

(c)选择表达上述可选择标志的霍乱弧菌；

(d)在没有选择试剂条件下培养步骤(c)的选择产物；

(e)选择不再表达选择标志，并因此而具有和一段已被删除了编码霍乱毒素的染色体DNA区域的霍乱弧菌；

(f)构建包含汞抗性基因和编码霍乱弧菌毒素B亚基的DNA及第二个外源可选择标志基因的第二质粒，该质粒不能在霍乱弧菌中进行染色体外复制，并且有足够长度以促成可检测之体内重组的序列侧翼接有上述的汞抗性基因和编码霍乱弧菌毒素B亚基的DNA；

(g)使携带上述第二质粒的微生物与步骤(e)中列述的含有可在体内检测重组所需足够长度DNA的同源序列的霍乱弧菌接合；

(h)选择表达上述的第二个可选择标志的霍乱弧菌；

(i)在没有第二种选择试剂的条件下培养步骤(h)的经选择的产物；

(j)选择不再表达第二个选择标志的霍乱弧菌；以及

(k)筛选步骤(j)中所述的霍乱弧菌，以得到有汞抗性基因和编码霍乱弧菌毒素B亚基的DNA并有一段紧密连接毒素和已被删除了编码霍乱毒素的染色体DNA霍乱弧菌。

该分离霍乱弧菌之缺失突变株的方法可用于步骤(f)中侧接包含可被破坏之基因的足够长度的序列而没有影响霍乱弧菌的定居和免疫性，其中所说的缺失突变株具有编码被删除的霍乱毒素和紧密连接毒素的染色体DNA区域，并具有被插入的汞抗性基因和编码霍乱弧菌B亚基的DNA。一个例子是溶血素基因。按照该方法构建霍乱弧菌CUD110和CVD111，其具有被删除的编码霍乱毒素A和B亚基及紧密连接毒素的染色体DNA区域，并具有被插入在溶血素基因位点的汞抗性基因及编码霍乱弧菌B亚基的DNA。有足够长度的序列的其他例子包括his基因(Hone，Microbial Patho-genesis，5，407-478(1989)和nanh基因(Vimr，J.Bacter.，170，1495-1504(1988))。

本发明还涉及菌株、疫苗和制备这些包含非01血清型霍乱弧菌之菌株及疫苗的方法。其中一个菌株CVD112缺失包括Cep、ace、zot、orfu和ctxAB在内的整个霍乱毒素核心区，以及缺失RS1元件和attRS1基因座位(Pearson et al.，Proc.Natl.Acad.Sei.(USA)，90，3750-3754，1993)及ctx染色体基因座位。另外，这些菌株具有编码之霍乱毒素B亚基的足够部分序列，以提供重新插入到弧菌染色体中的免疫原性。另外插入到染色体中的是赋予抗重金属如汞抗性的的序列。本发明的另一个称为CVD112RM的霍乱弧菌非01菌株具有上述非01菌株的鉴定特征，另外还具有霍乱弧菌recA基因座位的缺失，以致使所得到的菌株在同源重组中发生这种缺失。

实施例中使用的所有技术、反应和分离程序都是本领域熟知的。除另外指出者外，所有的酶均可从商业来源得到，如购自New Eng-land BioLabs-Beverly，Massachusetts；Collaborative Research-Waltham，Massachusetts；Miles Laboratories-Elkhart，Indiana；Boehringer Biochemicals Inc.-Indianapolis，Indiana；和Bethesda Research Laboratory-Rockville，Maryland等有代表性少数几个公司。除非特别说明者外，缓冲液和限制性酶消化的条件均按照各种酶的制造商推荐使用。使用较低浓度的酶进行部分限制性酶解，但所用酶浓度必须是根据用各批酶进行的初步实验结果预先确定的。可在Methads in Enzymology Vol.68，Ray Wu，ed.，A-cademic Press(1979)中查到其他酶反应、凝胶电泳分离及大肠杆菌转化的标准方法学。另一部标准参考文献是Maniatis，T.et al.，Molecular Cloning.Cold Spring Harbar(1982)。按照Miller，Ex-periments in Molecular Genetics，Cold Spring Harbor Laboratory(1972)中所述的一般方法培养细胞。按照Lennett，E.A.et al，eds.，Manual of Clinical Microbiology 3rd.Edition.AmericanSociety of Microbiology，Washington(1980)中所述一般方法增殖霍乱弧菌。按照Johnson，Steven R.et al.，J.Bact.，137，531(1979)；和Yokata，T.et al，J.Bact.，109，440(1972)中所述的一般方法接合大肠杆菌和霍乱弧菌。

本发明的菌株已在完成本申请之前寄存于美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，Rockville，Maryland)。已寄存的菌株是V.cholerae JBK56、V.cholerae JBK70、V.choleraeN1696、V.cholerae JVK70(pJBK51)、V.cholerae Ogawa395、CVD101、CVD109、V.cholerae E7946和E.coli：SM10 lambda pirpCVD51、V.cholerae CVD110及E.col：SY32，lambda pir(pCVD622.2B)，这些菌株的ATCC登记号分别是39，317、39，318、39，315、39，316、39，541、39，540、55，057(1990年6月4日寄存)、55，056(1990年6月4日寄存)、68，335(1990年6月5日寄存)、55，188(1991年6月3日寄存)和68，630(1991年6月3日寄存)。

                     实施例1

构建具有被插入以取代毒素基因之可选择标志基因的质粒

质粒JBK16含有包括毒素基因之染色体的4Kb PstI-Bg1II片段。毒素基因侧接AccI位点并含有一个内部AccI位位点。用AccI完全酶解JBK16并从质粒的其余部分中分离出含有毒素基因的AccI片段。用大肠杆菌(E.coli)聚合酶的Klenow片段将剩余的重叠或“粘性”AccI末端补成平头(即，将AccI酶切后余留的单链DNA制成有平端的双链DNA)。从质粒pREG153(其为pREG151的衍生质粒(Weiss，A.et al.，J.Bact.，112，549-552)经用氨苄青霉素抗性取代三甲氧苄二氨嘧啶抗性并加入cos序列改变而成的)中纯化编码氨苄青霉素抗性的基因并如上所述补平“粘性”末端。然后将此片段连接到弧菌DNA上，以使Ap抗性基因准确地处于现已被删除的，侧接同样弧菌序列之毒素基因的位置上。所得到的缺失毒素区域并包含Ap抗性基因为质粒被定名为pJBK21(图4)。

                      实施例2

加入侧翼同源序列，然后将基因接合转移到霍乱弧菌中

为了确保将pJBK21的缺失特定插入到染色体中，将大约7，000bp的附加DNA加到来自pJBK21之PstI-Bg1II片段的两末端增加侧翼同源序列的长度可增加发生同源重组的可能性。为此目的，克隆来自N16961之染色体的约18kb片段。该克隆被定名为pJBK44，其含有在每一侧接有约7kb DNA的4kb PstI-BglII tox基因片段(参见图5)。用PstI部分酶切质粒pJBK21以便只切掉一个PstI位点(另一PstI位点加在氨苄青霉素抗性基因之内)，然后用Bg7II酶切以分离缺失毒素区并含有Ap抗性区的4kb PstI-Bg1II片段。用Bg1II部分地消化含有约18kb弧菌片段的质粒pJBK44，以便只能切掉所存在的4个Bg1II位点中的一个。在此部分消化后再用PstI进行完全消化，并通过0.3％琼脂糖电泳分离所得到的片段。然后纯化并分析已分离的片段并发现其中一个含有除4kb PstI-Bg1II tox基因片段以外所有pJBK44之序列的片段(参见图5)。然后将该代表侧接DNA的片段混合连接到来自pJBK21的含氨苄青霉素抗性的PstI-Bg1II片段上。所得到的质粒pJBK54含有约17kb的弧菌染色体DNA及已将毒素基因置换得到的氨苄青霉素抗性基因。

然后将经过修饰的染色体区克隆到可以很容易地侵染霍乱弧菌内的质粒中。质粒pRK290(Ditta，G.et al，Proc.Natl，Acad.Sci.，77，7347(1980))属于P类不相容性质粒并具有一个向其中克隆pJBK54的EcoRI位点(图6)。然后使用接合质粒pRK20B使所得到的质粒pJBK55接合到霍乱弧菌N16961中，得到霍乱弧菌N16961(pJBK55)(Ap^r)。

                    实施例3

                    体内重组

在按实施例2中所述方法进行接合基因转移后，霍乱弧菌菌株N16961中的突变毒素基因现已在染色体外被切除(参见图1)。同源侧接序列以很低的频率(可能为10^-6至10^-8)进行碱基配对和交换到染色体中(参见图7)。这一罕见过程将导致质粒上缺失的毒素区取代染色体上的ctx基因。为选择这一罕见过程须利用质粒不相容性现象(Ruvkin，G.B.，supra)。质粒根据它们将一起被稳定地保留在同一细胞内的能力而分为称为A至W的不相容性类别。如果两个质粒不能一起稳定地保留在同一细胞中，则它们是不相容的并且均属于同一个不相容性类别，这可能是因为它们在该细胞中利用相同的复制机制。经选择性地使用存在于一个质粒上但不存在于其他质粒上的抗生素抗性，便有可能选择将被保留的不相容质粒。因为质粒pJBK55是由pRK290衍生的，所以属于(Inc)P类。质粒R702也属于Inc p类，并编码抗卡那霉素、四环素、磺胺和链霉素抗性，但不编码抗氨苄青霉素抗性。将pR702(Su^R)接合到N16961(pJBK55)(Ap^R)中并在含有氨苄青霉素和磺胺两者的培养基进行选择，因为pR702和pJBK55是不相容的，所以选择出那些其中氨苄青霉素已掺入到染色体中而横胺抗性仍在质粒R702上的细胞(参见图2)。所得到的菌株JBK56(图3)是氨苄青霉素抗性的，并且当在Y-1肾上腺细胞中并经Gm，ELISA方法试验时发现其为毒素阴性的。此外，当染色体DNA与含有克隆霍乱毒素(CT)基因杂变时，JBK56是阴性的，提示毒素基因已被完全删除。

经选择缺少质粒的自发清除的衍生体而除去R702上编码的抗生素抗性(其发生频率大约为2,000分之一)。

                     实施例4

             消除实施例1的可选择标志

为了除掉氨苄青霉素抗性，构建其中编码来自R100之抗汞抗性的基因(Hg^r)克隆到Ap基因之PstI位点中的pJBK55的衍生质粒，从而插入失活氨苄青霉素抗性。然后将该衍生物接合到霍乱弧菌JBK56，随后是pR702，并按上述方法选择Hg^r，Ag^s霍乱弧菌。最后的菌株霍乱弧菌JBK70是对试验的所有抗生素敏感的，对汞有抗性的，并且在表型上是毒素阴性的。没有检测到其染色体DNA与含有CT基因之DNA探针的杂交。对整个染色体进行短DNA序列测定，发现除了缺失毒素基因并插入汞抗性和失活性氨苄青霉素抗性基因外，JBK70似乎没有不同于亲本菌株N16961的其他改变。因为毒素基因不仅发生了突变而且已完全被删除，所以这样的菌株不能逆转为产毒素性的。

                     实施例5

          接合基因转移以赋予抗毒素免疫性

如果期望抗菌免疫和抗毒素免疫协同作用，可以制备JBK70的衍生体以使之只产生霍乱毒素的B亚基。为此目的，制备只产生B而缺少A基因的毒素衍生体(图8)。将含有B结构基因的pJBK16上的HpaII片段在基因两侧的Bam HI和EcoRI位点处插入噬菌体克隆载体M13mp 7中(图8)。将此现已侧接有Bam HI位点的片段克隆到含有很强的trp启动子的pMS9中。使B基因处于强启动子的转录控制之下以确保B抗原的高产生率。这一发现反映被克隆之插入段的两种可能的方向——一个正向，一个反向。使一个产生了B亚基的衍生体pJBK51接合到霍乱弧菌JBK70中，发现其可比亲代菌株N16961产生更多的B抗原，从而得到JBK70(pJBK51)。已使用包括PL启动子在内的不同启动子造成了其他只产生B亚基的突变株，可以用适当的模型估计这些启动子在体内表达差异中的重要性。

                    实施例6

JBK70异体定居于幼鼠肠而没有逆转为产毒性菌株

从其母鼠处移开哺乳小鼠(2.0-3.59体重)并禁食3至8小时。然后于第1天使用动物喂饲针经胃灌注对其中四只进行接种。接种物约为每只小鼠10⁸CFU(集落形成单位)JBK70，体积为0.05ml至0.1ml。基本上按照Baselski等人(文献同上)所述方法在BHI肉汤中制备接种物。接种物含有大约0.01％伊文氏兰染料。通过腹腔壁看到该染料在在胃内存在，表明接种物的适当释放。1天后倍加加入伊文氏兰染料，以避免抑制JBK70。

继后的接种包括小鼠到小鼠(MXM)、或者小鼠至平板至小鼠(MXPXM)，但需要使用与第1天接种所用的Baselski方法不同的方法制备接种物。

为了制备MXM接种物，在无菌保护条件下切掉从胃到肛门的肠管。将肠称重，放入玻璃匀浆管中并加入约0.5ml BHI肉汤。用Teflon研棒简单匀浆该混合物直到组织液化。用所得悬液接种约10⁸CFU至各幼鼠体内。在MEA(肉膏琼脂)平板上划线以检查其纯度。不加伊文氏兰染料。

为了制备MXPXM接种物，用无菌环将来自MEA细胞转移到BHI肉汤中。向大约1ml BHI中加入约10¹¹CFU/ml以形成浓的悬液。旋转混合物以使之均匀，每只幼鼠经口接种0.05-0.1ml(约10¹⁰CFU)。不加伊文氏兰染料。

所有接种过程中，小鼠均装在73-76°F室温下的烧杯中。将烧杯放在密闭的塑料盒中以使小鼠保持在约78℃稍高于室温的温度下。

从表I所示结果看，如通过在MEA平板上划线检查到的，肠中有足够的细胞接种下一只动物。因此霍乱弧菌JBK70移植到了幼鼠肠内。此外，因为FA比例滑有实质性增加，所以液体积聚水平也没有增加(FA比例大于或等于0.065为阳性液体积聚)。逆转为产毒性的证据已在另外的段落中指出。

                   实施例7

构建在编码A亚基的基因内有限制性片段缺失的霍乱弧菌菌株CVD101

另一个选用进行减毒的典型菌株是霍乱弧菌Ogawa 395(也称为“395”)，该菌株同N16961一样已在自愿者身上进行了广泛研究并已有实在的免疫性(Levine，M.M.，“Immunity to choleraas evaluated in volunteers”，in Cholera and Related Diarrheas：43rd Nobel Symposium，Stockholm，1978(O.Ouchterlong & J.Molmgren，eds.)Basel：S.Karger，pp.195-2-3(1980)；Levine，M.M.et al.，Acute Enteric，supr(1981))。用于395减毒的方法与用于减毒处理N16961的方法没有实质性差异(如实施例1-5所述)。

第一个步骤包括克隆395的两个毒素基因并制备其基因图。Southern印迹分析揭示了长度约16和12kb的两个Hind III片段，两者均能与克隆的霍乱毒素基因杂交。经琼脂糖凝胶电泳纯化这些片段并克隆到经碱性磷酸酶处理的Hind III消化的pBR325中(图9)。将所得到的含毒素基因的重组质粒定名为pCVD14和pCVD15。

然后用限制性核酸内切酶酶切绘制质粒pCVD14和pCVD15的酶切图谱。发现一约550bp的XbaI-ClaI片段含有除A1亚基之前10个氨基酸残基的密码子外的A1完整碱基序列。按如图10所示的涉及pCVD15一系列步骤，从pCVD14和pCVD15中体外删除该XbaI-ClaI片段。首先，用ClaI部分消化以得到其中5个ClaI位点中只有一个被切掉的线性分子群体。然后，使用DNA聚合酶进行补平以将线性分子的两末端修成平端。将XbaI接头连接到修成平端的ClaI位点上得到分子群，向其中加入XbaI酶以修整接头，并在XbaI片段上加入和连接四环素抗性基因。转化到大肠杆菌K-12中之后在四环素上选择转化株，检查许多转化体的质粒内容物。发现各种其中有一个或多个XbaI-ClaI片段被删除的缺失突变。选择一个只缺少含A1基因之550bp XbaI-ClaI片段的缺失突变体。纯化该定名为pCVD25的缺失突变体，用XbaI酶切并重新连接以删除四环素抗性基因。如在Y-1肾上腺细胞检测法中测知的，所得到克隆pCVD30是全毒素阴性的(Sack，D.A.et al.，supra(1975))，但经ELISA试验测知其为产生B亚基的阳性克隆(Sack，D.A.et al.，supra(1980))，并如使用标记的A1探针进行DNA杂交所显示的，该克隆缺少A1基因。然后将含有毒素缺失突变的pCVD30的Hind III片段克隆到pJBK85中——该质粒是pJBK108的Tc敏感性、Cm抗性衍生物。所得到的质粒被称为pJBK108。

在PJBK108的毒素缺失突变中缺少可选择标志需要改动以前用于减毒E1Tor N16961的方法。为了从395中删除A1基因，将pCVD15中的Hind III片段克隆到pJBK85中，得到pJBK88(图11)。然后将XbaI片段上的四环素抗性基因克隆到pJBK88之A1基因内的XbaI位中，得到pJBK107。再按处理霍乱弧菌pJBK59的方法将此四环素抗性基因重组到395的染色体中。使pJBK107(Tc^r，Cm^r)转化395中并导入第二个Inc P质粒，即pR751(Tp^r)。选择Tc^r、Tp^r、Cm^s菌落得到在两者染色体毒素基因拷贝中含有四环素抗性基因的霍乱弧菌JBK113。然后使包含缺失突变的pJBK108转移到霍乱弧菌JBK113中。缺失突变同源重组到染色体中将导致可根据四环素抗性丢失而测知的A1基因序列的丢失。因为重组过程是以很低的频率发生的，所以利用在四环素抗性细胞群体中富集四环素敏感性细胞的方法。该富集方法利用这样一个事实，即四环素是抑菌抗生素，而氨苄青霉素和D-环丝氨酸是杀菌剂。因此，使含有pJBK108的霍乱弧菌JBK113的培养物在含有3μg/ml四环素、50μg/ml氨苄青霉素和50μg/mlD-环丝氨酸的L-肉汤中于37℃生长3小时。3小时结束后终时大多数四环素抗性细胞被杀死，通过铺敷在L-琼脂上并复制铺敷含四环素的L-琼脂上来检测四环素敏感性细胞。经DNA杂交探查四环素敏感性菌落是否带有A1基因。一个有A1亚基的两基因拷贝缺失的四环素敏感菌株被定名为霍乱弧菌CVD101，并用ELISA方法检测B亚基的产生(Sack，supra)。发现霍乱弧菌CVD101以实质上相当于产毒亲本霍乱弧菌395的水平产生B亚基抗原。

                     实施例8

               毒素基因的DNA序列

已检测了霍乱弧菌Inaba 62746之毒素基因的完整DNA序列.并由Lockman等人(J.Biol.Chem.，258，13722(1983))报导了其部分序列。pCVD14和pCVD15的限制性核酸内切酶酶切图表明，见于菌株62746中的序列也存在于395的毒素基因中。图12中显示删除550bp XbaI-ClaI片段，但又加入XbaI接头序列后的预计的接合。霍乱毒素序列的XbaI位点跨越A1结构基因的氨基酸残基10和11(不含A1的18氨基酸前导序列)。

                   实施例9

构建有CVD101中紧密接合毒素缺失的霍乱弧菌菌株

按照实施例7中所述制备CVD101霍乱毒素缺失突变体的同样方法制备霍乱弧菌的zot缺失突变体。zot基因包含于重组质粒pBB68中。pBB68来自霍乱弧菌569B的EcoRI-PbrI染色体DNA片段组成，569B则含有zot基因和缺失550bp XbaI-ClaI片段的ctx基因。经用限制性酶StuI和AccI体外消化，从pBB68中删除575个碱基对的StuI-AccI限制性片段，经用DNA聚合酶将分子的末端补成平头(如此将除去1199碱基对zot基因的48％)。取一半样品与四环素抗性基因(外源的)连接，使之得有可选择标志。

按以前所述方法将上述体外构建的zot缺失突变体导入霍乱弧菌CVD101的染色体中以构建CVD101的ctx缺失突变体。将按上述方法得到的四环素抗性克隆到Inc P质粒pJBK85中。使该质粒(Tc^r、Cm^r)转化到CVD101中，选择Tc^r。导入第二个IncP质粒pR751(Tp^r)。选择Tc^r、Tp^r、Cm^s菌落，得到其中Tc^r基因已重组到zot基因中的霍乱弧菌菌株。

然后将合StuI-AccI缺失突变没有Tc^r基因的质粒转化到Tc^r霍乱弧菌菌株中。缺失突变体同源重组到染色体中，导致zot基因序列的丢失，此过程可根据Tc^r的丢失检测出来。选择Tc^s菌落，经使用StuI-AccI片段和为探针进行DNA杂交筛选丢失zot序列的菌株。

                   实施例10

构建编码霍乱弧菌毒素和紧密连接毒素缺失序列的CVD109-霍乱弧菌菌株

构建减毒的霍乱弧菌菌株CVD109(ATCC#55057包括将克隆的弧菌序列连同编码可选择标志的序列一起导入强毒力霍乱菌菌株的染色体中。来自重组质粒的同源序列首先体内重组到染色体中以在该位点提供可选择标志。同源侧接序列间的第二次体内重组过程导致从染色体中切掉熟练基因，并使终产物地生缺失突变。

图16图解显示CVD109的构建。zot和ctx基因在霍乱弧菌染色体上彼此相邻。称为RS1的2700碱基对DNA序列的多拷贝(重复序列)位在强毒力霍乱弧菌菌株E7946(E1 Tor生物型、Ogawa血清型)中zot和ctx基因的两侧。图16A中，由大的空心或内划虚线的箭头显示。RS1序列由较小的实心箭头显示。

重组质粒pCDV51(图16A)含有同源于染色体zot/ctx序列(在图17A中用内划虚线的箭头显示)克隆的zot/ctx序列(空心箭头)，并含有可选择标志，氨苄青霉素抗性(Ap^r)。在其中克隆了弧菌序列的质粒载体是pGP704(Miller and Mekalanos，J.Bact.，170，2575-2583(1988))。该质粒不能在霍乱弧菌进行染色体外复制，但能够在充许大肠杆菌菌株中复制。将大肠杆菌中的pCVD51与霍乱弧菌E7946接合。因为该质粒不能在霍乱弧菌中进行染色体外复制，所以选择Ap^r菌株得到那些其中完整质粒连同Ap^r标志均在zot/ctx序列的位点上同源重组到染色体中的菌株(尚不知道重组的确切位点是在zot基因还是ctx基因中)。该单一交换(不是双交换)过程称为“共整合”结构并图解显示于图17B中。

侧接zot/ctx区的RS1序列有足够的长度以提供可检测的体内重组；同源RS1元件间的分子内重组导致它们之间的所有序列的丢失。在没有氨苄青霉素的培养基中培养带有被整合之质粒的Ap^r霍乱弧菌并选择Ap敏感性(Ap^s)菌落。侧接ctx和zot基因之RS1元件的重组导致了间插zot和ctx序列连同含Ap^r之质粒载体的丢失(图16C)。

经针对zot序列的DNA杂交筛选由上述步骤得到的Ap^s霍乱弧菌菌落。DNA探针由衍生于克隆的zot基因的575碱基对StuI-AccI限制性片段组成。选择没有与该探针杂交的菌落并使用ctx基因探针进行DNA杂交以探查是否存在ctx基因。杂交结果进一步证实zot和ctx基因均已丢失。保存一个有代表性的菌株并定名为WD109。图16D显示已缺失了zot和ctx序列但保留RS1元件的一个拷贝的CVD109的染色体(图16D中所示的质粒未保留在最后的Ap^s菌株中但图中示出只是为了说明第二个交换过程的后果。因为质粒不能在霍乱弧菌中进行染色体外复制；所以该瞬时产物是自然丢失的)。

                     实施例11

构建缺失了编码霍乱弧菌毒素A和B亚基及紧密连接毒素之序列，并插入了汞抗性基因和编码霍乱弧菌毒素B亚基之DNA的霍乱弧菌菌株CVD110

直接从前已描述过的霍乱弧菌CVD109构建CVD110(ATCC#55188)。霍乱弧菌CVD109缺失霍乱毒素(CT)的A和B亚基以及编码zot的基因，并且是对汞敏感的。在体外构建含有CTB亚基基因(ctxB)和汞抗性基因的基因片段。然后将此构建体插入CVD109的染色体特别是溶血素基因中。因此，最后的疫苗菌株CVD110产生霍乱毒B亚基而不产生A亚基，其对汞有抗性并且不产片野生型HlyA蛋白质(溶血素)。

CTB构建：从实施例7中所述的质粒pCVD30中得到ctxB和ctx启动子序列。质粒pCVD30包含ctxB基因的缺失。用HinP7和HaeIII酶消pCVD30得到包含ctxB基因和ctx启动子但不含zot基因的1.4kb片段。用T4DNA聚合酶处理此处段以使其末端成为平端并将合成的KpnI接头连接到该片段上。然后将片段克隆到载体pCVD315(Galen，et al.，Advances in Research on Cholera andRelated Diarrheas Vol.7(Sack et al.，Eds.)pp.143-153(1990)中。除了存在KpnI位点外载体pCVD315对于这一目的没有特殊的意义。将所得到的含有ctxB基因的质粒称为pCVD621(图18)。

汞抗性基因：该汞抗性基因(mer)的来源是与用于霍乱弧菌JBK70的相应基因相同的。最初从pDBF(Barrineau，et al.，J.Molecular & Applied Genetics(1984)Vol.2，pp.601-619)得到含mer的4.2kb NcoI-StuI片段。用DNA聚合酶(Klenow片段)处理该片段使其末端成为平端并将合成的KpnI接头连接到该片段上。然后将片段克隆到质粒pCVD43.2(未发表的)中，该质粒是pCVD43(Kaper，et al.，Advances in Research on Cholera and Re-lated Diarrheas，Vol.6(Ohtomo.et al.，Eds.)pp.161-167(1988))的衍生物pCVD43含有克隆的霍乱弧菌溶血素基因(hlyA)但没有hlyA内部的400bp HpaI片段。因缺失400bp HpaI片段而使基因失活(Kaper，et al.，Advances，etc.Vol.6)。除了其中合成的Kp-nI接头已连接到pCVD43的单-HpaI位点中外，pCVD43.2与pCVD43完全相同。将mer基因已插入到hylA基因中的组合克隆称为pCVD43.3。

将ctxB和mer基因插入CVD109中：使用实施例10中所述的质粒载体pGP704将这些基因导入CVD109的染色体中。将来自含mer和hylA之pCVD43.3的8.1kb ClaI-BglII片段克隆到pGP704中以得到pJMK12(图18)。用KpnI部分消化pJMK12的产生其中3个KpnI位点只有1个被切掉的线性分子群体。然后将会有pCVD21 ctxB基因之(如上所述的)的1.4kb片段连接到pJMK12上以产生pCVD622.2B。图19中显示了被插入之基因的相对位置和方向。

然后经接合将大肠杆菌宿主菌株中的pCVD622.2B导入霍乱弧菌CVD109中。如实施例10中所述，pGP704不能在霍乱弧菌中进行染色体外复制，但能够在充许大肠杆菌菌株中复制。因CVD622.2B不能在霍乱弧菌中进行染色体外复制，故选择Ap^r菌落(pGP704含有编码氨苄青霉素抗性的基因)即得了其中完整pCVD622.2B质粒连同Ap^r标志均已在hylA基因的位点处同源重组到了染色体内的菌株(因为CVD109缺少这些基因故不耐重组到ctx或zot序列中)。该单一交换(非双交换)过程的产物称为“共整合”结构或“部分二倍体”(这些术语可互换使用)并示于图19B中。

侧接被整合之pCVD622.2B的同源hylA序列间可以发生第二次交换。该第二次交换自然发生并可经选择已丢失了Ap^r表型的菌株而检测到。该第二次交换过程依据重组的准确位点可以有两种可能的结果。两者可能的结果均导致pGP704质粒载体序列的丢失，并图解显示于图19C和19D中。一个结果简单地重新产生原始状态，即得到完全相同于缺少ctx、zot和mer之CVD109的菌株。第二个结果导致pGP704序列丢失但包含在hlyA序列内的ctx序列仍被保留。可使用放射标记的ctx序列作为探针进行DNA杂交很容易地区分这两种可能的结果。为了分离所需的结果，使含有被整合之pCVD622.2B的CVD109的培养物生长于没有加抗生素的L-肉汤中。将此培养物铺敷在非选择性L肉汤平板上并将所得到的菌落复制到含Ap的L琼脂平板上。然后使Aps菌落与ctx探针杂交并分离具有ctx序列的菌落。一个这样的菌落被定名为霍乱弧菌CVD110、经DNA杂交进一步证实该菌株含有ctx和mer序列并且也缺少pGP704序列以及hlyA基因内部的400bpHpaI片段。还经ELISA试验(Sack，D.A.et al.，supra(1980))证实霍乱弧菌CVD110产生霍乱毒素B亚基。

被插入之基因的DNA序列：从文献中知道被插入之ctx和mer基因的确切DNA序列。还知道在其中插入了这些基因的hlyA基因的准确位点。

                   实施例12

对ACE(辅助霍乱肠毒素)的描述

如上文描述的(实施例10)，许多E1 Tor菌株中4.3kb DNA区域上的zot和ctx基因均侧翼直接有RS1序列的拷贝。对于疫苗菌株CVD110则缺失该完整区域。除了zot和ctx基因外，还有编码第三种毒素，即ACE的DNA序列。图20中显示了该区域的酶切图。将2.9kb EcoRV片段(SEQ ID No.7)克隆到载体pCVD315(参见上文)中以得到克隆pCVD630(如图20中所示)。

然后将质粒pCVD630导入霍乱弧菌菌株CVD110中在ussing的室(详见上文所述)中研究该菌株的活性。按前述方法试验CVD110和含pCVD630之CVD110的培养物上清液。图21A显示了用含有小于10KDa之分子的上清部分和含有大于10KDa之分子的部分所进行的研究结果。在分子小于10KDa的部分中基本上未见有Ussing小室活性。在分子量大于10KDa的部分中，可见CVD110的短路电流(Isc)产生某些改变，但没有大于阴性对照PBS(磷酸盐缓冲盐水)。然而，CVD110(pCVD630)的上清液则出现Isc的显著增加。这一差异对比单用CVD110测得的结果有统计学上的差异显著性(P＜0.02)。如前所述，Isc增加可能是由于电势差(PD)或组织电导率(Gt)的增加所致。如图21B中所示，由包含于pCVD620上的基因诱导的Isc增加是由于PD增加所致。

因此，在E1 Tor菌株中侧接RS1元件的4.3kb区含有3种推测的肠毒素基因(该4.3kb区存在于经典菌株中，但只发现一侧有RS1序列)。在使用兔回肠组织进行的Ussing小室检测中，所有这三种毒素均能够增加Isc，其活性与人体的腹泻发生有关。两种毒素，即霍乱毒素和ACE通过增加PD起作用，而第三种毒素，即ZOT则通过增加组织电导性起作用。期望所有三种活性均从减毒的霍乱弧菌疫苗菌株中消除掉，以避免见于CVD101和其他减毒疫苗株的反应原性。CVD101不缺少所有三种活性，并且如图21中所示，在Ussing小室中毒素产生的改变与PBS诱导的改变差不多(即基本上没有改变)。

图22中显示包含于pCVD620中的2.9kb EcoRV片段(SEQ IDNo.：1)的DNA序列。在zot基因的直接上游有两个开放阅读框架(ORF)。紧接在zot上游的较小ORF可能是编码11KDa蛋白质的297bpORF(ACE)，紧接在297bp ORF上游的较大ORF可能是编码44KDa蛋白质的1185bp ORF(Orfu)。认为Ace活性定位于297bp开放读框内。

                   实施例13

构建霍乱弧菌CVD112——0139血清型的霍乱弧菌设苗菌株

霍乱弧菌菌株被分成多个O类型。O类1的菌株引起重症霍乱并有广泛大流行的可能性。其了O类霍乱弧菌，即所谓非01霍乱弧菌可引起疾病，但到目前尚没有引发大流行。最近报导，有千分之十的病例是非01霍乱弧菌引起的。一般认为，目前基于01类型的疫苗菌株尚未能证明可有效地对抗非01血清型菌株引起的病症。对已分离的新的非01菌株给出了新的血清型命名，即0139。

生产非01霍乱弧菌疫苗菌株的起始菌株是霍乱弧菌1837。该菌株是0139血清型的，并且是从孟加拉的霍乱病人中分离的。图23显示菌株1837中霍乱毒素基因座位的染色体排布。

将质粒pCVD51导入如实施例10中所述的菌株1837中。该质粒重组到细菌染色体内，并且第二次重组导致毒素基因的一个拷贝和RS1元件的3个拷贝丢失。所得到的菌株霍乱弧菌1837.1示于图24的第二行上。为简单起见，在图26中cep.orfu、ace、zot、ctxAB序列一起称为霍乱毒素“核心”。霍乱弧菌染色体基因座包括一个或多个核心区及相关联的RS1元件。

按下述方法删除菌株1937.1的其余核心序列。

制备菌株1937.1的染色体DNA并用限制性核酸内切酶Sau3a部分酶切以得到约30至40kb大小的片段。将这些片段克隆到粘性质粒克隆载体pH C79(Hohn and Collins，Gene，11，291-298，1980)中，并在导入大肠杆菌后使用ctx基因序列作为探针经DNA杂交筛选所得到的克隆。鉴定并分离在约30kb弧菌插入段上含cxt基因的克隆，然后绘制所得质粒的部分酶切图谱。将分离的构建体定名为pLC13(图25)。用EcoRI酶切该质粒并使之自连接，从而使插入段大小减小至大约25kb。所得质粒定名为pLC14。用Hind III部分酶切pLC14，然后使之自连以除去含有核心区、RS1序列和约7.4kb未鉴定特征之霍乱弧菌DNA的14.6kb Hind III片段。将所得到的缺少核心、RS1序列的质粒称为pLC15。在如Pearson et al.，P.N.A.S.(USA)，90，3750-3754(1993)中所述的减毒菌株构建中除去较小的Hind III片段。然后用SalI和EcoRI消化质粒pLC15并将此弧菌DNA克隆到实施例10中所述的自杀载体pGP704中。所得质粒被定名为pLC16。

用实施例10中所述的方法，将含有侧接ctx基因座之霍乱弧菌菌标1837.1染色体序列的自杀载体pLC16转移到霍乱弧菌菌株1837.1中。因为氨苄青霉素抗性是由载体序列编码的，所以经筛选氨苄青霉素抗性菌落确定载体序列是否同源重组到染色体内。

然后在没有氨苄青霉素的培养基中培养用该方法产生的并且具有已整合到细菌染色体中之质粒序列的氨苄青霉素抗性霍乱弧菌。并选择氨苄青霉素敏感性菌落。第二冷重组导致ctxA、ctxB、zot、ace、orfu、cep和RS1序列连同编码氨苄青霉素抗性之质粒载体的丢失。该所得质粒被称为1837.2。菌株1837.2中的弧菌染色体图解显示于图24的第三行。

按上文实施例11中所述方法，将编码霍乱毒素B亚基的基因连同编码汞抗性的基因加到菌株1837.2中。如用于制备菌株CVD110一样使用同一自杀载体pCVD622.2B。此过程导致图26中所示的B亚基序列的掺入。缺失了所有ctx、zot、ace、cep和RS1序列的最终菌株CVD112表达CTB亚基，并且是汞抗性的。制备用于疫苗研究的CVD112和A11837

于-70℃下，将霍乱弧菌CVD112和A11837菌株储存于含有18％甘油的TSB中。在给自愿者使用之前，融化一瓶适当的菌株并划线接种于血琼脂、TCBS和B1琼脂上。37℃保温24小时后，选择凝集适当血清的菌落并铺敷在BHI上，然后继续于37℃保温约20小时。再次铺敷霍乱弧菌，然后37℃保温5小时并用无菌盐水收获之。将溶液的光密度与已知标准品的光密度相比较以确定其浓度。在给自愿者投用微生物之前和之后用复制平板技术作进一步定量分析。

                 疫苗临床试用

招收并通知若干名18至40岁的成年自愿者，得到其签字同意。小心筛选自愿者以确保他们有极好的身体和精神健康状况。

令一组14名自愿者进入隔离病房并用两天时间使之适当环境，同时完成医学筛选并收集用于抗体检测的基线样品。

第3天，以双盲方式让自愿者随机接受下列材料之一：

(i)5×10⁸cfu的CVD112加缓冲液(n＝6)

(ii)5×10⁶cfu的CVD112加缓冲液(n＝6)

(iii)单一缓冲液

两名只接受了缓冲液的自愿者与疫苗接种者住在一起，以确定是否在该配置中发生疫苗菌株的个体间传播。疫苗接种后密切观察疫苗接种者5天，然后进行5天疗程的四环素治疗。约四周后用致病性霍乱弧菌0139菌株A11837攻击自愿者，以利用对抗同源性攻击的疫苗效力。攻击剂量包括约10⁶cfu霍乱弧菌0139菌株A11837。攻击后密切监视自愿者约120小时。所有自愿者均在疫苗接种后5天开始接受四环素(第6小时500mg，共5天)，并在攻击后4天消除疫苗和攻击菌株负载。

8名经受攻击的疫苗接种者，其中4名来自5×10⁸组，4名来自5×10⁶组。15名未作疫苗接种的对照者也给予攻击剂量。8名疫苗接种者中有4人，并且对照组中有12人在攻击后发生腹泻，求出疫苗保护效率为84％。1名发生腹泻的疫苗接种者接受了5×10⁶剂量的CVD112疫苗。

8名疫苗接种者中有3人(38％)，并在对照组中有14人(93％)排泄了攻击菌株(疫苗接种者的峰值排泄少100倍)，表明疫苗菌株已有效地移植于疫苗接种者体内。

这些结果表明霍乱弧菌CVD112在对抗0139血清型的非01弧菌菌株引起的霍乱症状中是一种安全并有效的疫苗菌株。

                    实施例14

构建霍乱弧菌CVD112 RM-减毒的，0139血清型的recA-霍乱弧菌衍生株

构建recA缺陷的，0139血清型减毒霍乱弧菌疫苗菌株的起始菌株是霍乱弧菌菌株CVD112。可望recA基因的突变将进一步降低减毒菌株与野生型ctx基因的体内重组变成强毒力菌株的可能性。按照Ketley等人(Infect.and Immun.，58(5)，1481-1484，1980)和Coldberg等人(J.Bacterl，165(3)，715-722，1986)所述的相似方法构建recA突变体。

霍乱弧菌E1 Tor菌株N16961的recA基因克隆于寄主范围广泛的质粒pCVD316。质粒pCVD831含有基因约7kb的NarI-NbeI片段。质粒pCD316是上文已描述的IncP质粒pRK290的衍生物。用XbaI和PvuII消化pCVD831以除去recA基因编码序列内部的约50bp片段。将限制性消化的DNA的末端修成平头并使质粒重新自身连接。约50bp缺失导致recA蛋白质失活。将所得质粒定名为pCVD832。

使质粒pCVD832转移到霍乱弧菌CVD112中，并径同源重组用突变的recA基因取代固有recA基因。基本上按照Kettler等人(1980，文献同上)所述的方法处理对甲磺酸甲酯(MMS)的敏感性以检测同源重组。由上述方法得到的菌株缺失所有的ctx、cep、orfu、ace和RS1序列、并有染色体recA基因座的失活突变(即为recA-菌株)。图27中图解显示在产生菌株CVD112中发生于霍乱弧菌re-cA基因座的重组过程。

霍乱弧菌菌株CVD112和CVD112RM是实质上有效的疫苗菌株并在用强毒力0139血清型及其他非01菌株攻击后提供对抗这些强毒力菌株的实质性保护作用。

也可以将CVD112和CVD112RM与一个或多个霍乱弧菌疫苗菌株、类毒素、前霍乱原样蛋白等一起使用，制成用于对抗强毒01菌株的强毒力非01菌株，例如Ogawa或Inada血清型霍乱弧菌菌株的联合疫苗。

最近，有人报导编码菌毛核心区的cep基因座可能起到辅助异位定居因子的作用。但认为cep基因产物没有在实质上干扰本发明霍乱弧菌在宿主生物体肠中，特别人肠中定居生长的能力。不过如果需要的话，可以按照本文所述的原则和方法将包含cep或任何其他适当的定居生长因子的序列重新插入本发明霍乱弧菌的染色体中。

作为实施，在溶血素基因座位处重新插入到染色体中的编码霍乱毒素B亚基的DNA和编码抗汞抗性的DNA中，可以方便地将可操作地连接到表达信号上的有用基因包括于在重组过程中所利用的质粒中。

这一重组过程所得到的菌株产生霍乱毒素B亚基，赋予抗汞或其他重金属抗性的蛋白质及其它有用基因产物。

                       实施例15

              霍乱弧菌CVD111疫苗菌株

按照如上文所述的构建疫苗菌株CVD109和CVD110的同样方法构建另一个称为霍乱弧菌CVD111(ctxA^-、zot^-、ace^-、mer，ctxB)的霍乱弧菌疫苗菌株。但该附加疫苗的起始菌株代之以霍乱弧菌E1 Tor Ogawa N16117。该菌株产生霍乱毒素、ZOT和ACE。尽管其产生霍乱毒素，但当在自愿者身上试验时菌株N16117并不引起腹泻。Leviae等人(Acute Enteric Infections in Children，NewProspects for Treatment and Prevention，1981，supra)首先描述了菌株N16117。应理解到，必要时可以用已述方法在CVD111霍乱弧菌中产生CVD112 RM中的上述recA突变。

因为霍乱弧菌CVD111衍生于不引起腹泻的菌株，所以缺失ctxA、zot和ace基因提供了具有最小反应原性，但仍表达霍乱毒素B亚基、引发实质性免疫原性反应的疫菌菌株。

以上述剂量程序投用霍乱弧菌CVD111，以在宿主接触到强毒性霍乱弧菌菌株后产生对抗霍乱病症的保护作用。

虽然已结合物定实施方案描述了本发明，但应明确的是，可以对本发明作进一步的改动，并且本申请意欲包括总地符合本发明原则的，以及属于本发明涉及的本领域已知或惯用实践的，又适用于文本所示基本特征的和落入待批权利要求范围内的任何改动、应用或修改。

Claims (10)

1.非01血清型的无毒力霍乱弧菌菌株，其中删除了包括霍乱毒素基因座的霍乱毒素核心和RSI序列的DNA，并且具有编码抗汞抗性的DNA，以及重新插入到染色体中编码霍乱毒素B亚基的DNA。

2.根据权利要求1的无毒力霍乱弧菌，其中所说的菌株是0139血清型的。

3.根据权利要求2的无毒力霍乱弧菌，其中所说的编码抗汞抗性的DNA，编码霍乱毒素B亚基的DNA被插入到溶血素基因的染色体位点上。

4.根据权利要求3的无毒力霍乱弧菌，其中所说的菌株是霍乱弧菌CVD112或其衍生株。

5.制造无毒力霍乱弧菌非01菌株的方法，所说的菌株缺失了霍乱毒素核心和RSI序列，但表达霍乱毒素B亚基以及编码赋予抗重金属抗性之产物的序列，该方法包括以下步骤：

(a)提供包含霍乱弧菌霍乱毒素核心区的DNA及有足够长度以促成可检测的体内重组的侧翼序列的第一质粒，其所说的序列被连接到编码外源第一可选择标志，赋予抗选择试剂抗性的基因上，所说的第一质粒不能够在霍乱弧菌中进行染色体外复制；

(b)使非01血清型的无毒力霍乱弧菌菌株与携带该第一质粒的第一微生物接合；

(c)选择并分离表达第一可选择标志的霍乱弧菌；

(d)在没有所说选择试剂的培养基中培养步骤(c)中分离的霍乱弧菌；

(e)根据表达所说第一可选择标志之能力的丢失筛选步骤(d)的霍乱弧菌；

(f)提供包含侧接霍乱毒素基因座之霍乱弧菌非01染色体序列的第二质粒，所说的第二质粒丢失了霍乱毒素核心和RSI序列的DNA，连接到赋予抗第二选择剂抗性的外源第二可选择标志上；

(g)使步骤(e)的经过筛选的产物与携带所说第二质粒的第二微生物接合；并

(h)选择表达第二可选择标志的霍乱弧菌；

(g)在没有第二选择剂的培养基中培养步骤(h)的经选择的产物；

(h)根据所说第二可选择标志的丢失筛选步骤(g)的霍乱弧菌；

(i)分离步骤(h)的筛选的产物；

(j)提供包含有足够长度以促成可检测之体内重组的霍乱弧菌染色体序列的第三质粒，所说的染色体序列侧翼接有霍乱毒素B亚基的序列，以及编码赋予抗重金属抗性之产物的序列，并连接到外源第三可选择标志上，其中所说的第三质粒不能移在霍乱弧菌中进行染色体外复制；

(k)使步骤(h)的经筛选的产物与携带所说第三质粒的第三微生物接合；

(1)选择表达第三可选择标志的霍乱弧菌；以及

(m)分离步骤(1)的选择的产物。

6.根据权利要求5的制造无毒力霍乱弧菌非01的方法，其中所说的霍乱弧菌非01无毒力菌株是0139血清型的。

7.根据权利要求6的制造无毒力霍乱弧菌非01的方法，其中所说的霍乱弧菌非01的无毒力菌株是菌株1837。

8.根据权利要求7的制造无毒力霍乱弧菌非01的方法，其中所说的步骤(m)的分离的选择的产物是霍乱弧菌CVD112。

9.根据权利要求7的制造无毒力霍乱弧菌非01菌株的方法，其中所述步骤(p)分离的选择的产物是霍乱弧菌CVD 112 RM。

10.一种用于防止霍乱的疫苗，其在接触包含根据权利要求1的无毒力霍乱弧菌非01菌株之霍乱弧菌非01菌株后可防止霍乱。

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