JPS594988B2 - グリコ−スイソメラ−ゼの製法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、グルコースを異性化してフラグ）−スに転化
するのに有用なグルコースイソメラーゼの製法に関し、
とくに、従来グルコースイソメラーゼを生産する微生物
の存在の全く知られていなかったコリネバクテリウム（
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃ ｔｅｒｉｎｍ）属に属するグリコ
ースイソメラーゼ生産菌を培養し、培養物からグルコー
スイソメラーゼを採取することを特徴とするグルコース
イソメラーゼの製法に関する。

フラクトースを原料とする液糖の需要増加、低カロリー
甘味料の需要増大、糖尿病、肝臓病などの治療、予防甘
味料としての需要向上などのために、ラクトースの需要
が、近年、増している。

このようなフラクトースの需要増大に伴って、グルコー
スイソメラーゼを用いて、グルコースからフラクトース
を製造する方法が実用化されている。

このような用途に有用なグルコースイソメラーゼを生産
する微生物として、バチルス属、エシェリキア属、エア
ロバクター属、ラクトバチルス属、アースロバフタ−属
、シュードモナス属、ブレビバクテリウム属に属する細
菌類及びストレプトミセス属、ノカルジア属、ミクロモ
ノスポラ属、ミクロビスポラ属、ストレプトスポランギ
ウム属に属する放線菌類が報告されている。

しかしながら、コリネバクテリウム属に属する微生物が
グルコースイソメラーゼを生産することは全く知られて
いない。

本発明者等は、実用に供し得る優れた生産量でグルコー
スイソメラーゼを生産できる微生物を検索し、土壌から
分離採取されたコリネバクテリウム属に属する微生物で
あるグルコースイソメラーゼ生産菌の存在を発見した。

更に、研究の結果、このコリネバクテリウム属に属する
グルコースイソメラーゼ生産菌は従来公知のグルコース
イソメラーゼ生産菌に比してまさるとも劣らない生産量
でグルコースイソメラーゼを生産し、その菌体もしくは
菌体から分離された酵素とグルコースとを接触させるこ
とにより、容易にグルコースをフラクトースに異性化で
きることを発見した。

従って、本発明の目的は、グルコースイソメラーゼの製
法を提供するにある。

本発明の他の目的は、グルコースイソメラーゼ生産能を
有するコリネバクテリウム属に属する微生物の存在を明
らかにし、この技術分野を一層豊かにするにある。

本発明の上記目的及び更に多くの他の目的及び利点は、
以下の記載から一層明らかとなるであろう。

本発明で用いるコリネバクテリウム属に属する微生物と
して、本発明者等が土壌より分離採取した微生物は、後
に詳述する菌学的性質を有し、後記する通り、コリネバ
クテリウム属に属する新菌種と同定された。

これら新菌稀の代表法は、下記のように命名され、下記
供託番号で工業技術院微生物工業技術研究所に供託され
た。

コリネバクテリウム・キャンジダス （Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｄｉｄｕｓ
）ＦＥＲＭ Ｐ Ａ３２８５ コリネバクテリウム・セリナス （Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｅｒｅｎｕｓ）
Ｆ Ｅ ＲＭ −Ｐ Ａ ３２８６ 以下に、上記代表法の菌学的性質を記載する。

コリネバクテリウム・キャンジダス （Ｆ Ｅ ＲＭ−Ｐ Ａ３２８５ ） １、形態的性質 形態；０．８〜１．ＯＸ４〜５ミクロンの桿菌で、形は
湾曲していてｖ字状につらなるもの がある。

運動性；なし。

ダラム染色；陽性。

胞子；なし。

２、培養的性質 肉汁寒天平板培養；生育中程度、周縁不規則、扁平状、
不透明、光あり、乳白色。

肉汁寒天斜面培養；生育中程度、糸状、不透明、光あり
、乳白色。

肉汁液体培養；もろい画壇をつくり透明、沈渣あり。

生育温度；２５〜３７℃。

生育１）Ｈ；４．５〜゛９゜ 酸素要求性；好気性。

３、生理的性質 リドマスミルク；やや脱色しゆっくりペプトン化する。

肉汁ゼラチン穿刺培養；ゼラチンは液化しない。

表面に増殖。

硫化水素；発生する。

インドール；発生しない。

殿粉；分解する。

硫酸塩；還元する。

カタラーゼ；生成する。

０−Ｆテスト； 酸およびガスの発生のいずれもなし。

アスパラギン；分解する。

くえん酸；資化する。

脱窒反応： − ＭＲテスト； − ＶＰテスト； − 無機Ｎ源の利用；硝酸塩 十 アンモニウム塩 十 色素の生成； − オキシダーゼ； − 抗酸性；なし。

コリネバクテリウム・セリナス （Ｆ Ｅ ＲＭ Ｐ Ａ３２８６ ）前記コリネバ
クテリウム・キャンジダスと比べると、次の点が異なる
。

肉汁寒天平板培養での培養的性質；生育中程度、周縁波
状、降起伏、不透明、光あり、乳白色。

０−Ｆテストにおける生理的性質；Ｄ−マンニットから
酸を生じる。

以上の菌学的性質を、１バーシース・マニュアル・オブ
・デイタミネテイヴ・バクテリオロン−１第７版の記載
に対比すると、該当する菌種が見当らない。

その結果、コリネバクテリウムに属する新菌種と同定さ
れ、以上の名前の通り命名された。

尚、本発明に於て、酵素活性の測定は以下の方法により
行った。

７、Ｍ ’）ン酸塩緩衝液（ｐＨ７，０）にグルコース
濃度が４００１１１ｆＩ／ｍｌとなるようにグルコース
を溶解し、且つ塩化コバルト濃度が０．５ｍＭとなるよ
うに塩化コバルトを溶解した溶液２．０ｍｌに、培養液
を遠心分離して得た菌体を加えて７０℃で１時間反応さ
せた。

反応が終ると５％過塩素酸２．０ Ｔ１１１を加えて反
応を停止し、次に反応液を遠心分離して得た上澄液中の
フラクトースをカルバゾール・システィーン硫酸反応法
を用いて定量した。

１時間に１〜のフラクトースを生成する酵素活性を１単
位（ｕ）とした。

本発明によれば、上述の如きコリネバクテリウム属に属
するグルコースイソメラーゼ生産菌を培地に培養し、得
られた培養液からグルコースイソメラーゼを含有する菌
体を採取することができる。

上記培地としては、炭素源、窒素源、無機塩類、消泡剤
などを含有する培地を利用することができる。

炭素源の例としては、糖質、着水炭素、アルコール類、
炭化水素類などをあげることができる。

本発明においては、グルコースイソメラーゼ生産の誘導
物質としてキシロースを培地に添加することがとくに好
結果を与える。

炭素源としてキシロースのみを利用することも可能であ
る。

また、窒素源としては、例えば、コーンスチープリカー
、酵母エキス、肉エキス、ペプトン１．魚粉、アンモニ
ウム塩類、硝酸塩類、尿素などをあげることができる。

更に、無機塩類としては、リン酸塩類、マグネシウム塩
類、鉄塩類、亜鉛塩類、コバルト塩類、カルシウム塩類
、マンガン塩類、モリブデン塩類、銅塩類などをあげる
ことができる。

これら無機塩類の使用量は少量でよく、例えば、鉄塩類
の場合には、Ｆｅ Ｓ Ｃ１７Ｈ２Ｏとして約０．３〜
１〜／ｍｌ程度、コバルト塩類の場合には、ＣｏＣ１□
・６Ｈ２０として約５〜２０■／ｌ程度の量が好ましく
採用される。

培地組成は所望により適宜に選択変更でき、また培養中
に適当に追加添加することができる。

培養は好気性条件下に行われ、例えば、振盪培養、通気
攪拌培養などの培養形式が好ましく採用される。

培養温度は約２０〜約４０°Ｃ程度、培養ｐＨは約３．
５〜約９．５、一層好ましくは約４〜約６程度がよい。

培養は通常１〜５日程度である。本発明方法によれば、
上述のようにして、コリネバクテリウム属に属するグル
コースイソメラーゼ生産菌を培養することによって、グ
ルコースイソメラーゼを工業的に有利に画体内に蓄積せ
しめることができる。

培養液は例えば遠心分離手段によって分離して、グルコ
ースイソメラーゼ含有菌体を採取することができる。

本発明方法によれば、得られた上記菌体、その破砕物、
乾燥物、菌体抽出物、粗酵素、精製酵素など任意の形の
グルコースイソメラーゼを利用して、グルコースを酵素
的に異性化してフラクトースに転化することができ、斯
くして、コリネバクテリウム属に属するグルコースイソ
メラーゼ生産菌を培養し、得られたグルコースイソメラ
ーゼとグルコースとを接触させることを特徴とするフラ
クトースの製法を提供することができる。

上記菌体からの酵素の抽出、分離、精製は他の微生物を
利用して菌体からグルコースイソメラーゼを抽出、分離
、精製する公知手段と同様に行うことができる。

例えば、グルコース・イソメラーゼ含有菌体を摩砕手段
、超音波、圧力の急変などの手段で破砕したり、或は自
己消化を利用したりして菌体外へグルコース・イソメラ
ーゼを取り出すことができる。

更に、菌体外へとりだした粗酵素は、硫安塩析手段、有
機溶剤による沈殿手段、ゲル涙過手段、カラムクロマト
グラフィーなど公知の手段を適当に組み合わせて精製す
ることができる。

菌体からの酵素分離採取及び精製の一例を示すと以下の
態様を示すことができる。

培養液から遠心分離して得られた菌体を、超音波処理に
より破砕する。

破砕液から遠心分離して得られた上澄液にアセトンを加
えて沈殿画分を採取する。

沈殿画分をファルアシア社製ＤＥＡＥセルロースやＤＥ
ＡＥ−８ＥＰＨＡＤＥＸを充填したカラムで液体クロマ
トを行い精製する。

本発明方法で得られた任意の形のグルコースイソメラー
ゼとグルコースとの接触は、異性化温度及びｐＨ条件下
に、両者を接触させ得る任意の手段で行うことができる
。

異性化温度は、約５０〜約８０℃が好ましく、一層好ま
しくは約６０〜約７５℃程度である。

また異性化ｐｉ−１は約６〜約１０が好ましく、一層好
ましくは約７±０．５程度である。

異性化時間は、他の反応条件によっても変更され、通常
１〜８０時間、好ましくは５〜３０時間程度である。

反応はグルコースが生成したフラクトースと平衡に達す
るまで行えばよい。

反応に際して、反応液中にＭｇイオン、Ｃｏイオンなど
の異性化促進作用を示すイオンを生成し得る促進物質を
添加存在せしめて反応を行うことができる。

異性化反応生成物液からのフラクトースの分離、精製は
、それ自体公知の複塩生成による晶析分別手段やイオン
交換樹脂吸着手段などを利用して行うことができる。

以下、実症例により本発明方法についてさらに詳しく説
明する。

実症例 １ コリネバクテリウム・キャンジダス［Ｆ Ｅ ＲＭ−Ｐ
Ａ３２８５ ］を、イオン交換純水１１あたりキシロー
ス１０ｇ、ペプトン１０ｇ、ＫＨ２ＰＯ４０，４ｇ、Ｈ
ａ ２ＨＰＯ４−１２Ｈ２０１，５ｇ、Ｍｇ５０４−７
Ｈ２００，５ｇを含有する種々の初発ｐＨをもつ殺菌し
た培地１００１ｒＬｌ収容の５００ｄ容三角フラスコに
植菌して、３０℃で２日間振とう培養した。

培養液に生産されたグルコースイソメラーゼの濃度を表
１に示した。

培養液に生産されたグルコースイソメラーゼの濃度の測
定は次のようにして行った。

培養液１０ｍ１を１０，０００回転、５分間遠心分離し
沈殿する菌体を得た。

この菌体をｐＨ７、０の％Ｍのリン酸緩衝液１１あたり
グルコース４００ｇ、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２００，５ｍ
ｍｏ ｌを含有するグルコースイソメラーゼ反応液２．
０ｄ収容の試験管（外径１５朋）に加えて７０℃で１時
間反応させたのち５％過塩素酸２．０ｒｕｌを加えて反
応を停止した。

反応液中に生成したフラクトースをカルバゾール・シス
ティン−硫酸反応法を用いて定量しグルコースイソメラ
ーゼの濃度を計算により求めた。

実症例 ２ 実症例１の初発ｐＨ４，５の培地を基本培地としてＦｅ
ＳＯ４” ７Ｈ２０ｔＣｏＣ１２” ６Ｈ２０を種々の
濃度に添加して殺菌した培地１０ ｏＴＬｌ（初発ｐＨ
４，５）収容の５００ｙｄ容三角フラスコに実症例１と
同様にコリネバクテリウム・キャンジダスを植菌して３
０℃で２日間振とう培養し、培養液に生産されたグルコ
ースイソメラーゼの濃度を測定した。

その結果を表２に示した。実症例 ３ 実症例２の基本培地にＦｅＳＯ４・７Ｈ２０を０．５■
、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２０を１０■添加した培地で培養す
る例において、コリネバクテリウム・キャンジダスの代
りにコリネバクテリウム・セリナス［ＦＥＲＭ−ＰＡ、
３２８６ ］を用いるほかは、実症例２と同様に実施し
たところ、培養液中のグルコースイソメラーゼの生産濃
度は培養液１１ｒｌｌありり１９．１ｕであった。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ コリネバクテリウム属に属するグルコースイソメラ
   ーゼ生産菌を培養し、培養物からグルコースイソメラー
   ゼを採取することを特徴とするグルコースイソメラーゼ
   の製法。 ２ 該グルコースイソメラーゼ生産菌がコリネバクテリ
   ウム・キャンジダス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ
   ｃａｎｄｉｄｕｓ ）である特許請求の範囲１記載の製
   法。 ３ 該グルコースイソメラーゼ生産菌が、コリネバクテ
   リウム・セリナス（ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍＣ
   ｅｒｅｎｕＳ）である特許請求の範囲１記載の製法。