JP2010537158A - 腫瘍細胞由来微小胞 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図2
Description
(細胞培養および微小胞の単離)
U373細胞(ヒト星状細胞腫)細胞、Tet−off調節EGFRvIIIまたは緑色蛍光タンパク質(pEGFPN1)カセット(U373vIII−GFP)にC末端で融合されたEGFRvIIIを発現するそれらの安定な変異体U373vIIIおよびA431を、微小胞枯渇ウシ胎仔血清(FBS)を含む培地中で以前に記載(Viloria−Petitら,Am.J.Pathology,1997,6:1523−1530;Yuら,2005,Blood,105:1734−1741)されるように維持する。HUVEC細胞を、EGM−2(Cambrex Bioscience,Walkesville,MD,USA)中に維持する。微小胞を、以前に記載(Al−Nedawiら,2005,Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.,25:1744−1749)されるように、馴化培地またはマウス血漿から回収する。つまり、培地を、300gおよび12000gで2回の連続する遠心分離に供して、細胞および残渣を除去する。微小胞を、2時間、100000gで超遠心分離法によってペレットにし、タンパク質含有量によって定量化し、EGFRまたはEGFRvIII含有量について分析した。走査型電子顕微鏡(SEM)のために、細胞をカバースリップで増殖させ、2.5%のグルテルアルデヒドで固定し、1%のOsO4で染色し、金で覆い、JEOL 840A機器を用いて視覚化した。インビボでの分析のために、腫瘍を、免疫不全(SCID)マウス(Charles River、カナダ)への1〜10×106U373vIIIまたはU373細胞の注入によって発生させる。一部の場合において、マウスを、示したようにpan−ErbB阻害剤CI−1033で毎日処理する。血液を、心穿刺によって癌を保有するマウス、またはコントロールマウスからヘパリン化されたシリンジ内に回収する。血小板を含まない血漿を、微小胞を調製するために使用する。
(微小胞転移アッセイ)
U373(アクセプター)細胞を、24時間、微小胞で処理し、単一の細胞懸濁液を、EGFRvIIIまたはGFPの発現についてフローサイトメトリーまたは蛍光顕微鏡法によって分析する。シグナル伝達事象を検出するために、U373を0.5%FBS(DMEM)中で飢餓し、その後、示した濃度で、インタクトな、またはアネキシンV、もしくはCI−1033のいずれかでプレインキュベートした微小胞を添加する。微小胞結合分子(EGFRvIII、TF)の発現、ならびに全ておよび活性化MAPKおよびAktの発現ならびに他の変化を、免疫ブロット法(BclXL、p27/Kip1)、ELISA(VEGF、R&Dシステム)によってアッセイするか、または他に記載(Lopez−Ocejoら,2000,Oncogene,40:4611−4620)されるプロモーター活性アッセイ(VEGF)によってアッセイする。軟寒天コロニー形成アッセイのために、単一の細胞懸濁液を、微小胞で前処理した等しい数の細胞からの0.3%アガロースまたはコントロール培地で調製する。培養物を、0.5%のアガロースでプレコーティングしたプレートに定着させ、4個より多い細胞を含む全てのコロニーを計測する。
(多形性膠芽腫を有する患者における循環EGFRvIIIの検出)
微小胞を、腫瘍を有するマウスの血漿について以前に記載されるもの(Al−Nedawiら,2008,Nature Cell Biology,10:619−624)と同様の方法でヒト血漿から回収する。つまり、保存記録血液試料を、5分間300g、次いで20分間12000gで2回の連続した遠心分離に供して、細胞および残渣を除去する。最終的に、微小胞を、2時間100000gでの遠心分離後に得て、大量のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で2回洗浄する。タンパク質溶解物を、氷上で10分間、以下を含む溶解緩衝液において調製する:10mM Tris、pH6.8、5mM EDTA、50mM NaF、30mM ピロリン酸ナトリウム、2%(wt/vol)SDS、1mM フッ化フェニルメチルスルホニル(PMSF)、および1mM Na3VO4。他に示さない限り、溶解物をSDS−PAGEにより分離し、例えば、マウスまたはヒツジ抗ヒトEGFRポリクローナル抗体または適切なマウスモノクローナル抗体を用いて免疫ブロット法に供する。免疫検出を、適切なHRP結合二次抗体および化学発光プラスキット(ECLキット;Amersham Pharmacia,Buckinghamshire,英国)を用いて達成し、その後、ブロットを走査し、タンパク質のバンドを、例えば、Storm860スキャナー(GE healthcare)を用いて定量化する。野生型EGFRおよびEGFRvIIIのバンドの両方を、予想したサイズにおいてこの方法で検出し、標準SDS−PAGEプロトコルを用いて分離する。
Claims (40)
- 被験体における発癌タンパク質の存在を検出する方法であって、
前記被験体から試料を回収する工程と、
前記試料から微小胞を単離する工程と、
前記微小胞における前記発癌タンパク質の存在を検出する工程と、を含む方法。 - 被験体における癌の予後を診断または決定するための方法であって、
前記被験体から試料を回収する工程と、
前記試料から微小胞を単離する工程と、
前記微小胞における発癌タンパク質の存在を検出する工程とを含み、
前記試料中の前記発癌タンパク質の存在は、前記被験体が癌を有する可能性がある指標となる、方法。 - 被験体における癌の進行をモニタリングするための方法であって、
a)第1の時点で癌を有する被験体から第1の試料を回収する工程と、前記第1の試料から微小胞を単離する工程と、前記第1の試料から得た前記微小胞における発癌タンパク質を測定する工程と、
b)第2の時点で癌を有する前記被験体から第2の試料を回収する工程であって、前記第2の時点は前記第1の時点の後に生じる工程と、前記第2の試料から微小胞を単離する工程と、前記第2の試料から得た前記微小胞における前記発癌タンパク質を測定する工程と、を含み、
前記第1の試料から得た前記微小胞における前記発癌タンパク質の量と比較した前記第2の試料から得た前記微小胞における前記発癌タンパク質の量の変化が、前記癌の進行の指標である、方法。 - 抗癌治療の治療効果をモニタリングするための方法であって、当該方法は、
a)第1の時点で癌を有する被験体から第1の試料を回収する工程と、前記第1の試料から微小胞を単離する工程と、前記第1の試料から得た前記微小胞における発癌タンパク質を測定する工程と、
b)第2の時点で癌を有する前記被験体から第2の試料を回収する工程であって、前記第2の時点は前記第1の時点の後に生じる工程と、前記第2の試料から微小胞を単離する工程と、前記第2の試料から得た前記微小胞における前記発癌タンパク質を測定する工程と、を含み、
前記第1の試料から得た前記微小胞における前記発癌タンパク質の量と比較して前記第2の試料から得た前記微小胞における前記発癌タンパク質の量の減少または変化がないことが、抗癌治療の治療効果を示す、方法。 - 前記癌は、乳癌、神経膠腫、大腸癌、肺癌、小細胞肺癌、胃癌、肝臓癌、血液癌、骨肉腫、膵臓癌、皮膚癌、頭部癌もしくは頸部癌、皮膚黒色腫もしくは眼球内黒色腫、子宮肉腫、卵巣癌、直腸癌もしくは結腸直腸癌、肛門癌、結腸癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、外陰癌、扁平上皮癌、膣癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、食道癌、小腸癌、内分泌癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織腫瘍、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、慢性白血病もしくは急性白血病、リンパ球性リンパ腫、膀胱癌、腎臓癌、尿道癌、腎細胞癌、腎盂癌、CNS腫瘍、神経膠腫、星状細胞腫、多形性膠芽腫、原発性CNSリンパ腫、骨髄腫、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、ぶどう膜黒色腫、精巣癌、口腔癌、咽頭癌、小児腫瘍、白血病、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、神経膠腫、横紋筋肉腫および肉腫からなる群より選択される、請求項2〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記発癌タンパク質は、EGFRvIII、EGFR、HER−2、HER−3およびHER−4からなる群より選択される、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記発癌タンパク質は、MET、cKit、PDGFR、Wnt、βカテニン、K−ras、H−ras、N−ras、Raf、N−myc、c−myc、IGFR、PI3K、Akt、BRCA1、BRCA2、PTEN、ならびにVEGFR−2、VEGFR−1、Tie−2、TEM−1およびCD276からなる群より選択される癌関連細胞の受容体からなる群より選択される、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記発癌または受容体タンパク質のリン酸化状態を測定する工程をさらに含む、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1の試料から得た前記微小胞における前記発癌タンパク質の量と比較した前記第2の試料から得た前記微小胞における前記発癌タンパク質の量の増加は、前記癌が増殖を進行しているか、または継続していることを示す、請求項3〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1の試料から得た前記微小胞における前記発癌タンパク質の量と比較した前記第2の試料から得た前記微小胞における前記発癌タンパク質の量の減少は、前記癌が退行していることを示す、請求項3〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1の試料から得た前記微小胞における前記発癌タンパク質の量と比較して前記第2の試料から得た前記微小胞における前記発癌タンパク質の量の変化がないことは、前記癌が進行していないことを示す、請求項3〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記被験体は抗癌治療を受けている、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1の時点は前記被験体が抗癌治療を受ける前に生じ、前記第2の時点は前記被験体が前記抗癌治療を受けた後に生じる、請求項3〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 前記試料は体液である、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
- 前記体液は、血液、リンパ液、尿、脳脊髄液、腹水、唾液、洗浄液、精液、腺分泌物、滲出液、嚢胞および糞便の内容物からなる群より選択される、請求項14に記載の方法。
- 少なくとも2つの発癌タンパク質は、前記微小胞において検出される、請求項1〜15のいずれか1項に記載の方法。
- 前記微小胞は、超遠心分離法、免疫沈降または精密濾過法によって単離される、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法。
- 前記微小胞における前記発癌タンパク質の存在は、免疫ブロット法、免疫沈降、ELISA、RIA、フローサイトメトリー、電子顕微鏡法または質量分析法によって検出または測定される、請求項1〜17のいずれか1項に記載の方法。
- 前記微小胞は、アネキシンVでコーティングしたウェルを用いるELISAによって検出または測定される、請求項1〜17のいずれか1項に記載の方法。
- 前記抗癌治療は、外科手術、放射線治療、化学療法、標的癌治療、またはそれらの組み合わせである、請求項12に記載の方法。
- 前記標的癌治療は、低分子、モノクローナル抗体、癌ワクチン、アンチセンス、siRNA、アプタマー、遺伝子治療およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項20に記載の方法。
- 被験体由来の試料中の癌を検出するためのキットであって、
発癌タンパク質に対する少なくとも1つの抗体と、前記試料中の微小胞における前記発癌タンパク質を検出するために前記少なくとも1つの抗体を使用するための指示書と、を含むキット。 - 被験体由来の試料中の発癌タンパク質を検出するためのキットであって、
前記発癌タンパク質に対する少なくとも1つの抗体と、前記試料中の微小胞における前記発癌タンパク質を検出するために前記少なくとも1つの抗体を使用するための指示書と、を含むキット。 - 前記癌は、乳癌、神経膠腫、大腸癌、肺癌、小細胞肺癌、胃癌、肝臓癌、血液癌、骨肉腫、膵臓癌、皮膚癌、頭部癌もしくは頸部癌、皮膚黒色腫もしくは眼球内黒色腫、子宮肉腫、卵巣癌、直腸癌もしくは結腸直腸癌、肛門癌、結腸癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、外陰癌、扁平上皮癌、膣癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、食道癌、小腸癌、内分泌癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織腫瘍、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、慢性白血病もしくは急性白血病、リンパ球性リンパ腫、膀胱癌、腎臓癌、尿道癌、腎細胞癌、腎盂癌、CNS腫瘍、神経膠腫、星状細胞腫、多形性膠芽腫、原発性CNSリンパ腫、骨髄腫、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、ぶどう膜黒色腫、精巣癌、口腔癌、咽頭癌、小児腫瘍、白血病、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、神経膠腫、横紋筋肉腫および肉腫からなる群より選択される、請求項22または23に記載のキット。
- 前記発癌タンパク質は、EGFRvIII、EGFR、HER−2、HER−3およびHER−4からなる群より選択される、請求項22〜24のいずれか1項に記載のキット。
- 前記発癌タンパク質は、MET、cKit、PDGFR、Wnt、βカテニン、K−ras、H−ras、N−ras、Raf、N−myc、c−myc、IGFR、PI3K、Akt、BRCA1、BRCA2、PTEN、ならびにVEGFR−2、VEGFR−1、Tie−2、TEM−1およびCD276からなる群より選択される癌関連細胞の受容体からなる群より選択される、請求項22〜24のいずれか1項に記載のキット。
- 前記試料は体液である、請求項22〜26のいずれか1項に記載のキット。
- 前記体液は、血液、尿、脳脊髄液、腹水、唾液、洗浄液、精液、腺分泌物、滲出液および糞便からなる群より選択される、請求項27に記載のキット。
- リン酸化型特異的抗体をさらに含む、請求項22〜28のいずれか1項に記載のキット。
- 被験体の試料中の癌の予後を診断または決定するための少なくとも1つの抗体の使用であって、前記少なくとも1つの抗体は、微小胞に存在する発癌タンパク質に結合する、使用。
- 前記癌は、乳癌、神経膠腫、大腸癌、肺癌、小細胞肺癌、胃癌、肝臓癌、血液癌、骨肉腫、膵臓癌、皮膚癌、頭部癌もしくは頸部癌、皮膚黒色腫もしくは眼球内黒色腫、子宮肉腫、卵巣癌、直腸癌もしくは結腸直腸癌、肛門癌、結腸癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、外陰癌、扁平上皮癌、膣癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、食道癌、小腸癌、内分泌癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織腫瘍、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、慢性白血病もしくは急性白血病、リンパ球性リンパ腫、膀胱癌、腎臓癌、尿道癌、腎細胞癌、腎盂癌、CNS腫瘍、神経膠腫、星状細胞腫、多形性膠芽腫、原発性CNSリンパ腫、骨髄腫、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、ぶどう膜黒色腫、精巣癌、口腔癌、咽頭癌、小児腫瘍、白血病、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、神経膠腫、横紋筋肉腫および肉腫からなる群より選択される、請求項30に記載の使用。
- 前記発癌タンパク質は、EGFRvIII、EGFR、HER−2、HER−3およびHER−4からなる群より選択される、請求項30または31に記載の使用。
- 前記発癌タンパク質は、MET、cKit、PDGFR、Wnt、βカテニン、K−ras、H−ras、N−ras、Raf、N−myc、c−myc、IGFR、PI3K、Akt、BRCA1、BRCA2、PTEN、ならびにVEGFR−2、VEGFR−1、Tie−2、TEM−1およびCD276からなる群より選択される癌関連細胞の受容体からなる群より選択される、請求項30または31に記載の使用。
- 前記試料は体液である、請求項30〜33のいずれか1項に記載の使用。
- 前記体液は、血液、尿、脳脊髄液、腹水、唾液、洗浄液、精液、腺分泌物、滲出液、および糞便からなる群より選択される、請求項34に記載の使用。
- 前記少なくとも1つの抗体は、リン酸化型特異的抗体である、請求項30〜35のいずれか1項に記載の使用。
- 癌を処置するための微小胞の交換を阻害する薬剤の使用。
- 前記薬剤は、アネキシンVもしくはその誘導体、またはPセレクチンもしくはそのリガンドPSGLを阻害する薬剤である、請求項37に記載の使用。
- 前記癌は、乳癌、神経膠腫、大腸癌、肺癌、小細胞肺癌、胃癌、肝臓癌、血液癌、骨肉腫、膵臓癌、皮膚癌、頭部癌もしくは頸部癌、皮膚黒色腫もしくは眼球内黒色腫、子宮肉腫、卵巣癌、直腸癌もしくは結腸直腸癌、肛門癌、結腸癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、外陰癌、扁平上皮癌、膣癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、食道癌、小腸癌、内分泌癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織腫瘍、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、慢性白血病もしくは急性白血病、リンパ球性リンパ腫、膀胱癌、腎臓癌、尿道癌、腎細胞癌、腎盂癌、CNS腫瘍、神経膠腫、星状細胞腫、多形性膠芽腫、原発性CNSリンパ腫、骨髄腫、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、ぶどう膜黒色腫、精巣癌、口腔癌、咽頭癌、小児腫瘍、白血病、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、神経膠腫、横紋筋肉腫および肉腫からなる群より選択される、請求項37または38に記載の使用。
- 発癌タンパク質を含む単離された微小胞。
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