KR20010113790A

KR20010113790A - (ｒ)-2-옥탄올탈수소효소, 그 효소의 제조방법, 그 효소를코드하는 ｄｎａ 및 이를 이용한 알코올의 제조방법

Info

Publication number: KR20010113790A
Application number: KR1020017012994A
Authority: KR
Inventors: 구도마사타케; 야마모토히로아키
Original assignee: 요시유키 칸다; 다이셀 화학 공업 주식회사
Priority date: 2000-02-16
Filing date: 2001-02-15
Publication date: 2001-12-28
Also published as: EP1179595A1; CZ300833B6; EP1179595A4; WO2001061014A1; CZ20013768A3; KR100760106B1; US6706507B2; US20040126857A1; DE60142949D1; US7202069B2; EP1179595B1; CN100413967C; ATE479758T1; TWI275645B; US20020192783A1; JP4651896B2; CN1366550A

Abstract

본 발명에 의해, NAD⁺(NADH)를 보효소로 한 산화환원반응을 촉매하는 (R)-2-옥탄올탈수소효소 및 그것을 코드하는 유전자가 제공되었다. 본 발명의 효소는, 피키아속(Pichia), 캔디다속(Candida) 및 오가타에아속(Ogataea) 미생물 등으로부터 얻을 수 있다. 이 (R)-2-옥탄올탈수소효소를 사용하여 케톤을 환원하여, 알코올, 특히 (S)-4-할로-3-히드록시낙산에스테르나 (R)-프로폭시벤젠유도체를 비롯한 알코올을 생산하는 것이 가능하다. 더욱이 본 발명에 의한 (R)-2-옥탄올탈수소효소는, 활성과 입체선택성이 우수하다.

Description

(Ｒ)-2-옥탄올탈수소효소, 그 효소의 제조방법, 그 효소를 코드하는 ＤＮＡ 및 이를 이용한 알코올의 제조방법{(R)-2-octanol dehydrogenase, process for producing the enzyme, DNA encoding the enzyme and process for producing alcohol by using the same}

기술분야

본 발명은, 알코올, 케톤, 특히 (S)-4-할로-3-히드록시낙산에스테르((S)-4-halo-3-hydroxybutyric acid esters), (R)-프로폭시벤젠유도체((R)-propoxybenzene derivatives)를 비롯한 광학활성 알코올의 제조에 유용한 신규한 (R)-2-옥탄올탈수소효소, 그 효소를 코드하는 DNA, 그 효소의 제조방법, 그 효소를 사용한 알코올, 케톤, 특히 (S)-4-할로-3-히드록시낙산에스테르 또는 (R)-프로폭시벤젠유도체를 비롯한 광학활성 알코올을 제조하는 방법에 관한 것이다.

배경기술

(S)-4-할로-3-히드록시낙산에스테르는, HMG-CoA 리덕타아제(reductase)저해제나 D-카르니틴(D-carnitine)등의 합성에 있어서 중간체로서 이용되는 화합물이다. 이들 화합물은, 의약이나 농약의 합성에 유용하다. 특히, 광학적으로 순수한 (S)-4-할로-3-히드록시낙산에스테르의 대장체(enantiomer)를 어떻게 얻을 수 있는가(합성 또는 분리)는, 산업상 중요한 과제로 되어 있다. 종래, (S)-4-할로-3-히드록시낙산에스테르의 제조법으로서, 비대칭합성(asymmetric synthesis), 결정석출(crystalization), 빵효모 등 미생물을 사용한 비대칭환원법(asymmetric reduction method)(일본국 특개소61-146191, 일본국 특개평6-209782 등)이 알려져 있다. 그러나 공지의 제조방법에는, 생성물의 광학순도가 낮고, 수율이 나쁘다고 하는 등의 문제점이 있기 때문에, 공업적인 이용이 곤란했었다.

또한, 4-할로아세토초산에스테르(4-haloacetoacetic acid esters)를 (S)-4-할로-3-히드록시낙산에스테르로 환원하는 효소가 탐색되고 있다. 예를 들면, 하기에 예시하는 바와 같은 효소가 알려져 있고, 이들 효소에 의한 (S)-4-할로-3-히드록시낙산에스테르의 합성방법이 보고되고 있다. 그러나 이들 효소는, 보효소(coenzyme)로서 환원형 니코틴아미드아데닌디뉴클레오티드인산(NADPH라고 약칭한다)을 이용하는 환원효소이다. 따라서, 이들 효소를 사용한 (S)-4-할로-3-히드록시낙산에스테르의 합성에는, 고가이고 또한 화학적으로 불안정한 NADPH의 첨가와 재생이 필요하여, 공업적으로 불리하다.

·빵효모 유래의 몇 개의 환원효소(D-enzyme-1, D-enzyme-2, J. Am. Chem. Soc. 107, 2993-2994, 1985)

·스포로볼로마이세스 ·살모니컬러(Sporobolomyces salmonicolor)유래의 알데히드 환원효소 2(Appl. Environ. Microbiol. 65, 5207-5211, 1999)

·캔디다 ·마세도니엔시스(Candida macedoniensis)유래의 케토 판토텐산에스테르 (Keto pantothenic acid ester)환원효소(Arch. Biochem. Biophys. 294, 469-474,1992)

·게오트리컴 ·캔디덤(Geotrichum candidum)유래의 4-클로로아세토초산에틸에스테르(4-chloroacetoacetic acid ethyl ester)환원효소(Enzyme Microb. Technol. 14, 731-738, 1992)

·캔디다 ·마그놀리아에(Candida magnoliae)유래의 카르보닐 환원효소(WO 9835025)

·클라이베로마이세스 ·락티스(Kluyveromyces lactis)유래의 카르보닐 환원효소(일본국 특개평11-187869)

·II형 지방산 합성효소의 하나로서 β-케토아실-아실캐리어프로틴(β-ketoacyl-acyl carrier protein)환원효소(일본국 특개2000-189170)

보효소로서, 환원형 니코틴아미드아데닌디뉴클레오티드(NADH라고 약칭)를 전자공여체로서 환원반응을 행하는 효소로서, 3α-히드록시스테로이드탈수소효소(일본국 특개평1-277494), 글리세롤탈수소효소(Tetrahedron Lett. 29, 2453-2454, 1988), 슈도모나스 ·에스피 PED(Pseudomonas sp. PED)유래의 알코올탈수소효소(J. Org. Chem. 57, 1526-1532, 1992)가 알려져 있지만, (S)-4-할로-3-히드록시낙산에스테르 합성반응의 활성자체가 낮기 때문에, 공업적으로는 불리하다.

이상과 같이, 미생물 및 효소를 사용한 (S)-4-할로-3-히드록시낙산에스테르의 공지의 제조방법은, 광학순도, 수율 또는 효소활성 등의 점에 있어서 만족할 만한 것은 아니었다. 이들 문제점이, 공지의 제조방법의 공업적인 이용을 곤란하게 하고 있었다.

한편, (R)-프로폭시벤젠유도체(일본국 특개평02-732)는, 의약품, 특히 합성항균제인 오플록사신(ofloxacin)의 광학활성체((S)-(-)-9-플루오로-3-메틸-10-(4-메틸-1-피페라디닐)-7-옥소-2,3-디히드로-7H-피리도[1,2,3-de][1,4]벤조옥사진-6-카르복실산, 일본국 특개평62-252790) 등의 합성중간체로서 유용한 화합물이다. 이 화합물의 광합적으로 순수한 대장체를 어떻게 얻을 수 있는가(합성 또는 분리)는, 산업상 중요한 과제로 되어 있다.

(R)-프로폭시벤젠유도체를 제조하는 방법으로서는, 프로폭시벤젠유도체의 라세미체(racemates)를 리파아제, 에스테라아제를 이용하여 비대칭아실화(asymmetric acylation)함으로써 합성하는 방법(일본국 특개평03-183489)이 알려져 있다. 그러나 공지의 방법은, (R)체를 비대칭아실화한 후에, 잔존하는 원료와 아실화된 생성물을 분리하는 공정, 아실화된 생성물을 탈아실화하는 공정이 필요해, 공정이 복잡하여 공업적인 생산에는 부적합하다.

또한, 미생물을 사용하여 아세토닐옥시벤젠유도체(acetonyloxybenzene derivatives)를 비대칭환원하는 방법도 보고되어 있다. 그러나 공지의 방법에 있어서는, 생성하는 (R)-프로폭시벤젠유도체의 광학순도가 84-98%(일본국 특개평03-183489), 또는 8.8-88.4%(일본국 특개평05-68577)로 낮고, 기질의 농도도 0.1-0.5% 정도로 공업적인 생산에는 부적합하다. 높은 광학순도로 비대칭환원 가능한 방법으로서는, 캔디다 ·마그놀리아에에 의해 얻어지는 카르보닐 환원효소를 이용한 방법(일본국 특개2000-175693)에 있어서, 99% 이상의 광학순도로 (R)-프로폭시벤젠유도체를 합성할 수 있는 것이 보고되어 있다. 그러나, 본 카르보닐 환원효소는,보효소로서 NADPH를 이용하는 환원효소이다. 따라서, 본 효소를 사용한 (R)-프로폭시벤젠유도체의 합성에는, 고가이고 또한 화학적으로 불안정한 NADPH의 첨가와 재생이 필요하여, 공업적으로 불리하다.

발명의 개시

본 발명은, NADH를 보효소로서 이용하여, 4-할로아세토초산에스테르를 환원하여, 높은 광학순도의 (S)-4-할로-3-히드록시낙산에스테르를 생성하는 효소활성을 갖는 신규한 효소를 제공하는 것을 과제로 한다. 더욱이, 본 발명은, 그 효소를 이용하여 높은 광학순도의 (S)-4-할로-3-히드록시낙산에스테르를 제조하는 방법의 제공을 과제로 한다.

또한, 본 발명은, NADH를 보효소로서 이용하여, 합성항균제의 합성중간체로서 유용한 (R)-프로폭시벤젠유도체를, 지극히 높은 광학순도로 생성하는 효소활성을 갖는 신규한 효소를 제공하는 것을 과제로 한다. 더욱이, 본 발명은, 그 효소를 이용하여 높은 광학순도의 (R)-프로폭시벤젠유도체를 제조하는 방법의 제공을 과제로 한다.

본 발명자 등은, 전자공여체로서 NADH를 이용할 수 있는 알코올탈수소효소가, 공업적인 이용에 있어서는 유용하다고 생각했다. NADH는 NADPH에 비교하여 저렴하고, 또한 화학적으로도 안정하다. 또한 광학활성 (S)-4-할로-3-히드록시낙산에스테르를 효율적으로 생성하는 효소를 발견하기 위해, (S)-4-할로-3-히드록시낙산에스테르와 입체배치가 동일하고, 또한 4-할로아세토초산에스테르와 비슷한 길이의장쇄(long chain)를 가지는 알코올인 (R)-2-옥탄올에 높은 활성을 갖는 알코올탈수소효소를 스크리닝했다.

종래의 사실에 의하면, (R)-2-옥탄올을 입체선택적으로 산화하여, 2-옥타논을 생성하는 활성을 갖는 2차 알코올탈수소효소로서는, 코마모나스 ·테리게나(Comamonas terrigena), 피키아 ·에스피 NRRL-Y-11328(Pichia sp. NRRL-Y-11328), 슈도모나스 ·에스피 SPD6(Pseudomonas sp. SPD6)유래의 효소가 보고되어 있다. 그러나, 이들 효소가 4-할로아세토초산에스테르를 환원하여, (S)-4-할로-3-히드록시낙산에스테르를 생성한다고 하는 보고는 없다. 또한, 이들 효소의 (R)-2-옥탄올에 대한 활성은, 2-프로판올과 같은 측쇄(side chain)가 짧은 2차 알코올에 비교하여 상당히 높은 활성을 갖지 않기 때문에, 카르보닐기에 부피가 큰 측쇄가 결합한 4-할로아세토초산에스테르를 환원하여, (S)-4-할로-3-히드록시낙산에스테르를 생성하는 활성은 낮다고 예상되었다.

따라서, 본 발명자 등은, (R)-2-옥탄올을 우선적으로 산화하는 능력을 갖는 효소를 갖는 미생물을 넓게 스크리닝했다. 그 결과, 다음의 속에 속하는 미생물이, (R)-2-옥탄올을 우선적으로 산화하는 능력을 갖는 효소를 갖는 것을 발견했다.

피키아속(GenusPichia)

캔디다속(GenusCandida)

오가타에아속(Genus Ogataea)

보다 구체적으로는, 예를 들면 다음과 같은 미생물이, (R)-2-옥탄올을 우선적으로 산화하는 능력을 갖는 효소를 갖는 것을 발견했다.

피키아 ·핀란디카(Pichia finlandica)

피키아 ·쟈디니(Pichia jadinii)

캔디다 ·우틸리스(Candida utilis)

오가타에아 ·윅커하미(Ogataea wickerhamii)

또한, 이들 미생물을 배양하여, 그 균체로부터 (R)-2-옥탄올을 산화하는 효소를 정제했다. 그리고, 그 성질을 검토한 결과, 그 효소가 (R)-2-옥탄올을 높은 입체선택성을 가지고 산화하며, 더욱이 (R)-2-옥탄올 이외의 많은 2차 알코올을 입체선택적으로 산화하는 것을 발견했다. 또한, 그 효소는 4-클로로아세토초산에스테르에 높은 환원활성을 가져, (S)-4-클로로-3-히드록시낙산에스테르를 생성함과 동시에, 2-아세토닐옥시-3,4-디플루오로니트로벤젠에 높은 환원활성을 가져, 2,3-디플루오로-6-니트로-[[(R)-2-히드록시프로필]옥시]벤젠을 생성하는 것을 발견하고, 본 발명을 완성시켰다.

즉 본 발명은, 아래의 알코올, 케톤, 특히 (S)-4-할로-3-히드록시낙산에스테르를 비롯한 광학활성 알코올의 제조에 유용한 신규한 (R)-2-옥탄올탈수소효소, 그 효소를 코드하는 DNA, 그 효소의 제조방법, 그 효소를 사용한 알코올, 케톤, 특히 (S)-4-할로-3-히드록시낙산에스테르나 (R)-프로폭시벤젠유도체를 비롯한 광학활성 알코올을 제조하는 방법에 관한 것이다.

[1] 다음에 나타내는 이화학적 성질 (1) 및 (2)를 갖는 (R)-2-옥탄올탈수소효소.

(1) 작용

i) 산화형 β-니코틴아미드아데닌디뉴클레오티드를 보효소로서, 알코올을 산화하여 케톤을 생성한다.

ii) 환원형 β-니코틴아미드아데닌디뉴클레오티드를 보효소로서, 케톤을 환원하여 알코올을 생성한다.

(2) 기질 특이성

i) 2-옥탄올에 포함되는 2개의 광학이성체 중 (R)-2-옥탄올을 우선적으로 산화한다.

ii) 4-할로아세토초산에스테르를 환원하여 (S)-4-할로-3-히드록시낙산에스테르를 생성한다.

[2] [1]에 있어서, 더욱이 다음에 나타내는 이화학적 성질 (3) 및 (4)를 갖는 (R)-2-옥탄올탈수소효소.

(3) 최적의 pH

산화반응의 최적의 pH는 8.0~11.0이다. 환원반응의 최적의 pH는 5.0~6.5이다.

(4) 기질 특이성

i) 2차 알코올에 대해, 1차 알코올 보다도 높은 효소활성을 갖는다.

ii) (R)-2-옥탄올에 대해, 2-프로판올 보다도 상당히 높은 효소활성을 갖는다.

[3] [1] 또는 [2]에 있어서, 피키아속, 캔디다속 및 오가타에아속으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 미생물에 유래하는 (R)-2-옥탄올탈수소효소.

[4] [3]에 있어서, 피키아속에 속하는 미생물이, 피키아 ·핀란디카(Pichia finlandica)인 (R)-2-옥탄올탈수소효소.

[5] [3]에 있어서, 피키아속에 속하는 미생물이, 피키아 ·쟈디니(Pichia jadinii)인 (R)-2-옥탄올탈수소효소.

[6] [3]에 있어서, 캔디다속에 속하는 미생물이, 캔디다 ·우틸리스(Candida utilis)인 (R)-2-옥탄올탈수소효소.

[7] [3]에 있어서, 오가타에아속에 속하는 미생물이, 오가타에아 ·윅커하미(Ogataea wickerhamii)인 (R)-2-옥탄올탈수소효소.

[8] 피키아속, 캔디다속 및 오가타에아속으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 미생물로서, [1] 또는 [2]의 효소를 생산하는 미생물을 배양하는 공정을 포함하는, [1] 또는 [2]의 (R)-2-옥탄올탈수소효소의 제조방법.

[9] 하기 (a)~(e) 중 어느 하나의 (R)-2-옥탄올탈수소효소활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드.

(a) 서열번호: 1의 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드,

(b) 서열번호: 2의 아미노산서열로 된 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드,

(c) 서열번호: 2의 아미노산서열에 있어서, 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산으로 된 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드,

(d) 서열번호: 1의 염기서열로 된 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트(stringent)한 조건하에서 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드,

(e) 서열번호: 2의 아미노산서열과 70% 이상의 상동성을 갖는 아미노산서열을 코드하는 폴리뉴클레오티드,

[10] [9]의 폴리뉴클레오티드에 의해 코드되는 단백질.

[11] [9]의 폴리뉴클레오티드가 삽입된 재조합 벡터.

[12] [11]에 있어서, 더욱이 β-니코틴아미드아데닌디뉴클레오티드를 보효소로 하는 산화환원반응을 촉매할 수 있는 탈수소효소를 코드하는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 재조합 벡터.

[13] [9]의 폴리뉴클레오티드 또는 [11]의 벡터를 발현 가능하게 보유한 형질전환체.

[14] [13]의 형질전환체를 배양하는 공정을 포함하는 [10]의 단백질의 제조방법.

[15] [1] 또는 [2]의 (R)-2-옥탄올탈수소효소, [10]의 단백질, 그 효소 또는 단백질을 생산하는 미생물, 또는 그 미생물의 처리물을 케톤에 작용시키고, 그 케톤을 환원하여 알코올을 제조하는 것을 특징으로 하는 알코올의 제조방법.

[16] [15]에 있어서, 상기 미생물이 [13]의 형질전환체인 알코올의 제조방법.

[17] [15]에 있어서, 케톤이, 4-할로아세토초산에스테르유도체이고, 알코올이 (S)-4-할로-3-히드록시낙산에스테르유도체인 알코올의 제조방법.

[18] [17]에 있어서, 4-할로아세토초산에스테르유도체가 4-클로로아세토초산에틸에스테르이고, 알코올이 (S)-4-클로로-3-히드록시낙산에틸에스테르인 알코올의제조방법.

[19] [15]에 있어서, 케톤이 일반식 1

일반식 1

(식중, X₁및 X₂는, 각각 할로겐원자를 의미한다)으로 나타내어지는 아세토닐옥시벤젠유도체이고, 알코올이 일반식 2

일반식 2

으로 나타내어지는 (R)-프로폭시벤젠유도체인 알코올의 제조방법.

[20] [19]에 있어서, 상기 아세토닐옥시벤젠유도체가 2-아세토닐옥시-3,4-디플루오로니트로벤젠이고, 알코올이 2,3-디플루오로-6-니트로[[(R)-2-히드록시프로필]옥시]벤젠인 알코올의 제조방법.

[21] [15]에 있어서, 더욱이 부가적으로 산화형 β-니코틴아미드아데닌디뉴클레오티드를 환원형으로 변환하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 알코올의제조방법.

[22] [1] 또는 [2]의 (R)-2-옥탄올탈수소효소, 또는 [9]의 단백질, 그 효소 또는 그 단백질을 생산하는 미생물, 또는 그 미생물의 처리물을 알코올에 작용시키고, 그 알코올을 산화하여 케톤을 제조하는 것을 특징으로 하는 케톤의 제조방법.

[23] [1] 또는 [2]의 (R)-2-옥탄올탈수소효소, 또는 [9]의 단백질, 그 효소 또는 그 단백질을 생산하는 미생물, 또는 그 미생물의 처리물을 라세미체 알코올에 작용시키고, 광학이성체의 한쪽을 우선적으로 산화하여, 잔존하는 광학활성 알코올을 취득하는 것을 특징으로 하는, 광학활성 알코올의 제조방법.

[24] [22] 또는 [23]에 있어서, 더욱이 부가적으로 환원형 β-니코틴아미드아데닌디뉴클레오티드를 산화형으로 변환하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.

본 발명은, 다음의 (1) 및 (2)에 나타내는 이화학적 성질을 갖는 효소를 제공한다.

(1) 작용

i) 산화형 β-니코틴아미드아데닌디뉴클레오티드(NAD⁺)를 보효소로서, 알코올을 산화하여, 케톤을 생성한다.

ii) 환원형 β-니코틴아미드아데닌디뉴클레오티드(NADH)를 보효소로서, 케톤을 환원하여, 알코올을 생성한다.

(2) 기질 특이성

i) 2-옥탄올에 포함되는 2개의 광학이성체 중, (R)-2-옥탄올을 우선적으로 산화한다.

또한, 본 발명의 효소는, 바람직하게는 더욱이 다음의 효소학적 성질 (3) 및 (4)를 가진다.

(3) 최적의 pH

(R)-2-옥탄올산화반응의 최적의 pH는 8.0~11.0이다. 4-클로로아세토초산에틸 환원반응의 최적의 pH는 5.0~6.5이다.

(4) 기질 특이성

i) 2차 알코올에 대해, 1차 알코올 보다도 높은 활성을 갖는다.

ii) (R)-2-옥탄올에 대해, 2-프로판올 보다도 상당히 높은 활성을 갖는다.

더욱이 본 발명에 있어서의 바람직한 (R)-2-옥탄올탈수소효소는, 다음의 이화학적 성질 및 효소학적 성질 (5)~(8)을 갖는다.

(5) 최적의 작용온도의 범위

(R)-2-옥탄올산화반응의 최적의 온도는 45-55℃이다. 4-클로로아세토초산에틸 환원반응의 최적의 온도는 55-60℃이다.

(6) 안정 pH의 범위

pH 8~9의 범위에서 안정하다.

(7) 저해

염화수은과 킬레이트제인 에틸렌디아민4초산2나트륨염(EDTA ·2Na)에 의해 조금 저해된다.

(8) 안정화

N-에틸말레이미드(N-ethylmaleimide), o-페난스롤린(o-phenanthroline), 염화마그네슘, 염화칼슘, 염화망간에 의해 안정화된다.

(9) 정제방법

본 발명의 효소는, 그 효소를 생산하는 미생물로부터 통상의 단백질의 정제방법에 의해, 정제할 수 있다. 예를 들면, 균체를 파쇄 후, 프로타민황산(protamine sulfate)침전을 행하여, 그 원심분리상청을 황산암모늄을 사용하여 염석(salting-out)하고, 더욱이, 음이온교환 크로마토그래피, 소수 크로마토그래피, 친화성(affinity)크로마토그래피, 겔여과 등을 조합시킴으로써, 정제할 수 있다.

본 발명에 있어서의 「탈수소효소」란, 탈수소반응, 즉 수소를 포함하는 화합물로부터 수소가 제거되는 산화반응을 촉매하는 효소를 의미한다. 더욱이 그 효소는, 케톤에 대한 환원활성을 가져, 환원적 조건하에 있어서는, 산화반응의 역반응을 촉매할 수 있다. 따라서 본 발명에 있어서의 「탈수소효소」는, 상기 산화반응의 역반응인 수소를 부가하는 환원반응을 촉매하는 작용을 갖는다. 일반적으로 「데히드로게나아제」, 「산화 환원효소」, 「옥시다아제」 또는 「리덕타아제」 등의 명칭으로 불리는 효소도 동일한 작용을 갖는 경우에는 본 발명에 의한 「탈수소효소」에 포함된다.

본 발명에 있어서, 4-클로로아세토초산에스테르에 대한 환원활성은, 다음과 같이 하여 측정할 수 있다. 인산칼륨완충액(pH 6.5) -100 mM, NADH -0.2 mM, 4-클로로아세토초산에틸 -20 mM 및 효소를 포함하는 반응액을, 30℃에서 반응하여 NADH의 감소에 동반되는 340 nm의 흡광도의 감소를 측정함으로써, 확인할 수 있다. 1U는 1분간 1 μmol의 NADH의 감소를 촉매하는 효소량으로 한다. 또한, 단백질의 정량은, BIORAD사제 단백질 어세이 키트(assay kit)를 사용한 색소결합법(dye binding method)에 의해 행할 수 있다.

한편, (R)-2-옥탄올산화활성은, 다음과 같이 하여 측정할 수 있다. 즉, 트리스-염산완충액(pH 8.5-50 mM), NAD⁺2.5 mM, (R)-2-옥탄올 5 mM 및 효소를 포함하는 반응액을 30℃에서 반응하여, NADH의 생성에 유래하는 340 nm의 흡광도의 증대를 측정함으로써 확인할 수 있다. 1U는 1분간 1 μmol의 NADH의 생성을 촉매하는 효소량으로 한다.

본 발명에 의한 (R)-2-옥탄올탈수소효소는 (R)-2-옥탄올에 대해 높은 산화활성을 갖는다. 또한, 그 효소의 (R)-2-옥탄올의 산화활성은 2-프로판올의 산화활성에 비교하여, 상당히 높은 활성을 나타낸다. 본 발명에 있어서, 기질이 되는 (R)-2-옥탄올에 NAD⁺존재하에서 접촉시켰을 때에, NADH의 증감에 동반되는 340 nm의 흡광도의 단위시간당 변화율이 2-프로판올을 1로 하는 상대활성으로서 2배 이상, 보다 바람직하게는 5배 이상인 경우에, 탈수소효소활성이 상당히 높다고 말할 수 있다.

또한, 본 발명에 있어서 (R)-2-옥탄올탈수소효소가 (R)-2-옥탄올을 「우선적」으로 산화한다고 하는 것은, (R)-2-옥탄올탈수소효소의 2-옥탄올의 R체에 대한 효소활성을 100으로 했을 때, S체에 대한 효소활성이 50 이하, 바람직하게는 20 이하, 더욱 바람직하게는 10 이하인 경우를 말한다.

상기와 같은 이화학적 성질을 갖는 (R)-2-옥탄올탈수소효소는, 이 효소를 생산하는 미생물의 배양물로부터 얻을 수 있다. 예를 들면 피키아속이나 캔디다속 또는 오가타에아속 효모에, 본 발명의 효소를 생산하는 균주를 발견할 수 있다. 피키아속 효모로서는 피키아 ·핀란디카(Pichia finlandica), 피키아 ·쟈디니(Pichia jadinii), 캔디다속 효모로서는 캔디다 ·우틸리스(Candida utilis), 오가타에아속 효모로서는 오가타에아 ·윅커하미(Ogataea wickerhamii)가 특히 본 발명에 의한 (R)-2-옥탄올탈수소효소의 생산능이 우수하다. 본 발명의 (R)-2-옥탄올탈수소효소를 얻기 위해 이용할 수 있는 균주로서, 아래의 것을 예시할 수 있다.

(i) 피키아 ·핀란디카: DSM 70280, DSM 1380

(ii) 피키아 ·쟈디니: DSM 2361, DSM 70167, IFO 0987

(iii) 캔디다 ·우틸리스: IFO 0988, IFO 0626

(iv) 오가타에아 ·윅커하미: IFO 1706

또한, 피키아 ·핀란디카가 생산하는 2차 알코올탈수소효소에 관해서는, 무세포추출액을 사용한 2-프로판올탈수소효소활성을 나타낸 보고가 있다(Biochimica et Biophysica Acta, 716, 298-307, 1982). 그러나 본 발명자 등의 추가시험에 의하면, 이 균주의 무세포추출액에는, 복수의 2-프로판올탈수소효소가 포함되어 있다. 한편, 본 발명의 (R)-2-옥탄올탈수소효소는, 매우 약한 2-프로판올탈수소효소활성 밖에 갖지 않는 소수성분(minor component)이다. 따라서 본 발명의 (R)-2-옥탄올탈수소효소는, 이 문헌기재의 효소와는 명확히 다르다.

상기 미생물은, YM 배지 등의 진균의 배양에 사용되는 일반적인 배지로 배양된다. 특히 피키아 ·핀란디카는 배지중의 탄소원으로서, 글루코오스, 글리세롤 및 메탄올 중 어느 하나를 사용하더라도 양호하게 목적으로 하는 효소를 얻을 수 있다. 캔디다 ·우틸리스는 배지중의 탄소원으로서 특히 메탄올을 사용했을 때에 양호하게 목적으로 하는 효소를 얻을 수 있다. 충분히 증식시킨 후에 균체를 회수하여, 2-메르캅토에탄올(2-mercaptoethanol) 등의 환원제나, 페닐메탄설포닐플루오리드 (phenylmethansulfonyl fluoride; PMFS)와 같은 프로테아제 저해제를 가한 완충액 속에서 파쇄하여 무세포추출액으로 한다. 무세포추출액으로부터, 단백질의 용해도에 따른 분획이나 각종 크로마토그래피 등을 적절히 조합시킴으로써 정제할 수 있다. 단백질의 용해도에 따른 분획방법으로서는, 예를 들면 아세톤이나 디메틸설폭시드와 같은 유기용매에 의한 침전이나 황산암모늄에 의한 염석 등을 이용할 수 있다. 한편 크로마토그래피에는, 양이온교환, 음이온교환, 겔여과, 소수성 크로마토그래피나, 킬레이트, 색소, 항체 등을 사용한 많은 어피티니 크로마토그래피가 공지이다. 보다 구체적으로는, 예를 들면, 페닐-토요펄(Phenyl-Toyopearl)을 사용한 소수 크로마토그래피, DEAE-세파로오스(DEAE-Sepharose)를 사용한 음이온교환 크로마토그래피, 부틸-토요펄(Butyl-Toyopearl)을 사용한 소수 크로마토그래피, 블루-세파로오스(Blue-Sepharose)를 사용한 친화성 크로마토그래피, Superdex 200을사용한 겔여과 등을 거쳐 전기영동적으로 거의 단일 밴드까지 정제할 수 있다.

본 발명은, (R)-2-옥탄올탈수소효소를 코드하는 폴리뉴클레오티드 및 그 호모로그에 관한 것이다. 본 발명에 있어서, 폴리뉴클레오티드는, DNA나 RNA와 같은 천연에 존재하는 폴리뉴클레오티드일 수도 있고, 인공적으로 합성된 뉴클레오티드유도체를 포함하는 폴리뉴클레오티드이더라도 좋다.

본 발명의 (R)-2-옥탄올탈수소효소를 코드하는 폴리뉴클레오티드는, 예를 들면 서열번호: 1에 나타내는 염기서열을 포함한다. 서열번호: 1에 나타내는 염기서열은, 서열번호: 2에 나타내는 아미노산서열을 포함하는 단백질을 코드하고 있어, 이 아미노산서열을 포함하는 단백질은, 본 발명에 의한 (R)-2-옥탄올탈수소효소의 바람직한 태양을 구성한다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는, 서열번호: 2의 아미노산서열에 1 또는 복수의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산서열을 포함하고, 또한 상기 이화학적 성질 (1)-(2)를 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 당업자라면, 서열번호: 1의 염기서열로 된 DNA에 부위특이적 변이도입법(Nucleic Acid Res. 10, pp.6487 (1982), Methods in Enzymol. 100, pp.448 (1983), Molecular Cloning 2nd Edt., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), PCR A Practical Approach IRL Press pp.200 (1991)) 등을 사용하여, 적절히 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가변이를 도입하는 것이 가능하다.

또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는, 서열번호: 1에 나타내어지는 염기서열로 된 DNA와 스트린젠트한 조건으로 하이브리다이즈할 수 있는 폴리뉴클레오티드이고, 또한 상기 이화학적 성질 (1)-(2)를 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드도 포함한다. 스트린젠트한 조건으로 하이브리다이즈할 수 있는 폴리뉴클레오티드란, 서열번호: 1의 염기서열 중 임의의 적어도 20개, 바람직하게는 적어도 30개, 예를 들면 40, 60 또는 100개의 연속된 서열을 하나 또는 복수 선택한 DNA를 프로브 DNA로 하여, 예를 들면 ECL direct nucleic acid labeling and detection system(Amersham Pharmacia Biotech사제)을 사용하여, 매뉴얼에 기재된 조건(wash: 42℃, 0.5x SSC를 포함하는 primary wash buffer)하에서, 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드를 가리킨다.

스트린젠트한 조건하에서 서열번호: 1의 염기서열로 된 DNA와 하이브리다이즈할 수 있는 폴리뉴클레오티드에는, 서열번호: 1과 유사한 염기서열을 포함하는 것이 포함된다. 이러한 폴리뉴클레오티드는, 서열번호: 2의 아미노산서열로 된 단백질과 기능적으로 동등한 단백질을 코드하고 있을 가능성이 높다.

더욱이, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는, 서열번호: 2에 나타내어지는 아미노산서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80% 또는 90%, 보다 바람직하게는 95% 이상의 호모로지를 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 단백질의 호모로지검색은, 예를 들면 SWISS-PROT, PIR 등의 단백질의 아미노산서열에 관한 데이터베이스나 DNA Databank of JAPAN(DDBJ), EMBL, Gene-Bank 등의 DNA에 관한 데이터베이스, DNA 서열을 토대로 한 예상 아미노산서열에 관한 데이터베이스 등을 대상으로, FASTA program이나 BLAST program 등을 사용하여, 예를 들면, 인터넷상에서 행할 수 있다. 서열번호: 2의 아미노산서열을 사용하여 DDBJ를 대상으로BLAST program을 사용하여 호모로지검색을 행한 결과, 기지의 단백질 중에서도 가장 높은 호모로지를 나타낸 것은, 바실루스 ·서브틸리스(Bacillus subtilis)의 글루코오스 데히드로게나아제의 43%(Identity), 61%(Positives)였다. 본 발명의 70% 이상의 호모로지란, 예를 들면, BLAST program을 사용한 Positive의 상동성값을 나타낸다.

본 발명에 있어서, 상기 이화학적 성질 (1)-(2)를 갖는 단백질을 코드하는 이들 폴리뉴클레오티드는, 특히 서열번호: 1의 염기서열로 된 폴리뉴클레오티드에 대한 호모로그라고 한다. 호모로그는, 변이의 도입 외에, 서열번호: 1의 염기서열을 토대로 다른 생물로부터 PCR 클로닝이나 하이브리다이즈에 의해 단리하는 것도 가능하다. 예를 들면 서열번호: 1의 염기서열은,Pichia finlandica로부터 단리된 유전자인 것이다. 이 밖에, 피키아 ·쟈디니(Pichia jadinii), 캔디다속 효모로서 캔디다 ·우틸리스(Candida utilis), 또는 오가타에아속 효모로서 오가타에아 ·윅커하미(Ogataea wickerhamii) 등의 미생물로부터 얻을 수 있는 상기 이화학적 성질 (1)-(2)를 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드도 본 발명에 포함된다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는, 본 발명의 (R)-2-옥탄올탈수소효소의 유전자공학적인 제조에 유용하다. 또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의해, 케톤이나 알코올의 제조에 유용한 (R)-2-옥탄올탈수소효소활성을 갖는 미생물을 유전자공학적으로 만들어낼 수 있다.

본 발명은, 서열번호: 2의 아미노산서열을 가지고, 또한 상기 이화학적 성질 (1)-(2)를 갖는 (R)-2-옥탄올탈수소효소 및 그 호모로그를 포함한다. 서열번호: 2에 나타내는 아미노산서열을 포함하는 단백질은, 본 발명에 의한 (R)-2-옥탄올탈수소효소의 바람직한 태양을 구성한다.

본 발명의 (R)-2-옥탄올탈수소효소의 호모로그란, 서열번호: 2의 아미노산서열에 1 또는 복수의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산서열을 포함한다. 당업자라면, 서열번호: 1의 염기서열로 된 DNA에 부위특이적 변이도입법(Nucleic Acid Res. 10, pp.6487 (1982), Methods in Enzymol. 100, pp.448 (1983), Molecular Cloning 2nd Edt., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), PCR A Practical Approach IRL Press pp.200 (1991)) 등을 사용하여, 적절히 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가변이를 도입함으로써 (R)-2-옥탄올탈수소효소의 호모로그를 코드하는 DNA를 얻을 수 있다. 그 (R)-2-옥탄올탈수소효소의 호모로그를 코드하는 DNA를 숙주에 도입하여 발현시킴으로써, 서열번호: 2의 (R)-2-옥탄올탈수소효소의 호모로그를 얻는 것이 가능하다.

더욱이, 본 발명의 (R)-2-옥탄올탈수소효소의 호모로그란, 서열번호: 2에 나타내어지는 아미노산서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80% 또는 90%, 보다 바람직하게는 95% 이상의 호모로지를 갖는 단백질을 말한다. 단백질의 호모로지검색은, 예를 들면 SWISS-PROT, PIR 등의 단백질의 아미노산서열에 관한 데이터베이스나 DNA Databank of JAPAN(DDBJ), EMBL, Gene-Bank 등의 DNA에 관한 데이터베이스, DNA 서열을 토대로 한 예상 아미노산서열에 관한 데이터베이스 등을 대상으로, FASTA program이나 BLAST program 등을 사용하여, 예를 들면, 인터넷상에서 행할 수 있다. 서열번호: 2의 아미노산서열을 사용하여 DDBJ를 대상으로 BLAST program을 사용하여 호모로지검색을 행한 결과, 기지의 단백질 중에서 가장 높은 호모로지를 나타낸 것은, 바실루스 ·서브틸리스(Bacillus subtilis)의 글루코오스 데히드로게나아제(glucose dehydrogenase)의 43%(Identity), 61%(Positives)였다. 본 발명의 70% 이상의 호모로지란, 예를 들면, BLAST program을 사용한 Positive의 상동성값을 나타낸다.

본 발명의 (R)-2-옥탄올탈수소효소를 코드하는 DNA는, 예를 들면 아래와 같은 방법에 의해 단리할 수 있다.

본 발명의 효소를 정제 후, N말단 아미노산서열을 해석하고, 더욱이, 리질 엔도펩티다아제(lysyl endopeptidase), V8 프로테아제 등의 효소에 의해 절단 후, 역상 액체 크로마토그래피 등에 의해 펩티드단편을 정제 후 프로테인 시퀀서(protein sequencer)에 의해 아미노산서열을 해석함으로써 복수의 아미노산서열을 결정할 수 있다.

부분적인 아미노산서열이 명확해지면, 그것을 코드하는 염기서열을 추정할 수 있다. 추정된 염기서열, 또는 서열번호: 1에 나타내는 염기서열을 토대로 PCR용 프라이머를 설계하여, 효소생산주의 염색체 DNA 또는 cDNA 라이브러리를 주형으로 하여, PCR을 행함으로써 본 발명의 DNA의 일부를 얻을 수 있다.

더욱이, 얻어진 DNA 단편을 프로브로서, 효소생산주의 염색체 DNA의 제한효소 소화물을 파지, 플라스미드 등에 도입하고, 대장균을 형질전환하여 얻어진 라이브러리나 cDNA 라이브러리를 이용하여, 콜로니하이브리다이제이션(colony hybridization), 플라크하이브리다이제이션(plaque hybridization)등에 의해, 본발명의 DNA를 얻을 수 있다.

또한, PCR에 의해 얻어진 DNA 단편의 염기서열을 해석하여, 얻어진 서열로부터, 기지의 DNA 바깥쪽으로 신장시키기 위한 PCR 프라이머를 설계하여, 효소생산주의 염색체 DNA를 적당한 제한효소로 소화 후, 자기고리화반응에 의해 DNA를 주형으로서 역PCR을 행함으로써(Genetics 120, 621-623 (1988)), 또한 RACE법(Rapid Amplification of cDNA End, 「PCR 실험 매뉴얼」p25-33, HBJ 출판국) 등에 의해 본 발명의 DNA를 얻는 것도 가능하다.

또한 본 발명의 DNA는, 상기의 방법에 의해 클로닝된 게놈 DNA, 또는 cDNA 외에, 합성에 의해 얻는 것도 가능하다.

이와 같이 하여 단리된, 본 발명에 의한 (R)-2-옥탄올탈수소효소를 코드하는 DNA를 공지의 발현벡터에 삽입함으로써, (R)-2-옥탄올탈수소효소 발현벡터가 제공된다. 또한, 이 발현벡터로 형질전환한 형질전환체를 배양함으로써, 본 발명의 (R)-2-옥탄올탈수소효소를 재조합체로부터 얻을 수 있다.

본 발명에 있어서 NAD⁺를 보효소로 하는 (R)-2-옥탄올탈수소효소를 발현시키기 위해, 형질전환의 대상이 되는 미생물은, NAD⁺를 보효소로 하는 (R)-2-옥탄올탈수소효소활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA를 포함하는 재조합 벡터에 의해 형질전환되어, NAD⁺를 보효소로 하는 (R)-2-옥탄올탈수소효소활성을 발현할 수 있는 생물이라면 특별히 제한은 없다. 이용 가능한 미생물로서는, 예를 들면 아래와 같은 미생물을 나타낼 수 있다.

에세리히아(Escherichia)속

바실루스(Bacillus)속

슈도모나스(Pseudomonas)속

세라티아(Serratia)속

브레비박테리움(Brevibacterium)속

코리네박테리움(Corynebacterium)속

스트렙토코커스(Streptococcus)속

락토바실루스(Lactobacillus)속 등 숙주벡터계가 개발되어 있는 세균

로도코커스(Rhodococcus)속

스트렙토마이세스(Streptomyces)속 등 숙주벡터계가 개발되어 있는 방선균(actinomycetes)

사카로마이세스(Saccharomyces)속

클라이베로마이세스(Kluyveromyces)속

쉬조사카로마이세스(Schizosaccharomyces)속

지고사카로마이세스(Zygosaccharomyces)속

야로위아(Yarrowia)속

트리코스포론(Trichosporon)속

로도스포리디움(Rhodosporidium)속

피키아(Pichia)속

캔디다(Candida)속 등의 숙주벡터계가 개발되어 있는 효모

뉴로스포라(Neurospora)속

아스페르길루스(Aspergillus)속

세팔로스포리움(Cephalosporium)속

트리코데르마(Trichoderma)속 등의 숙주벡터계가 개발되어 있는 곰팡이

형질전환체의 제작을 위한 순서 및 숙주에 적합한 재조합 벡터의 구축은, 분자생물학, 생물공학, 유전자공학의 분야에 있어서 관용되고 있는 기술에 준하여 행할 수 있다(예를 들면, Sambrook 등, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratories). 미생물속에서, 본 발명의 NAD⁺를 보효소로 하는 (R)-2-옥탄올탈수소효소유전자를 발현시키기 위해서는, 먼저 미생물속에서 안정하게 존재하는 플라스미드벡터나 파지벡터속에 이 DNA를 도입하여, 그 유전정보를 전사 ·번역시킬 필요가 있다. 그를 위해서는, 전사 ·번역을 제어하는 유닛에 해당하는 프로모터를 본 발명의 DNA 사슬의 5'-측 상류에, 보다 바람직하게는 터미네이터를 3'-측 하류에, 각각 함입하면 좋다. 이 프로모터, 터미네이터로서는, 숙주로서 이용하는 미생물속에 있어서 기능하는 것이 알려져 있는 프로모터, 터미네이터를 사용할 필요가 있다. 이들 각종 미생물에서 이용 가능한 벡터, 프로모터, 터미네이터 등에 관하여 「미생물학 기초강좌 8 유전자공학 ·교리츠출판」, 특히 효모에 관해서는, Adv. Biochem. Eng. 43, 75-102 (1990), Yeast 8, 423-488 (1992) 등에 상세하게 기술되어 있다.

예를 들면 에세리히아속, 특히 대장균 에세리히아 ·콜리(Escherichia coli)에 있어서는, 플라스미드벡터로서, pBR, pUC계 플라스미드를 이용할 수 있고, lac(β-galactosidase), trp(tryptophan operon), tac, trc(lac, trp의 융합), λ파지 PL, PR 등에 유래하는 프로모터 등을 이용할 수 있다. 또한, 터미네이터로서는, trpA 유래, 파지 유래, rrnB ribosomal RNA 유래의 터미네이터 등을 사용할 수 있다.

바실루스속에 있어서는, 벡터로서 pUB110계 플라스미드, pC194계 플라스미드 등이 이용 가능하고, 염색체에 인테그레이션(integration)하는 것도 가능하다. 또한, 프로모터, 터미네이터로서 apr(알칼리 프로테아제), npr(중성 프로테아제), amy(α-아밀라아제) 등을 이용할 수 있다.

슈도모나스속에 있어서는, 슈도모나스 ·푸티다(Pseudomonas putida), 슈도모나스 ·세파시아(Pseudomonas cepacia) 등에서 숙주벡터계가 개발되어 있다. 톨루엔화합물의 분해에 관여하는 TOL 플라스미드를 기본으로 한 광숙주역벡터(board-host-range vector)(RSF1010 등에 유래하는 자율적 복제에 필요한 유전자를 포함한다) pKT240 등이 이용 가능하고, 프로모터, 터미네이터로서, 리파아제(일본국 특개평5-284973)유전자 등을 이용할 수 있다.

브레비박테리움속 특히, 브레비박테리움 ·락토퍼멘텀(Brevibacterium lactofermentum)에 있어서는, pAJ43(Gene 39, 281 (1985)) 등의 플라스미드벡터가 이용 가능하다. 프로모터, 터미네이터로서는, 대장균에서 사용되고 있는 프로모터, 터미네이터가 그대로 이용 가능하다.

코리네박테리움속, 특히 코리네박테리움 ·글루타미컴(Corynebacteriumglutamicum)에 있어서는, pCS11(일본국 특개소57-183799), pCB101(Mol. Gen. Genet. 196, 175 (1984)) 등의 플라스미드벡터가 이용 가능하다.

스트렙토코커스(Streptococcus)속에 있어서는, pHV1301(FEMS Microbiol. Lett. 26, 239 (1985), pGK1(Appl. Environ. Microbiol. 50, 94 (1985)) 등이 플라스미드벡터로서 이용 가능하다.

락토바실루스(Lactobacillus)속에 있어서는, 스트렙토코커스속용으로 개발된 pAMβ1(J. Bacteriol. 137, 614 (1979)) 등이 이용 가능하고, 프로모터로서 대장균에서 이용되고 있는 것이 이용 가능하다.

로도코커스(Rhodococcus)속에 있어서는, 로도코커스 ·로도크로우스 (Rhodococcus rhodochrous)로부터 단리된 플라스미드벡터가 사용 가능하다(J. Gen. Microbiol. 138, 1003 (1992)).

스트렙토마이세스(Streptomyces)속에 있어서는, Hopwood 등의 Gentic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratories (1985)에 기재된 방법에 따라, 플라스미드를 구축할 수 있다. 특히, 스트렙토마이세스 ·리비단스(Streptomyces lividans)에 있어서는, pIJ486(Mol. Gen. Genet. 203, 468-478 (1986)), pKC1064(Gene 103, 97-99 (1991)), pUWL-KS(Gene 165, 149-150 (1995))를 사용할 수 있다. 또한, 스트렙토마이세스 ·버지니아(Streptomyces virginiae)에 있어서도, 동일한 플라스미드를 사용할 수 있다(Actinomycetol. 11, 46-53 (1997)).

사카로마이세스(Saccharomyces)속, 특히 사카로마이세스 ·세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)에 있어서는, YRp계, YEp계, YCp계, YIp계 플라스미드가 이용 가능하고, 염색체내에 다코피(multicopy)존재하는 리보솜 DNA와의 상동 재조합을 이용한 인테그레이션벡터(EP 537456 등)는, 다코피로 유전자를 도입할 수 있고, 또한 안정하게 유전자를 유지할 수 있기 때문에 지극히 유용하다. 또한, ADH(알코올탈수소효소), GAPDH(글리세르알데히드-3-인산탈수소효소), PHO(산성 포스파타아제) , GAL(β-갈락토시다아제), PGK(포스포글리세린산 키나아제), ENO(에놀라아제) 등의 프로모터, 터미네이터가 이용 가능하다.

클라이베로마이세스속, 특히 클라이베로마이세스 ·락티스(Kluyveromyces lactis)에 있어서는, 사카로마이세스 ·세레비지아에 유래 2 ㎛계 플라스미드, pKD1계 플라스미드(J. Bacteriol. 145, 382-390(1981)), 킬러활성(killer activity)에 관여하는 pGKl1 유래 플라스미드, 클라이베로마이세스속에 있어서의 자율증식유전자 KARS계 플라스미드, 리보솜 DNA 등과의 상동 재조합에 의해 염색체속에 인테그레이션 가능한 벡터 플라스미드(EP 537456) 등이 이용 가능하다. 또한, ADH, PGK 등에 유래하는 프로모터, 터미네이터가 이용 가능하다.

쉬조사카로마이세스(Schizosaccharomyces)속에 있어서는, 쉬조사카로마이세스 ·폼베(Schizosaccharomyces pombe)유래의 ARS(자율복제에 관여하는 유전자) 및 사카로마이세스 ·세레비지아에 유래의 영양요구성(auxotrophy)을 상보하는 선택마커를 포함하는 플라스미드벡터가 이용 가능하다(Mol. Cell. Biol. 6, 80 (1986)). 또한, 쉬조사카로마이세스 ·폼베 유래의 ADH 프로모터 등을 이용할 수 있다(EMBO J. 6, 729 (1987)). 특히, pAUR224는, 다까라주조로부터 시판되고 있어 용이하게이용할 수 있다.

지고사카로마이세스속(Zygosaccharomyces)에 있어서는, 지고사카로마이세스 ·로욱시(Zygosaccharomyces rouxii) 유래의 pSB3(Nucleic Acids Res. 13, 4267 (1985)) 등에 유래하는 플라스미드벡터가 이용 가능하고, 사카로마이세스 ·세레비지아에 유래 PH05 프로모터나, 지고사카로마이세스 ·로욱시 유래 GAP-Zr(글리세르알데히드-3-인산탈수소효소)의 프로모터(Agri. Biol. Chem. 54, 2521 (1990)) 등이 이용 가능하다.

피키아(Pichia)속에 있어서는, 피키아 ·파스토리스(Pichia pastoris) 등에 피키아 유래 자율복제에 관여하는 유전자(PARS1, PARS2) 등을 이용한 숙주벡터계가 개발되어 있어(Mol. Cell. Biol. 5, 3376 (1985)), 고농도 배양과 메탄올로 유도 가능한 AOX 등 강한 프로모터를 이용할 수 있다(Nucleic Acids Res. 15, 3859 (1987)). 또한, 피키아 ·안거스타(Pichia angusta, 옛이름 한제눌라 ·폴리모파Hansenula polymorpha)에 있어서 숙주벡터계가 개발되어 있다. 벡터로서는, 피키아 ·안거스타 유래 자율복제에 관여하는 유전자(HARS1, HARS2)도 이용 가능하지만, 비교적 불안정하기 때문에, 염색체로의 다코피 인테그레이션이 유효하다(Yeast 7, 431-443 (1991)). 또한, 메탄올 등으로 유도되는 AOX(알코올옥시다아제), FDH(포름산탈수소효소)의 프로모터 등이 이용 가능하다.

캔디다(Candida)속에 있어서는, 캔디다 ·말토오사(Candida maltosa), 캔디다 ·알비칸스(Candida albicans), 캔디다 ·트로피칼리스(Candida tropicalis), 캔디다 ·우틸리스(Candida utilis) 등에 있어서 숙주벡터계가 개발되어 있다. 캔디다 ·말토오사에 있어서는 캔디다 ·말토오사 유래 ARS가 클로닝되어(Agri. Biol. Chem. 51, 51, 1587 (1987)), 이를 이용한 벡터가 개발되어 있다. 또한, 캔디다 ·우틸리스에 있어서는, 염색체 인테그레이션타입의 벡터는 강력한 프로모터가 개발되어 있다(일본국 특개평08-173170).

아스페르길루스(Aspergillus)속에 있어서는, 아스페르길루스 ·니거(Aspergillus niger), 아스페르길루스 ·오리지(Aspergillus oryzae) 등이 곰팡이 중에서 가장 잘 연구되어 있어, 플라스미드나 염색체로의 인테그레이션이 이용 가능하고, 균체외 프로테아제나 아밀라아제 유래의 프로모터가 이용 가능하다(Trends in Biotechnology 7, 283-287 (1989)).

트리코데르마(Trichoderma)속에 있어서는, 트리코데르마 ·리제이 (Trichoderma reesei)를 이용한 호스트벡터(host-vector)계가 개발되어, 균체외 셀룰라아제 유전자 유래 프로모터 등을 이용할 수 있다(Biotechnology 7, 596-603 (1989)).

또한, 미생물 이외에서도, 식물, 동물에 있어서 여러 숙주 ·벡터계가 개발되어 있어, 특히 누에와 같은 곤충(Nature 315, 592-594(1985))이나 채종(菜種), 옥수수, 감자 등의 식물속에 대량으로 이종 단백질을 발현시키는 계가 개발되어 있어, 적합하게 이용할 수 있다.

본 발명에 있어서 사용하는 4-할로아세토초산에스테르 환원효소생산능을 갖는 미생물은, NAD⁺의존성 (R)-2-옥탄올탈수소효소생산능을 갖는 피키아속, 캔디다속 및 오가타에아속에 속하는 모든 균주, 돌연변이주, 변종, 유전자 조작기술의 이용에 의해 작성된 본 발명의 효소생산능을 획득한 형질전환주를 포함한다.

또한, 상기의 방법으로 얻어지는 본 발명의 (R)-2-옥탄올탈수소효소를 발현하는 균주는, 본 발명의 효소의 제조나, 아래에 기술하는 2차 알코올 및 케톤의 제조에 사용할 수 있다.

즉 본 발명은, 상기 (R)-2-옥탄올탈수소효소를 이용한 케톤의 환원에 의한 2차 알코올의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 (R)-2-옥탄올탈수소효소는, NADPH에 비해 저렴하고 안정된 NADH를 보효소로서 이용할 수 있는 것으로부터, 공업적인 이용에 있어서 유리하다. 본 발명의 효소, 효소를 포함하는 배양물, 그 처리물을 반응용액과 접촉시킴으로써, 목적으로 하는 효소반응을 행하게 할 수 있다.

또한, 효소와 반응용액의 접촉형태는 이들 구체예에 한정되지 않는다. 반응용액은, 기질이나 효소반응에 필요한 보효소인 NADH를 효소활성의 발현에 바람직한 환경을 주는 적당한 용매에 용해한 것이다. 본 발명에 있어서의 (R)-2-옥탄올탈수소효소를 포함하는 미생물의 처리물에는, 구체적으로는 계면활성제나 톨루엔 등의 유기용매처리에 의해 세포막의 투과성을 변화시킨 미생물, 또는 글래스 비드(glass beads)나 효소처리에 의해 균체를 파쇄한 무세포추출액이나 그것을 부분정제한 것 등이 포함된다.

본 발명에 의한 2차 알코올의 제조방법에 있어서의 케톤으로서는, 아세토페논, 2-옥타논, 4-할로아세토초산에스테르유도체, 일반식 I

(식중, X₁및 X₂는, 각각 할로겐원자를 의미한다)으로 나타내어지는 아세토닐옥시벤젠유도체, 브로모메틸시클로프로필케톤, 2-아세틸부티로락톤(2-acetylbutyrolactone), 5-클로로-2-펜타논 등이 바람직하게 사용된다. 또한 본 발명에 있어서 4-할로아세토초산에스테르유도체란, 아세토초산에스테르의 4번 위치가 임의의 할로겐원자로 치환된 화합물을 말한다. 또한 상기 아세토초산에스테르를 구성하는 알코올은, 임의의 알코올이더라도 좋다. 4-할로아세토초산에스테르유도체의 할로겐으로서는, 브롬, 염소, 요오드를 들 수 있고, 특히 염소가 바람직하게 사용된다. 에스테르로서는, 메틸에스테르, 에틸에스테르, 프로필에스테르, 이소프로필에스테르, 부틸에스테르, 옥틸에스테르, 벤질에스테르 등의 직쇄, 분기쇄, 방향족치환을 포함하는 알코올의 에스테르를 들 수 있지만, 에틸에스테르가 가장 바람직하게 사용된다. 4-할로아세토초산에스테르유도체로서는, 2번 위치에 직쇄 또는 분기쇄를 포함하는 알킬기, 염소, 브롬, 요오드 등의 할로겐을 포함하는 유도체 등을 들 수 있다. 아세토닐옥시벤젠유도체의 할로겐으로서는, 브롬, 염소, 요오드, 불소를 들 수 있고, 특히 불소가 바람직하게 사용된다. 특히, 2-아세토닐옥시-3,4-디플루오로니트로벤젠은, 합성항균제 오플록사신의 합성중간체인 2,3-디플루오로-6-니트로-[[(R)-2-히드록시프로필]옥시]벤젠을 주는 유용한 화합물이다.

또한 본 발명은, 상기 (R)-2-옥탄올탈수소효소의 2차 알코올의 산화에 의한 케톤의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 (R)-2-옥탄올탈수소효소, 또는, 그 효소를 생산하는 미생물 또는 그 처리물을 2차 알코올에 작용시켜, 반응산물인 케톤을 제조할 수 있다. 본 발명에 있어서 기질로 할 수 있는 2차 알코올에는, 2-프로판올, 2-부탄올, 2-옥탄올, 1-페닐에탄올 등, 할로겐, 방향족치환을 갖는 알킬알코올 등이 이용 가능하다.

더욱이, 본 발명의 효소, 또는, 그 효소를 생산하는 미생물 또는 그 처리물은, 라세미체 알코올을 기질로서, (R)-2-옥탄올탈수소효소의 비대칭산화능을 이용한 광학활성 알코올의 생산에도 이용할 수 있다. 즉, 본 발명의 효소에 의해, 광학이성체의 한쪽을 우선적으로 산화하여, 잔존하는 광학활성 알코올을 취득함으로써, 광학활성 알코올이 생산된다. 보다 구체적으로는, 2-옥탄올 또는 1-페닐에탄올의 (S)체와 (R)체가 혼재하는 라세미체에, 본 발명에 의한 (R)-2-옥탄올탈수소효소를 NAD⁺공존하에서 작용시키는 것이다. 입체선택성이 우수한 본 발명에 의한 (R)-2-옥탄올탈수소효소는, (R)체에 대해 특이적으로 작용하여, 이를 산화하여 케톤으로 하지만, (S)체의 알코올에는 작용하지 않기 때문에, 바로 (S)체의 비율이 커진다. 이렇게 하여 축적되는 (S)체를 분리하면, 최종적으로 라세미체로부터 (S)체의 알코올을 회수할 수 있다. 이렇게 하여 (RS)-2-옥탄올로부터 (S)-2-옥탄올, (RS)-페닐에탄올로부터 (S)-페닐에탄올 등을 얻을 수 있다.

또한 본 발명에 있어서의 「광학활성 알코올」이란, 어느 한 광학이성체가 다른 광학이성체 보다 많이 포함되는 알코올, 바람직하게는 50% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 광학순도(enantiomeric excess; ee)를 갖는 알코올을 의미한다. 더욱이, 본 발명의 「광학이성체」는, 일반적으로 「광학활성체」 및 「거울상 이성체(enantiomer)」라 불리는 경우도 있다.

상기 본 발명에 의한 케톤제조방법에 있어서는, NADH의 재생계를 조합시킬 수 있다. (R)-2-옥탄올탈수소효소에 의한 산화반응에 부수하여, NAD⁺로부터 NADH가 생성된다. NADH로부터 NAD⁺로의 재생은, 미생물이 함유하는 NADH로부터 NAD⁺를 재생하는 효소(계)에 의해 행할 수 있다. 또한, NADH로부터 NAD⁺를 생성하는 능력을 갖는 미생물 또는 효소, 예를 들면, 글루타민산탈수소효소, NADH 옥시다아제, NADH 탈수소효소 등을 반응계에 첨가함으로써 행하는 것이 가능하다. 더 나아가서는, 본 발명의 효소의 기질 특이성을 이용하여, 반응계에 2-옥타논, 아세토페논 등 환원반응의 기질을 첨가하여, 그 효소 자신에 의해 NADH로부터의 NAD⁺의 재생을 동시에 행하는 것도 가능하다.

마찬가지로 알코올의 제조방법에 있어서는, NAD⁺의 재생계를 조합시킬 수 있다. 환원반응에 부수하여, NADH로부터 NAD⁺가 생성된다. NAD⁺로부터 NADH로의 재생은, 미생물이 갖는 NAD⁺환원능(e.g., glycolysis)을 사용하여 행할 수 있다. 이들 NAD⁺환원능은, 반응계에 글루코오스 또는 에탄올을 첨가함으로써, 증강하는 것이 가능하다. 또한, NAD⁺로부터 NADH를 생성하는 능력을 갖는 미생물이나 그 처리물, 효소를 반응계에 첨가함으로써도 행할 수 있다. 포름산탈수소효소, 글루코오스탈수소효소, 말산탈수소효소, 글리세롤탈수소효소, 알코올탈수소효소 등을 포함하는 미생물, 그 처리물 및 정제효소를 사용하여 NADH의 재생을 행할 수 있다. 예를 들면, 상기 글루코오스탈수소효소의 경우에는, 글루코오스로부터 δ-글루콘산락톤(δ-gluconolactone)으로의 변환을 이용함으로써, NADH의 재생이 행해진다. 또한, 본 발명의 (R)-2-옥탄올탈수소효소의 성질을 이용하여, 반응계에 2-옥탄올 등 본 발명 효소의 산화반응의 기질을 첨가함으로써, 그 효소 자신을 사용하여 NADH의 재생을 행하는 것도 가능하다.

이들 NADH 재생에 필요한 반응을 구성하는 성분은, 본 발명에 의한 알코올의 제조를 위한 반응계에 첨가, 또는 고정화한 것을 첨가할 수 있다. 또는 NADH의 교환이 가능한 막을 사이에 두고 접촉시킬 수 있다.

또한, 본 발명의 DNA를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환한 미생물을, 생존한 상태에서 상기 알코올의 제조방법에 이용하는 경우에는, NADH 재생을 위한 부가적인 반응계를 불필요로 할 수 있는 경우가 있다. 즉, NADH 재생활성이 높은 미생물을 사용함으로써, 형질전환체를 사용한 환원반응에 있어서, NADH 재생용 효소를 첨가하지 않고 효율적인 반응을 행할 수 있다. 더욱이, NADH 재생에 이용 가능한글루코오스탈수소효소, 포름산탈수소효소, 알코올탈수소효소, 아미노산탈수소효소, 유기산탈수소효소(말산탈수소효소 등) 등의 유전자를, 본 발명의 NAD⁺의존성 (R)-2-옥탄올탈수소효소를 코드하는 DNA와 동시에 숙주에 도입함으로써, 보다 효율적인 NADH 재생효소와 NAD⁺의존성 (R)-2-옥탄올탈수소효소의 발현, 환원반응을 행하는 것도 가능하다. 이들 2개 또는 그 이상의 유전자의 숙주로의 도입에는, 불화합성(incompatibility)을 피하기 위해 복제기원이 다른 복수의 벡터에 따로 따로 유전자를 도입한 재조합 벡터에 의해 숙주를 형질전환하는 방법이나, 단일 벡터에 양쪽 유전자를 도입하는 방법, 또는 양쪽 유전자를 염색체속에 도입하는 방법 등을 이용할 수 있다.

본 발명에 있어서의 NADH 재생에 이용 가능한 글루코오스탈수소효소로서, 바실루스 ·서브틸리스(Bacillus subtilis)에 유래하는 글루코오스탈수소효소를 나타낼 수 있다. 또한, 포름산탈수소효소로서는 마이코박테리움 ·박카에(Mycobacterium vaccae)에 유래하는 포름산수소효소를 나타낼 수 있다. 이들 효소를 코드하는 유전자는 이미 단리되어 있다. 또는 이미 명확해져 있는 그 염기서열을 토대로, PCR이나 하이브리다이즈 스크리닝에 의해, 해당 미생물로부터 취득하는 것도 가능하다.

단일 벡터속에 복수의 유전자를 도입하는 경우에는, 프로모터, 터미네이터 등 발현제어에 관련된 영역을 각각의 유전자에 연결하는 방법이나 락토오스오페론과 같은 복수의 시스트론(cistron)을 포함하는 오페론으로서 발현시키는 것도 가능하다.

본 발명의 효소를 사용한 산화반응 또는 환원반응은, 수중 또는 물에 용해하기 어려운 유기용매, 예를 들면, 초산에틸, 초산부틸, 톨루엔, 클로로포름, n-헥산 등의 유기용매중에서, 또는 에탄올이나 아세톤 등의 수성 매체와의 2상(相)혼합계중에서 행할 수 있다.

본 발명의 반응은, 고정화효소, 막리액터(membrane reactor)등을 이용하여 행하는 것도 가능하다.

본 발명의 (R)-2-옥탄올탈수소효소에 의한 효소반응은, 아래의 조건으로 행할 수 있다.

·반응온도: 4-60℃, 바람직하게는 10-37℃

·pH: 3-11, 바람직하게는 5-10, 더욱 바람직하게는 pH 6.0-9.0

·기질농도: 0.01-90%, 바람직하게는 0.1-30%

반응계에는 필요에 따라 보효소 NAD⁺또는 NADH를 0.001 mM-100 mM, 바람직하게는, 0.01-10 mM 첨가할 수 있다. 또한, 기질은 반응개시시에 일괄하여 첨가하는 것도 가능하지만, 반응액속의 기질농도가 지나치게 높아지지 않도록 연속적, 또는 비연속적으로 첨가하는 것이 바람직하다.

NADH 재생을 위해 반응계에 첨가되는 화합물, 예를 들면 글루코오스탈수소효소를 이용하는 경우의 글루코오스, 포름산탈수소효소를 이용하는 경우의 포름산, 알코올탈수소효소를 이용하는 경우의 에탄올 또는 2-프로판올 등은, 기질케톤에 대해 몰비로 0.1-20, 바람직하게는 0.5-5배 과잉으로 첨가할 수 있다. NADH 재생용 효소, 예를 들면 글루코오스탈수소효소, 포름산탈수소효소, 알코올탈수소효소 등은, 본 발명의 NAD⁺의존성 (R)-2-옥탄올탈수소효소에 비교하여 효소활성으로 0.1-100배, 바람직하게는 0.5-20배 정도 첨가할 수 있다.

본 발명의 케톤의 환원에 의해 생성되는 알코올, 라세미알코올의 비대칭산화에 의해 생성되는 알코올의 정제는, 균체, 단백질의 원심분리, 막처리 등에 의한 분리, 용매추출, 증류 등을 적절히 조합시킴으로써 행할 수 있다.

예를 들면 4-할로-3-히드록시낙산에스테르에서는, 미생물균체를 포함하는 반응액을 원심분리하여, 미생물균체를 제거한 후, 그 상청에 초산에틸, 톨루엔 등의 용매를 첨가하여, 4-할로-3-히드록시낙산에스테르를 용매층에 추출한다. 이것을 상분리(相分離)후, 증류함으로써 순도 높은 4-할로-3-히드록시낙산에스테르를 정제할 수 있다.

이들 각종 합성반응에 이용하는 본 발명의 효소는, 정제효소에 한정되지 않고, 부분정제효소, 본 효소를 포함하는 미생물균체, 그 처리물도 포함된다. 또한 본 발명에 있어서의 처리물이란, 균체, 정제효소, 또는 부분정제효소 등을 여러 방법으로 고정화처리한 것을 총칭하여 나타내는 용어이다. 본 발명의 효소반응을 구성하는 효소는, 고정화하여 사용하는 것도 가능하다. 효소를 고정화하는 방법은, 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 글루타르알데히드, 아크릴아미드, κ-카라기난(κ-carrageenan), 알긴산칼슘, 이온교환 수지, 셀라이트(Celite)등을 사용하여효소를 고정화하는 방법이 공지이다. 본 발명의 반응은, 막리액터 등을 이용하여 행하는 것도 가능하다. 막 리액터를 구성할 수 있는 막으로서는, 한외여과막, 소수성 막, 양이온막, 나노필트레이션막(nanofiltration membrane)(J. Ferment. Bioeng. 83, 54-58(1997)) 등을 나타낼 수 있다.

또한 본 명세서에 있어서 인용된 모든 선행기술문헌은, 참조로서 본 명세서서에 추가되어 있다.

도면의 간단한 설명

도1은, 피키아 ·핀란디카로부터 정제한 (R)-2-옥탄올탈수소효소 효소활성의, pH 변화에 의한 영향을 나타내는 도. 세로축은 (R)-2-옥탄올탈수소효소의 최대활성을 100으로 했을 때의 상대활성을 나타낸다.

도2는, 피키아 ·핀란디카로부터 정제한 (R)-2-옥탄올탈수소효소의 4-클로로아세토초산에틸환원활성의 pH 변화에 의한 영향을 나타내는 도. 세로축은 최대활성을 100으로 했을 때의 상대활성을 나타낸다.

도3은, 피키아 ·핀란디카로부터 정제한 (R)-2-옥탄올탈수소효소의 효소활성의, 산화활성의 온도변화에 의한 영향을 나타내는 도. 세로축은 최대활성을 100으로 했을 때의 상대활성을 나타낸다.

도4는, 피키아 ·핀란디카로부터 정제한 (R)-2-옥탄올탈수소효소의 4-클로로아세토초산에틸환원활성의, 온도변화에 의한 영향을 나타내는 도. 세로축은 최대활성을 100으로 했을 때의 상대활성을 나타낸다.

도5는, 피키아 ·핀란디카로부터 정제한 (R)-2-옥탄올탈수소효소의 잔존활성을 나타내는 도. 세로축은, 미처리 효소활성을 100으로 했을 때의 잔존활성을 나타낸다.

도6은, 피키아 ·핀란디카 유래의 (R)-2-옥탄올탈수소효소유전자를 도입한 플라스미드(pSE-PF01)의 구축도. 플라스미드의 맵중에서, P(trc)는 trc 프로모터를, T(rrnB)는 rrnBT1T2 터미네이터를, Amp는 암피실린(ampicillin)저항성을 나타내는 β-락타마제(lactamase)유전자를, ori는 플라스미드의 복제기원을, rop는 ROP-protein 유전자를, laqIq는 락토오스 리프레서(lactose repressor)를 나타낸다. pSE-PF01중의 PfODH는 피키아 ·핀란디카 유래의 (R)-2-옥탄올탈수소효소유전자를 나타낸다.

도7은, 피키아 ·핀란디카 유래의 (R)-2-옥탄올탈수소효소유전자를 도입한 플라스미드(pSE-PF02)의 구축도. 플라스미드의 맵중에서, P(trc)는 trc 프로모터를, T(rrnB)는 rrnBT1T2 터미네이터를, Amp는 암피실린 저항성을 나타내는 β-락타마제 유전자를, ori는 플라스미드의 복제기원을, rop는 ROP-protein 유전자를, laqIq는 락토오스 리프레서를 나타낸다. pSE-PF02중의 PfODH는 피키아 ·핀란디카 유래의 (R)-2-옥탄올탈수소효소유전자를 나타낸다.

도8은, 고초균(Bacillus subtilis)유래의 글루코오스탈수소효소유전자를 도입한 플라스미드(pSE-BSG3)의 구축도. 플라스미드의 맵중에서, P(trc)는 trc 프로모터를, T(rrnB)는 rrnBT1T2 터미네이터를, Amp는 암피실린 저항성을 나타내는 β-락타마제 유전자를, ori는 플라스미드의 복제기원을, rop는 ROP-protein 유전자를,laqIq는 락토오스 리프레서를, BsGlcDH는 고초균 유래의 글루코오스탈수소효소유전자를 나타낸다.

도9는, 피키아 ·핀란디카 유래의 (R)-2-옥탄올탈수소효소유전자와 고초균 유래의 글루코오스탈수소효소유전자를 도입한 플라스미드(pSG-PF01)의 구축도. 플라스미드의 맵중에서, P(trc)는 trc 프로모터를, T(rrnB)는 rrnBT1T2 터미네이터를, Amp는 암피실린 저항성을 β-락타마제 유전자를, ori는 플라스미드의 복제기원을, rop는 ROP-protein 유전자를, laqIq는 락토오스 리프레서를, BsGlcDH는 고초균 유래의 글루코오스탈수소효소유전자를, PfODH는 피키아 ·핀란디카 유래의 (R)-2-옥탄올탈수소효소유전자를 나타낸다.

도10은, 피키아 ·핀란디카 유래의 (R)-2-옥탄올탈수소효소유전자와 고초균 유래의 글루코오스탈수소효소유전자를 도입한 플라스미드(pSG-PF02)의 구축도. 플라스미드의 맵중에서, P(trc)는 trc 프로모터를, T(rrnB)는 rrnBT1T2 터미네이터를, Amp는 암피실린 저항성을 나타내는 β-락타마제 유전자를, ori는 플라스미드의 복제기원을, rop는 ROP-protein 유전자를, laqIq는 락토오스 리프레서를, BsGlcDH는 고초균 유래의 글루코오스탈수소효소유전자를, PfODH는 피키아 ·핀란디카 유래의 (R)-2-옥탄올탈수소효소유전자를 나타낸다.

도11은, 마이코박테리움 ·박카에 유래의 포름산탈수소효소유전자를 도입한 플라스미드(pSE-MCF15)의 구축도. 플라스미드의 맵중에서, P(trc)는 trc 프로모터를, T(rrnB)는 rrnBT1T2 터미네이터를, Amp는 암피실린 저항성을 나타내는 β-락타마제 유전자를, ori는 플라스미드의 복제기원을, rop는 ROP-protein 유전자를,laqIq는 락토오스 리프레서를, McFDH는 마이코박테리움 ·박카에 유래의 포름산탈수소효소유전자를 나타낸다.

도12는, 피키아 ·핀란디카 유래의 (R)-2-옥탄올탈수소효소유전자와 마이코박테리움 ·박카에 유래의 포름산탈수소효소유전자를 도입한 플라스미드(pSF-PF02)의 구축도. 플라스미드의 맵중에서, P(trc)는 trc 프로모터를, T(rrnB)는 rrnBT1T2 터미네이터를, Amp는 암피실린 저항성을 나타내는 β-락타마제 유전자를, ori는 플라스미드의 복제기원을, rop는 ROP-protein 유전자를, laqIq는 락토오스 리프레서를, McFDH는 마이코박테리움 ·박카에 유래의 포름산탈수소효소유전자를, PfODH는 피키아 ·핀란디카 유래의 (R)-2-옥탄올탈수소효소유전자를 나타낸다.

도13은, 캔디다 ·우틸리스로부터 정제한 (R)-2-옥탄올탈수소효소 효소활성의 pH 변화에 의한 영향을 나타내는 도. 세로축은 최대활성을 100으로 했을 때의 상대활성을 나타낸다.

도14는, 캔디다 ·우틸리스로부터 정제한 (R)-2-옥탄올탈수소효소의 4-클로로아세토초산에틸환원활성의 pH 변화에 의한 영향을 나타내는 도. 세로축은 최대활성을 100으로 했을 때의 상대활성을 나타낸다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들에 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1] (R)-2-옥탄올탈수소효소의 스크리닝

전기영동과 (R) 또는 (S)-2-옥탄올의 기질, NAD⁺, 페나진 메토설페이트 (phenazine methosulfate)(PMS), 니트로블루 테트라졸리움(nitroblue tetrazolium)(NBT)을 포함하는 반응액을 사용하여 효소의 활성염색법에 의해, 효모로부터의 (R)-2-옥탄올탈수소효소의 스크리닝을 행했다. 반응액의 조성은 아래와 같다.

·반응액:

(S) 또는 (R)-2-옥탄올 5 mM

NAD⁺1.3 mM

PMS 0.13 mM

NBT 0.48 mM

그 결과, 기질이 (S)-2-옥탄올일 때에는 거의 염색되지 않고, (R)-2-옥탄올일 때에 우선적으로 염색하는 효소가, 아래의 효모균주속에 발견되었다. 또한, 이들 (R)-2-옥탄올탈수소효소활성을 갖는 효소는, 4-클로로아세토초산에틸을 환원하여 (S)-4-클로로-3-히드록시낙산에틸을 생성하는 활성을 함께 가지고 있었다.

·피키아 ·핀란디카: DSM 70280, DSM 1380

·피키아 ·쟈디니: DSM 2361, DSM 70167, IFO 0987

·캔디다 ·우틸리스: IFO 0988, IFO 0626

·오가타에아 ·윅커하미: IFO 1706

[실시예 2] (R)-2-옥탄올탈수소효소를 생산하는 배양조건

실시예 1의 (R)-2-옥탄올탈수소효소를 생산하는 균주를, 탄소원인 2% 글루코오스를, 2% 글리세롤 및 1% 메탄올로 바꿔 배양을 행했다. 그 결과, 피키아 ·핀란디카에 관해서는, 어느 배지에 있어서도 목적으로 하는 효소가 유도되었다. 한편, 캔디다 ·우틸리스에 관해서는, 탄소원으로서 메탄올을 사용했을 때에 강하게 목적으로 하는 효소가 유도되었다.

[실시예 3] 피키아 ·핀란디카로부터의 (R)-2-옥탄올탈수소효소의 정제

피키아 ·핀란디카 DSM 70280주를 4.8 L의 배지 A로 배양하여, 원심분리에 의해 균체를 조제했다. 얻어진 혼균체를 100 mM Tris-HCl 완충액(pH 8.0), 10% 글리세롤, 1 mM 에틸렌디아민4초산2나트륨(EDTA ·2Na), 0.02% 2-메르캅토에탄올 및 2 mM 페닐메탄설포닐플루오리드(PMSF)에 현탁시킨 후, 비드 비터(bead beater)(Biospec사제)에 의해 파쇄 후, 원심분리에 의해 균체잔사를 제거하여, 무세포추출액을 얻었다. 이 무세포추출액에 프로타민황산을 첨가하여, 원심분리에 의해 핵산을 제거한 상청을 얻었다. 그 상청에 황산암모늄을 첨가하여 40%~75% 포화에 있어서 침전한 획분을 얻었다. 그 침전에 30% 포화황산암모늄을 포함하는 표준완충액을 가해, 최종적인 농도에서 40% 포화황산암모늄을 포함하는 효소액을 얻었다. 그 효소액을 원심분리하여 상청을 얻었다. 상청을 30% 포화황산암모늄을 포함하는 표준완충액으로 평형화한 페닐-토요펄(Phenyl-Toyopearl)650 M(5.0 cm ×25 cm)에 첨가하여, 포화황산암모늄농도가 30%-0%의 구배용출(gradient elution)을 행했다. 사용한 배지 A, 표준완충액의 조성은 아래와 같다.

·배지 A:

효모 엑기스 10 g/L

헵톤 20 g/L

글루코오스 20 g/L

pH 6.0

·표준완충액:

Tris-HCl 완충액(pH 8.0) 10 mM

2-메르캅토에탄올 0.01%

글리세롤 10%

(R)-2-옥탄올탈수소효소활성은, 구배용출부분에 관찰되었다. 이 피크부분을 회수하여, 한외여과에 의해 농축했다.

농축한 효소액을, 표준완충액에 대해 투석한 후, 그 효소액을 원심분리하여 상청을 얻었다. 상청을 동 완충액으로 평형화한 블루-세파로오스 CL-6B(5 cm ×10 cm)에 첨가하여, 동 완충액으로 세척 후, 0-1.5 M 염화나트륨의 농도구배용출을 행했다. (R)-2-옥탄올탈수소효소활성은, 구배용출부분에 용출했기 때문에, 이 획분을 회수하여 농축했다. 농축한 효소액을 표준완충액(pH 8.5)에 대해 투석한 후, 동 완충액(pH 8.5)으로 평형화한 DEAE-세파로오스 FF(1.6 cm ×10 cm)에 첨가하여, 동 완충액(pH 8.5)으로 세척 후, 0-1 M 염화나트륨의 농도구배용출을 행했다. (R)-2-옥탄올탈수소효소활성은, 소통부분(part of fration passed through)과 구배용출부분에 용출했기 때문에, 활성획분을 각각 회수하여 농축했다. 소통부분으로부터 얻어진 효소액을 각각 Superdex 200(0.32 cm ×30 cm, SMART system, Amersham Pharmacia Biotech사제)을 사용하여, 0.3 M 염화나트륨을 포함하는 표준완충액으로 겔여과를 행했다. 겔여과에 의해 얻어진 활성획분을 농축하여 정제효소를 얻었다.

가장 높은 정제효소의 비활성(specific activity)은 (R)-2-옥탄올의 산화활성으로 약 91 U/mg-protein이었다. 정제의 요약을 표1에 나타낸다.

표 1

스텝 단백량 총활성 비활성 (mg) (U) (U/mg)

무세포추출액 26,900 603 0.0224 핵산제거 10,900 588 0.0540 황산암모늄 40-75% 5,560 361 0.0649 페닐-토요펄 398 162 0.408 블루-세파로오스 11.7 46.9 3.59 DEAE-세파로오스 0.880 4.53 5.15 Superdex 200 0.00288 0.262 91.1

[실시예 4] (R)-2-옥탄올탈수소효소의 분자량측정

실시예 3에서 얻어진 피키아 ·핀란디카 유래 효소의 서브유닛의 분자량을 SDS-PAGE에 의해 구한 결과, 약 3.0만이었다. 또한, Superdex 200의 겔여과컬럼을 사용하여 분자량을 측정한 바, 약 8.3만이었다.

[실시예 5] (R)-2-옥탄올탈수소효소의 최적의 pH

인산칼륨완충액(KPB), 트리스염산완충액(Tris-HCl), 글리신완충액(Glycine)을 사용하여 pH를 변화시켜, 실시예 3에서 얻어진 효소의 (R)-2-옥탄올탈수소효소활성을 조사했다. 최대활성을 100으로 한 상대활성으로 표시하여, 도1에 나타냈다. 그 결과 반응의 최적의 pH는 8.0-11.0이었다.

이어서, 인산칼륨완충액(KPB), 초산나트륨완충액(NaOAc)을 사용하여 pH를 변화시켜, 실시예 3에서 얻어진 효소의 4-클로로아세토초산에틸환원활성을 조사했다. 최대활성을 100으로 한 상대활성으로 표시하여, 도2에 나타냈다. 그 결과, 반응의 최적의 pH는 5.0-6.5였다.

[실시예 6] (R)-2-옥탄올탈수소효소의 작용의 최적의 온도

실시예 3에서 얻어진 효소를 표준반응조건 중 온도만을 변화시켜 (R)-2-옥탄올산화활성을 측정하여, 최대활성을 100으로 한 상대활성으로 표시하여, 도3에 나타냈다. 그 결과, 최적의 온도는 45-55℃였다.

실시예 3에서 얻어진 효소를 표준반응조건 중 온도만을 변화시켜 4-클로로아세토초산에틸환원활성을 측정하여, 최대활성을 100으로 한 상대활성으로 표시하여, 도4에 나타냈다. 그 결과, 적당한 온도는 55-60℃였다.

[실시예 7] (R)-2-옥탄올탈수소효소의 pH 안정성

실시예 3에서 얻어진 효소를, 브릿톤 ·로빈손(Britten Robinson)의 광역완충액 pH 3-12 속에서, 30℃, 30분간 인큐베이트하여 잔존활성을 측정했다. 미처리 활성을 100으로 한 잔존활성으로 표시하여, 도5에 나타냈다. 그 결과, 본 발명에 의한 (R)-2-옥탄올탈수소효소는, pH 8.0-9.0에 있어서 가장 안정적이었다.

[실시예 8] (R)-2-옥탄올탈수소효소의 기질 특이성

실시예 3에서 얻어진 효소를 여러 알코올과 반응시켜, 그 산화활성을 측정했다. NAD⁺를 보효소로서 (R)-2-옥탄올의 산화활성을 100으로 한 상대활성으로 표시하여, 표2에 나타냈다.

표 2

기질(산화반응) (R)-2-옥탄올 100 (S)-2-옥탄올 4.73 2-프로판올 6.79 1-옥탄올 1.72 (R)-4-클로로-3-히드록시낙산에틸 0.172 (S)-4-클로로-3-히드록시낙산에틸 2.24 (R)-1-페닐에탄올 255 (S)-1-페닐에탄올 1.81 (R)-3-히드록시낙산에틸 41.1 (S)-3-히드록시낙산에틸 1.03 에탄올 0.688 (R)-2-부탄올 49.3 (S)-2-부탄올 7.31 시클로헥산올 0.172 (R)-1-페닐-1,3-프로판디올 0.344 (S)-1-페닐-1,3-프로판디올 0.258 2-헥산올 54.1 (R)-1,3-부탄디올 1.29 (S)-1,3-부탄디올 0.516 2-옥탄올 77.8 1-페녹시-2-프로판올 15.5

그 결과, 알코올대기질로서, (S)-2-옥탄올에 대해서는 4.7%, 2-프로판올에 대해서는 6.8%, (R)-1-페닐에탄올에 대해서는 255%의 상대활성을 나타냈다.

실시예 3에서 얻어진 효소를 여러 케톤과 반응시켜, 그 환원활성을 측정했다. NADH를 보효소로서, 4-클로로아세토초산에틸의 환원활성을 100으로 한 상대활성으로 표시하여, 표3에 나타냈다.

표 3

기질(환원반응) 4-클로로아세토초산에틸 100 2-옥타논 31.2 아세토페논 45.3 아세토초산에틸 106 1-페녹시-2-프로판 54.2 프로피온알데히드 18.4 4-히드록시-2-부타논 0.691 아세톤 1.82 2-부타논 7.99

그 결과, 케톤대기질로서, 2-옥타논에 대해서는 31.2%, 아세토페논에 대해서 45%의 상대활성을 나타냈다.

[실시예 9] (R)-2-옥탄올탈수소효소의 각종 시약에 대한 거동

여러 시약속에서 30℃, 30분간 처리한 후, (R)-2-옥탄올탈수소효소활성을 측정하여, 시약을 포함하지 않는 조건에서 30℃, 30분간 처리한 후의 활성을 100으로 한 잔존활성으로 표시하여, 표4에 나타냈다. 본 발명에 의한 (R)-2-옥탄올탈수소효소는, 염화수은, 에틸렌디아민4초산2나트륨염(EDTA ·2Na)에 의해 조금 저해되었다. N-에틸말레이미드(N-ethylmaleimide), o-페난스롤린(o-phenanthroline), 염화마그네슘, 염화칼슘, 염화망간에 의해 안정화되었다.

표 4

시약 농도 잔존활성 (mM) (%)

대조군 - 100 페닐메틸설포닐 플루오리드 1 111 파라클로로수은안식향산 0.05 118 N-에틸말레이미드 1 147 EDTA ·2Na 1 81 o-페난스롤린 1 162 디티오스레이톨(Dithiothreitol) 1 123 NH ₂ OH ·HCl 0.01 99 쿠에루세틴(Quercetin) 0.1 99 KCl 1 106 MgCl ₂ ·6H ₂ O 1 185 CaCl ₂ ·2H ₂ O 1 174 MnCl ₂ ·4H ₂ O 1 185 FeCl ₂ 1 93 CoCl ₂ ·6H ₂ O 1 99 NiCl ₂ ·6H ₂ O 1 103 ZnCl ₂ 1 96 BaCl ₂ ·2H ₂ O 1 102 CuSO ₄ 1 100 HgCl ₂ 0.01 62

[실시예 10] (R)-2-옥탄올탈수소효소의 각종 시약에 의한 활성화

여러 시약속에 따른 (R)-2-옥탄올탈수소효소의 활성화효과를 측정하여, 시약을 포함하지 않는 조건의 활성을 100으로 한 상대활성으로 표시하여, 표5에 나타냈다. 본 발명에 의한 (R)-2-옥탄올탈수소효소는, 마그네슘이온, 망간이온, 아연이온에 의해 활성화되었다. 음이온의 영향에 대해서는, 황산이온에 의해 활성되는 것을 알 수 있었다.

표 5

시약 농도 상대활성 (mM) (%)

대조군 - 100 MgCl ₂ ·6H ₂ O 1 122 MgSO ₄ 1 125 MnCl ₂ ·4H ₂ O 1 114 MnSO ₄ ·4-5H ₂ O 1 121 ZnCl ₂ 1 105 ZnSO ₄ ·7H ₂ O 1 110

[실시예 11] (R)-2-옥탄올탈수소효소의 부분아미노산서열

실시예 3에서 얻어진 효소를 사용하여, 프로테인 시퀀서에 의해 N말단 아미노산서열을 해석했지만, N말단 아미노산은 블로킹(bloking)되어 있었다. 다음에, 정제효소를 SDS-PAGE에 의해 분리 후, (R)-2-옥탄올탈수소효소를 포함하는 겔을 잘라내, 트립신을 포함하는 트리스완충액(pH 8.0)을 가하여, 35℃, 20시간의 처리를 행했다. 그 후 시료용액을 역상 HPLC로 처리하여, 단편펩티드를 분리했다. 펩티드단편을 프로테인 시퀀서에 의해 아미노산서열을 해석한 결과, 3종류의 아미노산서열이 얻어졌다. 펩티드 A, 펩티드 B, 펩티드 C의 아미노산서열을 각각 서열번호: 3, 서열번호: 4, 서열번호: 5에 나타냈다.

서열번호: 3 : 펩티드 A

Val-Ala-Val-Val-Thr-Gly-Ala-Leu-Ser-Gly

서열번호: 4 : 펩티드 B

Leu-Ile-Ser-Glu-Thr-Leu-Ala-Thr-Phe-Gly-Gly-Leu

서열번호: 5 : 펩티드 C

Leu-Gly-Arg-Pro-Glu-Glu-Val-Ala-Asp-Ala

[실시예 12] 피키아 ·핀란디카로부터의 염색체 DNA의 조제

피키아 ·핀란디카로부터 Cryer 등의 방법(Meth. Cell Biol. 12, 39-44(1975))에 의해, 염색체 DNA의 정제를 행했다.

[실시예 13] (R)-2-옥탄올탈수소효소유전자의 코어영역(core region)의 PCR에 의한 클로닝

펩티드 A에 대응하는 센스프라이머 A 및 펩티드 C에 대응한 안티센스프라이머 C를 합성했다. 각각의 프라이머의 선두에는 BamHI의 제한효소사이트(GTCGGATCC)를 함입했다. 각각의 염기서열을 서열번호: 6(프라이머 A), 7(프라이머 C)로 나타냈다.

서열번호: 6 : 프라이머 A

GTCGGATCCGTBGCHGTBGTBACHGGHGC

서열번호: 7 : 프라이머 C

GTCGGATCCGCRTCNGCNACYTCYTCNGG

프라이머 A, 프라이머 C를 각 50 pmol, dNTP 10 nmol, 피키아 ·핀란디카 유래 염색체 DNA 100 ng, ExTaq용 완충액(다까라주조제), ExTaq 2U(다까라주조제)를 포함하는 50 μL의 반응액을, 변성(94℃, 30초), 어닐링(37℃, 30초), 신장(70℃, 1분)을 30사이클, PCR을 행하여, 특이적인 증폭산물을 얻었다.

[실시예 14] (R)-2-옥탄올탈수소효소유전자의 코어영역의 PCR 단편의 서브클로닝

PCR로 증폭된 각각의 DNA 단편은, 페놀/클로로포름추출 후, 에탄올침전으로서 회수 후, BamHI에 의한 제한효소 소화를 행했다. 나중에 2% 아가로우즈겔 전기영동을 행하고, 목적으로 하는 밴드를 잘라내, Sephaglas(Pharmacia제)에 의해 정제, 회수했다.

얻어진 각각의 DNA 단편을 BamHI로 제한효소 소화한 pUC18(다까라주조제)과 Takara Ligation Kit Ver.2를 사용하여, 라이게이션하여 대장균(Escherichia coli,E. coli라고 약칭한다) JM109주를 형질전환했다. 형질전환주를 암피실린(50 ㎍/mL), 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토피라노시드(50 ㎍/mL), 이소프로필티오-β-D-갈락토피라노시드(이하, IPTG라고 부른다)(20 ㎍/mL)를 포함하는 LB 배지(1% 박토-트립톤(bacto-trypton), 0.5% 박토-효모엑기스, 1% 염화나트륨, 이하, LB 배지라고 약칭한다) 플레이트상에서 생육시켜, 몇 개의 백색 콜로니를 암피실린을 포함하는 액체 LB 배지로 배양하여, Flexi-Prep(Pharmacia제)에 의해, 목적으로 하는 DNA 단편을 포함하는 플라스미드를 정제했다.

정제한 플라스미드를 사용하여, 삽입 DNA의 염기서열을 해석했다. DNA 염기서열의 해석에는, BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit(Applied Biosystems제)를 사용하여 PCR을 행하고, PRISM 310 Genetic Analyzer(Applied Biosystems제)에 의해 행했다. 결정된 코어영역의 염기서열을 각각 서열번호: 8 : PF-CORE로서 나타냈다.

[실시예 15] (R)-2-옥탄올탈수소효소유전자의 코어영역의 주변 DNA의 서브클로닝

피키아 ·핀란디카의 염색체 DNA를 제한효소 BstYI, NspI, PstI로 각각 소화하고, T4 리가아제를 사용하여 16℃에서 하룻밤 셀프 ·라이게이션반응에 의해, 각 단편을 고리화시켰다. 다음에, 선두부분에 BamHI 사이트(GTCGGATCC)를 함입한 프라이머 PfOD-c5u(서열번호: 9), PfOD-c3d(서열번호: 10)를 각 50 pmol, dNTP 10 nmol, 셀프 ·라이게이션시킨 DNA 125 ng, Ex-Taq용 완충액(다까라주조제), Ex-Taq 1U(다까라주조제)를 포함하는 50 μL의 반응액을 사용하여, 변성(94℃, 30초), 어닐링(55℃, 30초), 신장(72℃, 7분)을 35사이클, GeneAmp PCR System 2400(PerkinElmer제)을 사용하여 행했다. PCR 반응액의 일부를 아가로우즈겔 전기영동에 의해 해석한 결과, BstYI, NspI, PstI로 소화한 주형 DNA에 대응하여, 약 3500 bp, 2000 bp, 4000 bp의 DNA 단편을 검출할 수 있었다.

서열번호: 9 : PfOD-c5u

GTCGGATCCTCAGAGATCGTTACTTTGGC

서열번호: 10 : PfOD-c3d

GTCGGATCCCGACTCCTTTGATAGATGAG

PCR로 증폭된 각각의 DNA 단편은, 페놀/클로로포름추출 후, 에탄올침전으로서 회수 후, BamHI에 의한 제한효소 소화 후, 아가로우즈겔 전기영동을 행하여, 목적으로 하는 밴드를 잘라내, Sephaglas(Pharmacia제)에 의해 정제, 회수했다.

얻어진 각각의 DNA 단편을 BamHI로 제한효소 소화한 pUC18(다까라주조제)과 Takara Ligation Kit Ver.2를 사용하여, 라이게이션하여 대장균 JM109주를 형질전환했다. 형질전환주를 암피실린(50 ㎍/mL), 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토피라노시드(50 ㎍/mL), 이소프로필티오-β -D-갈락토피라노시드(이하, IPTG라고 부른다)(20 ㎍/mL)를 포함하는 LB 배지 플레이트상에서 생육시켜, 몇 개의 백색 콜로니를 암피실린을 포함하는 액체 LB 배지로 배양하여, Flexi-Prep(Pharmacia제)에 의해 플라스미드를 정제했다. 얻어진 플라스미드를, PCR의 주형으로 한 DNA의 조제에 사용한 제한효소 BstYI, NspI, PstI에 대응하여, 각각 pPF-Bst, pPF-Nsp, pPF-Pst, 로 했다.

정제한 플라스미드로부터 삽입 DNA의 염기서열을 해석했다. DNA 염기서열의 해석에는, BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit(Applied Biosystems제)를 사용하여 PCR을 행하고, PRISM 310 Genetic Analyzer(Applied Biosystems제)에 의해 행했다. pPF-Bst, pPF-Nsp, pPF-Pst 내의 삽입 DNA 단편의 해석한 염기서열을, 코어영역의 5'-상류측(5U), 3'-하류측(3D)으로 나눠, 각각 PF-5U(서열번호: 11), PF-3D(서열번호: 12)로서 나타냈다.

PF-5U, PF-3D, PF-CORE의 각 염기서열을 합성하여, ORF(open reading frame)검색에 의해 (R)-2-옥탄올탈수소효소유전자의 서열을 결정했다. 결정한 DNA의 염기서열은 서열번호: 1에, 이 염기서열이 코드하는 아미노산의 서열은 서열번호: 2에 나타낸다. 이들의 합성, ORF 검색은, Genetyx-ATSQ/WIN 및 Genetyx-WIN(모두 Software Developing Company제)소프트웨어를 이용하여 행했다.

[실시예 16] (R)-2-옥탄올탈수소효소유전자의 클로닝-1

(R)-2-옥탄올탈수소효소의 구조유전자의 염기서열을 토대로 발현벡터 구축용 프라이머 PFO-ATG1(서열번호: 13), PFO-TAA1(서열번호: 14)을 합성했다. 프라이머를 각 10 pmol, dNTP 10 nmol 피키아 ·핀란디카 유래 염색체 DNA 50 ng, Pfu-DNA polymerase용 완충액(STRATAGENE제), Pfu-DNA polymerase1.25U(STRATAGENE제)를 포함하는 50 μL의 반응액을 사용하여, 변성(95℃, 30초), 어닐링(50℃, 1분), 신장(75℃, 1분 30초)을 30사이클, GeneAmp PCR System 2400(PerkinElmer제)을 사용하여 행했다.

서열번호: 13 : PFO-ATG1

TCGACATGTCTTATAATTTCCATAACAAG

서열번호: 14 : PFO-TAA1

GCAGAATTCCTCTAGATTACTGGGCTGTGTACCC

PCR 반응액의 일부를 아가로우즈겔 전기영동에 의해 해석한 결과, 특이적인 밴드를 검출할 수 있었다.

얻어진 DNA 단편을, 페놀/클로로포름추출 후, 에탄올침전으로서 회수했다. DNA 단편을 제한효소 AflIII, EcoRI로 2중소화하고, 아가로우즈겔 전기영동을 행하여, 목적으로 하는 밴드부분을 잘라내, Sephaglas(Pharmacia제)에 의해 정제했다.

얻어진 DNA 단편을, NcoI, EcoRI로 2중소화한 pSE420D(Invitrogen제의 플라스미드벡터 pSE420의 멀티클로닝사이트를 개변한 플라스미드, 일본국 특개2000-189170)와 Takara Ligation Kit를 사용하여, 라이게이션하여 대장균 JM109주를 형질전환했다.

형질전환주를 암피실린(50 ㎍/mL)을 포함하는 LB 배지 플레이트상에서 생육시켜, 몇 개의 콜로니로부터 플라스미드를 정제하여, 삽입단편의 염기서열을 해석했다. 목적으로 하는 (R)-2-옥탄올탈수소효소유전자를 갖는 플라스미드를 pSE-PF01로 하여, 플라스미드의 구축과정을 도6에 나타냈다.

[실시예 17] (R)-2-옥탄올탈수소효소유전자의 클로닝-2

(R)-2-옥탄올탈수소효소의 구조유전자의 염기서열을 토대로 발현벡터 구축용 프라이머 PFO-ATG2(서열번호: 15), PFO-TAA2(서열번호: 16)를 합성했다. 프라이머를 각 10 pmol, dNTP 10 nmol, 피키아 ·핀란디카 유래 염색체 DNA 50 ng, Pfu-DNA polymerase용 완충액(STRATAGENE제), Pfu-DNA polymerase1.25U(STRATAGENE제)를 포함하는 50 μL의 반응액을 사용하여, 변성(95℃, 30초), 어닐링(50℃, 1분), 신장(75℃, 1분 30초)을 30사이클, GeneAmp PCR System 2400(PerkinElmer제)을 사용하여 행했다.

서열번호: 15 : PFO-ATG2

CACGAATTCTAAAATGTCTTATAATTTCCATAACAAG

서열번호: 16 : PFO-TAA2

AGTACTAGTATTACTGGGCTGTGTACCC

얻어진 DNA 단편을, 페놀/클로로포름추출 후, 에탄올침전으로서 회수했다.DNA 단편을 제한효소 EcoRI, SpeI로 2중소화하고, 아가로우즈겔 전기영동을 행하여, 목적으로 하는 밴드부분을 잘라내, Sephaglas(Pharmacia제)에 의해 정제했다.

얻어진 DNA 단편을, EcoRI, SpeI로 2중소화한 pSE420D와 Takara Ligation Kit를 사용하여, 라이게이션하여 대장균 JM109주를 형질전환했다.

형질전환주를 암피실린(50 ㎍/mL)을 포함하는 LB 배지 플레이트상에서 생육시켜, 몇 개의 콜로니로부터 플라스미드를 정제하여, 삽입단편의 염기서열을 해석했다. 목적으로 하는 (R)-2-옥탄올탈수소효소유전자를 갖는 플라스미드를 pSE-PF02로 하여, 플라스미드의 구축과정을 도7에 나타냈다.

[실시예 18] 재조합 (R)-2-옥탄올탈수소효소의 대장균에 의한 생산

(R)-2-옥탄올탈수소효소유전자의 발현플라스미드 pSE-PF01, pSE-PF02으로 형질전환된 대장균 JM109주를 암피실린을 포함하는 액체 LB 배지로 하룻밤 30℃ 배양하고, 0.1 mM IPTG(이소프로필티오갈락토피라노시드)를 가하고, 4시간 더 배양을 행했다.

균체를 원심분리에 의해 집균 후, 0.02% 2-메르캅토에탄올, 1 mM 황산마그네슘을 포함하는 100 mM 트리스/HCl 완충액(pH 8.5)에 현탁하여, 밀폐식 초음파 파쇄장치 UCD-200TM(CosmoBio제)을 사용하여 4분간 처리함으로써, 균체를 파쇄했다. 균체파쇄액을 원심분리하여, 그 상청을 균체추출액으로서 회수했다.

[실시예 19] 재조합 (R)-2-옥탄올탈수소효소의 활성

실시예 18에서 조제한 재조합 (R)-2-옥탄올탈수소효소를 사용하여 (R)-2-옥탄올에 대한 활성을 측정하여, 플라스미드를 함유하지 않는 상태에서 조제한 무세포추출액의 활성과 비교했다. 그 결과를 표6에 정리한다.

표 6

플라스미드	(R)-2-옥탄올탈수소효소활성 U/mg-protein
없음	0.00
pSE-PF01	4.16
pSE-PF02	1.95

[실시예 20] 재조합 (R)-2-옥탄올탈수소효소의 각종 대장균주에 의한 생산

피키아 ·핀란디카 유래의 (R)-2-옥탄올탈수소효소를 발현하는 플라스미드 pSE-PF01에 의해 대장균 HB101주, TG1주(E. coliDSM 6056), MG1665주(E. coliATCC 47076)를 형질전환했다.

각각의 재조합 대장균을 액체 LB 배지에 식균하고, 30℃에서 하룻밤 배양한 후, IPTG를 0.1 mM 첨가하고, 4시간 더 배양했다. 얻어진 2종류의 대장균을 집균하여, 효소활성의 측정을 행했다.

[실시예 21] pSE-PF01으로 형질전환한 각종 대장균주의 효소활성

실시예 20에 의해, 형질전환한 대장균(배양액 2 mL 상당)을, 실시예 18의 방법에 의해 균체파쇄하고, 균체추출액을 조제하여, 효소활성의 측정에 사용했다. 각각의 활성값을 표7에 나타낸다.

표 7

숙주	(R)-2-옥탄올탈수소효소활성 U/mg-protein
JM109	4.16
HB101	8.00
TG1	11.0
MG1655	10.4

[실시예 22] 고초균으로부터의 DNA의 정제

고초균(Bacillus subtilisBGSC 1A1주)을 LB 배지상에서 배양하여, 균체를 조제했다. 균체로부터의 염색체 DNA의 정제는, Qiagen Genomic Tip(Qiagen사제)을 사용하여, 부속 매뉴얼에 기재된 방법에 따라 행했다.

[실시예 23] 고초균으로부터의 글루코오스탈수소효소유전자의 클로닝

환원형 니코틴아미드아데닌디뉴클레오티드인산의 재생을 행하게 하기 위해, 문헌(일본국 특개2000-189170)기재의 고초균 유래 글루코오스탈수소효소유전자의 클로닝을 행했다. 문헌기재의 방법에 의해, pSE-BSG1을 얻었다. 플라스미드를 새롭게 구축하기 위해, 구조유전자의 5'-말단, 3'-말단의 서열을 토대로 프라이머 BSG-ATG3(서열번호: 19), BSG-TAA3(서열번호: 20)을 합성했다. pSE-BSG1을 주형으로서, PCR(95℃, 30초, 50℃, 1분, 75℃, 3분 15초)을 30사이클 행하여, 특이적인 증폭 DNA를 얻었다.

서열번호: 17 : BSG-ATG3

AGACCATGGATCCAATGTATCCAGATTTAAAAGGAA

서열번호: 18 : BSG-TAA3

GAATCTAGATTAACCGCGGCCTGCCTG

얻어진 DNA 단편을 NocI와 XbaI의 2종류의 제한효소로 2중소화했다. 플라스미드벡터 pSE42OD를 NcoI와 XbaI로 2중소화하고, 동효소로 2중소화한 PCR 증폭 DNA 단편을 T4 DNA 리가아제로 연결하여, pSE-BSG3을 얻었다. 플라스미드의 구축과정을 도8에 나타냈다.

[실시예 24] 피키아 ·핀란디카 유래의 (R)-2-옥탄올탈수소효소와 고초균 유래 글루코오스탈수소효소유전자를 공발현하는 플라스미드 pSG-PF01의 구축

실시예 15에서 구축한 pSE-PF01을 MluI, EcoRI의 2개의 제한효소로 2중소화하여, 피키아 ·핀란디카 유래의 (R)-2-옥탄올탈수소효소유전자를 포함하는 DNA 단편을 조제했다.

실시예 23에서 구축한 고초균 유래의 글루코오스탈수소효소유전자를 포함하는 플라스미드 pSE-BSG1을 MluI, EcoRI의 2개의 제한효소로 2중소화하고, 고초균 유래의 글루코오스탈수소효소유전자를 포함하는 DNA 단편을 조제하여, pSE-PF01로부터 동효소로 잘라낸 피키아 ·핀란디카 유래의 (R)-2-옥탄올탈수소효소유전자를 포함하는 DNA 단편과 T4 DNA 리가아제로 연결하여, 글루코오스탈수소효소와 (R)-2-옥탄올탈수소효소를 동시에 발현 가능한 플라스미드 pSG-PF01을 얻었다. 플라스미드의 구축과정을 도9에 나타냈다.

[실시예 25] 피키아 ·핀란디카 유래의 (R)-2-옥탄올탈수소효소와 고초균 유래 글루코오스탈수소효소유전자를 공발현하는 플라스미드 pSG-PF02의 구축

실시예 16에서 구축한 pSE-PF02를 EcoRI, SpeI의 2개의 제한효소로 2중소화하여, 피키아 ·핀란디카 유래의 (R)-2-옥탄올탈수소효소유전자를 포함하는 DNA 단편을 조제했다.

실시예 23에서 구축한 고초균 유래의 글루코오스탈수소효소유전자를 포함하는 플라스미드 pSE-BSG2를 EcoRI, SpeI의 2개의 제한효소로 2중소화하여, pSE-PF02로부터 동효소로 잘라낸 피키아 ·핀란디카 유래의 (R)-2-옥탄올탈수소효소유전자를 포함하는 DNA 단편과 T4 DNA 리가아제로 연결하여, 글루코오스탈수소효소와 (R)-2-옥탄올탈수소효소를 동시에 발현 가능한 플라스미드 pSG-PF02를 얻었다. 플라스미드의 구축과정을 도10에 나타냈다.

[실시예 26] 고초균 유래의 글루코오스탈수소효소와 피키아 ·핀란디카 유래의 (R)-2-옥탄올탈수소효소의 대장균에 있어서의 동시 발현

고초균 유래의 글루코오스탈수소효소와 피키아 ·핀란디카 유래의 (R)-2-옥탄올탈수소효소를 공발현하는 플라스미드 pSG-PF01, pSG-PF02에 의해 대장균 JM109주를 형질전환했다.

[실시예 27] pSG-PF01, pSG-PF02로 형질전환한 대장균의 효소활성

실시예 26에 의해, 형질전환한 대장균(배양액 2 mL 상당)을, 실시예 17의 방법에 의해 균체파쇄하고, 균체추출액을 조제하여, 효소활성의 측정에 사용했다. 글루코오스탈수소효소활성의 측정은, 100 mM 인산칼륨완충액(pH 6.5), 2.5 mM NAD⁺, 100 mM D-글루코오스 및 효소를 포함하는 반응액속에서 30℃로 행했다. 1U는 상기 반응조건에 있어서 1분간 1 μmol의 NADH의 생성을 촉매하는 효소량으로 했다. 각각의 활성값을 표8에 나타낸다.

표 8

플라스미드	(R)-2-옥탄올탈수소효소활성 U/mg-protein	글루코오스탈수소효소활성 U/mg-protein
pSG-PF01	5.64	0.14
pSG-PF02	8.80	0.15

[실시예 28] 마이코박테리움 ·박카에 유래 포름산탈수소효소의 서브클로닝

환원형 니코틴아미드아데닌디뉴클레오티드의 재생을 행하게 하기 위해, 문헌(Appl. Microbiol. Biotechnol. 44, 479-483(1995))기재의 마이코박테리움 ·박카에 유래의 포름산탈수소효소유전자로부터 포름산탈수소효소의 클로닝을 행했다.

문헌기재의 서열을 토대로, 포름산탈수소효소의 오픈 리딩 프레임(open reading frame)부분만을 클로닝하기 위해, 구조유전자의 5'-말단, 3'-말단 서열을 토대로, 프라이머 MCF-ATG2(서열번호: 19), MCF-TAA3(서열번호: 20)을 합성했다. 플라스미드 pSFR415(수탁번호 생명연조기 제7391호(FERM BP-7391))을 주형으로서,PCR(95℃, 45초, 50℃, 1분, 75℃, 7분)을 30사이클 행하여, 특이적인 증폭 DNA를 얻었다. 얻어진 DNA 단편을 NocI와 XbaI의 2종류의 제한효소로 2중소화했다. 플라스미드벡터 pSE42OD를 NocI와 XbaI로 2중소화하고, 동효소로 2중소화한 PCR 증폭 DNA 단편을 T4 DNA 리가아제로 연결하여, pSE-MCF15를 얻었다. 플라스미드의 구축과정을 도11에 나타냈다.

삽입 DNA 단편의 염기서열의 해석을 행한 결과, 그 코드하는 단백질은 문헌기재의 아미노산서열과 일치했다.

서열번호: 19 : MCF-ATG2

CTTTCTAGAGGAATTCAACCATGGCAAAAGTTCTGTGTGTTC

서열번호: 20 : MCF-TAA3

CAGTCTAGATTAGACCGCTTTTTTGAATTTGGCG

pSFR415로 형질전환한 대장균 JM109의 국제기탁:

(a) 기탁기관의 명칭 ·수신인명

명칭 : 경제산업성 산업기술종합연구소 생명공학공업기술연구소

(구명칭 : 통산산업성 공업기술원 생명공학공업기술연구소)

수신인명 : 일본 이바라키현 쓰꾸바시 히가시 1-1-3(우편번호 305-8566)

(b) 기탁일(원기탁일) 2000년 11월 10일

(c) 수탁번호 생명연조기 제7391호(FERM BP-7391)

[실시예 29] 피키아 ·핀란디카 유래의 (R)-2-옥탄올탈수소효소유전자와 마이코박테리움 유래 포름산탈수소효소유전자를 공발현하는 플라스미드 pSF-PF02의 구축

실시예 16에서 구축한 pSE-PF02를 EcoRI, SpeI의 2개의 제한효소로 2중소화하고, 피키아 ·핀란디카 유래의 (R)-2-옥탄올탈수소효소유전자를 포함하는 DNA 단편을 조제했다.

실시예 28에서 구축한 플라스미드 pSE-MCF15를 EcoRI, SpeI의 2개의 제한효소로 2중소화하고, 마이코박테리움 유래의 포름산탈수소효소유전자를 포함하는 DNA 단편을 조제, pSE-PF01로부터 동효소로 잘라낸 피키아 ·핀란디카 유래의 (R)-2-옥탄올탈수소효소유전자를 포함하는 DNA 단편과 T4 DNA 리가아제로 연결하여, 포름산탈수소효소와 (R)-2-옥탄올탈수소효소를 동시에 발현 가능한 플라스미드 pSF-PF02를 얻었다. 플라스미드의 구축과정을 도12에 나타냈다.

[실시예 30] 피키아 ·핀란디카 유래의 (R)-2-옥탄올탈수소효소와 마이코박테리움 유래 포름산탈수소효소의 대장균에 있어서의 동시 발현

마이코박테리움 유래의 포름산탈수소효소와 피키아 ·핀란디카 유래의 (R)-2-옥탄올탈수소효소를 공발현 가능한 플라스미드 pSF-PF02에 의해 대장균 JM109주를 형질전환했다.

재조합 대장균을 액체 LB 배지에 식균하고, 30℃에서 하룻밤 배양한 후, IPTG를 0.1 mM 첨가하여, 4시간 더 배양했다. 얻어진 대장균을 집균하여, 효소활성의 측정을 행했다.

[실시예 31] pSF-PF02로 형질전환한 대장균의 효소활성

실시예 30에 의해 조제한 pSF-PF02로 형질전환한 대장균(배양액 2 mL 상당)을, 실시예 17의 방법에 의해 균체파쇄하고, 균체추출액을 조제하여, 효소활성의 측정에 사용했다. 포름산탈수소효소활성의 측정은, 100 mM 인산칼륨완충액(pH 6.5), 2.5 mM NAD⁺, 100 mM 포름산 및 효소를 포함하는 반응액속에서 30℃로 행했다. 1U는 상기 반응조건에 있어서 1분간 1 μmol의 NADH의 생성을 촉매하는 효소량으로 했다. 재조합 대장균으로부터 얻은 조효소액(crude enzyme solution)의 효소활성은, (R)-2-옥탄올탈수소효소활성으로 8.99 U/mg-protein, 포름산탈수소효소활성으로 0.653 U/mg-protein이었다.

[실시예 32] 피키아 ·핀란디카 유래의 (R)-2-옥탄올탈수소효소에 의한 (S)-4-클로로-3-히드록시낙산에틸의 합성

100 mM 인산칼륨완충액(pH 6.5), 139.8 mg NADH, 실시예 3에 의해 얻어진 피키아 ·핀란디카 유래의 (R)-2-옥탄올탈수소효소 1.75 U, 0.5% 4-클로로아세토초산에틸을 포함하는 반응액속에서, 30℃로 하룻밤 반응시켰다. 생성한 4-클로로-3-히드록시낙산에틸의 광학순도를 다음과 같이 하여 구했다. 반응액으로부터 4-클로로-3-히드록시낙산에틸을 초산에틸로 추출하여, 탈용매한 후, 광학분할컬럼(optical resolution column)을 사용한 액체크로마토그래피에 의해 분석했다. 광학분할컬럼은, 다이셀화학공업주식회사제 키랄셀 OD(CHIRALCEL OD. 4.6 mm ×25 cm)를 사용하여, n-헥산:2-프로판올=93:7의 용출액(eluate), 유속 1 mL/min, RI 검출에 의해 행했다. 그 결과, 본 발명에 의해 생성된 4-클로로-3-히드록시낙산에틸은, 99%ee 이상의 S체였다.

[실시예 33] 피키아 ·핀란디카 유래의 (R)-2-옥탄올탈수소효소에 의한, 2,3-디플루오로-6-니트로-[[(R)-2-히드록시프로필]옥시]벤젠의 합성

200 mM 인산칼륨완충액(pH 6.5), 86 mM 글루코오스, 1 mM NAD⁺, 1 mM 황산마그네슘, 실시예 3에 의해 얻어진 피키아 ·핀란디카 유래 (R)-2-옥탄올탈수소효소 1 U, 글루코오스탈수소효소 2 U를 포함하는 1 mL의 반응액에 1% 2-아세토닐옥시-3,4-디플루오로니트로벤젠을 포함하는 톨루엔 1 mL를 첨가하여, 교반하에 25℃, 15시간 반응시켰다.

반응종료액을 분석한 결과, 2,3-디플루오로-6-니트로-[[(R)-2-히드록시프로필]옥시]벤젠이 1.0 g/L 생성되고, 그 광학순도는 거의 100%였다.

생성물인 2,3-디플루오로-6-니트로-[[(R)-2-히드록시프로필]옥시]벤젠의 정량은, 수상(水相) 및 유기상(有機相)에 포함되는 생성물을 역상 HPLC분석(컬럼: Inertsil-ODS-2(0.46 ×15 cm, G-L 사이언스주식회사); 용출액: 물/아세토니트릴=1/1; 유속: 0.5 mL/min; 컬럼온도: 실온; 검출: 260 nm에 있어서의 UV)에 의해 행했다.

더욱이, 생성물인 2,3-디플루오로-6-니트로-[[(R)-2-히드록시프로필]옥시]벤젠의 광학순도의 측정은, 광학분할컬럼을 사용한 HPLC분석(컬럼: CHIRALPAK AD (0.46 ×25 cm, 다이셀화학공업주식회사); 용출액: 헥산/2-프로판올=9/1; 컬럼온도: 40℃; 유속: 1 ml/min; 검출: 260 nm에 있어서의 UV 흡수)에 의해 행했다.

[실시예 34] pSF-PF02를 사용한 2,3-디플루오로-6-니트로-[[(R)-2-히드록시프로필]옥시]벤젠의 합성

실시예 30에 의해 조제한 pSF-PF02로 형질전환한 대장균(배양액 5 mL 상당)을 집균하여, 500 mM HEPES/NaOH 완충액(pH 6.5), 829 mM 포름산나트륨, 1 mM 황산마그네슘을 포함하는 5.22 mL의 반응액에 2-아세토닐옥시-3,4-디플루오로니트로벤젠 500 mg을 첨가하여 교반하에 30℃, 18시간 반응시켰다.

반응종료액을 분석한 결과, 2,3-디플루오로-6-니트로-[[(R)-2-히드록시프로필]옥시]벤젠이 486 mg 생성되고, 그 광학순도는 거의 100%였다.

생성물인 2,3-디플루오로-6-니트로-[[(R)-2-히드록시프로필]옥시]벤젠의 정량은, 반응액에 톨루엔을 가함으로써 생성물을 추출하여, 수상 및 유기상에 포함되는 생성물을 기체크로마토그래피로 정량하여, 출발원료에 대한 수율을 구했다. 기체크로마토그래피의 조건은 아래와 같다. 즉, 실리콘 OV-210 20% 크로모소르브 W(AW-DMCS) 60/80 메쉬(Silicone OV-210 20% Chromosorb W(AW-DMCS) 60/80 mesh, G-L 사이언스주식회사), 3.2 mm ×200 cm로 하고, 컬럼온도 170℃로 하여, 수소염이온화 검출기(FID)를 이용하여 검출했다.

더욱이, 생성물인 2,3-디플루오로-6-니트로-[[(R)-2-히드록시프로필]옥시]벤젠의 광학순도의 측정은, 광학분할컬럼을 사용한 HPLC분석(컬럼: CHIRALPAK AD (0.46 cm×25 cm, 다이셀화학공업주식회사); 용출액: 헥산/에탄올=9/1; 컬럼온도: 40℃; 유속: 1 mL/min; 검출: 260 nm에 있어서의 UV 흡수)에 의해 행했다.

[실시예 35] 캔디다 ·우틸리스로부터의 (R)-2-옥탄올탈수소효소의 정제

캔디다 ·우틸리스 IFO 0988주를 3.6 L의 배지 B로 배양하여, 원심분리에 의해 균체를 조제했다. 얻어진 습균체를 100 mM 인산칼륨완충액(pH 8.0), 10% 글리세롤, 1 mM 에틸렌디아민4초산2나트륨(EDTA ·2Na), 0.01% 2-메르캅토에탄올 및 2 mM 페닐메탄설포닐플루오리드(PMSF)에 현탁시켜, 비드 비터(Biospec사제)에 의해 파쇄 후, 원심분리에 의해 균체잔사를 제거하여, 무세포추출액을 얻었다. 이 무세포추출액에 프로타민황산을 첨가하여, 원심분리에 의해 핵산을 제거한 상청을 얻었다. 그 상청에 황산암모늄을 첨가하여 30% 포화에 있어서 원심분리에 의해 조효소액인 상청을 얻었다. 그 효소액을 30% 포화황산암모늄을 포함하는 표준완충액에 대해 투석한 후, 동완충액으로 평형화한 페닐-세파로오스 HP(2.6 cm ×10 cm)에 첨가하여, 황산암모늄농도를 30%-0%의 구배용출을 행했다. 용출한 획분 중, (R)-2-옥탄올에 선택성을 갖는 획분을 회수하여, 한외여과에 의해 농축했다. 사용한 배지 B의 조성은 아래와 같다.

·배지 B:

효모엑기스 10 g/L

헵톤 20 g/L

메탄올 1%

pH 6.0

농축한 효소액을 표준완충액에 투석한 후, 동완충액으로 평형화한 블루-세파로오스 HP(1.6 cm ×2.5 cm)에 첨가하여, 동완충액으로 세척 후, 0-1.5 M 염화나트륨의 농도구배용출을 행했다. (R)-2-옥탄올탈수소효소활성은, 소통 용출부분에 용출했기 때문에, 이 획분을 회수하여 농축했다. 표준완충액으로 평형화한 Mono Q HR 5/5(0.5 cm ×5 cm)에 첨가하여, 동완충액으로 세척 후, 0-1 M 염화나트륨의 농도구배용출을 행했다. (R)-2-옥탄올탈수소효소활성은, 구배용출부분에 용출했기 때문에, 이 획분을 회수하여 농축했다. 농축한 효소액을 Superdex 200(0.32 cm ×30 cm)을 사용하여, 0.3 M 염화나트륨을 포함하는 표준완충액으로 겔여과를 행했다.

겔여과에 의해 얻어진 활성획분을 모아, 정제효소를 얻었다.

정제효소의 비활성을 측정한 결과, (R)-2-옥탄올의 산화활성으로 약 3.33 U/mg이었다. 정제의 요약을 표9에 나타낸다.

표 9

스텝 단백량 총활성 비활성 (mg) (U) (U/mg)

무세포추출액 1,220 6.58 0.00539 핵산제거 396 2.30 0.00581 황산암모늄 30% 471 1.14 0.00242 페닐-세파로오스 17.7 0.757 0.0429 블루-세파로오스 10.2 0.745 0.0727 Mono Q 0.776 0.386 0.497 Superdex 200 0.0131 0.0434 3.33

[실시예 36] (R)-2-옥탄올탈수소효소의 분자량측정

실시예 35에서 얻어진 캔디다 ·우틸리스 유래의 효소의 분자량을, Superdex 200의 겔여과컬럼을 사용하여 측정한 바, 약 15만이었다.

[실시예 37] (R)-2-옥탄올탈수소효소의 최적의 pH

트리스염산완충액(Tris-HCl), 글리신완충액(Glycine)을 사용하여 pH를 변화시켜, 실시예 35에서 얻어진 효소의 (R)-2-옥탄올탈수소효소활성을 조사하여, 최대활성을 100으로 한 상대활성으로 표시하여, 도13에 나타냈다. 그 결과, 반응의 최적의 pH는 8.5-10.0이었다.

인산칼륨완충액(KPB), 초산나트륨완충액(NaOAc)을 사용하여 pH를 변화시켜, 실시예 35에서 얻어진 효소의 4-클로로아세토초산에틸환원활성을 조사하여, 최대활성을 100으로 한 상대활성으로 표시하여, 도14에 나타냈다. 그 결과, 반응의 최적의 pH는 5.0-6.5였다.

[실시예 38] (R)-2-옥탄올탈수소효소의 기질 특이성

실시예 35에서 얻어진 효소를 여러 종류의 알코올과 반응시켜, 그 산화활성을 측정했다. 결과는, NAD⁺를 보효소로 한 (R)-2-옥탄올의 산화활성을 100으로 한 상대활성으로 표시하여, 표10에 나타냈다. 그 결과, 알코올대기질로서, (S)-2-옥탄올에 대해서는 6.7%, 2-프로판올에 대해서는 8.3%, (R)-1-페닐에탄올에 대해서는 86.7%의 상대활성을 나타냈다.

표 10

기질(산화반응) (R)-2-옥탄올 100 (S)-2-옥탄올 6.7 2-프로판올 8.3 (R)-1-페닐에탄올 86.7 (S)-1-페닐에탄올 6.7

실시예 35에서 얻어진 효소를 여러 종류의 케톤과 반응시켜, 그 환원활성을 측정했다. 결과는, NADH를 보효소로 한 4-클로로아세토초산에틸의 환원활성을 100으로 한 상대활성으로 표시하여, 표11에 나타냈다. 그 결과, 케톤대기질로서, 2-옥타논에 대해서는 26.6%, 아세토페논에 대해서는 25.3%의 상대활성을 나타냈다.

표 11

기질(환원반응) 4-클로로아세토초산에틸 100 2-옥타논 26.6 아세토페논 25.3

[실시예 39] 캔디다 ·우틸리스 유래의 (R)-2-옥탄올탈수소효소에 의한 (S)-4-클로로-3-히드록시낙산에틸의 합성

100 mM 인산칼륨완충액(pH 6.5), 139.8 mg NADH, 캔디다 ·우틸리스 유래의 (R)-2-옥탄올탈수소효소 0.06 U, 0.5% 4-클로로아세토초산에틸을 포함하는 반응액속에서, 30℃에서 하룻밤 반응시켰다. 생성한 4-클로로-3-히드록시낙산에틸의 광학순도를 실시예 32와 동일하게 하여 구했다. 그 결과, 본 발명에 의해 생성된 4-클로로-3-히드록시낙산에틸은, 97%ee 이상의 S체였다.

산업상이용가능성

본 발명에 의해, 공업적 생산에 유리한 NADH 의존성 (R)-2-옥탄올탈수소효소가 제공되었다. 본 효소를 이용함으로써, 광학순도가 높은 (S)-4-할로-3-히드록시낙산에스테르를 비롯한, 광학활성 알코올의 효율적인 생산이 가능해졌다. 특히 4-할로아세토초산에스테르를 기질로서 본 발명을 토대로 하는 효소반응에 의해 얻을 수 있는 (S)-4-할로-3-히드록시낙산에스테르는, HMG-CoA 리덕타아제 저해제나 D-카르니틴 등의 의농약합성의 중간체로 되는 것으로부터, 본 발명은 산업상 매우 유용하다.

그 중에서도, 일본국 특개평02-732에 기재된 (R)-프로폭시벤젠유도체는, 합성항균제인 오플록사신의 광학활성체((S)-(-)-9-플루오로-3-메틸-10-(4-메틸-1-피페라지닐)-7-요오드-2,3-디히드로-7H-피리도[1,2,3-de][1,4]벤조옥사진-6-카르복실산 , 일본국 특개평62-252790) 등의 합성중간체로서 유용한 화합물이다. 오플록사신은, 특정 광학이성체에 있어서 높은 항균활성이 확인되고 있다. 오플록사신의 합성중간체를 높은 광학순도로 얻을 수 있는 본 발명은, 오플록사신 광학이성체의 합성에 공헌한다.

Claims

다음에 나타내는 이화학적 성질 (1) 및 (2)를 갖는 (R)-2-옥탄올탈수소효소.

(1) 작용

i) 산화형 β-니코틴아미드아데닌디뉴클레오티드를 보효소로서, 알코올을 산화하여 케톤을 생성한다.

ii) 환원형 β-니코틴아미드아데닌디뉴클레오티드를 보효소로서, 케톤을 환원하여 알코올을 생성한다.

(2) 기질 특이성

i) 2-옥탄올에 포함되는 2개의 광학이성체 중 (R)-2-옥탄올을 우선적으로 산화한다.

ii) 4-할로아세토초산에스테르를 환원하여 (S)-4-할로-3-히드록시낙산에스테르를 생성한다.
제1항에 있어서, 더욱이 다음에 나타내는 이화학적 성질 (3) 및 (4)를 갖는 (R)-2-옥탄올탈수소효소.

(3) 최적의 pH

산화반응의 최적의 pH는 8.0~11.0이다. 환원반응의 최적의 pH는 5.0~6.5이다.

(4) 기질 특이성

i) 2차 알코올에 대해, 1차 알코올 보다도 높은 효소활성을 갖는다.

ii) (R)-2-옥탄올에 대해, 2-프로판올 보다도 상당히 높은 효소활성을 갖는다.
제1항 또는 제2항에 있어서, 피키아속, 캔디다속 및 오가타에아속으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 미생물에 유래하는 (R)-2-옥탄올탈수소효소.
제3항에 있어서, 피키아속에 속하는 미생물이, 피키아 ·핀란디카(Pichia finlandica)인 (R)-2-옥탄올탈수소효소.
제3항에 있어서, 피키아속에 속하는 미생물이, 피키아 ·쟈디니(Pichia jadinii)인 (R)-2-옥탄올탈수소효소.
제3항에 있어서, 캔디다속에 속하는 미생물이, 캔디다 ·우틸리스(Candida utilis)인 (R)-2-옥탄올탈수소효소.
제3항에 있어서, 오가타에아속에 속하는 미생물이, 오가타에아 ·윅커하미(Ogataea wickerhamii)인 (R)-2-옥탄올탈수소효소.
피키아속, 캔디다속 및 오가타에아속으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 미생물로서, 제1항 또는 제2항의 효소를 생산하는 미생물을 배양하는 공정을 포함하는, 제1항 또는 제2항의 (R)-2-옥탄올탈수소효소의 제조방법.
하기 (a)~(e) 중 어느 하나의 (R)-2-옥탄올탈수소효소활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드.

(a) 서열번호: 1의 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드,

(b) 서열번호: 2의 아미노산서열로 된 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드,

(c) 서열번호: 2의 아미노산서열에 있어서, 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산으로 된 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드,

(d) 서열번호: 1의 염기서열로 된 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트(stringent)한 조건하에서 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드,

(e) 서열번호: 2의 아미노산서열과 70% 이상의 상동성을 갖는 아미노산서열을 코드하는 폴리뉴클레오티드,
제9항의 폴리뉴클레오티드에 의해 코드되는 단백질.
제9항의 폴리뉴클레오티드가 삽입된 재조합 벡터.
제11항에 있어서, 더욱이 β-니코틴아미드아데닌디뉴클레오티드를 보효소로하는 산화환원반응을 촉매할 수 있는 탈수소효소를 코드하는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 재조합 벡터.
제9항의 폴리뉴클레오티드 또는 제11항의 벡터를 발현 가능하게 보유한 형질전환체.
제13항의 형질전환체를 배양하는 공정을 포함하는 제10항의 단백질의 제조방법.
제1항 또는 제2항의 (R)-2-옥탄올탈수소효소, 제10항의 단백질, 그 효소 또는 단백질을 생산하는 미생물, 또는 그 미생물의 처리물을 케톤에 작용시키고, 그 케톤을 환원하여 알코올을 제조하는 것을 특징으로 하는 알코올의 제조방법.
제15항에 있어서, 상기 미생물이 제13항의 형질전환체인 알코올의 제조방법.
제15항에 있어서, 케톤이, 4-할로아세토초산에스테르유도체이고, 알코올이 (S)-4-할로-3-히드록시낙산에스테르유도체인 알코올의 제조방법.
제17항에 있어서, 4-할로아세토초산에스테르유도체가 4-클로로아세토초산에틸에스테르이고, 알코올이 (S)-4-클로로-3-히드록시낙산에틸에스테르인 알코올의제조방법.
제15항에 있어서, 케톤이 일반식 1

일반식 1

(식중, X₁및 X₂는, 각각 할로겐원자를 의미한다)으로 나타내어지는 아세토닐옥시벤젠유도체이고, 알코올이 일반식 2

일반식 2

으로 나타내어지는 (R)-프로폭시벤젠유도체인 알코올의 제조방법.
제19항에 있어서, 상기 아세토닐옥시벤젠유도체가 2-아세토닐옥시-3,4-디플루오로니트로벤젠이고, 알코올이 2,3-디플루오로-6-니트로[[(R)-2-히드록시프로필]옥시]벤젠인 알코올의 제조방법.
제15항에 있어서, 더욱이 부가적으로 산화형 β-니코틴아미드아데닌디뉴클레오티드를 환원형으로 변환하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 알코올의 제조방법.
제1항 또는 제2항의 (R)-2-옥탄올탈수소효소, 또는 제9항의 단백질, 그 효소 또는 그 단백질을 생산하는 미생물, 또는 그 미생물의 처리물을 알코올에 작용시키고, 그 알코올을 산화하여 케톤을 제조하는 것을 특징으로 하는 케톤의 제조방법.
제1항 또는 제2항의 (R)-2-옥탄올탈수소효소, 또는 제9항의 단백질, 그 효소 또는 그 단백질을 생산하는 미생물, 또는 그 미생물의 처리물을 라세미체 알코올에 작용시키고, 광학이성체의 한쪽을 우선적으로 산화하여, 잔존하는 광학활성 알코올을 취득하는 것을 특징으로 하는, 광학활성 알코올의 제조방법.
제22항 또는 제23항에 있어서, 더욱이 부가적으로 환원형 β-니코틴아미드아데닌디뉴클레오티드를 산화형으로 변환하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.