CZ216699A3 - Geny kodující pro deacetylázy aminokyselin se specifikací pro N-acetyl-L-fosfinothricin, způsob jejich izolace a jejich použití - Google Patents

Geny kodující pro deacetylázy aminokyselin se specifikací pro N-acetyl-L-fosfinothricin, způsob jejich izolace a jejich použití Download PDF

Info

Publication number
CZ216699A3
CZ216699A3 CZ992166A CZ216699A CZ216699A3 CZ 216699 A3 CZ216699 A3 CZ 216699A3 CZ 992166 A CZ992166 A CZ 992166A CZ 216699 A CZ216699 A CZ 216699A CZ 216699 A3 CZ216699 A3 CZ 216699A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
acetyl
deacetylase
ala
ppt
gly
Prior art date
Application number
CZ992166A
Other languages
English (en)
Inventor
Klaus Bartsch
Guido Kriete
Inge Broer
Alfred Pühler
Original Assignee
Hoechst Schering Agrevo Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hoechst Schering Agrevo Gmbh filed Critical Hoechst Schering Agrevo Gmbh
Publication of CZ216699A3 publication Critical patent/CZ216699A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8209—Selection, visualisation of transformants, reporter constructs, e.g. antibiotic resistance markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8287—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for fertility modification, e.g. apomixis
    • C12N15/8289—Male sterility
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Description

Vynález se týká molekuly DNA, která kóduje pro deacetylázy nebo proteiny s biologickou aktivitou deacetylázy a rovněž transgenních rostlinných buněk, které byly transformovány molekulou DNA podle vynálezu. Tyto molekuly se mohou používat k výrobě rostlin s řízené degradovatelnými částmi, to znamená samčí nebo samičí sterilní rostliny, a to specifickou expresí deacetylázového genu.
Dosavadní stav techniky
Možnost chemicky indukované, reversibilní samčí sterility rostlin antherenní specifickou expresí N-acetyl-fosfinothricin (N-acetyl-PPT) specifickou deacetylázou se popisuje v evropské patentové přihlášce EP 631 716. Při tom použité deacetylázové geny z Streptomyces viridochromogenes [N-acetyl-L-fosfonothricyl-alynyl-alanin (N-acetyl-PPT)deacetylázy, dea], případně argE z Escherichia coli (N-acetyl-L-ornithin-deacetyláza) kódují proteiny se specifikací pro N-acetyl-L-PPT. Pro oba geny lze doložit při tapetum-specifické expresi v rostlinách výskyt samčích sterilních květů po ošetření jednotlivých pupenů pomocí N-acetyl-L-PPT. Pro úspěšné použití tohoto systému obzvláště při ošetření celých rostlin pomocí N-acetyl-PPT za podmínek praktického užití je výhodné použít deacetylázy s vysokou substantní afinitou. Proto jsou hledány další deacetylázy s vysokou afinitou k N-acefyl-PPT.
Tato přihláška si klade za úkol dát k dispozici molekulu DNA, která kóduje pro deacetylázy. Těmito deacetylázami je možné vytvořit rostliny s cíleně degradovatelnými částmi těchto rostlin. Obzvláště zajímavá je příprava samčích nebo samičích sterilních rostlin.
Podstata vynálezu
Vynález se týká molekuly DNA, která kóduje pro deacetylázy nebo proteiny s biologickou aktivitou deacetylázy. Enzymatické vlastnosti těchto proteinů se popisují v příkladech. Vynález se týká také molekuly DNA, která kóduje biologicky aktivní dílčí fragment nebo derivát. Molekuly podle vynálezu zahrnují také fragmenty, deriváty nebo alelické varianty. Jako fragmenty se rozumí části, které ještě vykazují biologickou aktivitu deacetylázy.
Vynález se kromě toho týká transgenních částí rostlin, které byly transformovány molekulami DNA podle vynálezu. Transgení buňky rostlin se mohou vyrábět známými technikami a regenerovat na celé rostliny.
Vynález se týká molekuly DNA kóduj ící protein s biologickou aktivitou N-acetyl-PPT-deacetylázy.
Vynález se týká obzvláště molekuly DNA kódující protein s biologickou aktivitou N-acetyl-PPT-deacetylázy vybrané ze skupiny sestávaj ící z • ·
• ·
a) molekul DNA, které kódují pro protein se sekvencí aminokyselin uvedenou jako SEQ ID No 2 a jejich fragmentů a/nebo derivátů;
b) molekul DNA, které kódují pro sekvenci nukleotidu uvedenou jako SEQ ID No 1 nebo sekvenci, která se v rámci degenerace genetického kódu od této sekvence odvozuj e;
c) molekul DNA, které kódují pro protein se sekvencí aminokyselin uvedenou jako SEQ ID No 4 nebo jejich fragmentů a/nebo derivátů a
d) molekul DNA, které kódují pro sekvenci nukleotidu uvedenou jako SEQ ID No 3 nebo sekvenci, která se v rámci degenerace genetického kódu od této sekvence odvozuj e.
Vynález se kromě toho týká mikroorganizmů Stenotrophomonas sp. (DSM 9734) a Comamonas acidovorans (DSM 11070), které jsou identifikovány a doloženy způsoby popsanými v této přihlášce.
Předmětem vynálezu jsou obzvláště rostlinné buňky nebo rostliny, které obsahují molekuly DNA podle vynálezu.
Zvláštní pozornost se věnuje způsobům přípravy rostlin s cíleně degradovatelnými částmi specifickou expresí deacetylázového genu a způsob přípravy samčích nebo samičích sterilních rostlin specifickou expresí deacetylázového genu.
Předložený vynález se tedy také týká :
(1) cíleného obohacení mikroorganismů s vysokou N-acety1-PPT-deacetylázovou aktivitou (2) izolace odpovídajících deacetylázových genů (3) čištění a charakterizace proteinů s vysokou N-acetyl-PPT-deacetylázovou aktivitou, kódovaných těmito geny (4) exprese deacetylázových genů v rostlinách.
Předložený vynález se dále týká :
molekuly DNA, která kóduje pro enzymy s vysokou N-acetyl-PPT-deacetylázovou aktivitou proteinů, které jsou kódovány těmito geny exprese těchto deacetylázových genů v rostlinách.
Z půdních vzorků je možné na minerálním mediu s chitinem jako jediným zdrojem C obohatit bakterie, které jsou schopné štěpit N-acetyl-PPT s vysokou efektivitou. Tímto bylo možné isolovat jako čisté kultury 2 bakteriální kmeny : Stenotrophomonas sp. (DSM-doklad-č. 9734) a Comamonas acidovorans (DSM-doklad-č. 11070).
Pro podmínky vyžadované pro průmyslovou výrobu je však podstatně výhodnější, moci použít čištěný enzym.
Předložená přihláška zahrnuje nové deacetylázy specifické pro L-N-acetyl-PPT, nový a účinný způsob čištění a charakterizace tohoto enzymu z obohacené kultury půdních ·· ·· -• · · · · * • · · · · · · • · · · · · · • · · · · · ···· ·· ·· · • · · · · · • · ·· ·· mikroorganizmů a použití této deacetylázy.
Vynález se tedy dále týká :
1. Deacetylázy s
- molekulovou hmotností od 20 000 do 100 000 D
- optimálním pH 6,5 - 10,0
- substrátovou specifitou vůči Ln - acetyl fosfinothricinu.
2. Způsobu výroby deacetylázy, který se vyznačuje tím, že se mikroorganismus tvořící spory kultivuje v médiu obsahujícím krabí chitin, a z těchto mikroorganismů se izoluje deacetyláza.
3. Použití deacetylázy je charakterizováno ad 1 k výrobě samčích sterilních rostlin a ke stereoselektivní tvorbě L-fosfinothricinu.
Vynález se týká obzvláště enzymu, který má teplotní optimum ležící mezi 30 °C a 50 °C.
Způsob podle vynálezu k výrobě deacetyláz se s výhodou provádí s mikroorganismy vybranými ze skupiny, která sestává z mikroorganismů popsaných v přihlášce.
Krabi chitin se může získat způsobem popsaným v Shimahara, Kenzo a Takiguchi, Yasuyuki (Methods in Enzymology,
Vol 161, strany 417 - 423, 1988) nebo je možné jej zakoupit u firmy Sigma.
K čištění deacetylázy se miktoorganismus kultivuje v živném médiu, které je pro něj optimální. Pěstování mik6
roorganismů se provádí aerobně, příkladně submerzně za třepání nebo míchání v třepací baňce nebo fermentorech, případně za uvádění vzduchu nebo kyslíku. Fermentace se může provádět v rozmezí teplot asi 20 °C až 40 °C, s výhodou při asi 25 °C až 37 °C, obzvláště výhodně při 30 °C až 37 °C. Kultivuje se v rozmezí pH mezi 5 a 8,5, s výhodou mezi 5,5 a 8,0.
Za těchto podmínek vykazují mikroorganismy obecně po 1 až 3 dnech významnou akumulaci enzymu. Syntéza deacetylázy začíná v log-fázi. Produkce enzymu se může sledovat pomocí testu aktivity analýzou HPLC, případně fotometricky. Živný roztok použitý k výrobě transaminázy obsahuje 0,2 až 5 %, s výhodou 0,5 až 2 % krabího chitinu a anorganické soli.
Z anorganických solí může živný roztok obsahovat příkladně chloridy, uhličitay, sírany nebo fosforečnany alkalických kovů nebo kovů alkalických zemin, železa, zinku a manganu, ale také amonné soli a dusičnany.
Podle vynálezu se mohou účinná množství deacetylázy použít k deacetylizaci jako volné nebo v imobilizované formě, s výhodou se použijí v rostlinách, které exprimují deac-geny.
K fixaci přicházejí v úvahu známé způsoby jako způsob popsaný v německém vykládacím spise 32 37 341 a 32 43 591.
Izolace a čištění enzymu se může provádět klasickým způsobem za využití ultrazvuku a French-Press, srážením síranem amonným, použitím iontoměničů, afinitní chromatografie a gelové permeace.
»· ·♦ Λ · • · «··· ·· ·· ···*
*«« ··· • · ·· ·*
Enzymový preparát je možné charakterizovat molekulovou hmotností 20 000 až 100 000 D, s výhodou 30 000 až 80 000 D, obzvláště výhodně 40 000 až 70 000 D. Optimální pH enzymového produktu je v oblasti pH 6,0 až 10,0, obzvláště 7,0 až 8,0. Teplotní optimum enzymu leží mezi 30 °C až 50 °C, obzvláště mezi 35 °C až 45 °C.
Geny kódující pro deacetylázy se klonují v E.coli.
V případě genu deacl z Stenotrophomonas sp. byla s použitím screeningu zjištěna fágemidová expresní banka z genomické DNA v E.coli na N-acetyl-PPT-specifickou deacetylázovou aktivitu. Gen deac2 z Comamonas acidovorans se klonuje komplementací mutantů E.coli-arg E s genomickou bankou.
Sekvence aminokyselin odvozené ze sekvencí DNA obou genů jsou vzájemně podobné a vykazují kromě toho homologii k hippurátovým hydrolázám, jaké jsou známé z proteinových databank.
Vysoká substrátová afinita proteinů deacl pro N-acetyl-L-PPT (Km = 670 μΜ) je u transgenních rostlin pozorovatelná díky vysoké citlivosti tkáně vůči této substanci.
Tak se mohou při konstitutivní expresi genů deac získat rostliny, jejichž listy citlivě reagují ještě na koncentrace až do 0,4 mg/ml N-acetyl-D,L-PPT (= 0,2 mg/ml L-enantiomeru). Při tapetum-specifické expresi bylo dosaženo indukce samčích sterilních květů ošetřením pupenů 2 mg/ml N-acetyl-D,L-PPT (= 1 mg/ml) L-enanciomeru). Popsané výsledky se vztahují na skleníkové rostliny. Na základě nízké koncentrace substance je při použití ve volném prostředí bez dalšího možné vyšší dávkování o pěti až desetinásobek .
Příklady provedení vynálezu
Připojené příklady slouží k bližšímu vysvětlení vynálezu, aniž by jakkoliv omezovaly jeho rozsah. Údaje v procentech se vztahuj í na hmotnost, pokud není uvedeno j inak.
Příklad 1
Izolace a identifikace půdních mikroorganismů s N-acetylPPT-speciíickou deacetylázovou aktivitou
Vždy 1 g půdy (písčitá zemina, duna Schwanheimer) se při teplotě místnosti extrahuje po dobu jedné hodiny 10 mM NaCl, 10 mM Na-fosfátového pufru, pH = 7,0. K selekci rozdílných skupin mikroorganismů se části půd přeočkují do následujících kapalných médií :
(1) Médium MSI (pro Eubakterie):
mM glukózy 5 mM sukcinátu 10 mM glycerinu 1 g/1 nh4ci 50 ml/1 roztoku A 25 ml/1 roztoku B Roztok A : 50 g/1 K^HPO^
Roztok B : 2,5 g/1 MgS04
0,5 g/1 NaCl ml/1 stopových prvků (2) Médium s chitinem (pro Actinomycety a Streptomycety a • · ···· · · · · • · · « o · · · · · • · · · · · · · ·· · • · ··· · * · ··· ··· ······ ♦ · ······ ·· · · · ·* pro chitinovorní bakterie):
g/1 krabího chitinu i g/i (nh4)2so4 0,5 g/1 MgSO4 50 ml/1 roztoku A ml/1 stopových prvků (3) Antibiotikové médium (pro vyšší houby):
g/1 sladového extraktu 10 g/1 glukózy g/1 kvasinkového extraktu 0,5 g/1 (NH4)2S04 pg/ml tetracyklinu
Všechna média obsahují 5 mM N-acetyl-PPT a po přeočkování se inkubuji po dobu 3 až 5 dní při teplotě 28 °C.
Obohacené kultury se následně testují na deacetylaci N-acetyl-PPT. K tomu se buňky odstředí při 10 000 otáčkách za minutu a kapaliny se vyšetřují v analyzátoru aminokyselin (Biotronic LC 5001) z hlediska tvorby PPT. Pouze kultury z chitinového média se ukázaly být deacetylázově pozitivní. Po kultivaci na chitin-agarových plotnách se z těchto kultur izoluje celkem 40 jednotlivých kolonií, rekultivují se v kapalném chitinovém médiu a opětovně testují na deacetylázovou aktivitu. Přitom bylo nalezeno 6 pozitivních izolátů, z nichž mohly být po opakovaném natření na agarové plotny a další kultivaci získány jednotlivé kolonie čistých aktivních kultur. Kmen s nejvyšší deacetylázovou aktivitou byl identifikován jako Stenotrophomonas sp.
(Doklad DSM č. DSM 9734).
• · • 0 · « · · 0 • · » · · · · • · · · ··· ···
Příklad 2
Klonování a sekvenování N-acetyl-PPT-deacetylázového genu ze Stenotrophomonas sp.
Molekulárně biologické metody používané pro práci popisuje Maniatis a spol. 1982, Molecular Cloning : a laboratory manual Cold Spring Harbor, N.Y.
Genomická DNA ze Stenotrophomonas sp. se preparuje metodou podle Maede a spcl. 1982, J.Bacteroiol. 149, strany 114-122. Po parciální štěpení pomocí Sau3A se izoluje většinová frakce 4-10-kb a liguje se v lambda-ZAP-expres-vektoru Stratagenu štěpenéhc pomocí BamHI (ZAP Express Vector Kit. katalog č. 239 201, Instruction Manual). S balenou ligační násadou se vyrobí primární lambda fágová banka a následně se amplifikuje. Z toho se s pomocí pBK-CMV-fágemidového systému Strate genu (katalog č. 212 209,
Instruction Manual) nasací fágová expresní banka v Escherichia coli. Tato genová lanka se ověřuje na přítomnost deacetylázového genu pomocí screeningu aktivity na [14C]-N-acetyl-L-PPT jako substrátu. K tomuto účelu se přeočkuje 2000 jednotlivých klonů na mikrotitrační desky nechá se růst přes noc v mediu LB při teplotě 37 °C s 0,2 mM isopropylthioglalaktosidu (IPTG) jako induktorem a 50 pg/ml kanamycinu jako rezistentního markéru. Buňky se odstředí a inkubují se přes noc pri teplotě 28 °C vždy v 10 μΐ 1 mM [14C]-N-acetyl-L-PPT.
Následně se násady íinalyzují v achterpools chromatografií na tenké vrstvě a autoradiografií z hlediska reakce N-acetyl-PPT na PPT (viz EP 531 716, příklad 8) a při pozi• · · · · « · · ♦ · · • · · · · · · · ·· ·
9 9 9 9 9 9 9 999 999 ·*···· · · ······ «· · * · 9 9 tivním nálezu se jednotlivé klony dále testují. Tímto způsobem se mohl vyselektovat pozitivní klon s insertem 6-kb z 1920 transformantů. Tento fragment DNA byl blíže charakterizován restrikčním kartováním. Subklonováním restrikčních fragmentů insertu v pUC 18/19 a transformací rekombinantního plasmidu v E.coli bylo možné s pomocí výše popsaného testu aktivity lokalizovat strukturní gen deac na 2,5 kb (2487 základních párů) sall/smal fragmentu (obr. 1). Aktivita byla závislá na orientaci fragmentu relativně k lac-promotoru vektoru.
Fragment 2,5-kb se sekvencuje v obou řetězcích Sangerovou metodou (Sanger a spol., 1977, Proč. Nati. Acad. Sci USA 74 : 54 63 - 54 68). Celý fragment má délku 2478 nukleotidů, viz SEQ ID č. 1). Otevřený identifikační rámec délky 1493 nukleotidů začíná nukleotidem č. 367 a končí nukleotidem č. 1860.
Expresní studie se subfragmenty PCR z této oblasti v E. coli ukazují, že aktivní deacetylázový protein začíná v oblasti obsahující 1365 nukleotidů s ATG-startovním kodonem v pozici 496 a končící konečným kodonem TGA v pozici 1860. Sekvence aminokyselin odvozená ze sekvence aminokyselin představuje polypeptdd 454 aminokyselin (sekvence ID č. 2) s vypočtenou molekulovou hmotností 48,1 kDa.
Vyhledání homologu v EMBL-, DNA- a proteinových databankách vykázalo podobnosti s N-acetyl-PPT-deacetylázou z Comamonas acidovorans (37,4 % identických aminokyselin) popsanou poprvé v této přihlášce, hippurát-hydrolázy z Campylobacter jejuni (33,9 %) a N-acyl-L-aminohydrolázy z Bacillus stearothermophilus (33,7 %). Dále je gen izolovaný z Stenotrophomonas označován jako deac 1. Odpovídající protein se označuje jako Deac 1. Na základě homologie lze • © » · « · 4·4· ·· ·© » vycházet z toho, že také uvedené hippurát-hydrolázy a amidohydrolázy v kombinaci s promotory specifickými pro tkáně a následném ošetření se nohou s výhodou využít k výrobě rostlin se selektivně degradovatelnými tkáněmi, obzvláště samčích a/nebo samičích rjstlin.
Příklad 3
Charakterizace proteinu Deac 1
K přeexpresi a čištění deacetylázy z Stenotrophamonas sp. (deac 1) se použije glutathion-S-transferáza (GST)-GenFusionsvektor-System firmy Pharmacia (katalog č.
27-4581-01, katalog č. 27-4570-01). Tuto metodu popisuje Smith and Johnson, 1988, Gene 67:31 . Čištění fuzního proteinu se provádí afinitní chromatografii na Glutathion-Sepharose-4B.
Funkční deac-gen se jako 1,4-kb BamHl/Sall-PCR-fragment překlonuje na GST-ftzní vektor pGEX-4T-2 za řízení lac-pomotorem. Exprese lekombinantního fuzního proteinu se indukuje přídavkem 0,1 mí* IPTG. Elektroforézou surových extraktů transformantů E. coli SDS/polyakrylamid mohl být prokázán fuzní protein jeko pás 74-kDA.
K čištění proteinu se buňky z transformantu 2 1 kultury indukovaného expresně pozitivního E. coli rozruší ultrazvukem a extrakt se následně solubilizuje přídavkem 1 % Triton-X-100. Zbytek je vázán na Glutathion-Sepharosu-4B.
Po opakovaném promytí puírem PBS (140 mM NaCl, 3 mM KC1, 10 mM Na2HP04, 2 mM KH2PO4, pH = 7,3) byl štěpen fuzní protein vázaný na sepharosovou matrici trombinem. Eluát obsahuje • · · · φ · φφφ φ φ φ φ φ φ φ φ • φ φφφ φ φφφφ ΦΦ ΦΦ φφφφ ΦΦ ΦΦ φ φφφφ φ φφφφ φ φ φφφ φφφ φ φ φ • φ φ φ φ jako jediný proteinový pás štěpný produkt 48-kDa (po denaturalizující elektroforéze SDS/polyakrylamid), který byl při enzymovém pokusu (viz níže) identifikován jako N-acetyl-PPT-deacetyláza. Popsanou metodou bylo možné vyčistit ze 2 1 bakteriální kultury až k homogenímu stavu 200 pg deacetylázového proteinu.
Aktivita deacetylázového proteinu se měří dvěma následujícími pokusy :
(1) Radioaktivní test :
Vždy 2,5 pg čištěného enzymu se inkubuje po násadách 10 pl v pufru PBS s 0,1 mM [14C]-N-acetyl-L-PPT po dobu 15 minut při teplotě 37 °C. Následně se vzorky zředí 1:6 v 5 mM KH2PO4, 10 % methanolu, pH = 1,92 a analyzují se pomocí HPLC detektoru radioaktivity (dělicí sloupec : Spherisorb SAX, eluát; 5 mM KH2PO4, 10 % methanolu, pH = 1,92, eluční poměr : 0,5 ml/min). Za těchto podmínek eluuje [14C]-L-PPT za 4,5 minuty a [14C]-N-acetyl-L-PPT za 6,5 minuty. Specifické deacetylázové aktivity byly zjištěny v [nmol [14C]-L-PPT/min/mg proteinu]. Ke zjištění optima pH se inkubují násady v pufrovém systému sestávajícím z 40 mM Bis-Tris, Tris a Caps mezi pH 6 a 9. Pro měření hodnoty Km se provádí trojnásobné stanovení s koncentrací [^4C]-N-acetyl-L-PPT mezi 0,01 mM a 1 mM při hodnotě pH = 8,0 v přítomnosti 1 mM C0CI2.
(2) Neradioaktivní test :
K vyšetření substrátové specifriky se inkubuje vždy 5 pg čištěného enzymu v 20 pl násady v pufru PBS vždy s 25 mM určité N-acetyl-aminokyseliny, případně N-acyl-aminoky• · • · · · seliny po dobu 60 minut při teplotě 28 °C. Následně s vzorky měří na tvorbu aminokyselin (Biotronic LC 5001). Specifické aktivity se zjišťují v [nmol aminokyseliny /min/mg proteinu]. Pro N-acetyl-PPT-deacetylázu bylo zjištěno optimální pH = 8 (viz Tabulka 1) a optimální teplota 37 °C (viz Tabulka 2). Kinetická měření poskytla hodnotu Km 670 pm. Přídavkem 1 mM C0CI2 stoupla aktivita enzymu o asi 20 %.
Tabulka 1 : Optimum pH N-acetyl-PPT-deacetylázy
pH-hodnota Specifická aktivita [mol/min/mg proteinu]
6 2,4
7 7,2
8 12,0
9 8,5
Tabulka 2 : Optimum teploty N-acetyl-PPT-deacetylázy
Teplota [°C] Specifická aktivita [nmol/min/mg proteinu] :
28 9,6
37 16,8
50 14,9
60 4,3
Výsledky měření substrátové specificity jsou uvedeny v Tabulce 3.
• · ···· · · · · ·· · * · * · · ·· · ··· ··· ····· ·· · ·· · ·
Enzym má realitivně široké substrátové spektrum.
Nejvyšší konverze se dosáhne s kyselinou hippurovou (N-benzoyl-glycin) a N-acetyl-L-glutamátem. Afinita vůči N-acetyl-L-PPT činí přibližně o 50 % méně než pro oba výše jmenované substráty. Deacetyláza má výhradní specifitu pro N-acetyl-L-aminokyseliny. S odpovídajícími D-enantiomery nebyla pozorována žádná reakce.
Tabulka 3 : Substrátová specifita N-acetyl-PPT-deacetylázy
Substrát1 Relativní aktivita2 [%]
Kyselina hippurová 100
(N-benzoyl-glycin)
N-Ac-fosfinothricin 43
N-Ac-ornithin 37
N-Ac-methionin 0
N-Ac-tryptofan 0,4
N-Ac-fenylalanin 24
N-Ac-tyrosin 11
kyselina N-Ac-glutamová 100
N-Ac-glutamin 30
N-Ac-glycin 59
N-Ac-histidin 43
N-Ac-leucin 33
N-Ac-valin 2
N-Ac-serin 4
N-Ac-prolin 0
U všech sloučenin se jedná o L-enanciomery • · · 2 Specifická aktivita změřená s kyselinou hippurovou byla stanovena na 100 % a ostatní hodnoty byly vztaženy k této hodnotě
Příklad 4
Konstitutivní exprese genu deac-1 v tabáku
Deacl-strukturní gen se překlonuje jako fragment 1,4 kb BamHl/Sall-PCT na binární vektor pPCV8081 (Koncz a Schell, 1986, Mol.Gen.Genet. 204:383-396) za řízení promotoru 35S. Vzniklý plasmid pPCVKDEACl (obrázek 2) se expresním vektorem 35S-promotor-deacl-strukturgen-35S-terminátor za použití standardních metod transformuje v Agrobacterium tumefaciens (kmen ATHV). Kousky listů tabáku (Nicotiana tabacum) se transformují rekombinantními agrobakteriemi metodou podle Horsch a spol., 1985, Science 227:1229-1231 a selektují na kanamycinovém mediu, 18 nezávislých tabákových transformantů se regeneruje a testuje na expresi deacetylázy v listech. V případě aktivity proteinu v transgenních rostlinách bylo třeba počítat s citlivostí listů vůči N-acetyl-PPT, neboť substance v rostlinách se potom na základě enzymatické aktivity deacetylázy přeměňuje na herbicidní účinnou látku fosfinothricin.
Při kapkovém pokuse se listy transgenních rostlin stejně jako několik netransgenních kontrolních rostlin ošetří vždy 5 μΐ následujících koncentrací N-acetyl-D,L-PPT :
mg/ml (= 15 mM), 1 mg/ml (= 3,75 mM), 0,4 mg/ml (= 1,5 mM), 0,1 mg/ml (= 0,38 mM). Ošetřená místa se po 1 až 2 týdnech vyšetřují na zesvětlení případně tvorbu nekroz. Zároveň se měří N-acetyl-PPT-specifická deacetylázová akti• *
vita transformantů a kontrolních rostlin v surovém extraktu. K tomu účelu se homogenizuje vždy 100 mg listového materiálu ve 200 μΐ pufru PBS, rozpadlé buňky se odstředí a zbytky obsahující protein se přes noc dialyzují při teplotě 4 °C proti stejnému pufru. Vždy 10 μΐ těchto vzorků se inkubuje přes noc při teplotě 37 °C v 0,1 mM [^4C]-N-acetyl-L-PPT. Násady se následně analyzují v HPLC na tvorbu [14C]-L-PPT, jak se popisuje výše.
Výsledky testů kapkových pokusů a testů aktivity uvádí pro vybrané rostliny Tabulka 4. Ukazuje se, že asi 60 % transformantů exprimuje deacetylázový protein a preferuje odpovídající fenotyp.
Tabulka 4 :
Citlivost rostlin pPCVKDEACl vůči N-acetyl-PPT a deacetylázová aktivita v surových extraktech
Rostlina Kapkový pokus N-Ac-D,L-PPT 4 mg/ml Deac. aktivita v surovém roztoku [% L-PPT]1
1 mg/ml 0,4 mg/ml 0,1 mg/ml
Pozorování (list):
Kontrola - - - - 0
pPCVK9 + + + + - - 14,2
pPCVK14 zkroucen : + + - - 12,1
PPCVK15 zkroucen : + + + + - 36,0
PPCVK16 zkroucen + + - - 4,7
pPCVK17 , zkroucen + + - - 4,3
+++ vztaženo na použitou radioaktivitu [^4C]-N-acetyl-L-PPT silná nekroza • · ···· ++ zřetelné škody + slabé zesvětlení žádné symptomy
Příklad 5
Tapetum-specifická exprese genu deacl v tabáku
Za použití standardních metod se tapetum-specifický promotor genu tapl z hledíku (Antirrhinum majus) jako fragment 2,2-kbEcoRl/BamHl fušuje se strukturním genem deacl (fragment 1,4-kb BamHl/Sall-PCR) a terminátorem 35S. Takto vzniklá expresní kazeta tapl-promotor-deac-strukturní gen-35S-terminátor se jako fragment 3,8-kb EcoRl vklonuje na pozici oblasti 35S-promoteru/terminátoru v binárním vektoru pPCV801 (plasmid pPCVTDEACl, obrázek 3). Transformace tabáku se provede stejně, jak se popisuje v příkladu 4.
V případě tapetum-specifické exprese deacetylázy by se měly ošetřením květních pupenů pomocí N-acetyl-PPT indukovat samčí sterilní květy. Konverze derivátů PPT na herbicidně účinnou látku fosfinothricin vede k selektivnímu poškození tapetum-tkáně, čímž se zabrání vývoji funkčních pollů.
Pomocí-acetyl-PPT se ošetří vždy jen jedna strana inflorescence (celá oblast vyvíjejícího se květního pupenu), druhá strana inflorescence zůstane neošetřena aby se zajistilo, že pozorované jevy nevznikají pochybením na daných rostlinách. Ošetření se provede v okamžiku, kdy jednotlivé pupeny nejsou větší než 5 mm (aktivní fáze pro tapetum-promotor). Transformanty tabáku a několik kontrolních rostlin NT Sam NN se v průběhu jednoho týdne ošetří třikrát 0,2 % • · · · · ·
N-acetyl-D,L-PPT (= 7,5 mM)/O,l % Genapol (smáčedlo). Po vykvetení pupenů (asi 9-11 dní po ukončení ošetřování) se rostliny vyšetřují z hlediska výskytu samčích sterilních květů.
Zároveň se měří N-acetyl-PPT specifická deacetylázová aktivita v nezralých antherenech transformantů a rovněž kontrolní rostliny. K tomu se preparuji nezralé anthereny z asi 5 mm velkých květních pupenů a přes noc se inkubuji při teplotě místnosti vždy v 50 μΜ roztoku [14C]-N-acetyl-L-PPT. Následně se anthereny promyji 1 x 500 μΐ pufru PBS a potom se homogenizují v 50 μΐ pufru PBS. Po odstředění rozpadlých buněk se zbytky zahustí ve Speed-Vac a pelety se rozpustí vždy v 30 μΐ pufru HPLC (5 mM KH2PO4, 10 % methanolu, pH = 1,92). Násady se analyzují v HPLC výše popsaným způsobem z hlediska tvorby [^4C]-PPT.
Výsledky ošetřování květů a testy aktivity uvádí pro vybrané rostliny Tabulka 5. Prakticky u všech transformantů byla zjištěna specifická deacetylázová aktivita pro anthereny. U třech transformantů se na straně květních hroznů ošetřené N-acetyl-PPT pozorují samčí sterilní květy, to znamená, že se nevytvořily žádné polly, případně květy se silně redukovanými polly. Účinek na nové zrající pupeny vydržel po dobu asi 3 týdnů. Neošetřené květy transformantů, stejně jako ošetřené květy kontrolních rostlin jsou ve všech případech fertilní. U samčích sterilních květů nebyla zjištěna tvorba semen. Řízené cizí sprášení samčích sterilních květů však bylo možné, čímž se dokázalo, že samičí části rostlin si zachovaly svou plnou funkci (Nacken a spol., 1991,
Mol.Gen.Genet. 229:129-136).
« · ·· ···· • · · · ·
Tabulka 5 :
Indukovaná samčí sterilita u rostlin pPCVTDEACl ošetřováním květů pomocí N-acetyl-PPT a deacetylázová aktivita v antherenech
Rostlina Počet sterilních květů příp.květů s redukovanými polly Deac. aktivita v antherenech [% L-PPT]1
Ošetřené Neošetřené
Kontrola 0 0 0
pPCVT14 18 0 70,0
pPCVT15 0 0 13,8
pPCVTló 10 0 20,4
vztaženo na použitou radioaktivitu [14C]-N-acetyl-L-PPT
Příklad 6
Izolace a identifikace deacetylázy se specifitou pro
N-acetyl-fosfinothricin z Comamonas acidovorans
Půdní vzorek z Bangkoku se rozmíchá v minerálním solném mediu (0,5 g K2HPO4, 0,2 g MgSO4, 2 g (NH4)2SO4, 0,01 g FeSO4 v 980 ml H20), který jako jediný zdroj uhlíku obsahuje chitin (2 g/1) a následně se inkubuje 48 hodin při teplotě 30 °C. Potom se provede přeočkování do čerstvého media s minerálními solemi a po dalších 48 hodinách inkubace se očkuje na desky na LB medium (Miller, Experiments in molecular genetics, Cold Spring Harbour Laboratory Press) ve zře• · · · ďovací řadě.
Mezi narůstajícími koloniemi se nacházejí také takové bakteriální kmeny, které se jako čistá kultura vyznačují velmi dobrým zhodnocením N-acetyl-glutamátu jako jediného zdroje uhlíku (výtěr na mediu s minerálními solemi s N-acetyl-glutamátem (2 g/1 přidán jako sterilně filtrovaný roztok k autoklávovanému mediu s minerálními solemi se 14 g/1 agaru) vede během 12 hodin inkubace při teplotě 30 °C ke tvorbě zřetelně viditelnýých kolonií). Deacetylace N-acetyl-PPT se prokazuje stejně jako je popsáno výše. Kmen opatřený laboratorním označením B6 byl DSM identifikován jako Comamonas acidovorans [DSM 11070].
Příklad 7
Klonování deacetylázového genu z Comamonas acidovorans
Veškerá DNA z Comamonas acidovorans se izoluje, štěpí se EcoRI a liguje se rovněž EcoRI štěpenou DNA vektoru pACYC184 (Cang a Cohen, 1978, J.Bacteriol. 134, 1141-1156). Ligačni násada se použije k elektroporaci E. coli argE-Mutante XSID2 (Mountain a spol., 1984, Mol.Gen.Genet. 197, 82-89). Selekcí na komplementací arginin-auxotrofie se podařilo izolovat 8,9 kb velký EcoRI-fragment z genomu C. acidovorans, který byl dostatečný pro komlementaci. Subklonováním bylo možné omezit komplementující oblast na 1,4 kb velký fragment. Tento se vyskytuje v derivátu sekvencujícího vektoru pSVB30 označeném pGK83 (Arnold a Puhler, 1988, Gene 70, 172-178).
·· ·* • · · ·· ···»
Příklad 8
Sekvencování deacetylázového genu z Comamonas acidovorans
Komplementující fragment velký 1,4 kb (1387 základních párů) se známými metodami úplně ve dvou řetězcích sekvencu j e.
Příklad 9
Analýza kóduj ící oblasti a porovnání homologie sekvencované oblasti
Analýza kódující oblasti poskytla otevřený čtecí rámec od pozice 1 do 1206 (SEQ No. 3), který kóduje pro protein o velikosti 402 aminokyslin (SEQ ID No.4).
Porovnání homologie se známými geny z databank ukazuje zřetelnou homologii k jedné N-acyl-L-amidohydroláze z Bacillus stearothermophilus (ama, Sakanyan a spol., 1993,
Appl.Environ.Microbiol. 59, 3878-3888) a jedné hippurátové hydroláze z Campylobacter jejuni (dosud nezveřejněno). Ve srovnáni proteinů vykazuje hippurátová hydroláza 43 % identických aminokyselin (Tabulka 6). Navíc vykazuje gen na rovině DNA a proteinu velmi nápadnou homologii k deacetylázovému genu izolovanému z Stenotrophomonas spec. Vycházeje z označení genu z Stenotrophomonas sp. byl gen identifikovaný z C. acidovorans označen deac2.
♦ · • · • ··· ·· ··«* ► · ♦ fl ·· · • ·
Tabulka 6
Srovnání homologie se známými sekvencemi
Gen Organismus Funkce Ident.AS Kons.AS
n. n Campylobacter j ej uni Hippurátová hydroláza (383 AS) 43,1 % 60,0 %
deac2 Stearothermo- philus N-acyl-L-amidohydroláza (370 AS) 37,0 % 49,5 %
Příklad 10
Přeexprese genu deac2 z rostlinného konstruktu Comamonas acidovorans
K analýze substrátové specifity deac2-genového produktu z Comamonas acidovorans se tento produkt přeexprimuje.
K tomu se gen klonuje na vektor s vysokým počtem kopií za řízení promotoru IacZ. Expresní účinnost je však omezena současnou translací IacZ-alfa, ke které dochází v jiném čtecím rámci. Proto se tato translace přeruší zavedením stop-kodonu, takže vektor pGK81 umožní přeexpresi deac2-genu, neovlivněnou nepoříznivě lac-Z-genem. Toto mohlo být prokázáno také fenotypicky, neboř tento konstrukt vykazuje zřetelně silnější komplementaci argE-mutantu E. coli.
K transformaci rostlin se strukturní gen deac2 překlonuje za použití binárního vektoru pROKl (Baulcombe a spol., 1986, Nátuře, 321:446-449) za konstitutivního promotoru 35S případně tapetum-specifického promotoru TA-29. Získané ** ·· • · · » · • ♦·· · » » · · · · « · · · · ···· ·· ·9
99 « · · · · • · · · • · ··· 999
9 9
99 99 expresní plasmidy pGK83 a pMF9 jsou znázorněny na obrázcích.
Příklad 11
Vyšetření substrátové specifity deac2-genového produktu z Comamonas acidovorans
K vyšetření substrátové specifity deac2-genového produktu z Comamonas acidovorans se použijí buňky E. coli kmenu XLI-Blue, permeabilizované ošetřením toluenem/ethanolem, s vektorem pGK81 a bez něj. Indukce reprimovaného deac2genu, vznikajícího v tomto kmenu, přítomným Lac1-represorem, je možné dosáhnout ošetřením IPTG. Permeabilizované buňky se inkubují s různými N-acetylovánými aminokyselinami (konečná koncentrace 25 mM) po dobu 3 hodiny při teplotě 30 °C a zbytky se vyšetřují s pomocí analyzáotoru aminokyselin. Z tohoto vyšetření vyplývá, že více jak 20 % disponibilního N-acetyl-ornitinu zreagovalo. Také pro N-acetyl-fosfino-thricin je možné zjistit vzrůstající deacetylaci na fosfinothricin, analogicky použité koncentraci N-acetyl-fosfino-thricinu (Tabulka 7).
Tabulka 7 :
Reakce N-acetylovaných aminokyselin deac2-genovým produktem
N-acetyl-ornitin (25 mM) N-acetylfenylalanin (25 mM) N-acetylfosfinothricin
(12,5 mM) (25 mM) (50 mM)
5860 nM < 5 nM 8,0 nM 20,0 nM 44,7 nM
Uváděny jsou koncentrace použitých N-acetylovaných aminokyselin a aminokyselin vzniklých deacetylací.
V následujícím jsou uvedeny sekvenční protokoly SEQ ID No 1 až 4 .
Sekvenční protokol (1) Všeobecné informace (i) Přihlašovatel :
(A) Jméno : Hoechst Schering AgrEvo GmbH (B) Ulice : (C) Místo : Frankfurt (D) Spolková země : (E) Země : Německo (F) Poštovní směrovací číslo : 65926 (G) Telefon : 069-305-5596 (H) Telefax : (+69) 357175 (I) Telex : (ii) Název přihlášky : Nové geny kódující pro deacetylázy aminokyselin se specifikací pro N-acetyl-Lfosfinothricin, jejich izolace a použití (iii) Počet sekvencí : 4 (iv) Forma uložená v počítači :
(A) Nosič dat : pružný disk (B) Počítač : IBM PC kompatibilní (C) Provozní systém : PC-DOS/MS-DOS (D) Software : Patentln Release #1.0, verse • · • · · ·
#1.25 }EPA] (2) Informace k SEQ ID No 1 :
(i) Sekvenční charakteristika :
(A) Délka : 1365 základních bází (B) Druh : nukleová kyselina (C) Struktura : jednořetězová (D) Topologie : lineární (ii) Druh molekul : DNS (genomická) (ix) Znak :
(A) Jméno/Klíč : exon (B) Poloha : 1..1365 (xi) Popis sekvence : SEQ ID No 1 :
ATGATCCGCA AGACCGTTCT GTTGACTGCG CTGTCCTGCG CCCTGGCCTC CGCGACAGCC 60
ACCGCCGCCG AAGGCCAGCG GCCCGAGGTG GAGGCCGCCG CCGCGCGCCT GCAGCGGCAG 120
GTGGTGGAGT GGCGCCGCGA TTTCCACCAG CATCCGGAGC TGTCCAACCG CGAGGTGCGC 180
ACCGCCGCCA AGGTGGCCGA GCGCCTGCGC GCGATGGGCC TGCAACCGCA GACCGGCGTC 240
GCCGTGCACG GCGTGGTGGC GATCATCAAG GGCGCCCTGC CGGGGCCGAA GATCGCCCTG 300
CGCGCGGACA TGGACGCGCT GCCGGTGACC GAACAGACCG GGCTGCCGTT CGCCTCCACC 360
GCCACGGCCG AGTACCGCGG CGAGAAGGTC GGGGTGATGC ATGCCTGCGG CCACGACGCC 420
CATACCGCCA CCCTGCTCGG CGTGGCCGAC GCGCTGGTGG CCATGCGCGA CACGCTGCCC 480
GGCGAAGTAA TGCTGATCTT CCAGCCGGCC GAGGAAGGCG CGCCGCCGCC GGAGCAGGGC 540
• · · ·
GGTGCCGAGC TGATGCTCAA GGAGGGGCTG TTCAAGGAGT TCAAGCCGGA GGCGGTGTTC 600
GGCCTGCACG TGTTCTCCAG CGTCCAGGCC GGGCAGATCG CCGTGCGCGG CGGCCCGCTG 660
ATGGCCGCCT CCGACCGCTT CGCCATCACC GTCAACGGCC GCCAGACCCA TGGCTCGGCG 720
CCCTGGAACG GCATCGATCC GATTGTCGCC GCCTCCGACC TGATCGGCAC CGCGCAGACC 780
ATCGTCAGCC GCCGCGCCAA CCTGTCCAAG CAGCCGGCGG TGCTGACCTT CGGCGCGATC 840
AAGGGCGGCA TCCGCTACAA CATCATCCCC GACTCGGTGG AGATGGTCGG CACCATCCGC 900
ACCTTCGACC CGGACATGCG CAAGCAGATC TTCGCCGACT TGCGCAACGT CGCCGAGCAC 960
ACCGCTGCCG CATGGCGCCA CCGCCACCAC CGACATCTAC GAGAAGGACG GCAACCCGGC 1020
CACGGTCAAC GACCCGGCGC TGACCGCGCG CATGCTGCCC AGCCTGCAGG CCGTGGTCGG 1080
CAAGGACAAC GTCTACGAGC CGCCGCTGCA GATGGGCTCG GAGGACTTCT CGCTGTATGC 1140
GCAGCAGGTG CCGGCGATGT TCTTCTTCGT CGGCTCCACC GGCGCGGGCA TCGACCCGGC 1200
CACCGCGCCC AGCAACCACT CGCCGAAGTT CCTGCTCGAC GAGAAGGCGC TGGACGTGGG 1260
CCTGCGCGCG CTGCTGCAGG TGTCGCTGGA CTATCTGCAC GGTGGCAAGG CGGGGTGACC 1320
CCTGCCAGTA TCGTGCCCCC GATACGGAAG AAGGACCTCC CATGA
1365
A ·
AAAA
A A
(2) Informace k SEQ ID No 2 :
(i) Sekvenční charakteristika :
(A) Délka : 454 aminokyselin (B) Druh : aminokyselina (C) Struktura : jednořetězová (D) Topologie : lineární (ii) Druh molekul : protein (ix) Znak :
(A) Jméno/Klíč : protein (B) Poloha : 1..454 (xi) Popis sekvence : SEQ ID No 2:
Met 1 Ile Arg Lys Thr 5 Val Leu Leu Thr Ala 10 Leu Ser Cys Ala Leu 15 Ala
Ser Ala Thr Ala 20 Thr Ala Ala Glu Gly 25 Gin Arg Pro Glu Val 30 Glu Ala
Ala Ala Ala 35 Arg Leu Gin Arg Gin 40 Val Val Glu Trp Arg 45 Arg Asp Phe
His Gin 50 His Pro Glu Leu Ser 55 Asn Arg Glu Val Arg 60 Thr Ala Ala Lys
Val 65 Ala Glu Arg Leu Arg 70 Ala Met Gly Leu Gin 75 Pro Gin Thr Gly Val 80
Ala Val His Gly Val 85 Val Ala Ile Ile Lys 90 Gly Ala Leu Pro Gly 95 Pro
Lys Ile Ala Leu Arg Ala Asp Met Asp Ala Leu Pro Val Thr Glu Gin
100 105 110 • · • · · * • 44 4 4 • · · · · · • 4 4 4 4 4 • · 4 4 4
4444 44 ··
4 44
4 4 4 · • 4 4 4 4 • 4 444 444 • 44 ·ί
Thr Gly Leu 115 Pro Phe Ala Ser Thr Ala Thr Ala Glu 120 Tyr 125 Arg Gly Glu
Lys Val Gly Val Met His Ala Cys Gly His Asp Ala His Thr Ala Thr
130 135 140
Leu Leu Gly Val Ala Asp Ala Leu Val Ala Met Arg Asp Thr Leu Pro
145 150 155 160
Gly Glu Val Met Leu Ile Phe Gin Pro Ala Glu Glu Gly Ala Pro Pro
165 170 175
Pro Glu Gin Gly Gly Ala Glu Leu Met Leu Lys Glu Gly Leu Phe Lys
180 185 190
Glu Phe Lys Pro Glu Ala Val Phe Gly Leu His Val Phe Ser Ser Val
195 200 205
Gin Ala Gly Gin Ile Ala Val Arg Gly Gly Pro Leu Met Ala Ala Ser
210 215 220
Asp Arg Phe Ala Ile Thr Val Asn Gly Arg Gin Thr His Gly Ser Ala
225 230 235 240
Pro Trp Asn Gly Ile Asp Pro Ile Val Ala Ala Ser Asp Leu Ile Gly
245 250 255
Thr Ala Gin Thr Ile Val Ser Arg Arg Ala Asn Leu Ser Lys Gin Pro
260 265 270
Ala Val Leu Thr Phe Gly Ala Ile Lys Gly Gly Ile Arg Tyr Asn Ile
275 280 285
Ile Pro Asp Ser Val Glu Met Val Gly Thr Ile Arg Thr Phe Asp Pro
290 295 300
Asp Met Arg Lys Gin Ile Phe Ala Asp Leu Arg Asn Val Ala Glu His
305 310 315 320
Thr Ala Ala Ala Trp Arg His Arg His His Arg His Leu Arg Glu Gly
325 330 335
Arg Gin Pro Gly His Gly Gin Arg Pro Gly Ala Asp Arg Ala His Ala
340 345 350
• · « · • · · · • *
Ala Gin Pro Ala Gly Arg Gly Arg 355 360
Ala Ala Asp Gly Leu Gly Gly Leu 370 375
Gly Asp Val Leu Leu Arg Arg Leu 385 390
His Arg Ala Gin Gin Pro Leu Ala 405
Ala Gly Arg Gly Pro Ala Arg Ala 420
Ala Arg Trp Gin Gly Gly Val Thr 435 440
Gin Gly Gin Arg Leu Arg Ala Ala 365
Leu Ala Val Cys Ala Ala Gly Ala 380
His Arg Arg Gly His Arg Pro Gly 395 400
Glu Val Pro Ala Arg Arg Glu Gly 410 415
Ala Ala Gly Val Ala Gly Leu Ser 425 43°
Pro Ala Ser Ile Val Pro Pro Ile 445
Arg Lys 450
Lys Asp Leu Pro (2) Informace k SEQ
ID No 3 :
(i) Sekvenční charakteristika :
(A) Délka : 1273 základních bází (B) Druh : nukleová kyselina (C) Struktura : jednořetězová (D) Topologie : lineární (ii) Druh molekul : DNS (genomická) (ix) Znak :
(A) Jméno/Klíč : exon (B) Poloha : 1..1273 « · * ·
9 9 9 9
999« · 9
9 9 9 9 9 *·♦· «9 99 · 9 9
9 9 9
9 9 9
999 999 ·
9 9 9 (xi) Popis sekvence : SEQ ID No 3
ATGGCCTTGC TGCAGGAGCT GCTGGACAGC GCACCCGAGA TCACCGCGCT GCGCCGCGAC
ATACATGCCC ATCCCGAACT GTGCTTCGAG GAACTGCGCA CCGCCGACCT GGTGGCCCGG 120
CAGCTCGAAG GCTGGGGCAT TGCCGTGCAC CGCGGCCTGG GCCGCACGGG CGTGGTGGGC 180
ACCATCCACG GCCGTGACGG CGGCGCCAGC GGCCGGGCCA TCGGGCTGCG CGCCGACATG 240
GACGCCCTGC CCATGCAGGA GTTCAACACC TTCGAGCACG CCAGCCGCCA CGCCGGAAAA 300
ATGCATGCCT GCGGACATGA CGGCCATGTC GCCATGCTGC TGGCCGCCGC GCAGTACCTG 360
GCCGTGCACC GCGACAGCTT CGAGGGCACG GTGCACCTGA TCTTCCAGCC GGCCGAAGAG 420
GGCGGCGGCG GGGCGCGCGA GATGGTCGAG GACGGCCTGT TCACCCAGTT CCCCATGCAG 480
GCCGTGTTCG GCATGCACAA CTGGCCGGGC ATGAAGGCCG GCACCATGCC GTGGGCCCCG 540
GGCCCGGCCA TGGCGTCGAG CAACGAGTTC CGCATCGTCG TGCGCGGCAA GGGCGGCCAC 600
GCGGCCATGC CGCACATGGT GATCGACCCG CTGCCCGTGG CGGCCCAGCT CATCCTGGGC 660
CTGCAGACCA TCGTCAGCCG CAACGTCAAG CCCATCGAGG CGGGCGTGGT CTCGGTCACC 720
ATGGTCCATG CGGGCGAGGC CACGAACGTG GTGCCCGACA GCGTGGAGCT GCAGGGCACG 780
GTGCGCACCT TCACGCTGGA GGTGCTGGAC CTGATCGAGC GGCGCATGAA GGCCCTGGCC 840
GAGAGCATCT GCGCGGCGCA TGACACGCGC TGCGAGTTCG AGTTCGTGCG CAACTACCCG 900
CCCACCATCA ACTCCGCCCC GGAGGCCGAG TTCGCACGCC GCGTCATGGC CGAGGTCGTG 960
GGCGAGGCCA ACGTGCTGCC CCAGGAGCCG TCCATGGGCG CCGAGGACTT CGCCTTCATG 1020
CTGCTGGAAA AGCCCGGCGC CTACTGCTTC ATCGCCAATG GCGACGGCGA CCACCGCGCC 1080
ATCGGCCACG GCGGCGGTCC CTGCACGCTG CACAACCCCA GCTACGACTT CAACGACCAG 1140
CTGATTCCGC AGGGCGCCAC GTTCTGGGTG AAGCTGGCCC AGCGCTGGCT GAGCGAGCCC 1200
ACGCGCTGAG GCCTTGCGGG GTCCGGCCGA CACCGGCATG TCACACACCG CACCTAGCAT 1260
GCGGTCCCTG TGA
1273 • · · ·
Φ · • φ φ φ · · φ φφφ φ φ • φ
(2) Informace k SEQ ID No 4 :
(i) Sekvenční charakteristika :
(A) Délka : 402 aminokyselin
(B) Druh : aminokyselina
(C) Struktura : jednořetězová
(D) Topologie : lineární
(ii) Druh molekul : protein
(i x) Znak :
(A) Jméno/Klíč : protein
(B) Poloha : 1 . .402
(xi) Popis sekvence : SEQ ID No 4 :
Met Ala Leu Leu Gin Glu Leu Leu Asp Ser Ala Pro Glu Ile Thr Ala
1 5 10 15
Leu Arg Arg Asp Ile His Ala His Pro Glu Leu Cys Phe Glu Glu Leu
20 25 30
Arg Thr Ala Asp Leu Val Ala Arg Gin Leu Glu Gly Trp Gly Ile Ala
35 40 45
Val His Arg Gly Leu Gly Arg Thr Gly Val Val Gly Thr Ile His Gly
50 55 60
Arg Asp Gly Gly Ala Ser Gly Arg Ala Ile Gly Leu Arg Ala Asp Met
65 70 75 80
Asp Ala Leu Pro Met Gin Glu Phe Asn Thr Phe Glu His Ala Ser Arg
85 90 95
His Ala Gly Lys Met His Ala Cys Gly His Asp Gly His Val Ala Met
100 105 110
Asn Gly Asp 355 Gly Asp His Arg Ala 360 Ile Gly His Gly Gly 365 Gly Pro Cys
Thr Leu His Asn Pro Ser Tyr Asp Phe Asn Asp Gin Leu Ile Pro Gin
370 375 380
Gly Ala Thr Phe Trp Val Lys Leu Ala Gin Arg Trp Leu Ser Glu Pro
Thr Arg
Vysvětlení obrázků na výkresech
Obrázek 1 Restrikční mapa fragmentu 2,5 kb Sall/BamHI, který zprostředkuje N-acetyl-PPT specifickou deacetylázovou aktivitu. Pozice a orientace strukturního genu deacl je označena šipkou (BP = bázické páry)
Obrázek 2
Obrázek 2
Mapa plasmidu pPVCKDEACl ke konstitutivní expresi genu deac v rostlinách
Mapa plasmidu pPCVTDEACl k tapetum-specifické expresi genu deac v rostlinách
Obrázek 2
Mapa plasmidu pGK83
Obrázek 2 Mapa plasmidu pMF9

Claims (7)

1. Molekula DNA kódující protein s biologickou aktivitou N-acetyl-fosfinothricin-deacetylázy.
2. Molekula DNA kódující protein s biologickou aktivitou N-acetyl-fosfinothricin-deacetylázy vybraná ze skupiny sestávající z
a) molekul DNA, které kódují pro protein se sekvencí aminokyselin uvedenou pod SEQ ID No 2 a jeho fragmenty a/nebo deriváty;
b) molekul DNA, které kódují pro sekvenci nukleotidů uvedenou pod SEQ ID No 1 nebo sekvence, které se od této sekvence odvozují v rámci degenerace genetického kódu;
c) molekul DNA, které kódují pro protein se sekvencí aminokyselin uvedenou pod SEQ ID No 4 nebo jeho fragmenty a/nebo deriváty a
d) molekul DNA, které kódují pro sekvenci nukleotidů uvedenou pod SEQ ID No 3 nebo sekvence, které se od této sekvence odvozují v rámci degenerace genetického kódu.
3. Způsob izolace mikroorganismů s vysokou N-acetyl-fosfinothricin-deacetylázovou aktivitou.
4.
Stenotrophomonas sp. (DSM 9734) a Comamonas • · • · · · · · acidovorans (DSM 11070).
5. Rostlinné buňky nebo rostliny, keré obsahují molekulu DNA podle nároku 1.
6. Způsob výroby rostlin s řízené degradovatelnými částmi specifickou expresí deacetylázového genu.
7. Způsob výroby samčích nebo samičích sterilních rostlin specifickou expresí deacetylázového genu.
CZ992166A 1996-12-16 1997-12-03 Geny kodující pro deacetylázy aminokyselin se specifikací pro N-acetyl-L-fosfinothricin, způsob jejich izolace a jejich použití CZ216699A3 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19652284A DE19652284A1 (de) 1996-12-16 1996-12-16 Neue Gene codierend für Aminosäure-Deacetylasen mit Spezifität für N-Acetyl-L-Phosphinothricin, ihre Isolierung und Verwendung

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ216699A3 true CZ216699A3 (cs) 1999-10-13

Family

ID=7814866

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ992166A CZ216699A3 (cs) 1996-12-16 1997-12-03 Geny kodující pro deacetylázy aminokyselin se specifikací pro N-acetyl-L-fosfinothricin, způsob jejich izolace a jejich použití

Country Status (18)

Country Link
US (1) US6177616B1 (cs)
EP (1) EP0942965B1 (cs)
JP (1) JP2001506130A (cs)
CN (1) CN1171993C (cs)
AT (1) ATE377072T1 (cs)
AU (1) AU727831B2 (cs)
BR (1) BR9714513A (cs)
CA (1) CA2275134A1 (cs)
CZ (1) CZ216699A3 (cs)
DE (2) DE19652284A1 (cs)
ES (1) ES2296318T3 (cs)
HU (1) HUP0000396A3 (cs)
NZ (1) NZ335852A (cs)
PL (2) PL193489B1 (cs)
RU (1) RU2205219C2 (cs)
TR (1) TR199901332T2 (cs)
WO (1) WO1998027201A2 (cs)
ZA (1) ZA9711146B (cs)

Families Citing this family (120)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19933362A1 (de) * 1999-07-20 2001-02-08 Aventis Cropscience Gmbh Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren aus ihren racemischen N-Acetyl-D,L-Derivaten durch enzymatische Racemat-Spaltung mittels isolierter, rekombinanter Enzyme
US6384304B1 (en) * 1999-10-15 2002-05-07 Plant Genetic Systems N.V. Conditional sterility in wheat
WO2002072804A2 (en) * 2001-03-12 2002-09-19 Bayer Bioscience N.V. Novel genes for conditional cell ablation
EP1258531A1 (en) * 2001-05-14 2002-11-20 Givaudan SA Compounds and methods for inhibiting axillary malodour
AU2002315526A1 (en) 2001-07-06 2003-01-21 Monsanto Technology Llc Methods for enhancing segregation of transgenes in plants and compositions thereof
US7132590B2 (en) * 2001-12-18 2006-11-07 The Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona Methods of making male-sterile plants by underexpressing allene oxide synthase
EP2535414B1 (en) 2003-04-29 2017-12-13 Pioneer Hi-Bred International Inc. Novel glyphosate-n-acetyltransferase (gat) genes
WO2005001101A1 (en) 2003-06-03 2005-01-06 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Conditional sterility in plants
CA2733145C (en) * 2003-07-02 2012-06-19 Corus Pharma, Inc. Aztreonam l-lysine and method of determining impurities therein
WO2005070088A2 (en) 2004-01-15 2005-08-04 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Chimeric sequences for tissue-specific gene expression in plants
NZ571115A (en) * 2006-03-02 2011-11-25 Athenix Corp Method and compositions for improved enzyme activity in transgenic plant
US7951995B2 (en) 2006-06-28 2011-05-31 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Soybean event 3560.4.3.5 and compositions and methods for the identification and detection thereof
US8097712B2 (en) 2007-11-07 2012-01-17 Beelogics Inc. Compositions for conferring tolerance to viral disease in social insects, and the use thereof
US8748695B2 (en) * 2008-07-23 2014-06-10 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Molecular markers linked to PPO inhibitor tolerance in soybeans
US8697941B2 (en) 2008-07-23 2014-04-15 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Molecular markers linked to PPO inhibitor tolerance in soybeans
PL2342331T3 (pl) 2008-09-26 2016-05-31 Basf Agrochemical Products Bv Mutanty ahas odporne na herbicydy i sposoby ich zastosowania
CA2765034A1 (en) 2009-06-09 2010-12-23 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Early endosperm promoter and methods of use
US8962584B2 (en) 2009-10-14 2015-02-24 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem, Ltd. Compositions for controlling Varroa mites in bees
EP2494056A1 (en) 2009-10-26 2012-09-05 Pioneer Hi-Bred International Inc. Somatic ovule specific promoter and methods of use
EP2529027A1 (en) 2010-01-26 2012-12-05 Pioneer-Hi-Bred International, Inc. Hppd-inhibitor herbicide tolerance
EP3231872B1 (en) 2010-03-08 2020-05-06 Monsanto Technology LLC Polynucleotide molecules for gene regulation in plants
CN103237894A (zh) 2010-08-13 2013-08-07 先锋国际良种公司 包含具有羟基苯丙酮酸双加氧酶(hppd)活性的序列的组合物和方法
CN103748227A (zh) 2010-11-24 2014-04-23 先锋国际良种公司 芸苔gat事件dp-073496-4及其鉴定和/或检测组合物和方法
WO2012071039A1 (en) 2010-11-24 2012-05-31 Pioner Hi-Bred International, Inc. Brassica gat event dp-061061-7 and compositions and methods for the identification and/or detection thereof
TWI667347B (zh) 2010-12-15 2019-08-01 瑞士商先正達合夥公司 大豆品種ｓｙｈｔ０ｈ２及偵測其之組合物及方法
AU2012308660B2 (en) 2011-09-13 2017-05-25 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
US10760086B2 (en) 2011-09-13 2020-09-01 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
US10806146B2 (en) 2011-09-13 2020-10-20 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
EP2756085B1 (en) 2011-09-13 2019-03-20 Monsanto Technology LLC Methods and compositions for weed control
CN104160028A (zh) 2011-09-13 2014-11-19 孟山都技术公司 用于杂草控制的方法和组合物
UA116093C2 (uk) 2011-09-13 2018-02-12 Монсанто Текнолоджи Ллс Спосіб та композиція для боротьби з бур'янами (варіанти)
AU2012308753B2 (en) 2011-09-13 2018-05-17 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
EP2756084B1 (en) 2011-09-13 2020-06-03 Monsanto Technology LLC Methods and compositions for weed control
CA2848685A1 (en) 2011-09-13 2013-03-21 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control comprising topical application of a glutamine synthetase polynucleotide
MX350771B (es) 2011-09-13 2017-09-15 Monsanto Technology Llc Métodos y composiciones para el control de malezas.
US9840715B1 (en) 2011-09-13 2017-12-12 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for delaying senescence and improving disease tolerance and yield in plants
US10829828B2 (en) 2011-09-13 2020-11-10 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
US9920326B1 (en) 2011-09-14 2018-03-20 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for increasing invertase activity in plants
US9204603B2 (en) 2011-12-21 2015-12-08 The Curators Of The University Of Missouri Soybean variety S05-11482
US20130167262A1 (en) 2011-12-21 2013-06-27 The Curators Of The University Of Missouri Soybean variety s05-11268
BR112014016791A2 (pt) 2012-01-06 2019-09-24 Pioneer Hi Bred Int molécula de ácido nucléico isolada, cassete de expressão, vetor, célula vegetal, planta, semente transgénica, método para expressão de um polinucleotídeo em uma planta ou célula vegetal, método para expressão de um polinucleotídeo, preferencialmente em tecidos de óvulo de uma planta
US9006515B2 (en) 2012-01-06 2015-04-14 Pioneer Hi Bred International Inc Pollen preferred promoters and methods of use
WO2013109754A1 (en) 2012-01-17 2013-07-25 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Plant transcription factors, promoters and uses thereof
CN104703998B (zh) 2012-03-13 2020-08-21 先锋国际良种公司 植物中雄性育性的遗传减少
WO2013138309A1 (en) 2012-03-13 2013-09-19 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Genetic reduction of male fertility in plants
CN104619843B (zh) 2012-05-24 2020-03-06 A.B.种子有限公司 用于使基因表达沉默的组合物和方法
CA2876426A1 (en) 2012-06-15 2013-12-19 E. I. Du Pont De Nemours And Company Methods and compositions involving als variants with native substrate preference
AU2012208997B1 (en) 2012-07-30 2013-09-19 Dlf Usa Inc. An alfalfa variety named magnum salt
WO2014059155A1 (en) 2012-10-11 2014-04-17 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Guard cell promoters and uses thereof
AR093058A1 (es) 2012-10-18 2015-05-13 Monsanto Technology Llc Metodos y composiciones para el control de pestes en plantas
US20140173781A1 (en) 2012-12-13 2014-06-19 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods and compositions for producing and selecting transgenic wheat plants
WO2014100525A2 (en) 2012-12-21 2014-06-26 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions and methods for auxin-analog conjugation
AU2013371825B2 (en) 2013-01-01 2019-10-24 A.B. Seeds Ltd. Methods of introducing dsRNA to plant seeds for modulating gene expression
US10683505B2 (en) 2013-01-01 2020-06-16 Monsanto Technology Llc Methods of introducing dsRNA to plant seeds for modulating gene expression
US10000767B2 (en) 2013-01-28 2018-06-19 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for plant pest control
AU2014248958A1 (en) 2013-03-13 2015-10-01 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
UY35379A (es) 2013-03-13 2014-09-30 Monsanto Technology Llc ?métodos y composiciones para el control de malezas?.
AU2014241045B2 (en) 2013-03-13 2017-08-31 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Glyphosate application for weed control in brassica
BR112015023286A2 (pt) 2013-03-14 2018-03-06 Arzeda Corp polipeptídeo recombinante com atividade da dicamba descarboxilase, construto de polinucleotídeo, célula, método de produção de uma célula hospedeira compreendendo um polinucleotídeo heterólogo que codifica um polipeptídeo tendo atividade da dicamba descarboxilase, método para descarboxilar dicamba, um derivado de dicamba ou um metabolito de dicamba, método para a detecção de um polipeptideo e método para a detecção da presença de um polinucleotideo que codifica um polipeptideo tendo atividade da dicamba descarboxilase
CN105339380A (zh) 2013-03-14 2016-02-17 先锋国际良种公司 用以防治昆虫害虫的组合物和方法
US20140304857A1 (en) 2013-03-14 2014-10-09 Pioneer Hi Bred International Inc Maize stress related transcription factor 18 and uses thereof
CA2905595A1 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions having dicamba decarboxylase activity and methods of use
US20140283211A1 (en) 2013-03-14 2014-09-18 Monsanto Technology Llc Methods and Compositions for Plant Pest Control
US10568328B2 (en) 2013-03-15 2020-02-25 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
US10023877B2 (en) 2013-03-15 2018-07-17 Pioneer Hi-Bred International, Inc. PHI-4 polypeptides and methods for their use
BR112015023700A2 (pt) 2013-03-15 2017-07-18 Pioneer Hi Bred Int método de aprimoramento da tolerância ao estresse abiótico em uma planta de cultura agrícola , planta de milho transgênica, célula vegetal, semente, método de regulação negativa de um gene de acc oxidase endógeno em uma planta de milho.
EP2781151A1 (en) 2013-03-18 2014-09-24 Bayer CropScience AG Methods of separating hybrid seed from a mixture of seeds
EP3030663B1 (en) 2013-07-19 2019-09-04 Monsanto Technology LLC Compositions and methods for controlling leptinotarsa
US9850496B2 (en) 2013-07-19 2017-12-26 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for controlling Leptinotarsa
CA2918909A1 (en) 2013-07-25 2015-01-29 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Method for producing hybrid brassica seed
EA030896B1 (ru) 2013-08-16 2018-10-31 Пайонир Хай-Бред Интернэшнл, Инк. Инсектицидные белки и способы их применения
BR122021005579B1 (pt) 2013-09-13 2022-11-29 Pioneer Hi-Bred International, Inc Construto de dna, método de obtenção de planta transgênica, proteína de fusão, método para controlar uma população de praga de inseto, método para inibir o crescimento ou matar uma praga de inseto
CA2927180A1 (en) 2013-10-18 2015-04-23 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Glyphosate-n-acetyltransferase (glyat) sequences and methods of use
WO2015061548A1 (en) 2013-10-25 2015-04-30 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Stem canker tolerant soybeans and methods of use
NZ719544A (en) 2013-11-04 2022-09-30 Beeologics Inc Compositions and methods for controlling arthropod parasite and pest infestations
UA119253C2 (uk) 2013-12-10 2019-05-27 Біолоджикс, Інк. Спосіб боротьби із вірусом у кліща varroa та у бджіл
US10334848B2 (en) 2014-01-15 2019-07-02 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control using EPSPS polynucleotides
BR112016018103B1 (pt) 2014-02-07 2024-01-16 E.I. Du Pont De Nemours And Company Polipeptídeo e seu uso, polinucleotídeo, composição, proteína de fusão, método para controlar uma população, método para inibir o crescimento, método para controlar a infestação, método para obtenção de uma planta ou célula vegetal, construto
CA2939156A1 (en) 2014-02-07 2015-08-13 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins and methods for their use
BR112016022711A2 (pt) 2014-04-01 2017-10-31 Monsanto Technology Llc composições e métodos para controle de pragas de inseto
AU2015280252A1 (en) 2014-06-23 2017-01-12 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for regulating gene expression via RNA interference
US11807857B2 (en) 2014-06-25 2023-11-07 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for delivering nucleic acids to plant cells and regulating gene expression
US9686931B2 (en) 2014-07-07 2017-06-27 Alforex Seeds LLC Hybrid alfalfa variety named HybriForce-3400
RU2021123470A (ru) 2014-07-29 2021-09-06 Монсанто Текнолоджи Ллс Композиции и способы борьбы с насекомыми-вредителями
US20170218384A1 (en) 2014-08-08 2017-08-03 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Ubiquitin promoters and introns and methods of use
US20170247719A1 (en) 2014-09-17 2017-08-31 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions and methods to control insect pests
AU2015323919B2 (en) 2014-09-29 2019-01-31 Dlf Usa Inc. Low lignin non-transgenic alfalfa varieties and methods for producing the same
BR112017007932A2 (pt) 2014-10-16 2018-01-23 Du Pont proteínas inseticidas e métodos para uso das mesmas
WO2016099916A1 (en) 2014-12-19 2016-06-23 E. I. Du Pont De Nemours And Company Polylactic acid compositions with accelerated degradation rate and increased heat stability
EP3256589B1 (en) 2015-01-22 2021-12-22 Monsanto Technology LLC Compositions and methods for controlling leptinotarsa
CN116333064A (zh) 2015-05-19 2023-06-27 先锋国际良种公司 杀昆虫蛋白及其使用方法
CN107750125A (zh) 2015-06-02 2018-03-02 孟山都技术有限公司 用于将多核苷酸递送至植物中的组合物和方法
WO2016196782A1 (en) 2015-06-03 2016-12-08 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for introducing nucleic acids into plants
CA2986265A1 (en) 2015-06-16 2016-12-22 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions and methods to control insect pests
WO2017023486A1 (en) 2015-08-06 2017-02-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Plant derived insecticidal proteins and methods for their use
US11104911B2 (en) 2015-12-22 2021-08-31 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Embryo-preferred Zea mays promoters and methods of use
BR112018016057A2 (pt) 2016-02-05 2019-01-29 Pioneer Hi Bred Int métodos para selecionar uma planta de soja ou um germoplasma de soja com resistência aprimorada a infecção por podridão parda da haste e kit
EP3451837B1 (en) 2016-05-04 2021-08-25 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins and methods for their use
CA3022858A1 (en) 2016-06-16 2017-12-21 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions and methods to control insect pests
BR112018076816A2 (pt) 2016-06-24 2019-09-03 Pioneer Hi Bred Int elemento regulador híbrido, promotor híbrido, construto de dna, cassete de expressão, célula hospedeira, planta transgênica, método para criar um elemento regulador híbrido e método para expressão direcionada de uma sequência de polinucleotídeos em uma planta ou célula vegetal
EP3954202A1 (en) 2016-07-01 2022-02-16 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins from plants and methods for their use
WO2018013333A1 (en) 2016-07-12 2018-01-18 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions and methods to control insect pests
EP3535285B1 (en) 2016-11-01 2022-04-06 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins and methods for their use
CA2968938A1 (en) 2017-05-31 2018-11-30 Bayer Cropscience Lp Canola hybrid variety 5cn0130
CA2968905A1 (en) 2017-05-31 2018-11-30 Bayer Cropscience Lp Canola hybrid variety 5cn0125
WO2019060383A1 (en) 2017-09-25 2019-03-28 Pioneer Hi-Bred, International, Inc. PROMOTERS HAVING PREFERENCE FOR FABRICS AND METHODS OF USE
CN109988806B (zh) * 2017-12-29 2023-02-28 弈柯莱生物科技(上海)股份有限公司 一种n-乙酰-草铵膦盐的消旋方法
CN115850420A (zh) 2018-03-14 2023-03-28 先锋国际良种公司 来自植物的杀昆虫蛋白及其使用方法
CN111867377B (zh) 2018-03-14 2023-05-23 先锋国际良种公司 来自植物的杀昆虫蛋白及其使用方法
CA3004115A1 (en) 2018-05-07 2019-11-07 Bayer Cropscience Lp Canola hybrid variety 6cn0122
WO2019226508A1 (en) 2018-05-22 2019-11-28 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Plant regulatory elements and methods of use thereof
WO2020005933A1 (en) 2018-06-28 2020-01-02 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods for selecting transformed plants
JP2022512817A (ja) 2018-10-31 2022-02-07 パイオニア ハイ－ブレッド インターナショナル， インコーポレイテッド オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）媒介植物形質転換のための組成物及び方法
CA3040289A1 (en) 2019-04-12 2020-10-12 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Canola hybrid variety 7cn0298
CA3047768A1 (en) 2019-06-21 2020-12-21 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Canola hybrid variety 7cn0425
US11672218B2 (en) 2020-04-24 2023-06-13 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Canola hybrid variety 7CN0065
US11997965B2 (en) 2020-04-24 2024-06-04 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Canola hybrid variety 8CN0001
US11997966B2 (en) 2020-04-24 2024-06-04 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Canola hybrid variety 7CN0020
WO2022015619A2 (en) 2020-07-14 2022-01-20 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins and methods for their use
CN112940963B (zh) * 2021-01-22 2022-06-14 上海交通大学 脱乙酰酶DacApva、编码基因及其在脱乙酰反应中的应用

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE531716C (de) 1930-06-08 1931-08-18 Mergenthaler Setzmaschfab Gmbh Einrichtung zum Ausrichten der Giessform gegenueber dem Giessformtraeger von Matrizensetz- und Zeilengiessmaschinen
DK158316C (da) * 1974-01-23 1990-10-08 Toyo Jozo Kk Fremgangsmaade til fremstilling af 3-substituerede 7-amino-3-cephem-4-carboxylsyrederivater
DE4126414A1 (de) * 1991-08-09 1993-02-11 Hoechst Ag Deacetylasegene zur erzeugung von phosphinothricin oder phosphinothricyl-alanyl-alanin, verfahren zu ihrer isolierung und ihre verwendung
DE4308061A1 (de) * 1993-03-13 1994-09-15 Hoechst Ag Neue Aminosäure-Deacetylase mit Spezifität für L-N-Acetyl-Phosphinothricin, ihre Herstellung und Verwendung
DE19639463A1 (de) * 1996-09-26 1998-04-02 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Verfahren zur Herstellung weiblich steriler Pflanzen

Also Published As

Publication number Publication date
WO1998027201A3 (de) 1999-03-04
EP0942965B1 (de) 2007-10-31
ATE377072T1 (de) 2007-11-15
AU727831B2 (en) 2001-01-04
JP2001506130A (ja) 2001-05-15
HUP0000396A3 (en) 2002-02-28
DE19652284A1 (de) 1998-06-18
ES2296318T3 (es) 2008-04-16
RU2205219C2 (ru) 2003-05-27
PL193489B1 (pl) 2007-02-28
HUP0000396A2 (hu) 2000-06-28
EP0942965A2 (de) 1999-09-22
US6177616B1 (en) 2001-01-23
CA2275134A1 (en) 1998-06-25
WO1998027201A2 (de) 1998-06-25
NZ335852A (en) 2001-06-29
CN1171993C (zh) 2004-10-20
TR199901332T2 (xx) 1999-09-21
AU5753598A (en) 1998-07-15
DE59712890D1 (de) 2007-12-13
PL334530A1 (en) 2000-02-28
CN1240476A (zh) 2000-01-05
ZA9711146B (en) 1998-06-17
BR9714513A (pt) 2000-03-21
PL193522B1 (pl) 2007-02-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ216699A3 (cs) Geny kodující pro deacetylázy aminokyselin se specifikací pro N-acetyl-L-fosfinothricin, způsob jejich izolace a jejich použití
Carreno-Lopez et al. Physiological evidence for differently regulated tryptophan-dependent pathways for indole-3-acetic acid synthesis in Azospirillum brasilense
Mayfield et al. Stable nuclear transformation of Chlamydomonas reinhardtii by using a C. reinhardtii gene as the selectable marker.
De Bruijn et al. Rhizobium meliloti 1021 has three differentially regulated loci involved in glutamine biosynthesis, none of which is essential for symbiotic nitrogen fixation
Engelke et al. Biochemical and genetical analysis of Rhizobium meliloti mutants defective in C4-dicarboxylate transport
US5177010A (en) Process for transforming corn and the products thereof
US4940840A (en) Novel chitinase-producing bacteria and plants
US5767371A (en) Deacetylase genes for the production of phosphinothricin or phosphin-othricyl-alanyl-alanine, process for their isolation, and their use
JPH03501086A (ja) パラチオンヒドロラーゼ類縁体並びにその製造方法及び精製方法
CN110592137B (zh) 拟南芥at5g10290基因及其突变体在提高植物耐旱性的应用
US5668294A (en) Metal resistance sequences and transgenic plants
US6852909B2 (en) Process for producing female-sterile plants
JP2009536819A (ja) 除草剤を分解するための酵素
CN101668859A (zh) 具有增强的产量相关性状的植物及其制备方法
US6555733B2 (en) Genes coding for amino acid deacetylases with specificity for N-acetyl-L-phosphinothricin, their isolation and use
US5474929A (en) Selectable/reporter gene for use during genetic engineering of plants and plant cells
CN111560055B (zh) 水稻基因OsLAT3在调节敌草快的吸收累积中的应用
Rossbach et al. Cloning and analysis of Agrobacterium tumefaciens C58 loci involved in glutamine biosynthesis: neither the glnA (GSI) nor the glnII (GSII) gene plays a special role in virulence
JP4534034B2 (ja) 植物へ遺伝子を導入する効率が向上したアグロバクテリウム菌およびその作製方法
WO2024218767A1 (en) Plants comprising bromoform production genes
JP2000500002A (ja) 新規なｄｎａ配列及び植物における防御誘導因子を同定するためのこれらの使用
Holsters et al. Present plant biotechnology
MXPA00012786A (en) Water stress or salt stress tolerant transgenic cereal plants

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic