ES2296318T3

ES2296318T3 - Nuevo gen que codifica una desacetilasa de aminoacido con especificidad para la n-acetil-l-fosfinotricina, su aislamiento y su utilizacion.

Info

Publication number: ES2296318T3
Application number: ES97953733T
Authority: ES
Inventors: Klaus Bartsch; Guido Kriete; Inge Broer; Alfred Puhler
Original assignee: Bayer CropScience AG
Current assignee: Bayer CropScience AG
Priority date: 1996-12-16
Filing date: 1997-12-03
Publication date: 2008-04-16
Anticipated expiration: 2017-12-03
Also published as: PL193489B1; CA2275134A1; EP0942965A2; CZ216699A3; CN1240476A; US6177616B1; AU727831B2; PL193522B1; PL334530A1; BR9714513A; CN1171993C; AU5753598A; EP0942965B1; DE59712890D1; ATE377072T1; HUP0000396A2; WO1998027201A2; RU2205219C2; WO1998027201A3; JP2001506130A

Abstract

LA INVENCION TRATA DE MOLECULAS DE DNA QUE CODIFICAN LAS DESACETILASAS O PROTEINAS CON LA ACTIVIDAD BIOLOGICA DE LA DESACETILASA, ASI COMO CELULAS VEGETALES TRANSGENICAS, QUE ESTAN TRANSFORMADAS CON LAS MOLECULAS DE DNA DE LA INVENCION. ESTAS MOLECULAS SE PUEDEN UTILIZAR PARA LA PREPARACION DE PLANTAS CON PARTES QUE SE PUEDEN DESTRUIR DE MANERA DELIBERADA, ES DECIR PLANTAS MASCULINAS O FEMENINAS ESTERILES, MEDIANTE LA EXPRESION ESPECIFICA DE UN GEN DE LA DESACETILASA.

Description

Nuevo gen que codifica una desacetilasa de aminoácido con especificidad para la N-acetil-L-fosfinotricina, su aislamiento y su utilización.

El concepto de una esterilidad masculina reversible, inducible químicamente, en el caso de plantas, mediante una expresión, específica para las anteras, de una desacetilasa específica para la N-acetil-fosfinotricina (N-acetil-PPT) se describe en el documento de solicitud de patente europea EP 531.716. Los genes de desacetilasas, utilizados en este caso, el procedente de Streptomyces viridochromogenes [de desacetilasa de N-acetil-L-fosfinotricil-alanilalanina (N-acetil-PTT), dea] y respectivamente el argE procedente de Escherichia coli (de desacetilasa de N-acetil-L-ornitina) codifican proteínas con una especificidad para la N-acetil-L-PPT. Para ambos genes, en el caso de una expresión específica para el tapetum en plantas, se pudo mostrar la aparición de flores estériles masculinamente después de un tratamiento de capullos individuales con la N-acetil-L-PPT. Para una aplicación con éxito de este sistema, en particular en el caso del tratamiento de plantas enteras con N-acetil-PPT en condiciones relevantes para la práctica, es ventajoso poder emplear desacetilasas con una alta afinidad para los substratos. Por lo tanto, se buscaron otras desacetilasas adicionales con una alta afinidad para la N-acetil-PPT.

La solicitud aquí descrita se basa, por consiguiente, en la misión de poner a disposición moléculas de ADN, que codifiquen desacetilasas. Con estas desacetilasas es posible producir plantas con partes de plantas que se pueden destruir deliberadamente. Es de interés especial la producción de plantas estériles masculina o femeninamente. El problema planteado por esta misión se resuelve mediante la puesta a disposición de las formas de realización reseñadas en las reivindicaciones de esta patente.

El invento se refiere a moléculas de ADN, que codifican desacetilasas o proteínas con la actividad biológica de una desacetilasa. Las propiedades enzimáticas de estas proteínas se describen en los Ejemplos.

El invento se refiere además a células de plantas transgénicas, que habían sido transformadas con las moléculas de ADN conformes al invento. Las células de plantas transgénicas se pueden producir de acuerdo con técnicas conocidas y se pueden regenerar para dar plantas enteras.

El invento se refiere a moléculas de ADN que codifican una proteína con la actividad biológica de una desacetilasa de N-acetil-PPT.

El invento se refiere en particular a moléculas de ADN, que codifican una proteína con la actividad biológica de una desacetilasa de N-acetil-PPT, seleccionada entre el conjunto que se compone de

a): moléculas de ADN, que codifican una proteína con la secuencia de aminoácidos, que se indica dentro de la SEQ ID No 2, y fragmentos y/o derivados de ella;

b): moléculas de ADN, que codifican una secuencia de nucleótidos, que se indica dentro de la SEQ ID No 1.

El invento se refiere además al microorganismo Stenotrophomonas sp. identificado según el procedimiento descrito en esta solicitud y depositado (como DSM 9734).

Son objeto del invento en particular células de plantas, o plantas, que contienen las moléculas de ADN conformes al invento.

Presentan un interés especial unos procedimientos para la producción de plantas con partes que se pueden destruir deliberadamente mediante una expresión específica de un gen de desacetilasa, así como unos procedimientos para la producción de plantas estériles masculina o femeninamente mediante una expresión específica de un gen de desacetilasa.

La presente solicitud se refiere además a:

-: las moléculas de ADN, que codifican enzimas con una alta actividad de la desacetilasa de N-acetil-PPT,

-: las proteínas, que son codificadas por estos genes,

-: la expresión de estos genes de desacetilasas en plantas.

A partir de muestras de suelos se pueden enriquecer, en un medio mineral con quitina como única fuente de C, unas bacterias que están en situación de disociar a la N-acetil-PPT con una alta efectividad. De esta manera se pudieron aislar 2 cepas de bacterias como cultivos puros: Stenotrophomonas sp. (nº de depósito en la DSM como DSM 9734) y Comamonas acidovorans (nº de depósito en la DSM 11070).

El invento se refiere además por consiguiente a:

\newpage

1.: Una desacetilasa con

-: un peso molecular de 20.000 a 100.000 dalton

-: un valor óptimo del pH de 6,5 – 10,0

-: una especificidad para substratos frente a L-N-acetil-fosfinotricina.

2.: La utilización de la desacetilasa caracterizada dentro de 1. para la producción de plantas estériles masculinamente.

El invento se refiere en particular a una enzima que tiene un valor óptimo de la temperatura que está situado entre 30ºC y 50ºC.

El gen que codifica la desacetilasa se clonó en E. coli. En el caso del gen deac 1 procedente de Stenotrophomonas sp., se escrutó un banco de expresión de fagémidos de un ADN genómico en E. coli para encontrar la actividad de una desacetilasa específica para N-acetil-PPT.

La secuencia de aminoácidos que se deriva de la secuencia de ADN, posee además una homología con hidrolasas de hipurato, como son conocidas a partir de bancos de datos de proteínas.

La alta afinidad de la proteína Deac 1 para el substrato N-acetil-L-PPT (K_{m} = 670 \muM) se hace apreciable en las plantas transgénicas mediante una alta sensibilidad del tejido frente a esta sustancia. Así, en el caso de una expresión constitutiva del gen deac, se pueden obtener unas plantas, cuyas hojas reaccionan de una manera sensible todavía a unas concentraciones hasta de 0,4 mg/ml de N-acetil-D,L-PPT (= 0,2 mg/ml del enantiómero L). En el caso de una expresión específica para el tapetum se consiguió la inducción de flores estériles masculinamente mediante tratamiento de los capullos con 2 mg/ml de N-acetil-D,L-PPT (= 1 mg/ml del enantiómero L). Los resultados descritos se refieren a plantas cultivadas en un invernadero. A causa de las bajas concentraciones de las sustancias, en caso necesario, en condiciones al aire libre, es posible sin dificultades una dosificación más alta en torno a un múltiplo de
5-10 veces.

Los Ejemplos siguientes sirven para explicar más ampliamente el invento. Los datos porcentuales se refieren, cuando no se indica otra cosa distinta, al peso. Además, el invento se define en las reivindicaciones de esta pa-
tente.

Ejemplo 1

Aislamiento e identificación de microorganismos del suelo con una actividad de desacetilasa específica para N-acetil-PPT

Cada vez 1 g de un suelo (légamo arenoso, de la duna de Schwanheim) se extrajo durante 1 h a la temperatura ambiente con 10 mM de NaCl y 10 mM de un tampón de fosfato de Na, de pH = 7,0. Para la selección de diferentes grupos de microorganismos, los materiales sobrenadantes del suelo se sobreinocularon en los siguientes medios líquidos:

(1) Medio MS1 (para eubacterias):

: 5 mM de glucosa

: 5 mM de succinato

: 10 mM de glicerol

: 1 g/l NH_{4}Cl

: 50 ml/l de la Solución A

: 25 ml/l de la Solución B

Solución A:

\hskip0.5cm

50 g/l de K_{2}HPO_{4}

Solución B:

\hskip0.5cm

2,5 g/l de MgSO_{4}

: 0,5 g/l de NaCl

: 25 ml/l de oligoelementos.

\newpage

(2) Medio de quitina (para actinomicetos y estreptomicetos así como bacterias quitinovoras):

: 10 g/l de quitina de cangrejo

: 1 g/l de (NH_{4})_{2}SO_{4}

: 0,5 g/l de MgSO_{4}

: 50 ml/l de la Solución A

: 1 ml/l de oligoelementos.

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(3) Medio de antibiótico (para hongos superiores)

: 20 g/l de extracto de malta

: 10 g/l de glucosa

: 2 g/l de un extracto de levadura

: 0,5 g/l de (NH_{4})_{2}SO_{4}

: 50 \mug/ml de tetraciclina.

Todos los medios contenían 5 mM de N-acetil-PPT y después de la sobreinoculación se incubaron durante 3-5 días a 28ºC.

Los cultivos de enriquecimiento fueron a continuación ensayados para determinar la desacetilación de N-acetil-PPT. Para esto, las células se separaron por centrifugación a 10.000 rpm y los materiales sobrenadantes se investigaron en un aparato analizador de aminoácidos (Biotronic LC 5001) para determinar la formación de PPT. Solamente los cultivos de quitina y de medio se manifestaron como positivos para desacetilasas. Después de la extensión en placas sobre un agar de quitina, de estos cultivos se aislaron en total 40 colonias individuales, se volvieron a cultivar en un medio líquido con quitina y se ensayaron de nuevo para determinar la actividad de desacetilasa. En este caso se encontraron 6 materiales aislados positivos, a partir de los cuales los cultivos puros activos se pudieron obtener mediante una renovada extensión sobre placas de agar y una cultivación adicional de colonias individuales. La cepa que tenía la más alta actividad de desacetilasa fue identificada como Stenotrophomonas sp, (número de depósito en la DSM (Colección Alemana de Microorganismos, DSM 9734).

Ejemplo 2

Clonación y secuenciación del gen de desacetilasa de N-acetil-PPT procedente de Stenotrophomonas sp.

Los métodos clásicos de biología molecular, usados para los trabajos, se describen en la cita de Maniatis y colaboradores, 1982, Molecular Cloning: a laboratory manual [Clonación molecular, un manual de laboratorio], Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.

Un ADN genómico procedente de Stenotrophomonas sp. se preparó de acuerdo con el método de Meade y colaboradores, 1982, J. Bacteriol. 149:114-122. Después una digestión parcial con Sau3A se aisló la fracción de tamaños de 5-10 kb y se ligó en el vector de expresión de ZAP - lambda, cortado con BamHI, de Stratagene (ZAP Express Vector Kit, (estuche de vectores de expresión ZAP), nº de catálogo 239201, manual de instrucciones). Con la tanda de ligación envasada se produjo un banco primario de fagos lambda y a continuación se amplificó. Después de esto, con ayuda del sistema de fagémidos de pBK-CMV de Stratagene (nº de catálogo 212209, manual de instrucciones) se estableció un banco de expresión de fagémidos en Escherichia coli. Este banco de genes se ensayó mediante un escrutinio de la actividad con [^{14}C]-N-acetil-L-PPT como substrato, para determinar la presencia del gen de desacetilasa. Con esta finalidad, se sobreinocularon en placas de microtitulación 2.000 clones individuales y se cultivaron durante una noche en un medio LB a 37ºC con 0,2 mM de isopropiltiogalactósido (IPTG) como inductor y 50 \mug/l de kanamicina como marcador de resistencia. Las células se separaron por centrifugación y se incubaron durante una noche a 28ºC, cada vez en 10 \mul de [^{14}C]-N-acetil-L-PPT 1 mM.

A continuación, las tandas se analizaron en grupos de ocho mediante una cromatografía de capa fina y una autorradiografía para averiguar la reacción de N-acetil-PPT en PPT (véase el documento de patente europea EP 531.716, Ejemplo 8) y en el caso de un hallazgo positivo, se ensayaron posteriormente los clones individuales. Con este procedimiento se pudo seleccionar a partir de 1.920 transformantes un clon positivo con un inserto de 6 kb (kilobases). Este fragmento de ADN fue caracterizado más detalladamente mediante un cartografiado por restricción. Por medio una subclonación de fragmentos de restricción del inserto en pUC18/19 y por transformación de los plásmidos recombinantes en el seno de E. coli, se pudo localizar, con ayuda del ensayo de actividad arriba descrito, el gen estructural deac en un fragmento para SalI/Smal de 2,5 kb (2.487 pares de bases) (Figura 1). La actividad era dependiente de la orientación del fragmento en relación con el promotor lac del vector.

El fragmento de 2,5 kb fue secuenciado en ambas cadenas con el método de Sanger (Sanger y colaboradores, 1977, Proc. Natl. Acad. Sci USA 74:5463-5468). Todo el fragmento tenía una longitud de 2.487 nucleótidos (véase la SEQ ID NO. 1). El cuadro de lectura abierto, con una longitud de 1.494 nucleótidos, comienza con el nucleótido nº 367 y termina con el nº 1860.

Estudios de expresión con subfragmentos de la PCR (reacción en cadena de la polimerasa) a partir de esta zona en E. coli, muestran que la proteína desacetilasa activa es codificada por una zona que tiene una longitud de 1.365 nucleótidos, comenzando con el codón de iniciación ATG en la posición 496 y terminando con el codón de detención TGA en la posición 1.860. La secuencia de aminoácidos, que se deriva de la secuencia de ADN, representa un polipéptido de 454 aminoácidos (Seq ID NO 2) con un peso molecular calculado de 48,1 kDa.

Una búsqueda de homologías en los bancos de datos EMBL, de ADN y de proteínas, dio como resultado similaridades con la desacetilasa de N-acetil-PPT procedente de Comamonas acidovorans, descrita por primera vez en esta solicitud, (37,4% de aminoácidos idénticos), con la hidrolasa de hipurato procedente de Campylobacter jejuni (33,9%) y con la N-acil-L-amidohidrolasa procedente de Bacillus stearothermophilus (33,7%). En lo sucesivo, el gen aislado a partir de Stenotrophomonas es designado como deac1. La proteína correspondiente es designada como Deac 1. A causa de la homología se puede partir del hecho de que también las mencionadas hidrolasas de hipurato y amidohidrolasas, en combinación con promotores específicos para tejidos y con un subsiguiente tratamiento, se pueden usar ventajosamente para la producción de plantas con tejidos que se pueden destruir selectivamente, en particular plantas estériles masculina y/o femeninamente.

Ejemplo 3

Caracterización de la proteína Deac 1

Para la sobreexpresión y la purificación de la desacetilasa procedente de Stenotrophamonas sp. (deac1) se utilizó el sistema de vector de fusión del gen con glutatión de S-transferasa (GST) de Pharmacia (nº de catálogo 27-4581-01, nº de catálogo 27-4570-01). El método se describe en la cita de Smith y Johnson, 1988, Gene 67:31. La purificación de la proteína de fusión se efectúa mediante una cromatografía de afinidad en presencia de glutatión-Sepharose-4B.

El gen deac funcional fue transclonado como fragmento de PCR para BamHI/SalI de 1,4 kb (kilobases) en el vector de fusión con GST pGEX-4T-2 bajo el control del promotor lac. La expresión de la proteína de fusión recombinante fue inducida por medio de la adición de 0,1 mM de IPTG. Por medio de una electroforesis en SDS (dodecil-sulfato de sodio)/poli(acrilamida) de extractos brutos de los transformantes de E. coli se pudo detectar la proteína de fusión como una banda de 74 kDa.

Para la purificación de la proteína, las células procedentes de un cultivo de 2 l de un transformante en E. coli inducido, positivo para expresión, se disgregaron con ultrasonidos, y el extracto, a continuación, fue solubilizado por adición de 1% de Triton-X-100. El material sobrenadante fue fijado a glutatión-Sepharose 4B. Después de haber lavado múltiples veces con un tampón de PBS [= solución salina tamponada con fosfato] (140 mM de NaCl, 3 mM de KCl, 10 mM de Na_{2}HPO_{4}, 2 mM de KH_{2}PO_{4}, pH = 7,3), la proteína de fusión, fijada a la matriz de Sepharose, fue disociada con trombina. El material eluído contenía como única banda de proteína un producto de disociación con un tamaño de 48 kDa (después de una electroforesis con SDS/poli(acrilamida) desnaturalizadora), que se había podido identificar en el ensayo con enzimas (véase más adelante) como desacetilasa de N-acetil-PPT. Con el método descrito, a partir de 21 cultivos bacterianos se pudieron purificar hasta homogeneidad 200 \mug de la proteína de desacetilasa.

La actividad de la proteína de desacetilasa se midió con los dos siguientes ensayos:

1): Ensayo radiactivo: Cada vez 2,5 \mug de una enzima purificada se incubaron en tandas de 10 \mul en un tampón de PBS con 0,1 mM de [^{14}C]-N-acetil-L-PPT durante 15 min. a 37ºC. A continuación las muestras se diluyeron a 1:6 en 5 mM de KO_{2}PO_{4}, 10% de metanol, pH = 1,92, y se analizaron en la HPLC (cromatografía en fase líquida de alto rendimiento) con un detector de la radiactividad (columna de separación: Spherisorb SAX, agente eluyente: 5 mM de KH_{2}PO_{4}, 10% de metanol, pH = 1,92, velocidad de flujo: 0,5 ml/min). En estas condiciones, la [^{14}C]-N-acetil-L-PPT se eluye a los 4,5 min y la [^{14}C]-N-acetil-L-PPT se eluye a los 6,5 min. Las actividades de desacetilasas específicas se determinaron en [nmol (nanomoles) de [^{14}C]-N-acetil-L-PPT/min/mg de proteína]. Con el fin de determinar el valor óptimo del pH, las tandas se incubaron en un sistema tamponador en cada caso a base de 40 mM de Bis-Tris, Tris y Caps entre unos pH = de 6 y 9. Para la medición del valor de K_{m} se llevaron a cabo determinaciones en triplicado (en 3 veces) con unas concentraciones de [^{14}C]-N-acetil-L-PPT comprendidas entre 0,1 mM y 1 mM a un pH = 8,0 en presencia de 1 mM de CoCl_{2}.

2): Ensayo no radiactivo: Con el fin de investigar la especificidad para un substrato, en cada caso 5 \mug de una enzima purificada se incubaron en tandas de 20 \mul en un tampón de PBS, cada vez con 25 mM de un determinado N-acetil- o respectivamente N-acil-aminoácido durante 60 min. a 28ºC. A continuación, las muestras se midieron en cuanto a la formación de los aminoácidos libres en el aparato analizador de aminoácidos (Biotronic LC 5001). Las actividades específicas se determinaron [en nmol de aminoácidos/min/mg de proteína]. Para la desacetilasa de N-acetil-PPT se determinó un valor óptimo del pH de pH = 8 (véase la Tabla 1) y un valor óptimo de la temperatura de 37ºC (véase la Tabla 2). Las mediciones cinéticas dieron un valor de K_{m} de 670 \muM. Por adición de 1 mM de CoCl_{2} se pudo aumentar la actividad enzimática en aproximadamente un 20%.

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TABLA 1 Valor óptimo del pH de la desacetilasa de N-acetil-PPT

1

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TABLA 2 Valor óptimo de la temperatura de la desacetilasa de N-acetil-PPT

2

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100

Los resultados de las mediciones de la especificidad para substratos se representan en la Tabla 3.

La enzima posee un espectro de substratos relativamente amplio. Las más altas conversiones se consiguieron con ácido hipúrico (N-benzoil-glicina) y con N-acetil-L-glutamato. La afinidad para la N-acetil-L-PPT está situada aproximadamente un 50% por debajo de la afinidad para los dos substratos arriba mencionados. La desacetilasa posee una exclusiva especificidad para N-acetil-L-aminoácidos. Con los correspondientes enantiómeros D no se pudieron observar reacciones de ningún tipo.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 3 Especificidad para substratos de la desacetilasa de N-acetil-PPT

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Ejemplo 4

Expresión constitutiva del gen deac1 en tabaco

El gen estructural deac1 se transclonó como fragmento de PCT para BamHI/SalI de 1,4 kb en el vector binario pPCV801 (Koncz y Schell, 1986, Mol. Gen. Genet. 204; 383-396) bajo el control del promotor de 35S. El resultante plásmido pPCVKDEAC1 (Figura 2) con el vector de expresión promotor de 35S - gen estructural deac1 - terminador de 35S, se transformó en el seno de Agrobacterium tumefaciens (cepa ATHV) mediando utilización de métodos clásicos. Pequeños trozos de hojas de tabaco (Nicotiana tabacum) se transformaron con las agrobacterias recombinantes de acuerdo con el método de Horsch y colaboradores, 1985, Science 227: 1229-1231, y se seleccionaron en un medio de kanamicina, se regeneraron 18 transformantes de tabaco independientes y se ensayaron en cuanto a la expresión de la desacetilasa en las hojas. En el caso de una actividad de la proteína en las plantas transgénicas había que contar con una sensibilidad de las hojas frente a la N-acetil-PPT, puesto que la sustancia es transformada en la planta, a causa de la actividad enzimática de la desacetilasa, entonces en la sustancia activa herbicida fosfinotricina.

En un ensayo de goteo, las hojas de las plantas transgénicas así como de varias plantas testigos no transgénicas, se trataron cada vez con 5 \mul de las siguientes concentraciones de N-acetil-DL-PPT: 4 mg/ml (= 15 mM), 1 mg/ml (= 3,75 mM), 0,4 mg/ml (= 1,5 mM), 0,1 mg/ml (= 4,38 mM). Los sitios de tratamiento fueron investigados después de 1-2 semanas en cuanto a aclaraciones del color y respectivamente formación de necrosis. Al mismo tiempo, se midió la actividad de desacetilasa, específica para la N-acetil-PPT, de las transformantes, así como de las plantas testigos en extractos brutos. Para esto, cada vez 100 mg de un material de hojas se homogeneizaron en 200 \mul de un tampón de PBS, los desechos celulares se separaron por centrifugación y los materiales sobrenadantes que contenían proteínas se dializaron durante una noche a 4ºC frente al mismo tampón. En cada caso 70 \mul de estas muestras se incubaron a 37ºC durante una noche con 0,1 mM de [^{14}C]-N-acetil-L-PPT. Las tandas se analizaron a continuación en la HPLC, como arriba se ha descrito, para determinar la formación de [^{14}C]-N-acetil-L-PPT.

Los resultados de los ensayos de goteo y de los ensayos de actividad se representan en la Tabla 4 para plantas seleccionadas. Se muestra que aproximadamente un 60% de las transformantes expresan la proteína desacetilasa funcional y se traducen en el correspondiente fenotipo.

TABLA 4 Sensibilidad de plantas con pPCVKDEAC1 frente a N-acetil-PPT y actividad de desacetilasa en extractos brutos

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Ejemplo 5

Expresión específica para el tapetum del gen deac1 en tabaco

Mediando utilización de métodos clásicos, el promotor específico para el tapetum del gen tap1 procedente de hierba becerra (Antirrhinum majus) como un fragmento para EcoRI/BamHI de 2,2 kb se fusionó con el gen estructural deac1 (fragmento de PCR para BamHI/SalI de 1,4 kb) y con el terminador de 35S, en el vector pUC18. La casete de expresión así resultante, promotor tap1 - gen estructural deac - terminador de 35S se introdujo por clonación como fragmento de EcoRI de 3,8 kb en vez de la región de promotor de 35S/terminador, en el vector binario pPCV801 (plásmido pPCVTDEAC1, Figura 3). La transformación de tabaco se llevó a cabo tal como se ha descrito en el Ejemplo 4.

En el caso de una expresión de la desacetilasa, específica para el tapetum, se deberían poder inducir flores estériles masculinamente mediante un tratamiento de los capullos de hojas con N-acetil-PPT. La transformación del derivado de PPT en la sustancia activa herbicida fosfinotricina conduce a un daño selectivo para el tejido de tapetum, con lo cual se impide el desarrollo de polen funcional.

En cada caso, solamente un lado de las inflorescencias (la zona total de los capullos de flores que se desarrollan) se trató con N-acetil-PPT, el otro lado de las inflorescencias permaneció sin tratar, con el fin de asegurarse de que los fenómenos que se observan no han de atribuirse a malformaciones de las respectivas plantas. El tratamiento se llevó a cabo en un momento, en el que los capullos individuales no eran mayores que 5 mm (fase activa para el promotor de tapetum). Las transformantes de tabaco así como varias plantas testigos NT Sam NN se trataron en el transcurso de una semana 3 veces con 0,2% de N-acetil- D,L-PPT (= 7,5 mM) y 0,1% de Genapol (agente humectante). Después del florecimiento de los capullos (aproximadamente a los 9-11 días después de la terminación del tratamiento) las plantas fueron investigadas en cuanto a la aparición de flores estériles masculinamente.

Al mismo tiempo se midió la actividad de desacetilasa, específica para la N-acetil-PPT, en anteras no maduras de las transformantes, así como de las plantas testigos. Para esto, las anteras no maduras fueron extraídas y preparadas a partir de capullos de flores con un tamaño de 5 mm, y se incubaron durante una noche a la temperatura ambiente cada vez en 50 \muM de una solución de [^{14}C]-N-acetil-L-PPT. A continuación, las anteras se lavaron 1 vez en 500 \mul de un tampón de PBS y luego se homogeneizaron en 50 \mul de un tampón de PBS. Después de haber separado por centrifugación los desechos celulares, los materiales sobrenadantes se concentraron por evaporación en el aparato Speed-Vac y los sedimentos se recogieron cada vez en 30 \mul de un tampón de HPCl (con 5 mM de KH_{2}PO_{4}, 10% de metanol, pH = 1,92). Las tandas se analizaron en la HPLC, como arriba se ha descrito, en cuanto a la formación de [^{14}C]-L-PPT.

Los resultados del tratamiento de las flores y de los ensayos de actividad se representan en la Tabla 5 para plantas seleccionadas. En casi todas las transformantes se pudo comprobar una actividad de desacetilasa específica para las anteras. En el caso de 3 transformantes se observó por el lado tratado con N-acetil-PPT del racimo de flores estériles masculinamente, es decir no se formó nada de polen, o respectivamente se observaron flores grandemente reducidas en cuanto al contenido de polen. El efecto sobre nuevos capullos que maduraban se detuvo durante un período de tiempo de aproximadamente 3 semanas. Las flores no tratadas de las transformantes, así como las flores tratadas de las plantas testigos eran fértiles en todos los casos. En el caso de las flores estériles masculinamente no se podía comprobar ninguna formación de semillas. Una deliberada polinización ajena de las hojas estériles masculinamente era sin embargo posible, con lo cual se demostró que las partes femeninas de las flores han mantenido su plena capacidad funcional (Nacken y colaboradores, 1991, Mol. Gen. Genet. 229: 129-136).

TABLA 5 Esterilidad masculina inducida en plantas que contienen pPCVTDEAC1 mediante tratamiento de las flores con N-acetil-PPT, y actividad de desacetilasa en anteras

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Fig. 1 Mapa de restricción del fragmento para SalI/SamHI de 2,5 kb, que media en la actividad de desacetilasa específica para la N-acetil-PPT. La posición y la orientación del gen estructural deac1 están marcadas por una flecha (bps = pares de bases)

Fig. 2 Mapa del plásmido pPVCKDEAC1 para la expresión constitutiva del gen deac en plantas

Fig. 3 Mapa del plásmido pPCVTDEAC1 para la expresión específica para el tapetum del gen deac en plantas

Fig. 4 Mapa del plásmido pGK83

Fig. 5 Mapa del plásmido pMF9.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i): SOLICITANTE

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(A): NOMBRE: Hoechst Schering AgrEvo GmbH

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(B): CALLE: -

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(C): LOCALIDAD: Frankfurt

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(D): PAÍS FEDERAL: -

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(E): PAIS: Alemania

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(F): NÚMERO DE CÓDIGO POSTAL: 65926

\vskip0.500000\baselineskip

(G): TELÉFONO: 069-305-5596

\vskip0.500000\baselineskip

(H): TELEFAX: (+69) 357175

\vskip0.500000\baselineskip

(I): TELEX: -

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(ii): TÍTULO DE SOLICITUD: Nuevos genes que codifican desacetilasas de aminoácidos con especificidad para N-acetil-L-fosfinotricina, su aislamiento y su utilización

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): NÚMERO DE LAS SECUENCIAS: 4

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): FORMA LEGIBLE EN ORDENADOR

\vskip0.500000\baselineskip

(A): SOPORTE DE DATOS: disquete

\vskip0.500000\baselineskip

(B): ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C): BSISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D): SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, version #1.25 (EPA)

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN ACERCA DE LA SEQ ID NO: 1

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICA DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1.365 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): FORMA DE CADENA: Monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE LA MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: exón

\vskip0.500000\baselineskip

(B): SITUACIÓN: 1...1365

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

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6

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\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN ACERCA DE LA SEQ ID NO: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICA DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD. 454 aminoácidos

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(B): TIPO: Aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): FORMA DE CADENA: Monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE LA MOLÉCULA: Proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS;

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(A): NOMBRE/CLAVE: Proteína

\vskip0.500000\baselineskip

(B): SITUACIÓN: 1....454

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

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7

8

9

Claims

1. Molécula de ADN que codifica una proteína con una alta actividad de la desacetilasa de N-acetil-fosfinotricina, que se puede aislar a partir de Stenotrophomonas sp. depositada como DSM 9734.

2. Proteína, que es codificada por una molécula de ADN de acuerdo con la reivindicación 1.

3. Microorganismo Stenotrophomonas sp., depositado como DSM 9734.

4. Célula de planta, que contiene una molécula de ADN de acuerdo con la reivindicación 1.

5. Planta, que contiene una molécula de ADN de acuerdo con la reivindicación 1.

6. Procedimiento para la producción de plantas transgénicas con partes que se pueden destruir deliberadamente, que comprende:

a): la transformación de una célula de planta con una molécula de ADN de acuerdo con la reivindicación, que se encuentra bajo el control de un promotor específico para un tejido, y

b): la regeneración de plantas a partir de las células de plantas obtenidas de acuerdo con (a), poseyendo las partes de plantas unas partes de plantas que pueden ser destruidas selectivamente.

7. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6, para la producción de plantas estériles masculinamente, caracterizado porque

a): el promotor específico para un tejido es un promotor específico para el tapetum; y

b): el tratamiento con N-acetil-fosfinotricina daña al tejido del tapetum.