WO2006137595A1 - Ｈｅｒ２発現癌の予防・治療薬 - Google Patents

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her2
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cells
therapeutic agent
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Sei Yoshida
Akira Hayashi
Kenichiro Naito
Koji Yoshimura
Toshiyuki Fujioka
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Takeda Pharmaceutical Company Limited
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Definitions

  • the present invention relates to an agent for preventing or treating HER2-expressing cancer comprising an energy metabolism inhibitor or an energy metabolism inhibitor mimetic. More specifically, the present invention relates to a method for screening for a HER2-expressing cell growth inhibitor, a HER2 signal inhibitor, a HER2-expressing cancer preventive / therapeutic agent.
  • HER2 (sometimes called erbB2) is a receptor with tyrosine kinase activity that belongs to the EGF receptor family, and is a factor involved in cancer growth and malignancy. HER2 is highly expressed in various tumors such as breast cancer, lung cancer, colon cancer, knee cancer, and ovarian cancer, and the prognosis of patients with HER2 expression is poor (Seminar in Oncology. 27, No. 5, 2000, Supplment 9, pages 13-19). Thus, anti-HER2 therapy against HER2-expressing tumors is expected to suppress tumor growth.
  • humanized monoclonal antibodies against HER2 are resistant to HER2-expressing chemotherapeutic agents, It has been clinically effective against metastatic breast cancer (Seminar in Oncology. Vol. 29, No. 3, Supplment IK 2002, pp. 38-43).
  • Trastuzumab itself does not have the neutralizing activity of HER2 sidanol, and binding of tumor cells to the HER2 receptor promotes intracellular uptake of the receptor and reduces the number of receptors on the cell surface.
  • Cancer cells require a large amount of energy in order to retain properties such as infinite growth potential and metastatic potential.
  • the energy of cells is ATP, but in order to cover it, cancer cells enhance metabolic pathways involved in energy production such as sugar metabolism, lipid metabolism, and amino acid metabolism.
  • Prophylactic / therapeutic agent for HE R2-expressing cancer comprising an energy metabolism inhibitor or an energy metabolism inhibitor mimetic
  • HE R 2 force A protein containing the same or substantially the same amino acid E sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 5, or a partial peptide thereof, or a salt thereof.
  • a prophylactic / therapeutic agent according to [1] or [11] above, which is a HE R2-expressing cell growth inhibitor and / or a HE R2 signal inhibitor, [16] signal is cancer
  • prophylactic / therapeutic agent according to [1] or [11] which is a dephosphorylating agent for HE R2
  • a prophylactic / therapeutic agent according to [1] or [11] above which is an agent for suppressing metastasis / recurrence or a cancer cell apoptosis promoting agent
  • a prophylactic / therapeutic agent for HER2-expressing cancer comprising a substance having a mitochondria respiratory chain complex inhibitory action and an AMP-activating protein kinase activation action,
  • a method of screening for a preventive / therapeutic agent for HE R2-expressing cancer which comprises contacting a test compound with a cell and measuring intracellular energy metabolism.
  • [2 0 c] The screening method according to [2 0] above, wherein the indicator of intracellular energy metabolism is phosphorylation of AMP-activated protein kinase (AMPK) protein or (and) phosphorylation of AMPK substrate protein,
  • AMPK AMP-activated protein kinase
  • [2 2] Inhibiting energy metabolism in mammals A method of preventing or treating HE R 2 expressing cancer, comprising administering an effective amount of a drug or an energy metabolism inhibitor mimetic;
  • a method for preventing / treating HER2-expressing cancer comprising administering an energy metabolism inhibitor or an energy metabolism inhibitor mimetic to a patient who expresses HER 2 and has increased glucose metabolism Etc.
  • the present invention also provides
  • Figure 1 shows the results of measuring changes in HER2 phosphorylation over time when the oxygen concentration during cell culture was reduced from 20% to 7%.
  • the vertical axis shows the amount of HER2 protein phosphorylation at each time as a relative ratio, with the amount of HER2 protein phosphorylation when cultured at an oxygen concentration of 20% as 100%.
  • the present invention is based on the finding that suppression of cell energy metabolism or imitation of energy metabolism suppression significantly inhibits the growth of HER2-expressing cells. Therefore, in one aspect, the present invention provides a prophylactic / therapeutic agent for H E R 2 expressing cancer, comprising an energy metabolism inhibitor or an energy metabolism inhibitor mimetic.
  • Energy metabolism inhibitors include substances that have an effect on the energy metabolism of cells (eg, synthetic compounds, peptides, proteins, antibodies, non-peptide compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts) , Animal tissue extracts, plasma, etc.) and these substances themselves or agents containing the substances may be used.
  • Cellular energy metabolism involves ATP production, transporters, AMP-activated protein kinases, etc. directly or indirectly. Therefore, “energy metabolism inhibitors” typically include, for example, ATP production inhibitor, transporter activity inhibitor and the like.
  • cells include animal cells (eg, mammalian cells), insects Includes cells. Preferred are animal cells, more preferred are human cells, and most preferred are human cancer cells, particularly HER2-expressing cells.
  • ATP production inhibitors include substances that inhibit ATP production (eg, synthetic compounds, peptides, proteins, antibodies, non-peptide compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animals Tissue extract, plasma, etc.) itself or an agent containing the substance may be used, and examples thereof include a sugar metabolism inhibitor, an amino acid metabolism inhibitor, and a lipid metabolism inhibitor.
  • “Sugar metabolism inhibitors” include substances that inhibit sugar metabolism (eg, synthetic compounds, peptides, proteins, antibodies, non-peptide compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts) Liquid, plasma, etc.) or an agent containing the substance. Examples thereof include mitochondrial activity inhibitors and glycolytic inhibitors.
  • Mitochondria activity inhibitors include substances having an action that inhibits the activity and function of mitochondria (eg, synthetic compounds, peptides, proteins, antibodies, non-peptide compounds, fermentation products, cell extracts, Plant extract, animal tissue extract, plasma, etc.) or an agent containing the substance, for example, electron transport system inhibitors, TCA circuit inhibitors and the like.
  • suppressing aerobic metabolism by, for example, inducing hypoxia and limiting nutrient supply such as sugars, lipids, and amino acids is equivalent to using mitochondria activity inhibitors. Can be considered.
  • Electrode transport system inhibitors include substances that have an action of inhibiting the electron transport system (eg, synthetic compounds, peptides, proteins, antibodies, non-peptide compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts) , Animal tissue extract, plasma, etc.) itself or an agent containing the substance, for example, inhibiting at least one selected from respiratory chain complexes I, II, III, IV and V Agents and the like.
  • “An agent that inhibits at least one selected from respiratory chain complexes I, II, III, IV and V” includes respiratory chain complexes I, 1 1., III, I Substances that have an action of inhibiting at least one selected from V and V (eg, synthetic compounds, peptides, proteins, antibodies, non-peptide compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, plasma It may be itself or an agent containing the substance. For example, rotenone, piericidin, myxothiazole, capsaicin, acetogenin, arachidonic acid, etc.
  • TCA circuit inhibitors include substances that inhibit the TCA circuit (eg, synthetic compounds, peptides, proteins, antibodies, non-peptide compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animals Tissue extract, plasma, etc.) itself or an agent containing the substance may be used, and examples thereof include trifluoroacetic acid and salicylic acid.
  • glycolytic inhibitors include substances that inhibit glycolysis (eg, synthetic compounds, peptides, proteins, antibodies, non-peptidic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animals (Tissue extract, plasma, etc.) itself or an agent containing the substance may be used, and examples thereof include 2-deoxydalose, sodium fluoride, lithium iodide acetic acid and the like.
  • amino acid metabolism inhibitors include substances that inhibit amino acid metabolism (eg, synthetic compounds, peptides, proteins, antibodies, non-peptide compounds, fermented products, cell extracts, plant extracts' solutions, animals Tissue extract, plasma, etc.) itself or an agent containing the substance, such as amino group transfer inhibitors (eg, aminoxycetyl acid, etc.), deamination group inhibition Agents, weak rubonic acid inhibitors and the like. '
  • Lipid metabolism inhibitors include substances that have an action of inhibiting lipid metabolism (Eg, synthetic compounds, peptides, proteins, antibodies, non-peptidic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, plasma, etc.)
  • an overnight oxidation inhibitor eg, Tetradecylglycidic acid
  • Tetradecylglycidic acid Tetradecylglycidic acid
  • Transporter activity inhibitors include substances that have the effect of inhibiting the transporter activity of cells (eg, synthetic compounds, peptides, proteins, antibodies, non-peptidic compounds, fermentation products, cell extracts, plants Extract, animal tissue extract, plasma, etc.), and these substances themselves or agents containing the substances may be used.
  • glucose transport inhibitors eg, phlorizin, etc.
  • pyruvate / lactic acid transport inhibitors eg, cyan-4-hydroxycinnamate ( ⁇
  • 2-aminobicyclo- (2, 2, 1) -heptane-2-carboxyl ic acid (BCH)), etc. are examples of “transpo and overnight activity inhibitors”, but are not limited to these.
  • any substance capable of inhibiting the energy metabolism of the cell by inhibiting the transporter activity and suppressing the supply of the substrate necessary for the energy metabolism of the cell is included.
  • “Energy metabolism inhibition mimics” include cell physiological reactions caused by energy metabolism inhibition or starvation conditions (eg, protein phosphorylation and dephosphorylation, active oxygen) without directly inhibiting cell energy metabolism. Substances that induce production fluctuations, enzyme activity fluctuations, mRNA transcription / translation fluctuations, protein degradation and synthesis fluctuations, etc. (eg, synthetic compounds, peptides, proteins, antibodies, non-peptidic compounds, fermentation production) Substances, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, plasma etc.), and these substances themselves or agents containing the substances may be used. For example, AMP-activated protein kinase Examples include activators.
  • AMP-activated protein kinase activators include substances that have the effect of activating AMP-activated protein kinase (eg, synthetic compounds, peptides, proteins, antibodies, non-peptidic compounds, fermentation products, cell extracts) Plant extracts, animal tissue extracts, plasma, etc.), and these substances themselves or agents containing the substances may be used.
  • metformin, phenformin, pformin, AICAR 5-aminoimidazole-4-powered lupoxami driponucleoside
  • insulin resistance improver eg, troglitazone, ogl itazone or its Salt (preferably hydrochloride), Rosiglitazone or its salt (preferably maleate), Reglixane, Netoglitazone, Lipoglitazone (Rivogl izone), Eda glitazone ( Etc.)
  • AMP-activated protein kinase Any substance that activates and suppresses phosphorylation of HER 2 is included.
  • the “AMP-activated protein kinase activator” may have an action as the above-mentioned “mitochondrial activity inhibitor”.
  • HER2 (hereinafter also referred to as the protein of the present invention or the protein used in the present invention) is a human warm-blooded animal (eg, guinea pig, rat, mouse, chicken, rabbit, bush, hidge, ugly).
  • Cells eg, retinal cells, hepatocytes, spleen cells, neurons, glial cells, knees; 8 cells, bone marrow cells, mesangial cells, Langerhans cells, epidermal cells, epithelial cells, endothelial cells, Fibroblasts, fibrocytes, muscle cells, adipocytes, immune cells (eg, macrophages, T cells, B cells, natural killer cells, obesity cells, neutrophils, basophils, eosinophils, monocytes, Platelets, etc.), megakaryocytes, synovial cells, chondrocytes, bone cells, osteoblasts, osteoclasts, mammary cells, hepatocytes or stromal cells, or precursor cells of these cells, stem cells or Cancer cells, etc.
  • immune cells eg, macrophages, T cells, B cells, natural killer cells, obesity cells, neutrophils, basophils, eosinophils, monocytes, Platelets, etc.
  • any tissue in which these cells exist such as the brain, brain regions (eg, retina, olfactory bulb, amygdala, basal sphere, hippocampus, thalamus, hypothalamus, cerebral cortex, medulla, cerebellum), spinal cord, Pituitary gland, stomach, knee, kidney, liver, gonad, thyroid, gall bladder, bone marrow, adrenal gland, skin, muscle, lung, gastrointestinal tract (eg, large intestine, small intestine), blood vessel, heart, thymus, spleen, submandibular gland Peripheral blood, prostate, testicle, egg nest, placenta, uterus, bone, joint, skeletal muscle, etc., or cells of the blood system or cultured cells thereof (eg MEL, Ml, CTLL-2, HT-2, fraction 3) , HL-60, JOSK-1, K562, ML-1, MOLT-3, M0LT-4, MOLT-10, CCRF-CEM, T
  • HE R 2 includes a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 5, or a partial peptide thereof, or a salt thereof. It is possible.
  • amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 5 the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 5 And about 50% or more, preferably about 60% or more, more preferably about 70% or more, more preferably about 80% or more, particularly preferably about 90% or more, and most preferably about 95%.
  • An amino acid sequence having a homology of at least% is mentioned.
  • Examples of the protein containing the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 5 include, for example, the aforementioned SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 or Comprising an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, A protein having substantially the same quality of activity as a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 5 is preferred.
  • the substantially homogeneous activity includes, for example, HE R 2 action.
  • Substantially homogeneous means that their properties are qualitatively homogenous (eg, physiologically or pharmacologically). Therefore, it is preferable that the action of HE R 2 and the like is equivalent (eg, about 0.0 1 to 10 times, preferably about 0.:! To 10 times, more preferably 0.5 to 2 times). However, the degree of these activities and the quantitative factors such as the molecular weight of the protein may be different.
  • Examples of the protein of the present invention include (i) 1 or 2 or more (for example, 1 to 100 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 5) About, preferably about 1 to 30 amino acids, preferably about 1 to 10 amino acids, more preferably a few (1 to 5) amino acids, (ii) SEQ ID NO: 1, 1 or 2 or more (for example, about 1 to 100, preferably about 1 to 30 and preferably about 1 to 10) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 5.
  • an amino acid sequence to which a number (1 to 5) amino acids are added (iii) 1 or 2 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 5.
  • an amino acid sequence in which a number (1 to 5) amino acids are inserted (iv) 1 or 2 or more in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 5
  • about 1 to 100 amino acids, preferably about 1 to 30 amino acids, preferably about 1 to 10 amino acids, more preferably several (1 to 5) amino acids are substituted with other amino acids.
  • muteins such as sequences or (V) proteins containing amino acid sequences in combination of them.
  • the position of the insertion, deletion or substitution is not particularly limited.
  • Proteins in this specification are labeled at the left end according to the convention of peptide labeling. N-terminal (amino terminal), right end is C-terminal (force loxyl terminal).
  • the protein used in the present invention including the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, has a C-terminal carboxyl group (-C00H), a carboxylate (-C00-), and an amide (_C0NH). 2 ) or ester (-C00R).
  • R in the ester e.g., methyl, Echiru, n- propyl, isopropyl
  • alkyl groups such as n _ butyl, for example, C 3 _ 8 consequent opening alkyl groups such as cyclohexyl cyclopentyl, to sik port, for example, phenyl , - C 6, such as naphthyl - 12
  • Ariru group e.g., benzyl, phenylene Lou C i_ 2 alkyl groups Moshikuwahi such off
  • Ararukiru groups such as ⁇ - Nafuchiru alkyl group such as naphthylmethyl, Pibaro Iruokishimechiru A group or the like is used.
  • a protein in which the force lpoxyl group is amidated or esterified is also used in the present invention. Included in proteins.
  • the ester in this case for example, the above-mentioned C-terminal ester is used.
  • an amino group of an N-terminal amino acid residue (eg, methionine residue) has a protecting group (for example, a C 1Hi acyl group such as an alkanoyl such as a formyl group, an acetyl group, etc.) Protected with, N-terminal glutamine residue generated by cleavage in vivo and pi-glutamine oxidation, Substituents on the side chain of amino acids within the molecule (eg —OH, 1 SH, amino Group, imidazole group, indole group, guanidino group, etc.) protected with an appropriate protecting group (for example, CH 6 alkanoyl group such as formyl group, acetyl group, etc.) or sugar chain It also includes complex proteins such as so-called glycoproteins that are bound by.
  • a protecting group for example, a C 1Hi acyl group such as an alkanoyl such as a formyl group, an acetyl group, etc.
  • protein used in the present invention include, for example, a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and represented by SEQ ID NO: 3. And a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5.
  • the partial peptide of the protein used in the present invention is a partial peptide of the protein used in the present invention described above, and preferably has the same properties as the protein used in the present invention described above. Any one is acceptable.
  • At least 20 or more of the constituent amino acid sequences of the protein used in the present invention preferably 50 or more, more preferably 70 or more, more preferably 100 or more, most preferably Peptides having 20 or more amino acid sequences are used.
  • the partial peptide used in the present invention is 1 or 2 or more in the amino acid sequence (preferably about 1 to 20, more preferably about 1 to 10, more preferably number (1 to 5). Or one or more amino acids in the amino acid sequence (preferably about 1 to 20 pieces, more preferably about 1 to 10 pieces, more preferably numbers (1 to 5)) 1 or more amino acids, or 1 or more (preferably about 1 to 20 pieces, more preferably about 1 to 10 pieces, more preferably numbers (1 to 5 pieces) in the amino acid sequence. ) Amino acids, or 1 or more (preferably about 1 to 20 pieces, more preferably about 1 to 10 pieces, more preferably numbers (1 to 5)) in the amino acid sequence. Amino acids) may be substituted with other amino acids Yes.
  • the C-terminus may be either a force loxyl group (—C00H), a carboxyloxylate (—COO—), an amide (—C0NH 2 ) or an ester (—C00R). Good.
  • the partial peptide used in the present invention can also be used as an antigen for antibody production.
  • a salt with a physiologically acceptable acid eg, inorganic acid, organic acid
  • base eg, alkali metal salt
  • Physiologically acceptable acid addition salts are preferred.
  • examples of such salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid), or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid).
  • the protein used in the present invention or a partial peptide thereof or a salt thereof can be produced from the aforementioned cells of human or warm-blooded animals or tissues by a known protein purification method. It can also be produced by culturing a transformant containing the encoded DNA. It can also be produced according to known peptide synthesis methods.
  • any polynucleotide may be used so long as it contains a base sequence encoding the protein used in the present invention.
  • it is DNA.
  • DNA genomic DNA, genomic DNA library, cell-tissue-derived cDNA described above, cell-tissue-derived cDNA described above Either the library or the synthetic DNA A can be used.
  • the vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like.
  • amplification can be performed directly by reverse transcriptase polymerase chain reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR method) using a total RNA or mRNA fraction prepared from the above-mentioned cell tissue.
  • RT-PCR method reverse transcriptase polymerase chain reaction
  • DNA encoding the protein used in the present invention for example, DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 2, It contains the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 6 and the nucleotide sequence that hybridizes under highly stringent conditions, and is represented by the aforementioned SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 5. Any DNA may be used as long as it encodes a protein having substantially the same properties as the protein containing the amino acid sequence.
  • DNA that can be hybridized with the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 6 under highly stringent conditions include, for example, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: : About 50% or more, preferably about 60% or more, more preferably about 70% or more, more preferably about 80% or more, particularly preferably about 90% or more, Most preferably, DNA containing a base sequence having a homology of about 95% or more is used.
  • Hypridization can be carried out according to a method known per se or a method analogous thereto, such as the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Saibrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989).
  • The When using a commercially available library, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual. More preferably, it can be performed according to high stringent conditions.
  • High stringent conditions include, for example, a sodium concentration of about 19 to 40 mM, preferably about 19 to 20 mM, and a temperature of about 50 to 70 ° C, preferably about 60 to 65. Indicates the condition at ° C. In particular, it is most preferable when the sodium concentration is about 1.9 mM and the temperature is about 65 ° C.
  • the DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 includes DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, and the like. : As a DNA encoding a protein having the amino acid sequence represented by 3, a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 4, a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 As the DNA encoding DNA, DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6 is used.
  • the DNA encoding the partial peptide used in the present invention may be any DNA as long as it contains the base sequence encoding the partial peptide used in the present invention described above. Further, any of genomic DNA, genomic DNA library, the above-mentioned cell / tissue-derived cDNA, the above-mentioned cell 'tissue-derived cDNA library, and synthetic DNA may be used.
  • the DNA encoding the partial peptide used in the present invention includes, for example, a DNA having a part of the DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 6, Or comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 6 and the base sequence that is hybridized under highly stringent conditions, and is substantially the same as the protein of the present invention.
  • DNA containing a portion of DNA encoding a protein having the same quality of activity is used.
  • a DNA that can hybridize with the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 6 has the same significance as described above.
  • amplification is performed by PCR using a synthetic DNA primer having a portion of the base sequence encoding the protein of the present invention, or DNA incorporated into an appropriate vector is used. It can be selected by hybridization with a DNA fragment encoding a part or the entire region of the protein of the present invention or labeled with synthetic DNA.
  • the hybridization method can be performed, for example, according to the method described in Molecular Cloning 2 ⁇ Ed (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). In addition, when using a commercially available library, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual.
  • DNA base sequence conversion can be performed by PCR, known kits, such as
  • Mutan TM -super Express Km (Takara Shuzo Co., Ltd.), Mutan TM -K (Takara Shuzo Co., Ltd.), etc., or a method known per se such as ODA-UPCR method, Gapped duplex method, Kunkel method or the like Can be done according to.
  • the DNA encoding the cloned protein can be used as it is or after digestion with a restriction enzyme or addition of a linker if desired.
  • the DNA may have ATG as a translation initiation codon on the 5 ′ end side, and may have TAA, TGA or TAG as a translation termination codon on the 3 ′ end side. These translation initiation codons and translation termination codons can also be added using an appropriate synthetic DNA adapter. '
  • An expression vector for the protein of the present invention can be obtained by a known method, for example, (i) cutting out the target DNA fragment from the DNA encoding the protein of the present invention, and (ii) placing the DNA fragment in an appropriate expression vector. It can be manufactured by connecting to the downstream of the Promoter.
  • HER2-expressing cancer refers to HER2 (preferably a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 5, or a portion thereof. Any cancer cell may be used as long as the peptide is expressed.
  • gene detection methods eg, FISH (fluorescence in situ hybridization method), CISH (chromosome in situ hybridization method), PCR (polymerase chain reaction method), Southern blot method, etc.
  • messenger RNA detection methods Examples: RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR), ISH (in situ hybridization method), Northern plot method, etc.), Enoprotein detection method (eg, IHC (immuno-histo-cheinistry method), Western blot method, ELISA (Enzyme-1 inked immune sorbent assay) etc.] and the like, and HER2 gene, messenger RNA of HER2, and cancer cells in which HER2 protein is detected.
  • HER2-expressing cell growth is inhibited, HER2 dephosphorylation occurs, or HER2 signaling is inhibited
  • HER2 signal examples include cancer cell proliferation signal, anti-apoptosis signal, invasion signal, and metastasis signal.
  • energy metabolism inhibitors and energy metabolism inhibitors mimics are useful as preventive and therapeutic agents for HER2-expressing cancers, such as cancer (eg, brain tumors, pituitary adenomas, gliomas, acoustic schwannomas, retinal sarcomas, Thyroid cancer, pharyngeal cancer, laryngeal cancer, tongue cancer, thymoma, mesothelioma, breast cancer, lung cancer, non-small cell lung cancer, small cell lung cancer, stomach cancer, esophageal cancer, duodenal cancer, colon cancer, colon cancer, rectal cancer, Liver cancer, hepatocellular carcinoma, knee cancer, vaginal endocrine tumor, bile duct cancer, gallbladder cancer, penile cancer, kidney cancer, renal pelvic cancer, ureteral cancer, renal cell cancer, testicular cancer, prostate cancer, bladder cancer, vulvar cancer, uterus Cancer, cervical cancer, endometrial cancer, uterine sarcoma,
  • the energy metabolism inhibitor and the energy metabolism inhibitor mimetic may be formulated according to conventional means, if necessary.
  • Energy metabolism inhibitors and energy metabolism inhibition mimics have a stronger growth inhibitory effect on HER2-expressing cancers.
  • HER2 expression is expressed in patients with HER2 expression and increased glucose metabolism. It has excellent clinical effects when administered for the prevention and treatment of cancer. As a result, unnecessary medication can be reduced, the risk of side effects can be reduced, and the therapeutic effect on the patient can be increased.
  • Examples of patients expressing HER2 and having increased glucose metabolism include, for example, HER2 (preferably containing the same or substantially the same amino acid sequence as SEQ ID NO: 1.
  • Patients who express protein or its partial peptides and are judged to have increased glucose metabolism by known methods for example, patients whose presence is recognized by PET (Positron Emision on Tomography) And patients whose blood flow to cancer is recognized by methods such as angiography and magnetic resonance imaging (MRI).
  • Energy metabolism inhibitors and energy metabolism inhibitors mimics include hormone therapy agents, anticancer agents (eg, chemotherapeutic agents, immunotherapeutic agents, or agents that inhibit the action of cell growth factors and their receptors), etc. It can be used in combination with hormone therapy agents, anticancer agents (eg, chemotherapeutic agents, immunotherapeutic agents, or agents that inhibit the action of cell growth factors and their receptors), etc. It can be used in combination with hormone therapy agents, anticancer agents (eg, chemotherapeutic agents, immunotherapeutic agents, or agents that inhibit the action of cell growth factors and their receptors), etc. It can be used in combination with hormone therapy agents, anticancer agents (eg, chemotherapeutic agents, immunotherapeutic agents, or agents that inhibit the action of cell growth factors and their receptors), etc. It can be used in combination with hormone therapy agents, anticancer agents (eg, chemotherapeutic agents, immunotherapeutic agents, or agents that inhibit the action of cell growth factors and their receptors), etc. It can be used in combination with hormone therapy
  • hormone therapy agents include phosfestol, jet Rustilbestrol, chlorotriacene, medroxyprogesterone acetate, megestrol acetate, chlormadinone acetate, cyproterone acetate, danazol, dienogest, asoprisnil, allylestrenol, guestrinone, nomegestrol, evening denan, Mepaltricin, raloxififene, olmeroxifene, lepormeroxifene, antiestrogens (eg, citrate evening moxifen, toremifene citrate, etc.), ER downregure overnight (eg, fulvestrant, etc.), human menopausal gonadotropins , Follicle stimulating hormone, pill formulation, mepitiostan, testoractone, aminoglutethimide, LH-RH agonist (eg goserelin acetate, buserelin, leuproreli
  • chemotherapeutic agent examples include alkylating agents, antimetabolites, anticancer antibiotics, plant-derived anticancer agents, and the like.
  • alkylating agent examples include nitrogen mustard, nitrogen mustard hydrochloride- ⁇ -oxide, culamum butyl, cyclophosphamide, ifosfamide, thiotepa, carbocon, inprosulfan tosylate, busulfan, Dimustine hydrochloride, mitopronitol, mephalan, dacarbazine, ranimustine, estramustine sodium phosphate, triethylene melamine, carmustine, mouth mucin, streptozocin, pipbloman, etoglucid, carpoplatin, cisbra Chin, Mipoplatin, Nedaplatin, Oxaribratin, Artretamine, Ambamustine, Dibrospidum hydrochloride, Fotemustine, Predimustine, Pumitepa, Lipomustine, Temozo mouthmid, Threosulfan, Mouth fosfamide, Blastozetin Is mentioned.
  • antimetabolite examples include mercaptopurine, 6-mercaptopurine riboside, thioinosine, methotrexate, enoshiyu bin, shiyu rabin, shiyu rabinokphosphatate, anshiyubin hydrochloride, 5-FU series Drugs (eg, fluorouracil, tegafur, UFT, doxyfluridine, strength rumofur, garose evening bottle, emiteful, etc.), aminopterin, leucoporin calcium, tabloid, butosine, fluorite calcium, repofluorinate calcium, cladribine, emitalefur, fludarra , Gemshi Yubin, Hydroxycarbamide, Pentosyu Chin, Piritrixim, Idoxyuridine, Mitoguazone, Thiazofurin, Ambamucin, etc.
  • 5-FU series Drugs eg, fluorouracil, tegafur, UFT, doxyfluridine, strength
  • anticancer antibiotics include actinomycin D, actinomycin C, mitomycin C, chromomycin A3, bleomycin hydrochloride, bleomycin sulfate, bepromycin sulfate, daunorubicin hydrochloride, doxorubicin hydrochloride, aclarubicin hydrochloride, pirarubicin hydrochloride, Examples include epilubicin hydrochloride, neocalcinostatin, misramycin, sarcomycin, force rutinophilin, mitotane, zorubicin hydrochloride, mitoxantrone hydrochloride, idarubicin hydrochloride.
  • plant-derived anticancer agent examples include etoposide, etoposide phosphate, vinblastine sulfate, vincristine sulfate, vindesine sulfate, teniposide, paclitaxel, docetaxel, vinorelpine and the like.
  • Immunotherapy includes, for example, picibanil, krestin, schizophyllan, lentinan, ubenimex, interferon, in leukin, macrophage colony stimulating factor, granulocyte colony stimulation Factors, erythropoietin, lymphotoxin, BCG vaccine, corynebacterium parvum, levamisole, polysaccharide K, procodazole and the like.
  • the “cell growth factor” in the “drug that inhibits the action of cell growth factor and its receptor” may be any substance that promotes cell growth, and usually has a molecular weight of 20,000 or less.
  • a peptide is a factor that acts at a low concentration by binding to a receptor.
  • EGF epidermal growth factor
  • IGF insulin, IGF (insulin-like growth factor) -1, IGF-2, etc.
  • FGF fibroblast growth factor
  • Other Cell growth factor eg, CSF (colony stimulating fac tor), EPO (erythropoietin), IL-2 (interleukin-2), NGF (nerve growth factor), PDGF (platelet-derived growth factor), TGF ⁇ (transf orming growth factor j6), HGF (hepatocyte growth factor) VEGF (vascular endothelial growth factor), etc.
  • CSF colony stimulating fac tor
  • EPO erythropoietin
  • IL-2 interleukin-2
  • NGF nerve growth factor
  • PDGF platelet-derived growth factor
  • TGF ⁇ transf orming growth factor j6
  • HGF hepatocyte growth factor
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • the “cell growth factor receptor” may be any receptor capable of binding to the above-mentioned cell growth factor. Specifically, the EGF receptor, the haredarin receptor (HER2) Insulin receptor, IGF receptor, FGF receptor_1, or FGF receptor-2.
  • “Agents that inhibit the action of cell growth factors” include trastuzumab (Herceptin TM; HER2 antibody), imatinib mesylate, ZD1839 or cetuximab, antibodies to VEGF (eg, bevacizumab), antibodies to VEGF receptor, Gefutinib, el mouth tinib, etc.
  • LH-RH agonist eg, goserelin acetate, buserelin, leuprorelin, etc.
  • trastuzumab HER2 antibody
  • the timing of administration of the energy metabolism inhibitor and the concomitant drug is not limited, and these may be administered simultaneously to the administration subject, or may be administered with a time difference.
  • the dose can be appropriately selected based on the clinically used dose.
  • the mixing ratio of the energy metabolism inhibitor and the concomitant drug can be appropriately selected according to the administration subject, administration route, target disease, symptom, combination and the like.
  • a screening method for prophylactic and therapeutic drugs for HER2-expressing cancer which comprises contacting test compounds with cells and measuring intracellular energy metabolism
  • the present invention is characterized in that a test compound is brought into contact with a cell, and energy metabolism in the cell is measured.
  • Examples of the “cell” to which the test compound is contacted include animal cells and insect cells.
  • animal cells preferably human cultured cancer cells are used.
  • animal cells include monkey cells COS-7, Vero, Chinese ham Suichi cell CH0, dhfr gene-deficient Chinese hamster cell CH0, mouse L cell, mouse 20-20 cell, mouse myeloma cell, mouse ATDC5 cell, rat GH3 cell, human FL cell, human cultured cancer cell [eg, human breast cancer Cells (eg, BT-474, SK-BR-3, etc.), human lung cancer cells (eg, A549), human colon cancer cells (eg, HT-29, HCT-116, etc.), human vaginal cancer cells (eg, , AsPC-1, MIA-PaCa-2, etc.), human ovarian cancer cells (eg, 0V-CAR-3, CaOV-3, etc.), human kidney cancer (eg, ACHN, etc.), etc.
  • human breast cancer Cells eg, BT-474, SK-BR-3, etc.
  • human lung cancer cells eg, A549
  • human colon cancer cells eg
  • Insect cells include, for example, larvae-derived cell lines (Spodoptera frugiperda cells; Si cells), MG1 cells derived from the midgut of Trichoplus ia ni, High Five TM cells derived from eggs of Trichoplusia ni, Ma estra brassicae Derived cells, cells derived from Estigmena acrea, sputum-derived cell lines (Bombyxmori N cells; BmN cells), and the like.
  • Examples of the Sf cells include Sf9 cells (ATCC CRL1711) and S1 cells (above, In Vivo, 13, 213-217, (1977)).
  • examples of the medium include MEM medium containing about 5-20% fetal calf serum CScience, 122, 501 (1952)], MEM medium [Virology, 8, 396 (1959) )], RPMI 1640 medium CThe Journal of the American Medical Association 199, 519 (1967)], 199 medium [Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)].
  • the pH is preferably about 6-8.
  • Cultivation is usually carried out at about 30 ° C to 40 ° C for about 15 to 60 hours, with aeration and agitation as necessary.
  • test compounds for example, synthetic compounds, peptides, proteins, antibodies, non-peptide compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, plasma and the like are used.
  • Examples of screening include the following methods.
  • Intracellular ATP levels when HER2-expressing cells are cultured in the presence of a test compound are measured and compared.
  • a known method for example, a fluorescent ATP measurement method (Journal of I ⁇ unological Calthds. 160, pp. 8–88, 1993) or a method equivalent thereto is used.
  • a known method for example, an MTT measurement method (Journal of Immunologycal Methds. 65, 55-63, 1983) or a method equivalent thereto is used.
  • HER2-expressing cells and non-HER2-expressing cells are seeded with about 1,000 to 100,000 Zwells and cultured for about 24 to 120 hours.
  • HER2-expressing cell for example, the above-mentioned “HER2-expressing cancer” cell or the like is used.
  • the energy metabolism inhibitory activity in the case of (b) is about 20% or more, preferably 30% or more, more preferably about 50% or more compared to the energy metabolism inhibitory activity in the case of (a).
  • the compound to be selected is selected as a compound that inhibits the energy monometabolism inhibitory activity.
  • the culture solution may be reduced in the glucose concentration or the oxygen concentration may be reduced.
  • the test compound in which the cell proliferation activity in the case of (d) is reduced by about 20% or more, preferably 30% or more, more preferably about 50% or more compared to the cell proliferation activity in the case of (c) Is selected as a compound having a growth inhibitory action selectively on HER2-expressing cells.
  • SRB Sulphorhodamine-B
  • BrdU incorporation ELISA Journal of Immunology Methods. 85 Vol., Pp. 169-179, 1985.
  • HER2-expressing cells and non-HER2-expressing cells are seeded with about 1,000 to 100,000 Zwells and cultured for about 24 to 120 hours.
  • HER2-expressing cell for example, the above-mentioned “HER2-expressing cancer” cell or the like is used.
  • AMPK protein is activated by measuring and comparing the AMPK protein activity when HER2-expressing cells are cultured and (f) when HER2-expressing cells are cultured in the presence of the test compound.
  • Select a compound a mimetic to inhibit energy metabolism).
  • (ii-1) As specific examples, (e-1) phosphorylation of AMPK protein was observed when HER2-expressing cells were cultured and (f-1) HER2-expressing cells were cultured in the presence of the test compound. The method of measuring and comparing is mentioned.
  • (ii-2) Specific examples include (e-2) phosphorylation of AMPK substrate protein when HER2-expressing cells are cultured and (f-2) when HER2-expressing cells are cultured in the presence of the test compound. A method of measuring and comparing each of these.
  • AMPK substrate proteins include p70 S6K protein and ACC protein (Journal of Cell Science. 117, 5479-5487, 2004).
  • Detection of AMPK protein phosphorylation and AMPK substrate protein phosphorylation is performed according to known methods. For example, after incubation, the SDS sample bag Add fur directly or after extraction (eg, extraction with RIPA buffer, etc.) to lyse cells. The resulting cell lysate is separated by SDS-PAGE and subjected to Western plotting using an antibody specific for phosphorylated AMPK protein or an antibody specific for phosphorylation of AMPK substrate protein. Do.
  • HER2-expressing cells are seeded at about 1,000 to 100,000 cells / well and cultured for about 2 to 24 hours.
  • HER2-expressing cell for example, the above-mentioned “HER2-expressing cancer” cell or the like is used.
  • the activity of AMPK protein in the case of ( ⁇ ) is about 20% or more, preferably 30% or more, more preferably about 50% or more compared to the activity of AMPK protein in the case of (e) above.
  • the compound to be enhanced is selected as a compound that activates the AMPK protein (a mimetic to inhibit energy metabolism).
  • the compounds obtained in (i) and (ii) above have an energy metabolism inhibitory activity or an activity that mimics energy metabolism inhibition (eg, AMPK activation action), and have a selective growth inhibitory action on HER2-expressing cells. Therefore, it is a low-toxic compound that is specific and safe for HER2-expressing cancer.
  • a low-toxic compound that is specific and safe for HER2-expressing cancer.
  • baboons or warm-blooded animals eg, mice, rats, rabbits, sheep, pigs, rabbits, horses, birds, cats, dogs, monkeys, chimpanzees, etc.
  • It can be administered parenterally as a prophylactic / therapeutic agent for HER2-expressing cancer.
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on its action, target disease, administration subject, administration route, etc.
  • the compound or a salt thereof is administered at about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg per day.
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, the target disease, etc.
  • the compound is usually formed in the form of an injection.
  • the present invention provides a method for preventing and treating HER2-expressing cancer, which comprises inhibiting cell energy metabolism or mimicking energy metabolism.
  • Cellular energy metabolism involves ATP production, transporters, AMP-activated protein kinase, etc. directly or indirectly, and therefore, “inhibiting energy metabolism” typically involves: For example, inhibiting ATP production, inhibiting transporter activity and the like.
  • energy metabolism is directly involved in ATP production, which is for example related to sugar metabolism.
  • Sugar metabolism includes mitochondrial activity and glycolysis.
  • Mitochondria activities include those involving the electron transport system and those involving the TCA circuit.
  • the electron transport system is involved in at least one selected from respiratory chain complexes I, I I, I I I, I V and V.
  • mimicking the inhibition of energy metabolism can be achieved by directly affecting the cellular physiological response (eg, protein phosphorylation and dephosphorylation) caused by energy metabolism inhibition or starvation.
  • Oxidation, fluctuations in reactive oxygen production, fluctuations in enzyme activity, fluctuations in mRNA transcription / translation, fluctuations in proteolysis and synthesis, etc.) eg synthetic compounds, 'peptides, proteins, antibodies, non-peptidic compounds, fermentation Induced by the action of products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, plasma, etc. It is included.
  • Preferable examples include activating AMP-activated protein kinase by administering to a cell or subject a substance having an action of activating AMP-activated protein kinase.
  • the method for preventing and treating HE R2-expressing cancer of the present invention comprises, for example, subjecting an effective amount of the energy metabolism inhibitor or energy metabolism inhibitor mimetic described in (1) above to a subject (for example, a mammal, preferably, Administration to humans).
  • the method includes administering an effective amount of a compound obtained by the screening method described in (2) above to a subject (eg, a mammal, preferably a human).
  • a subject eg, a mammal, preferably a human.
  • the scope of the present invention is not limited to these specific embodiments, but by providing the target cell with any compound or condition that acts to directly or indirectly inhibit intracellular energy metabolism. Inhibiting the energy metabolism of the cells is also within the scope of the present invention.
  • sequence listing when bases, amino acids, etc.
  • DN A Deoxyliponucleic acid
  • RNA Liponucleic acid
  • RNA Messenger ribonucleic acid
  • d ATP Deoxyadenosine triphosphate
  • TTP Deoxythymidine triphosphate
  • EDTA ethylenediamine tetraacetic acid
  • a 1 a Alanine
  • S ec selenocystine
  • the amino acid sequence of human HER2 is shown.
  • Example 1 The present invention is not limited to the following examples.
  • Example 1 The present invention is not limited to the following examples.
  • Example 1
  • BT-474 breast cancer cells purchased from ATCC
  • MDA-MB-231 breast cancer cells purchased from ATCC
  • These cells are seeded in a 96-well multiwell plate (BT-474: 3.0 x 10 4 cells / well, MDA-MB-231: 1.5 x 10 4 cells / well), and a carbon dioxide incubator ⁇ ( The cells were cultured overnight in 5% C02, 37 ° C).
  • Mitochondria respiratory chain complex inhibitory compound (complex I: rotenone) was added in 10 stages in a 4-fold dilution series from a final concentration of 10 mol / L, and further cultured for 5 days.
  • the medium containing rotenone is removed, the cells are washed with phosphate buffer, fixed with 5% triclonal acetate solution, and 0.4% (W / V) Sulphorhodamine-B (SRB) dye solution (1 % Dissolved in acetic acid) Yes, cell proteins were stained. Then, remove the SRB dye solution from the plate, wash with 1% acetic acid solution, add IOO L lOmM Tris buffer solution, extract and dissolve the dye, measure the absorbance at an absorption wavelength of 550 nm, and determine the amount of protein. (Journal of National Cancer Institute. 82, 1107-1112, 1990).
  • IC 5 in BT-474 cells Values are 0.004 mol / L, IC 5 in MDA-MB-231 cells. The value was 0.5 xmol / L.
  • Seeding is a human HER2 expressing human breast cancer cell lines BT- 474 (purchased from American Tissue Culture Collection (ATCC)) in 24-well multiwell plate (BT-474: 1.2 X 10 5 cells / Ueru), and carbon dioxide incubator ( 5% C0 2, was cultured overnight at 37 ° C) in.
  • Mitochondria respiratory chain complex inhibitor complex I: rotenone, complex III: antimycin, complex V: oligomycin: Wako Pure Chemical Industries
  • the culture was continued after addition. After 2 hours, the culture solution was removed, and the cells were lysed with SDS sample buffer (200 L). Western blotting analysis was performed as follows.
  • this cell lysate was separated by SDS-PAGE (gel concentration: 7.5-15%) (Analytical Biochemistry, No. 166, pages 368-379, 1987) and transferred to a nitrocellulose membrane (BioRad).
  • an antibody specific for phosphorylated HER2 manufactured by Cell signaling technology, code no. No. 2244
  • anti-phospho Akt antibody specific to downstream anti-apoptotic signaling molecule Akt Cell Signaling Technology, code number 9271
  • anti-phosphorylated MAPK antibody specific to downstream growth signaling molecule MAPK The antibody was detected with EC Renstem (Amersham) using Cell Signaling Technology (code number 9101) and quantified as the amount of phosphorylated protein by image analysis.
  • HER2 phosphorylation was prominently detected in BT-474 cells in the solvent control group. At this time, inhibition of HER2 phosphorylation was observed by rotenone, antimycin and oligomycin. Along with this, suppression of phosphorylation of Akt and MAPK was also observed.
  • Human HER2-expressing human cancer cell line BT-474 (purchased from ATCC) was seeded in a 24-well multiwell plate (1.2 X 10 5 cells / well), and carbon dioxide incubate (20% 0 2 , 5% C0 2 , Incubated overnight at 37 ° C). The plates were transferred to a carbon dioxide incubator one (7% 0 2, 5% CO physician 37 ° C), over time added SDS sample buffer (200 L) in Ueru, cells were lysed. This cell lysate (8 ⁇ L) was separated by SDS-PAGE method (gel concentration: 7.5-15%) (Shagger et al., Analytical Biochemistry, 166, 368-379, 1987). Next, Western blotting analysis was performed in the same manner as in Example 1 to detect phosphorylated HER2, phosphorylated Akt, and phosphorylated MAPK.
  • SK2-BR-3 purchased from ATCC
  • a HER2-expressing human cancer cell line was seeded in a 24-well multi-well: Ruprey mushroom (4.0 x 10 5 cells / well) and carbon dioxide incubate overnight (5% C0 2, 37 ° C) was cultured overnight in, replacing the medium in which the amount of glucose contained a 0. lmg / mL, and incubated an additional 2 hours.
  • 2-Deoxyglucose a glucose metabolism antagonist, was added to a final concentration of 5 mg / mL. After 2 hours, the culture solution was removed, and the cells were lysed with SDS sample buffer (200 ⁇ L).
  • This cell lysate was separated by SDS-PAGE method (gel concentration: 7.5-15%) (Shagger. Et al., Analytical Biotechnology, 166, 368-379, 1987) .
  • Western blotting analysis was performed in the same manner as in Example 1 to detect phosphorylated HER2, phosphorylated Akt, and phosphorylated MAM.
  • AMPK is known to act as a sensor for intracellular energy metabolism and to be activated by inhibiting energy metabolism (increasing the ADP / ATP ratio). Whether HER2 phosphorylation and its signal are suppressed by AMPK activation (which mimics the inhibition of energy metabolism) was examined as follows. Human HER2-expressing human cancer cell line BT-474 (purchased from ATCC) was seeded in a 24-well multi-well plate (1.2 x 10 5 cells / well), and carbon dioxide incubate (1% 20% 0 2 , 53 ⁇ 4 C0 2 , 37 Incubated overnight in ° C).
  • Metformin that activates AMPK (The Journal of Biological Chemistry, Vol.279, No.279, No.42, 43940-43951, 2004) was added to the final concentration of 15minol / L in 5 stages in a 3-fold dilution series, and the culture was continued. It was. After 2 hours, the culture solution was removed and the cells were lysed with SDS sample buffer (200 D. This cell lysate (8 L) was separated by SDS-PAGE (gel concentration: 7.5-15%) (Analytical Biochemistry 166, 368-379, 1987) Next, Western blotting analysis was performed in the same manner as in Example 1 to quantify phosphorylated HER2, phosphorylated Akt, and phosphorylated MAPK.
  • HER2 phosphorylation was remarkably detected in BT-474 cells in the solvent control group, and concentration-dependent suppression of HER2 phosphorylation was observed by the addition of metformin. Along with this, suppression of phosphorylation of Akt and MAPK was also observed.
  • BT-474 purchased from American Tissue Culture Collection (ATCC)
  • ATCC American Tissue Culture Collection
  • human HER2-expressing human breast cancer cell line in a 24-well multiwell plate
  • BT-474 1.2 ⁇ 10 5 cells / well
  • the mitochondrial respiratory complex I inhibitor compound rotenone (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added at final concentrations of 1, 0.333, 0.111, 033. and 0. Oll mol / L, and the culture was continued. After 2 hours, the culture solution was removed, cells were lysed with SDS sample buffer (200 zL), and Western blotting analysis was performed using this cell lysate.
  • this cell lysate (8 til) was separated by SDS-PAGE (gel concentration: 7.5-15%) (Analytical Biochemistry, 166, 368-379, 1987) and transferred to a nitrocellulose membrane (manufactured by Bioad).
  • Phosphorylated HER2 specific antibody Cell signaling technology, code number 2244
  • AMPK specific AMPK antibody cell signaling technology, code number 2535
  • phosphorylated AMPK specific antiphosphor Using an oxidized AMPK antibody (Cell Signaling Technology, code number 2532), chemiluminescence detection of the antibody with the ECL system (Amersham), and the amount of phosphorylated protein using the LAS-1000 plus image analyzer (Fuji Photo Film) Quantified.
  • HER2 phosphorylation was prominently detected in the BT-474 cells of the solvent control group and decreased in a dose-dependent manner by the addition of rotenone. At this time, the amount of AMPK phosphorylation indicating that AMPK was activated increased in a dose-dependent manner as opposed to the amount of phosphorylation of HER2. At this time, no quantitative change was observed in the protein amount of AMPK itself.
  • 2,4-dinitrophenol 300, 100, 30, 10 and 3 DIO1 / L were added and the culture continued.
  • the culture solution was removed 2 hours after the addition of the drug, cells were lysed with SDS sample buffer (200 L), and then Western blotting analysis was performed using this cell lysate. That is, this cell lysate (8 L) was separated by SDS-PAGE (gel concentration: 7.5-15%) (Analytical Biochemistry, 166, 368-379, 1987), and a nitrocellulose membrane (BioRad) Antibody specific to phosphorylated HER2 (Code No. 2244), pACC antibody specific to phosphorylated acetylyl CoA carboxyxylase (ACC) (Code No.
  • S6K phosphorylated S6 kinase specific anti-phosphorylated S6K antibody
  • HER2 phosphorylation was prominently detected in the BT-474 cells of the solvent control group and decreased in a dose-dependent manner with the addition of antimycin, oligomycin, and 2,4-dinitrophenol.
  • ACC which is a substrate of AMPK and is an indicator of activity, increased phosphorylation in a dose-dependent manner in any compound.
  • phosphorylation of S6K which is known as a downstream molecule, was suppressed, and it became clear that the signal from AMPK was transmitted inside the cell.
  • BT2-474 breast cancer cells MDA-MB-453 breast cancer cells, A549 non-small cell lung cancer cells, LNCaP prostate cancer cells as human HER2-expressing cells, MDA-MB-231 breast cancer cells, A498 renal cancer cells as HER2-non-expressing cells (Both purchased from ATCC). Each cell was seeded in a 96-well plate at 500 cells / 150 L / wel 1 and cultured overnight.
  • Antimycin final concentration: 1, 0.1, 0.01, 0.001 mol / L
  • 2,4-dinitrophenol final concentrations: 0.6, 0.2, 0.06, 0.02 ol / L
  • metformin final concentration: 25 , 5, 1, 0.2 olol / U
  • AICAR final concentration: 25, 5, 1, 0.2 mmol / L
  • the cell counts were determined using a cell Counting Ki t_F (Dojin chemical Laboratory).
  • the number of viable cells using Cell Counting Kit-F was measured by the following method according to the package insert. The supernatant was removed from the 96-well plate that had been cultured for 5 days, and 100 L / wel of Cell Counting Kit-F diluted 1000-fold with RPMI medium (no phenol red, no serum) was added. After reacting at room temperature for 30 minutes, fluorescence (excitation wavelength: 480 ⁇ , fluorescence wavelength: 530 nm) was measured with a fluorescence plate reader.
  • Human EGFR-expressing human epidermoid carcinoma cell line A431 (American Tissue
  • this cell lysate (8 xL) was separated by SDS-PAGE method (gel concentration: 7.5-15%) (Analytical Biochemistry, 166, 368-379, 1987), and a nitrocellulose membrane.
  • the antibody was detected with an ECL system (Amersham) using an antibody specific to phosphorylated EGFR (Cell Signaling Technology, code number 2232) and phosphorylated by image analysis. Quantified as the amount of oxidized protein.
  • EGFR phosphorylation was prominently detected in the A431 cells of the solvent control group. At this time, inhibition of EGFR phosphorylation by rotenone was not observed.
  • EGFR also called HER1
  • HER1 is a receptor tyrosine kinase that is highly homologous to HER2 and is classified in the same family. Combined with the results of Example 2, it was revealed that the inhibition of receptor tyrosine phosphorylation by inhibition of intracellular energy metabolism is HER2-specific.
  • Example 1 0
  • BT2-474 breast cancer cells, MDA-MB-453 breast cancer cells, and LNCaP prostate cancer cells were used as human HER2-expressing cells, and MDA-MB-231 breast cancer cells and A498 kidney cancer cells (all purchased from ATCC) as HER2-expressing cells was used.
  • Each cell was seeded in a 96-well plate at 500 cells / 150 L / well, and then used for sputum culture. Trodari evening (final concentration: 25, 6.25, 1.56 n ⁇ / l) was diluted with medium and added at 50 L / well to the final concentration. 5 days, 37 ° C, after incubation at 53 ⁇ 4 C0 2, the cell counts were determined using a Cell CountingKit-F (Dojin Chemical Laboratory).
  • the number of viable cells using Cell Counting Kit-F was measured by the following method according to the package insert. The supernatant was removed from the 96-well plate that had been cultured for 5 days, and Cell Counting Kit-F diluted 1000-fold with RPMI medium (without phenol red and without serum) was added at 100 L / well. After reacting at room temperature for 30 minutes, fluorescence (excitation wavelength: 480 nm, fluorescence wavelength: 530 nm) was measured with a fluorescence plate reader.
  • troglialzone inhibited HER2-expressing cancer cells at a concentration of 25 IHO1 / L at a concentration of 50% for BT474 cells, 25% for MB453 cells, and 48% for LNCaP cells. This growth inhibition was concentration dependent.
  • HER2 non-expressing cancer cells showed 100% MDA-MB-231 cells and 105% A498 cells at a concentration of 25 / xniol / L, showing no growth inhibitory activity.
  • Energy metabolism inhibitors or energy metabolism inhibitors mimics For example, prevention and treatment of HER2-expressing cancer, growth inhibitor of HER2-expressing cell, HER2 signal inhibitor, HER2 deactivation It can be used as a safe drug as a phosphorylating agent, a cancer metastasis' recurrence inhibitor, a cancer cell apoptosis promoter, or a prophylactic / therapeutic agent for rheumatoid arthritis. Furthermore, HER2-expressing cancer can be prevented and treated by administering an energy metabolism inhibitor or an energy metabolism-inhibiting mimic to a HER2-expressing cancer patient. By contacting a test compound with a cell and measuring intracellular energy metabolism, a prophylactic / therapeutic agent for HER2-expressing cancer can be efficiently screened.

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Abstract

本発明は、ＨＥＲ２発現癌の予防・治療薬、ＨＥＲ２発現細胞の増殖阻害薬、ＨＥＲ２シグナル阻害薬などとして有用であるエネルギー代謝阻害剤またはエネルギー代謝阻害模倣剤を提供する。

Description

明細書
HER2発現癌の予防 ·治療薬 技術分野
本発明は、 エネルギー代謝阻害剤またはエネルギー代謝阻害模倣剤を 含有してなる HER2発現癌の予防'治療薬などに関する。さらに詳しくは、 HER2発現細胞の増殖阻害薬、 HER2シグナル阻害薬、 HER2発現癌の予防 · 治療薬のスクリーニング方法などに関する。 背景技術
HER2 (erbB2と呼ばれることもある） は、 EGF受容体ファミリ一に属す るチロシンリン酸化酵素活性を有する受容体であり、 癌の増殖 ·悪性化 に関与する因子である。 HER2は、 乳癌、 肺癌、 大腸癌、 膝癌、 卵巣癌な どの種々の腫瘍に高発現しており、 HER2発現患者の予後は不良である （ Seminar in Oncology. 27巻、 5号、 2000年、 Supplment 9、 13- 19頁） 。 これより、 HER2発現腫瘍に対する抗 HER2療法は、 腫瘍増殖を抑制するも のと期待され、 事実、 HER2に対するヒト化モノクローナル抗体 （トラス ッズマブ、 八一セプチン） は HER2高発現の化学療法剤抵抗性、 転移性乳 癌に対し臨床で効果を示している （Seminar in Oncology. 29巻、 3号、 Supplment IK 2002年、 38-43頁） 。 トラスッズマブ自身は、 HER2シダナ' ルの中和活性を持たず、 腫瘍細胞の HER2受容体への結合により、 受容体 の細胞内取り込みを促進し、 細胞表面の受容体数を減らし、 その結果、 抗腫瘍効果を示すといわれており （Cancer Iiiunology Immunotherapy 37 巻、 255- 263頁、 1993年） 、 その効果は、 HER2高発現腫瘍に限定されてい る (Journal of Clinical Oncology, 21巻、 15号、 2889- 2895頁、 2003 年） 。 この欠点を補うべく、 受容体チロシンリン酸化酵素阻害など、 現 在、 HER2シグナルを中和、 阻害し、 腫瘍の増殖を抑制する試みが行われ ている。 一方、 癌細胞は、 無限増殖能、 転移能などの性質を保持するため、 多 量のエネルギーを必要としている。細胞のエネルギーは ATPであるが、 そ れを賄うため癌細胞は糖代謝、 脂質代謝、 アミノ酸代謝等エネルギー産 生に関与する代謝経路を亢進させている。 例えば、 癌細胞への糖取り込 み亢進は、 一般的であり （Genomics 84巻、 1014- 1020頁、 2004年、 Nature Reviews of Cancer 4巻、 89卜 899頁、 2004年） 、 臨床において PET診断の 技術的基本となっている。 増殖因子受容体は、 細胞増殖シグナルを伝達 する作用に加え、 下流 mTORなどの情報伝達分子を介して、 直接、 間接的 にミ トコンドリアを含めた代謝活性を亢進させ、 受容体発現細胞のエネ ルギ一代謝を促進する （Current Opinion of Clinical Nutrition Metabolism Care, 8巻、 1号、 67- 72頁、 2005年) 。 発明の開示
安全で治療効果の優れた HER2発現癌の予防'治療薬が切望されている。 本発明者らは、 上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、 糖代謝の抑制、 呼吸の抑制、 およびミ トコンドリアの活性の抑制による エネルギー代謝の抑制またはエネルギー代謝抑制の模倣により、 HER2の リン酸化が低下すること、 HER2発現細胞の増殖が阻害されることを見出 し、 さらに研究を重ね、 本発明を完成するに至った。
すなわち、 本発明は、
〔 1〕 エネルギー代謝阻害剤またはエネルギー代謝阻害模倣剤を含有し てなる HE R 2発現癌の予防 ·治療薬、
〔2〕 エネルギー代謝阻害剤が、 AT P産生阻害剤である上記 〔1〕 記 載の予防 ·治療薬、
〔3〕 AT P産生阻害剤が、 糖代謝阻害剤である上記 〔2〕 記載の予防 •治療薬、
〔4〕 糖代謝阻害剤が、 ミ トコンドリア活性阻害剤である上記 〔3〕 記 載の予防 ·治療薬、
〔5〕 ミ トコンドリア活性阻害剤が、 電子伝達系阻害剤である上記 〔4 〕 記載の予防 '治療薬、
〔6〕 電子伝達系阻害剤が、 呼吸鎖複合体 I、 I I、 I I I、 I Vおよ び Vから選ばれる少なくとも一種を阻害する剤である上記 〔5〕 記載の 予防 ·治療薬、
〔7〕 ミ トコンドリア活性阻害剤が、 T CA回路阻害剤である上記 〔4 〕 記載の予防 ·治療薬、
〔8〕 ミ小コンドリア活性阻害剤が、 AMP活性化プロテインキナーゼ 活性化剤である上記 〔4〕 記載の予防 ·治療薬、
〔9〕 糖代謝阻害剤が、 解糖系阻害剤である上記 〔3〕 記載の予防 '治 療薬、
〔 1 0〕 エネルギー代謝阻害模倣剤が、 AMP活性化プロテインキナー ゼ活性化剤である上記 〔 1〕 記載の予防 ·治療薬、
〔 1 1〕 エネルギー代謝阻害模倣剤を含有してなる HE R 2発現癌の予 防 ·治療薬、
〔 1 2〕 エネルギー代謝阻害模倣剤が、 AMP活性化プロテインキナー ゼ活性化剤である上記 〔 1 1〕 記載の予防 ·治療薬、
〔1 3〕 AMP活性化プロテインキナーゼ活性化剤が、 ミ トコンドリア 活性阻害剤である上記 〔 1 2〕 記載の予防 ·治療薬、
〔 1 4〕 HE R 2力 配列番号： 1、 配列番号 3または配列番号 ： 5 で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸 E列を 含有するタンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩である上記 〔 1〕 または 〔 1 1〕 記載の予防 ·治療薬、
〔 1 5〕 HE R 2発現細胞の増殖阻害薬および （または） HE R 2シグ ナル阻害薬である上記 〔 1〕 または 〔 1 1〕 記載の予防 ·治療薬、 〔 1 6〕シグナルが、癌細胞の増殖シグナル、抗アポト一シスシグナル、 浸潤シグナルおよび転移シグナルから選ばれる少なくとも一種である上 記 〔 1 5〕 記載の予防 .治療薬、
〔 1 7〕 HE R 2の脱リン酸化剤である上記 〔 1〕 または 〔 1 1〕 記載 の予防 ·治療薬、 〔 1 8〕 瘙の転移 ·再発抑制薬または癌細胞のアポトーシス促進薬であ る上記 〔 1〕 または 〔 1 1〕 記載の予防 治療薬、
〔 1 9〕 ミ トコンドリア呼吸鎖複合体阻害作用および AMP活性化プロ ティンキナーゼ活性化作用を有する物質を含有してなる H E R 2発現癌 の予防 ·治療薬、
〔2 0〕 試験化合物を細胞に接触させ、 細胞内のエネルギー代謝を測定 するこどを特徴とする HE R 2発現癌の予防 ·治療薬のスクリ一二ング 方法、
[2 0 a] 細胞内のエネルギー代謝の指標が、 細胞内 AT P量である上 記 〔2 0〕 記載のスクリーニング方法、
〔2 0 b〕 細胞内のエネルギー代謝の指標が、 ミ トコンドリア酸化還元 活性である上記 〔 2 0〕 記載のスクリーニング方法、
〔2 0 c〕 細胞内のエネルギー代謝の指標が、 AMP活性化プロテイン キナーゼ （AMPK) タンパク質のリン酸化または （および） AMPK の基質タンパク質のリン酸化である上記 〔2 0〕 記載のスクリーニング 方法、
〔2 1〕 エネルギー代謝を阻害またはエネルギー代謝の阻害を模倣する ことを特徴とする HE R 2発現癌の予防 ·治療方法、
〔2 1 a〕 エネルギー代謝が、 ATP産生である上記 〔2 1〕 記載の方 法、
〔2 1 b〕 ATP産生が、 糖代謝である上記 〔 2 1 a〕 記載の方法、 〔2 1 c〕 糖代謝が、 ミ トコンドリア活性である上記 〔2 1 b〕 記載の 方法、
〔2 1 d〕 ミトコンドリア活性が、 電子伝達系である上記 〔2 1 c〕 記 載の方法、 '
〔2 1 e〕 電子伝達系が、 呼吸鎖複合体 I I I I I I I Vおよび Vから選ばれる少なくとも一種である上記 〔2 1 d〕 記載の方法、
C 2 1 f ) ミトコンドリア活性が、 T C A回路である上記 〔2 1 d〕 記 載の方法、 〔2 1 g〕 糖代謝が、 解糖系である上記 〔2 1 b〕 記載の方法、
〔2 1 h〕 エネルギー代謝の阻害を模倣することが、 AMP活性化プロ ティンキナ一ゼを活性化することである上記 〔2 1〕 記載の方法、
〔2 1 i〕 エネルギー代謝の阻害を模倣することを特徴とする HE R 2 発現癌の予防 ·治療方法、
〔2 1 j〕 エネルギー代謝の阻害を模倣することが、 AMP活性化プロ ティンキナーゼを活性化することである上記 〔2 1 i〕 記載の方法、
〔2 1 k〕 AMP活性化プロテインキナーゼを活性化することが、 ミ ト コンドリア活性を阻害することである上記 〔2 1 j〕 記載の方法、 . 〔2 2〕 哺乳動物に対し、 エネルギー代謝阻害剤またはエネルギー代謝 阻害模倣剤の有効量を投与することを特徴とする HE R 2発現癌の予防 •治療方法、
〔2 3〕 HER 2発現癌の予防 ·治療薬を製造するためのエネルギー代 謝阻害剤またはエネルギー代謝阻害模倣剤の使用、
〔24〕 HER 2が発現しており、 糖代謝が亢進している患者に対し、 エネルギー代謝阻害剤またはエネルギー代謝阻害模倣剤を投与すること を特徴とする、 HER 2発現癌の予防 ·治療方法などを提供する。
また、 本発明は、
〔i〕エネルギー代謝阻害剤またはエネルギー代謝阻害模倣剤を含有して なる HER 2に関連する疾患の予防 ·治療薬、
〔ii〕 HE R 2に関連する疾患が癌または関節リウマチである上記 〔i 〕 記載の予防 ·治療薬も提供する。 エネルギー代謝阻害剤またはエネルギー代謝阻害模倣剤は、 HER2のリ ン酸化を抑制し、 HER2のシグナルを阻害、 HER2'発現細胞の増殖を阻害す るため、 例えば、 HER2発現癌の予防 ·治療薬、 HER2発現細胞の増殖阻害 薬、 HER2シグナル阻害薬、 HER2の脱リン酸化剤、癌の転移 ·再発抑制薬、 ' 癌細胞のアポトーシス促進薬、 関節リウマチの予防 ·治療薬などとして 安全な医薬として使用することができる。 さらには、 HER2発現癌患者に 対し、 エネルギ 代謝阻害剤またはエネルギー代謝阻害模倣剤を投与す ることにより、 HER2発現癌を予防 ·治療することができる。 試験化合物 を細胞に接触させ、細胞内のエネルギー代謝を測定することにより、 HER2 発現癌の予防 ·治療薬が効率よくスクリーニングすることができる。 図面の簡単な説明
• 図 1は、 細胞培養時の酸素濃度を 20 %から 7%へと低下させた場合に、 HER2のリン酸化量の変化を経時的に測定した結果を表す図である。 図中、 縦軸は酸素濃度 20 %で培養した場合の HER2 タンパク質リン酸化量を 100 %として、 各時間での HER2タンパク質リン酸化量を相対比で示す。 発明を実施するための最良の形態
( 1 ) エネルギー代謝阻害剤またはエネルギー代謝阻害模倣剤を含有し てなる HER2発現癌の予防 ·治療薬
本発明は、 細胞のエネルギー代謝の抑制またはエネルギー代謝抑制の 模倣により、 H E R 2発現細胞の増殖が顕著に阻害されることを見出し たことに基づいている。 したがって、 本発明は、 一つの局面において、 エネルギー代謝阻害剤またはエネルギー代謝阻害模倣剤を含有してなる H E R 2発現癌の予防 ·治療薬を提供する。
「エネルギー代謝阻害剤」 としては、 細胞のエネルギー代謝を姐害す る作用を有する物質 （例、 合成化合物、 ペプチド、 タンパク質、 抗体、 . 非ペプチド性化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織 抽出液、 血漿など） が含まれ、 これらの物質自体であっても、 該物質を 含む剤であってもよい。 細胞のエネルギー代謝には、 A T P産生、 トラ ンスポーター、 A M P活性化プロテインキナ ゼなどが直接または間接 的に関与しており、 したがって、 「エネルギー代謝阻害剤」 としては、 典型的には、 例えば、 A T P産生阻害剤、 トランスポーター活性阻害剤 などが挙げられる。
「細胞」 としては、 例えば、 動物細胞 （例、 哺乳動物の細胞） 、 昆虫 細胞などが含まれる。 好ましくは、 動物細胞であり、 より好ましくはヒ ト細胞であり、 最も好ましくは、 ヒト癌細胞、 特に H E R 2発現細胞で ある。
「A T P産生阻害剤」 としては、 A T P産生を阻害する作用を有する 物質 （例、 合成化合物、 ペプチド、 タンパク質、 抗体、 非ペプチド性化 合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液、 血漿な ど） 自体であっても、 該物質を含む剤であってもよく、 例えば、 糖代謝 阻害剤、 アミノ酸代謝阻害剤、 脂質代謝阻害剤などが挙げられる。
「糖代謝阻害剤」 としては、糖代謝を阻害する作用を有する物質（例、 合成化合物、 ペプチド、 タンパク質、 抗体、 非ペプチド性化合物、 発酵 生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液、 血漿など） 自体で あっても、 該物質を含む剤であってもよく、 例えば、 ミ トコンドリア活 性阻害剤、 解糖系阻害剤などが挙げられる。
「ミ トコンドリア活性阻害剤」 としては、 ミ トコンドリアの活性 ·機 能を阻害する作用を有する物質 （例、 合成化合物、 ペプチド、 タンパク 質、 抗体、 非ペプチド性化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液、 血漿など） 自体であっても、 該物質を含む剤であって もよく、 例えば、 電子伝達系阻害剤、 T C A回路阻害剤などが挙げられ る。 また、 例えば、 低酸素状態の誘導、 糖、 脂質、 アミノ酸等の栄養供 給を制限するなどして、 好気的代謝を抑制することは、 ミ トコンドリア 活性阻害剤を使用することと等価なものと考えることができる。
「電子伝達系阻害剤」 としては、 電子伝達系を阻害する作用を有する 物質 （例、 合成化合物、 ペプチド、 タンパク質、 抗体、 非ペプチド性化 合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液、 血漿な ど） 自体であっても、 該物質を含む剤であってもよく、 例えば、 呼吸鎖 複合体 I 、 I I 、 I I I 、 I Vおよび Vから選ばれる少なくとも一種を 阻害する剤などが挙げられる。
「呼吸鎖複合体 I 、 I I 、 I I I 、 I Vおよび Vから選ばれる少なく とも一種を阻害する剤」 としては、 呼吸鎖複合体 I 、 1 1.、 I I I 、 I Vおよび Vから選ばれる少なくとも一種を阻害する作用を有する物質 （ 例、 合成化合物、 ペプチド、 タンパク質、 抗体、 非ペプチド性化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液、 血漿など） 自 体であっても、 該物質を含む剤であってもよく、 例えば、 複合体 I に対 するロテノン、 ピエリシヂン、 ミクソチアゾール、 カプサイシン、 ァセ トゲニン、 ァラキドン酸など ；複合体 I Iに対するマロン酸、 ジメチル コハク酸、 TTFA ( 2- Thenoyl t r i f luoroace tone) など；複合体 I I Iに対 するアンチマイシン、 スティグマテリン、 ァラキドン酸；複合体 V I に 対するアジ化ナトリウム、 シアニド、 硫化水素、 ハイ ド口コルチゾン、 デクサメサゾンなど；複合体 Vに対する 2， 4 -ジニトロフエノ一ル、バリ ノマイシン、 オリゴマイシン； FCCP 〔力ルポエル シァニド- 4 -（トリフル ォロメ トキシ）フエニルヒドラゾン〕 などが挙げられる。
「T C A回路阻害剤」 としては、 T C A回路を阻害する作用を有する 物質 （例、 合成化合物、 ペプチド、 タンパク質、 抗体、 非ペプチド性化 合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液、 血漿な ど） 自体であっても、 該物質を含む剤であってもよく、 例えば、 トリフ ルォロ酢酸、 サリチル酸などが挙げられる。
「解糖系阻害剤」 としては、解糖系を阻害する作用を有する物質（例、 合成化合物、 ペプチド、 タンパク質、 抗体、 非ペプチド性化合物、 発酵 生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液、 血漿など） 自体で あっても、 該物質を含む剤であってもよく、 例えば、 2 -デォキシダルコ ース、 フッ化ナトリウム、 リチウムョード酢酸などが挙げられる。
「アミノ酸代謝阻害剤」 としては、 アミノ酸代謝を阻害する作用を有 する物質 （例、 合成化合物、 ペプチド、 タンパク質、 抗体、 非ペプチド 性化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出'液、 動物組織抽出液、 血 漿など） 自体であっても、 該物質を含む剤であってもよく、 例えば、 ァ ミノ基転移阻害剤 （例、 アミノォキシァセチル酸など） 、 脱アミノ基阻 害剤、 脱力ルボン酸阻害剤などが挙げられる。 '
「脂質代謝阻害剤」 としては、 脂質代謝を阻害する作用を有する物質 (例、 合成化合物、 ペプチド、 タンパク質、 抗体、 非ペプチド性化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液、 血漿など） 自 体であっても、 該物質を含む剤であってもよく、 例えば、 ベ一夕一酸化 阻害剤 （例、 テ卜ラデシルグリシル酸（Tetradecylglycidic acid) など） などが挙げられる。
「トランスポーター活性阻害剤」 としては、 細胞のトランスポーター 活性を阻害する作用を有する物質 （例、 合成化合物、 ペプチド、 タンパ ク質、 抗体、 非ペプチド性化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出 液、 動物組織抽出液、 血漿など） が含まれ、 これらの物質自体であって も、 該物質を含む剤であってもよい。 例えば、 グルコーストランスポー 夕一阻害剤 （例、 フロリジンなど） 、 ピルビン酸 ·乳酸トランスポー夕 一阻害剤 （例、 シァノ -4-ヒドロキシシンナメート （α
-cyano-4-hydroxyGinnamate) 、 ρ—クロロメ レクリ安肩、香酸 ( p-chloromercur ibenzenesul fonic acid) など) 、 アミノ酸トランスポ一 夕一阻害剤 （例、 2-アミノビシクロヘプタンカルボン酸 （
2-aminobicyclo- (2, 2, 1) -heptane-2-carboxyl ic acid (BCH) ) など） な どが、 「トランスポ一夕一活性阻害剤」 の例として挙げられるが、 これ らに限定されず、 トランスポーターの活性を阻害し細胞のエネルギー代 謝に必要な基質の供給を抑えることによって、 細胞のエネルギー代謝を 阻害する作用を奏することができる任意の物質が含まれる。
「エネルギー代謝阻害模倣剤」 としては、 細胞のエネルギー代謝を直 接阻害することなく、 エネルギー代謝の阻害状態または飢餓状態により 生じる細胞の生理反応 （例、 タンパク質のリン酸化および脱リン酸化、 活性酸素産生量の変動、 酵素活性の変動、 mRNA転写 ·翻訳の変動、 タン パク質分解および合成の変動など） を誘導する物質 （例、 合成化合物、 ペプチド、 タンパク質、 抗体、 非ペプチド性化合物、 発酵生産物、 細胞 抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液、. 血漿など） が含まれ、 これらの 物質自体であっても、 該物質を含む剤であってもよく、 例えば、 AMP 活性化プロテインキナーゼ活性化剤などが挙げられる。 「AMP活性化プロテインキナーゼ活性化剤」 としては、 AMP活性 化プロティンキナーゼを活性化する作用を有する物質（例、合成化合物、 ペプチド、 タンパク質、 抗体、 非ペプチド性化合物、 発酵生産物、 細胞 抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液、 血漿など） が含まれ、 これらの 物質自体であっても、 該物質を含む剤であってもよい。 例えば、 メトフ オルミン、 フェンフオルミン、 プフォルミン、 AICAR (5-アミノイミダゾ ール- 4-力ルポキサミ ドリポヌクレオシド） 、 インスリン抵抗性改善剤 〔 例、 トログリ夕ゾン （Troglitazone)、 ピオダリ夕ゾン（ ogl itazone) またはその塩 （好ましくは塩酸塩）、 ロシグリタゾン（Rosiglitazone)ま たはその塩 （好ましくはマレイン酸塩）、 レグリキサン（Reglixane)、 ネ 卜グリタゾン（Netoglitazone).、 リポグリタゾン（Rivogl i zone)、 エダ グリタゾン（Edaglitazone)、 テサグリタザール（Tesaglitazar)、 ラガグ リタザール（Ragaglitazar)、 ムラグリタザール（Muragl itazar)、 メ夕グ リダセン（Me glidasen)、 ナベグリ夕ザ一ル（Navegl i tazar)、 バラグリ 夕ゾン（BalagliUzone)など〕 などが挙げられるが、 これらに限定されず 、 AMP活性化プロテインキナーゼを活性化し、 HER 2のリン酸化を 抑制する任意の物質が含まれる。 なお、 「AMP活性化プロテインキナ ーゼ活性化剤」 力 上記 「ミ トコンドリア活性阻害剤」 としての作用を 有していてもよい。
HER2 (以下、 本発明のタンパク質または本発明で用いられるタンパク 質と称することもある） は、 ヒトゃ温血動物 （例、 モルモッ ト、 ラッ ト、 マウス、 ニヮトリ、 ゥサギ、 ブ夕、 ヒッジ、 ゥシ、 サルなど） の細胞 （ 例、 網膜細胞、 肝細胞、 脾細胞、 神経細胞、 グリア細胞、 膝臓 ;8細胞、 骨髄細胞、 メサンギゥム細胞、 ランゲルハンス細胞、 表皮細胞、 上皮細 胞、 内皮細胞、 線維芽細胞、 繊維細胞、 筋細胞、 脂肪細胞、 免疫細胞 （ 例、 マクロファージ、 T細胞、 B細胞、 ナチュラルキラ一細胞、 肥満細 胞、 好中球、 好塩基球、 好酸球、 単球、. 血小板など） 、 巨核球、 滑膜細 胞、 軟骨細胞、 骨細胞、 骨芽細胞、 破骨細胞、 乳腺細胞、 肝細胞もしく は間質細胞、 またはこれら細胞の前駆細胞、 幹細胞もしくは癌細胞など ) もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、 例えば、 脳、 脳の各 部位 （例、 網膜、 嗅球、 扁桃核、 大脳基底球、 海馬、 視床、 視床下部、 大脳皮質、 延髄、 小脳） 、 脊髄、 下垂体、 胃、 膝臓、 腎臓、 肝臓、 生殖 腺、 甲状腺、 胆のう、 骨髄、 副腎、 皮膚、 筋肉、 肺、 消化管 （例、 大腸、 小腸） 、 血管、 心臓、 胸腺、 脾臓、 顎下腺、 末梢血、 前立腺、 睾丸、 卵 巣、 胎盤、 子宮、 骨、 関節、 骨格筋など、 または血球系の細胞もしくは その培養細胞 （例えば、 MEL、 Ml、 CTLL-2, HT-2、 画ト 3、 HL - 60、 JOSK-1 、 K562, ML-1、 MOLT- 3、 M0LT-4、 MOLT- 10、 CCRF- CEM、 TALL- 1、 Jurkat, CCRT-HSB-2, KE- 37、 SKW- 3、 HUT_78、 HUT- 102、 H9、 U937, THP-K HEL、 JK-L CMK、 K0-812、 MEG- 01など） に由来するタンパク質であってもよく 、 合成タンパク質であってもよい。
HE R 2としては、 配列番号 ： 1、 配列番号： 3または配列番号 ： 5 で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を 含有するタンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩が挙げられ る。
配列番号： 1、 配列番号 ： 3または配列番号 ： 5で表されるアミノ酸 配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、 配列番号： 1、 配列番号 ： 3または配列番号： 5で表わされるアミノ酸配列と約 5 0 %以上、 好 ましくは約 6 0 %以上、 さらに好ましくは約 7 0 %以上、 より好ましく は約 8 0 %以上、 特に好ましくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
アミノ酸配列の相同性は、 相同性計算アルゴリズム NCBI BLAST ( National Center ior Biotechnology Inf ormat ion Basic Local Al ignment Search Tool) を用い、 以下の条件 （期待値 = 10； ギャップを許す；マト リクス=8105 62； フィルタリング = 0FF) にて計算することができる。 配列番号 ： 1、 配列番号 ： 3または配列番号 ： 5で表されるアミノ酸 配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、 例 えば、 前記の配列番号 ： 1、 配列番号： 3または配列番号 ： 5で表され るアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号： 1、 配列番号： 3または配列番号： 5で表されるアミノ酸配列を含有する夕 ンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。 実質的に同質の活性としては、例えば HE R 2作用などが挙げられる。 実質的に同質とは、 それらの性質が性質的に （例、 生理学的に、 または 薬理学的に） 同質であることを示す。 したがって、 HE R 2作用などが 同等 （例、 約 0. 0 1〜 1 0 ひ倍、 好ましくは約 0. ：!〜 1 0倍、 より 好ましくは 0. 5〜 2倍） であることが好ましいが、 これらの活性の程 度、 夕ンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
また、 本発明のタンパク質としては、 例えば、 （i) 配列番号： 1、 配 列番号 ： 3または配列番号 ： 5で表されるアミノ酸配列中の 1または 2 個以上 （例えば 1〜 1 0 0個程度、 好ましくは 1〜 3 0個程度、 好まし くは 1〜 1 0個程度、 さらに好ましくは数 （ 1〜 5 ) 個） のアミノ酸が 欠失したアミノ酸配列、 （ii) 配列番号： 1、 配列番号： 3または配列 番号： 5で表されるアミノ酸配列に 1または 2個以上 （例えば 1〜 1 0 0個程度、 好ましくは 1〜 3 0個程度、 好ましくは 1〜 1 0個程度、 さ らに好ましくは数 （ 1〜 5) 個） のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、 (iii) 配列番号： 1、 配列番号： 3または配列番号： 5で表されるアミ ノ酸配列に 1または 2個以上 （例えば 1〜 1 0 0個程度、 好ましくは 1 3 0個程度、 好ましくは 1〜 1 0個程度、 さらに好ましくは数 （ 1〜 5 ) 個） のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、 （iv) 配列番号： 1、 配列番号： 3または配列番号： 5で表されるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （例えば 1〜 1 0 0個程度、 好ましくは 1〜 3 0個程度、 好ま しくは 1〜 1 0個程度、 さらに好ましくは数 （ 1〜 5 ) 個） のアミノ酸 が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、 または （V) それらを組み合 わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質などのいわゆるムテインも含 まれる。
上記のようにアミノ酸配列が挿入、 欠失または置換されている場合、' その挿入、 欠失または置換の位置としては、 とくに限定されない。
本明細書におけるタンパク質は、 ぺプチド標記の慣例に従って左端が N末端 （ァミノ末端） 、 右端が C末端 （力ルポキシル末端） である。 配 列番号 ： 1で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質をはじめと する、本発明で用いられるタンパク質は、 C末端がカルボキシル基（-C00H ) 、 カルポキシレート （- C00— ) 、 アミ ド （_C0NH2) またはエステル （- C00R ) の何れであってもよい。
ここでエステルにおける Rとしては、 例えば、 メチル、 ェチル、 n— プロピル、 イソプロピル、 n _ブチルなどの アルキル基、 例えば、 シクロペンチル、シク口へキシルなどの C 3_8シク口アルキル基、例えば、 フエニル、 —ナフチルなどの C 6— 12ァリール基、 例えば、 ベンジル、 フ エネチルなどのフエ二ルー C i_2アルキル基もしくはひ—ナフチルメチル などの α—ナフチルー アルキル基などの C 7 14ァラルキル基、 ピバロ ィルォキシメチル基などが用いられる。
本発明で用いられるタンパク質が C末端以外に力ルポキシル基 （また はカルポキシレート） を有している場合、 力ルポキシル基がアミ ド化ま たはエステル化されているものも本発明で用いられるタンパク質に含ま れる。 この場合のエステルとしては、 例えば上記した C末端のエステル などが用いられる。
さらに、 本発明で用いられるタンパク質には、 N末端のアミノ酸残基 (例、 メチォニン残基） のァミノ基が保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァ セチル基などの アルカノィルなどの C 1Hiァシル基など） で保護され ているもの、 生体内で切断されて生成する N末端のグルタミン残基がピ 口グルタミン酸化したもの、 分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基 （例え ば— O H、 一 S H、 アミノ基、 イミダゾール基、 インドール基、 グァニ ジノ基など） が適当な保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチル基などの C 6アルカノィル基などの C Hァシル基など） 'で保護されているもの、 あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖夕ンパク質などの複合タンパク質な ども含まれる。
本発明で用いられるタンパク質の具体例としては、 例えば、 配列番号 ： 1で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、 配列番号： 3で表 されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、 配列番号： 5で表されるァ ミノ酸配列を含有するタンパク質などがあげられる。
本発明で用いられるタンパク質の部分べプチドとしては、 前記した本 発明で用いられるタンパク質の部分ペプチドであって、 好ましくは、 前 記した本発明で用いられるタンパク質と同様の性質を有するものであれ ばいずれのものでもよい。
. 例えば、 本発明で用いられるタンパク質の構成アミノ酸配列のうち少 なくとも 2 0個以上、 好ましくは 5 0個以上、 さらに好ましくは 7 0個 以上、 より好ましくは 1 0 0個以上、 最も好ましくは 2 0 0個以上のァ ミノ酸配列を有するぺプチドなどが用いられる。
また、 本発明で用いられる部分ペプチドは、 そのアミノ酸配列中の 1 または 2個以上 （好ましくは 1〜 2 0個程度、 より好ましくは 1〜 1 0 個程度、 さらに好ましくは数 （ 1〜 5 ) 個） のアミノ酸が欠失し、 また は、そのアミノ酸配列に 1または 2個以上（好ましくは 1〜 2 0個程度、 より好ましくは 1〜 1 0個程度、 さらに好ましくは数 （ 1〜 5 ) 個） の アミノ酸が付加し、 または、 そのアミノ酸配列に 1または 2個以上 （好 ましくは 1〜 2 0個程度、 より好ましくは 1〜 1 0個程度、 さらに好ま しくは数 （ 1〜 5 ) 個） のアミノ酸が挿入され、 または、 そのアミノ酸 配列中の 1または 2個以上 （好ましくは 1〜 2 0個程度、 より好ましく は 1〜 1 0個程度、 さらに好ましくは数 （ 1〜 5 ) 個） のアミノ酸が他 のアミノ酸で置換されていてもよい。
また、 本発明で用いられる部分ペプチドは C末端が力ルポキシル基 （ -C00H) 、 カルポキシレート （- COO—) 、 アミ ド （- C0NH2) またはエステ ル （-C00R) の何れであってもよい。
さらに、 本発明で用いられる部分ペプチドには、 前記した本発明で用 いられるタンパク質と同様に、 C末端以外に力ルポキシル基 （または力 ルポキシレート） を有しているもの、 N末端のアミノ酸残基 （例、 メチ ォニン残基） のァミノ基が保護基で保護されているもの、 N端側が生体 内で切断され生成したグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、 ' 分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているも の、 あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖べプチドなどの複合べプチドな ども含まれる。
本発明で用いられる部分べプチドは抗体作成のための抗原としても用 いることができる。
本発明で用いられるタンパク質または部分ペプチドの塩としては、 生 理学的に許容される酸 （例、 無機酸、 有機酸） や塩基 （例、 アルカリ金 属塩） などとの塩が用いられ、 とりわけ生理学的に許容される酸付加塩 が好ましい。 この様な塩としては、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 リ ン酸、 臭化水素酸、 硫酸） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ 酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン 酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン 酸） との塩などが用いられる。
本発明で用いられるタンパク質もしくはその部分ぺプチドまたはその 塩は、 前述したヒ-,トゃ温血動物の細胞または組織から自体公知のタンパ ク質の精製方法によって製造することもできるし、 タンパク質をコード する D N Aを含有する形質転換体を培養することによつても製造するこ とができる。 また、 公知のペプチド合成法に準じて製造することもでき る。
ヒトゃ哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、 ヒトゃ哺乳動物 の組織または細胞をホモジナイズした後、 酸などで抽出を行ない、 該抽 出液を逆相クロマトグラフィ一、 イオン交換クロマトグラフィーなどの クロマトグラフィ一を組み合わせることにより精製単離することができ る。
本発明で用いられるタンパク質をコードするポリヌクレオチドとして は、 前述した本発明で用いられるタンパク質をコ一ドする塩基配列を含 有するものであればいかなるものであってもよい。 好ましくは D N Aで ある。 D N Aとしては、 ゲノム D N A、 ゲノム D N Aライブラリー、 前 記した細胞 ·組織由来の c D N A、 前記した細胞 ·組織由来の c D N A ライブラリ一、 合成 DN Aのいずれでもよい。
ライブラリーに使用するべクタ一は、 バクテリオファージ、 プラスミ ド、 コスミ ド、 ファージミ ドなどいずれであってもよい。 また、 前記し た細胞 '組織より total RN Aまたは mRN A画分を調製したものを用い て直接 Reverse Transcript ion Polymerase Chain React ion (以下、 RT - PCR 法と略称する） によって増幅することもできる。
. 本発明で用いられるタンパク質をコ一ドする DN Aとしては、例えば、 配列番号： 2、 配列番号： 4または配列番号： 6で表される塩基配列を 含有する DNA、 または配列番号： 2、 配列番号： 4または配列番号： 6で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイプリダイ ズする塩基配列を含有し、 前記した配列番号： 1、 配列番号： 3または 配列番号： 5で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に 同質の性質を有するタンパク質をコードする DNAであれば何れのもの でもよい。
配列番号 ： 2、 配列番号 ： 4または配列番号 ： 6で表される塩基配列 とハイストリンジェントな条件下でハイプリダイズできる DN Aとして は、 例えば、 配列番号： 2、 配列番号： 4または配列番号： 6で表され る塩基配列と約 5 0 %以上、 好ましくは約 6 0 %以上、 さらに好ましく は約 7 0 %以上、 より好ましくは約 8 0 %以上、 特に好ましくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有する塩基配列を含有 する D N Aなどが用いられる。
塩基配列の相同性は、 相同性計算アルゴリズム NCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool) を用い、 以下の条件 （期待値 =10； ギャップを許す； フィルタリ ング = 0N;マッチスコア =1；ミスマッチスコア =-3) にて計算すること ができる。
ハイプリダイゼーションは、 自体公知の方法あるいはそれに準じる方 法、 例えは、 Molecular Cloning 2nd (J. Saibrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行なうことができ る。 また、 市販のライブラリ一を使用する場合、 添付の使用説明書に記 載の方法に従って行うことができる。 より好ましくは、 ハイストリンジ ェントな条件に従って行うことができる。
ハイストリンジェントな条件とは、 例えば、 ナトリウム濃度が約 1 9 〜 40 mM、 好ましくは約 1 9〜 2 0 mMで、 温度が約 5 0〜 7 0 °C、 好ましくは約 6 0〜6 5°Cの条件を示す。 特に、 ナトリウム濃度が約 1 .9 mMで温度が約 6 5 °Cの場合が最も好ましい。
より具体的には、 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有する夕 ンパグ質をコードする DNAとしては、 配列番号： 2で表される塩基配 列を含有する DN Aなどが、 配列番号 ： 3で表されるアミノ酸配列を含 有するタンパク質をコードする DNAとしては、 配列番号 ： 4で表され る塩基配列を含有する DNAなどが、 配列番号 ： 5で表されるアミノ酸 配列を含有するタンパク質をコードする DN Aとしては、 配列番号 ： 6 で表される塩基配列を含有する DN Aなどが用いられる。
本発明で用いられる部分ペプチドをコードする DNAとしては、 前述 した本発明で用いられる部分べプチドをコードする塩基配列を含有する ものであればいかなるものであってもよい。 また、 ゲノム DNA、 ゲノ ム DN Aライブラリ一、 前記した細胞 ·組織由来の c DN A、 前記した 細胞'組織由来の c DNAライブラリー、合成 DN Aのいずれでもよい。 本発明で用いられる部分べプチドをコードする D N Aとしては、'例え ば、 配列番号： 2、 配列番号： 4または配列番号： 6で表される塩基配 列を含有する DNAの一部分を有する DNA、 または配列番号 ： 2、 配 列番号： 4または配列番号 ： 6で表される塩基配列とハイストリンジェ ントな条件下でハイプリダイズする塩基配列を含有し、 本発明のタンパ ク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質をコードする DNAの一 部分を含有する D N Aなどが用いられる。
配列番号： 2、 配列番号 ： 4または配列番号 ： 6で表される塩基配列 とハイブリダィズできる DNAは、 前記と同意義を示す。
ハイプリダイゼ一ションの方法およびハイストリンジェン卜な条件は 前記と同様のものが用いられる。
本発明で用いられるタンパク質、 部分ペプチド （以下、 これらをコー ドする DN Aのクロ一ニングおよび発現の説明においては、 これらを単 に本発明のタンパク質と略記する場合がある） を完全にコードする DN Aのクローニングの手段としては、 本発明のタンパク質をコードする塩 基配列の一部分を有する合成 DN Aプライマーを用いて P C R法によつ て増幅するか、 または適当なベクターに組み込んだ DN Aを本発明の夕 ンパク質の一部あるいは全領域をコードする DNA断片もしくは合成 D N Aを用いて標識したものとのハイプリダイゼ一ションによって選別す ることができる。 ハイブリダィゼーシヨンの方法は、 例えば、 Molecular Cloning 2ηα Ed (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行なうことができる。 また、 市販のラ ィブラリーを使用する場合、 添付の使用説明書に記載の方法に従って行 なうことができる。
DNAの塩基配列の変換は、 PCR、 公知のキッ ト、 例えば、
Mutan™-super Express Km (宝酒造 （株） ） 、 MutanTM- K (宝酒造 （株） ) 等を用いて、 ODA- UPCR法、 Gapped duplex法、 Kunkel法等の自体公知 の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行うことができる。
クローン化されたタンパク質をコードする DNAは目的によりそのま ま、 または所望により制限酵素で消化したり、 リンカ一を付加しだりし て使用することができる。 該 DNAはその 5 ' 末端側に翻訳開始コ ドン としての ATGを有し、 また 3 ' 末端側には翻訳終止コドンとしての T AA、 T GAまたは TAGを有していてもよい。 これらの翻訳開始コド ンゃ翻訳終止コドンは、 適当な合成 DN Aアダプターを用いて付加する こともできる。 '
本発明のタンパク質の発現ベクターは、 公知の方法、 例えば、 （i) 本 発明のタンパク質をコードする DN Aから目的とする DN A断片を切り 出し、 （ii) 該 DNA断片を適当な発現ベクター中のプロモ一ターの下 流に連結することにより製造することができる。 「HER2発現癌」 とは、 HER2 (好ましくは、 配列番号： 1、 配列番号： 3または配列番号 ： 5で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に 同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチド） が 発現している癌細胞であれば、 いずれの癌細胞でもよい。 例えば、 公知 の方法、遺伝子検出方法〔例、 FISH (fluorescence in situ hybridization method) 、 CISH (chromosome in situ hybridization method) 、 PCR (polymerase chain reaction method) 、 サザンブロット法など〕 、 メ ッセンジャー RNA検出方法 〔例、 RT- PCR (Reverse Transcriptase PCR) 、 ISH (in situ hybridization method) 、 ノーザンプロット法など〕 、 夕 ンパク質検出方法 〔例、 IHC (immuno-histo-cheinistry method) 、 ゥェ スタンブロッ 卜法、 ELISA (Enzyme - 1 inked immune so rbent assay) など 〕 などの方法で、 HER2遺伝子、 HER2のメッセンジャー RNA、 HER2タンパク 質が検出される癌細胞などが挙げられる。
エネルギー代謝 （好ましくは、 糖代謝など） を阻害する、 またはエネ ルギ一代謝阻害を模倣することにより、 HER2発現細胞の増殖が阻害され、 HER2の脱リン酸化が起こり、 または HER2のシグナルが阻害される。 「HER2 のシグナル」 としては、 例えば、 癌細胞の増殖シグナル、 抗アポト一シ スシグナル、 浸潤シグナル、 転移シグナルなどが挙げられる。
従って、 エネルギー代謝阻害剤およびエネルギー代謝阻害模倣剤は、 HER2発現癌の予防 ·治療薬として有用であり、 例えば、 癌 （例、 脳腫瘍、 下垂体腺腫、 神経膠腫、 聴神経鞘腫、 網膜肉腫、 甲状腺癌、 咽頭癌、 喉 頭癌、 舌癌、 胸腺腫、 中皮腫、 乳癌、 肺癌、 非小細胞肺癌、 小細胞肺癌、 胃癌、 食道癌、 十二指腸癌、 大腸癌、 結腸癌、 直腸癌、 肝臓癌、 肝細胞 癌、 膝癌、 塍内分泌腫瘍、 胆管癌、 胆嚢癌、 陰茎癌、 腎臓癌、 腎盂癌、 尿管癌、 腎細胞癌、 精巣腫瘍、 前立腺癌、 膀胱癌、 外陰癌、 子宮癌、 子 宮類部癌、 子宮体部癌、 子宮肉腫、 絨毛性疾患、 膣癌、 卵巣癌、 卵巣胚 細胞腫瘍、 皮膚癌、 悪性黒色腫、 菌状息肉症、 基底細胞腫、 軟部肉腫、 悪性リンパ腫、 ホジキン病、 骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、 白血病、 急性骨髄性白血病、 慢性骨髄性白血病、 急性リンパ性白血病、 慢性リン パ性白血病、 成人 T細胞白血病、 慢性骨髄増殖性疾患、 膝内分泌腫瘍、 線 維性組織球腫、 平滑筋肉腫、 横紋筋肉腫、 原発不明癌など、 好ましくは 乳癌など） 、 ァテローム性動脈硬化症、 血管新生 （例、 固形癌および肉 腫の成長にともなう血管新生、 腫瘍 転移にともなう血管新生、 および 糖尿病性網膜症にともなう血管新生など） 、 ウィルス性疾患 （例、 HIV 感染など） 、 関節リウマチなどの予防，治療薬などとして、 さらには、 癌の転移 ·再発抑制薬、 癌細胞のアポトーシス促進薬などとして安全な 医薬として使用することができる。
エネルギー代謝阻害剤およびエネルギー代謝阻害模倣剤は、 必要に応 じ、 常套手段に従って製剤化すればよい。
エネルギー代謝阻害剤およびエネルギー代謝阻害模倣剤は、 HER2発現 癌に対し、 より強い増殖阻害作用を示すことより、 例えば、 HER2が発現 しており、 糖代謝が亢進している患者に対し、 HER2発現癌の予防 ·治療 のために投与されることにより、 優れた臨床効果を示す。 この結果、 不 必要な投薬を減らし、 副作用の危険を減弱するとともに、 該患者に対す る治療効果を上げることができる。
HER2が発現しており、 糖代謝が亢進している患者としては、 例えば、 HER2 (好ましくは、 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしく は実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分べ プチド） が発現しており、 公知の方法で糖代謝が亢進していると判断さ れる患者、 例えば PET (Pos i t ron Em i s s i on Tomography) により癌の存在 が認識される患者、 血管造影、 MRI (magne t i c resonance iiage ing) な どの方法で癌への血流が認識される患者などが挙げられる。
エネルギー代謝阻害剤およびエネルギー代謝阻害模倣剤は、 ホルモン 療法剤、 抗癌剤 （例、 化学療法剤、 免疫療法剤、 または細胞増殖因子な らびにその受容体の作用を阻害する薬剤） など （以下、 併用薬物と略記 する） と併用して使用することができる。
「ホルモン療法剤」 としては、 例えば、 ホスフェストロール、 ジェチ ルスチルベストロール、 クロロトリア二セン、 酢酸メドロキシプロゲス テロン、酢酸メゲストロール、酢酸クロルマジノン、酢酸シプロテロン、 ダナゾ一ル、 ジエノゲスト、 ァソプリスニル、 ァリルエストレノール、 ゲストリノン、 ノメゲストロール、 夕デナン、 メパルトリシン、 ラロキ シフェン、 オルメロキシフェン、 レポルメロキシフェン、 抗エストロゲ ン （例、 クェン酸夕モキシフェン、 クェン酸トレミフェン等） 、 ERダウ ンレギユレ一夕一 （例、 フルべストラント等） 、 ヒト閉経ゴナドトロピ ン、卵胞刺激ホルモン、 ピル製剤、 メピチォスタン、 テストロラク トン、 アミノグルテチイミ ド、 LH-RHァゴニスト （例、 酢酸ゴセレリン、 ブセレ リン、 リュープロレリン等） 、 ドロロキシフェン、 ェピチォス夕ノール、 スルホン酸ェチニルエストラジオール、 ァロマターゼ阻害薬 （例、 塩酸 フアドロゾール、 アナストロゾ一ル、 レトロゾ一ル、 ェキセメスタン、 ポロゾ一ル、 フオルメスタン等) 、 抗アンドロゲン （例、 フルタミ ド、 ビカルタミ ド、 ニル夕ミ ド等） 、 5 α -レダクターゼ阻害薬 （例、 フイナ ステリ ド、 デュタステリ ド、 エブリステリ ド等） 、 副腎皮質ホルモン系 薬剤 （例、 デキサメタゾン、 プレドニゾロン、 ベタメタゾン、 トリアム シノロン等） 、 アンドロゲン合成阻害薬 (例、 アビラテロン等) 、 レチ ノイ ドおよびレチノイ ドの代謝を遅らせる薬剤 （例、 リアロゾール等） などが挙げられる。 LH- RHァゴニスト （例、 酢酸ゴセレリン、 ブセレリン 、 リュープロレリン等） が好ましい。
「化学療法剤」 としては、 例えばアルキル化剤、 代謝拮抗剤、 抗癌性 抗生物質、 植物由来抗癌剤などが挙げられる。
「アルキル化剤」 としては、 例えば、 ナイ トロジェンマスタード、 塩 酸ナイ トロジェンマスタ一ド- Ν-ォキシド、 ク口ラムブチル、 シクロフォ スフアミ ド、 ィホスフアミ ド、 チォテパ、 カルボコン、 トシル酸インプ ロスルファン、 ブスルファン、 塩酸二ムスチン、 ミ トプロニトール、 メ ルファラン、 ダカルバジン、 ラニムスチン、 リン酸エストラムスチンナ トリウム、 トリエチレンメラミン、 カルムスチン、 口ムスチン、 ストレ プトゾシン、 ピポブロマン、 ェトグルシド、 カルポプラチン、 シスブラ チン、 ミポプラチン、 ネダプラチン、 ォキサリブラチン、 アルトレタミ ン、 アンバムスチン、 塩酸ジブロスピジゥム、 フォテムスチン、 プレド 二ムスチン、 プミテパ、 リポムスチン、 テモゾ口ミ ド、 トレオスルファ ン、 卜口フォスフアミ ド、 ジノス夕チンスチマラマー、 アドゼレシン、 システムスチン、 ビゼレシンなどが挙げられる。
「代謝拮抗剤」 としては、 例えば、 メルカプトプリン、 6-メルカプト プリンリボシド、 チオイノシン、 メ ト トレキサート、 エノシ夕ビン、 シ 夕ラビン、 シ夕ラビンォクフォスフアート、 塩酸アンシ夕ビン、 5-FU系 薬剤 (例、 フルォロウラシル、 テガフール、 UFT、 ドキシフルリジン、 力 ルモフール、 ガロシ夕ビン、 エミテフール等） 、 アミノプテリン、 ロイ コポリンカルシウム、タブロイ ド、 ブトシン、 フオリネィ トカルシウム、 レポフオリネイ トカルシウム、 クラドリビン、 エミテフール、 フルダラ ビン、 ゲムシ夕ビン、 ヒドロキシカルバミ ド、 ペントス夕チン、 ピリ ト レキシム、 イ ドキシゥリジン、 ミ トグァゾン、 チアゾフリン、 アンバム スチンなどが挙げられる。
「抗癌性抗生物質」 としては、 例えば、 ァクチノマイシン D、 ァクチノ マイシン C、マイ トマイシン C、クロモマイシン A3、塩酸ブレオマイシン、 硫酸ブレオマイシン、 硫酸べプロマイシン、 塩酸ダウノルビシン、 塩酸 ドキソルビシン、 塩酸アクラルビシン、 塩酸ピラルビシン、 塩酸ェピル ビシン、 ネオカルチノスタチン、 ミスラマイシン、 ザルコマイシシ、 力 ルチノフィ リン、 ミ トタン、 塩酸ゾルビシン、 塩酸ミ トキサントロン、 塩酸ィダルビシンなどが挙げられる。
「植物由来抗癌剤」 としては、 例えば、 エトポシド、 リン酸エトポシ ド、 硫酸ビンブラスチン、 硫酸ビンクリスチン、 硫酸ビンデシン、 テニ ポシド、 パクリ夕キセル、 ドセタクセル、 ビノレルピンなどが挙げられ る。
「免疫療法剤 （BRM) 」 としては、 例えば、 ピシバニ一ル、 クレスチン 、 シゾフィラン、 レンチナン、 ウベニメクス、 インターフェロン、 イン 夕一ロイキン、 マクロファージコロニー剌激因子、 顆粒球コロニー刺激 因子、 エリスロポイエチン、 リンホトキシン、 BCGワクチン、 コリネバク テリゥムパルブム、 レバミゾール、 ポリサッカライ ド K、 プロコダゾール などが挙げられる。
「細胞増殖因子ならびにその受容体の作用を阻害する薬剤」 における 「細胞増殖因子」 としては、 細胞の増殖を促進する物質であればどのよ うなものでもよく、 通常、 分子量が 20， 000以下のペプチドで、 受容体と の結合により低濃度で作用が発揮される因子が用いられ、 具体的には、 (1) EGF (epidermal growth factor) またはそれと実質的に同一の活性 を有する物質 〔例、 EGF、 ハレダリン （HER2リガンド） 等〕 、 （2) イン シュリンまたはそれと実質的に同一の活性を有する物質 〔例、 インシュ リ ,IGF( insulin-like growth factor) - 1、 IGF- 2等〕、（3)FGF(f ibroblast growth factor) またはそれと実質的に同一の活性を有する物質 〔例、 酸 性 FGF、 塩基性 FGF、 KGF (kerat inocyte growth factor) 、 FGF-10等〕 、 (4) その他の細胞増殖因子 〔例、 CSF (colony stimulating factor) 、 EPO (erythropoietin)、 IL-2 ( interleukin-2)、 NGF (nerve growth factor) 、 PDGF (platelet-derived growth factor)、 TGF β ( t ransf orming growth factor j6 ) 、 HGF (hepatocyte growth factor)、 VEGF (vascular endothelial growth factor)等〕 などが挙げられる。
「細胞増殖因子の受容体」 としては、 前記の細胞増殖因子と結合能を 有する受容体であればいかなるものであってもよく、 具体的には、 ' EGF 受容体、 ハレダリン受容体 （HER2) 、 インシュリン受容体、 IGF受容体、 FGF受容体 _1または F GF受容体- 2などが挙げられる。
「細胞増殖因子の作用を阻害する薬剤」 としては、 トラスッズマブ （ ハーセプチン （商標） ； HER2抗体） 、 メシル酸ィマチニブ、 ZD1839また はセツキシマブ、 VEGFに対する抗体 （例、 べバシツマブ） 、 VEGF受容体 に対する抗体、 ゲフイチニブ、 エル口チニブなどが挙げられる。
前記の薬剤の他に、 L-ァスパラギナーゼ、 ァセグラトン、 塩酸プロ力 ルバジン、 プロトポルフィ リン · コバルト錯塩、 水銀へマトボルフイリ ン -ナトリウム、 トポイソメラーゼ I阻害薬 （例、 イリノテカン、 トポテ カン等） 、 トポイソメラーゼ I I阻害薬 （例えば、 ソブゾキサン等） 、 分 化誘導剤 （例、 レチノイ ド、 ビタミン D類等） 、 血管新生阻害薬 （例、 サ リ ドマイ ド、 SU 11248等） 、 α —ブロッカー （例、 塩酸夕ムス口シン、 ナ フトピジル、 ゥラピジル、 アルフゾシン、 テラゾシン、 プラゾシン、 シ ロドシン等） 、 セリン ·スレオニンキナーゼ阻害薬、 エンドセリン受容 体拮抗薬 （例、 アトラセンタン等） 、 プロテアゾーム阻害薬 （例、 ポル テゾミブ等） 、 Hsp90阻害薬（例、 17- AAG等）、 スピロノラクトン、 ミノキ シジル、 11 ひーヒドロキシプロゲステロン、 骨吸収阻害 ·転移抑制薬（ 例、 ゾレドロン酸、 アレンドロン酸、 パミ ドロン酸、 ェチドロン酸、 ィ バンドロン酸、 クロドロン酸）なども用いることができる。
. 前記した.中でも、 併用薬物としては、 LH- RHァゴニスト （例、 酢酸ゴセ レリン、 ブセレリン、 リュープロレリン等） 、 トラスッズマブ （HER2抗 体） などが好ましい。
エネルギー代謝阻害剤と併用薬物の投与時期は限定されず、 これらを 投与対象に対し、 同時に投与してもよいし、 時間差をおいて投与しても よい。 投与量は、 臨床上用いられている用量を基準として適宜選択する ことができる。また、上記エネルギー代謝阻害剤と併用薬物の配合比は、 投与対象、 投与ルート、 対象疾患、 症状、 組み合わせ等に応じて適宜選 択することができる。
( 2 ) 試験化合物を細胞に接触させ、 細胞内のエネルギー代謝を測定す る、 HER2発現癌の予防，治療薬のスクリーニング方法
本発明はまた、 別の局面において、 試験化合物を細胞に接触させ、 細 胞内のエネルギー代謝を測定することを特徴と.する H E R 2発現癌の予 防 ·治療薬のスクリ一ニング方法'を提供する。'
試験化合物を接触させる 「細胞」 としては、 例えば、 動物細胞、 昆虫 細胞などが用いられる。 好ましくは、 動物細胞、 好ましくはヒト培養癌 細胞などが用いられる。
動物細胞としては、 例えば、 サル細胞 COS- 7、 Vero、 チャイニーズハム ス夕一細胞 CH0、 dhfr遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞 CH0、 マウ ス L細胞、マウス ΑΠ- 20細胞、マウスミエローマ細胞、マウス ATDC5細胞、 ラット GH3細胞、 ヒト FL細胞、 ヒト培養癌細胞 〔例、 ヒト乳癌細胞 （例、 BT-474, SK- BR- 3など） 、 ヒト肺癌細胞 （例、 A549など） 、 ヒト大腸癌細 胞 （例、 HT- 29、 HCT- 116など） 、 ヒト塍癌細胞 （例、 AsPC- 1、 MIA-PaCa-2 など） 、 ヒト卵巣癌細胞 （例、 0V-CAR- 3、 CaOV- 3など） 、 ヒト腎臓癌 （ 例、 ACHNなど） など〕 などが用いられる。
昆虫細胞としては、 例えば、 夜盗蛾の幼虫由来株化細胞 （Spodoptera frugiperda cell ； Si細胞） 、 Tr ichoplus ia niの中腸由来の MG1細胞、 Trichoplusia niの卵由来の High FiveTM細胞、 Ma estra brassicae由来 の細胞、 Estigmena acrea由来の細胞、蚕由来株化細胞（Bombyxmori N 細 胞 ； BmN細胞） などが用いられる。 該 Sf細胞としては、 例えば、 Sf9細胞 (ATCC CRL1711) 、 S 1細胞 （以上、 In Vivo, 13, 213-217, (1977) ) な どが用いられる。
上記動物細胞を培養する際、 培地としては、 例えば、 約 5〜20%の眙児 牛血清を含む MEM培地 CScience, 122巻, 501 (1952)〕， MEM培地 [Virology, 8 巻， 396 (1959)〕 ， RPMI 1640培地 CThe Journal of the American Medical Association 199巻， 519 (1967)〕 ， 199培地 [Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73巻， 1 (1950)〕 などが用いられる。 pHは 約 6〜8であるのが好ましい。 培養は通常約 30°C〜40°Cで約 15〜60時間行 ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。 - 上記昆虫細胞を培養する際、 培地としては、 Grace' s Insect Medium (Grace, T. C. C.， Nature, 195, 788 (1962)) に非動化した 10 %ゥシ血清等 の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。 培地の pHは約 6.2〜6.4が 好ましい。 培養は通常約 27°Cで約 3〜5日間行ない、 必要に応じて通気や 撹拌を加える。
試験化合物としては、 例えば、 合成化合物、 ペプチド、 タンパク質、 抗体、 非ペプチド性化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動 物組織抽出液、 血漿などが用いられる。 スクリ一二ングの例として、 以下の方法などが挙げられる。
(i) (a) HER2発現細胞を培養した場合と （b) 試験化合物存在下、 HER2 発現細胞を培養した場合のエネルギー代謝阻害活性をそれぞれ測定し、 比較することにより、 エネルギー代謝阻害活性を有する化合物を選択す る。
(i-1) 具体例として、 （a-1) HER2発現細胞を培養した場合と （b-l
)試験化合物存在下、 HER2発現細胞を培養した場合の細胞内 ATP量をそれ ぞれ測定し、 比較する方法などが挙げられる。
細胞内 ATP量の測定は、 公知の方法、 例えば、 蛍光 ATP測定法 （Journal of I匪 unologycal Methds. 160巻、 8卜 88頁、 1993年） またはそれに準ず る方法などを用いる。
(i-2) 具体例として、 （a- 2) HER2発現細胞を培養した場合と （b - 2
) 試験化合物存在下、 HER2発現細胞を培養した場合のミ トコンドリア酸 化還元活性をそれぞれ測定し、 比較する方法などが挙げられる。
ミ トコンドリア酸化還元活性の測定は、 公知の方法、 例えば、 MTT測定 法 （Journal of Immunologycal Methds. 65巻、 55-63頁、 1983年） また はそれに準ずる方法などを用いる。
HER2発現細胞および HER2非発現細胞は、 約 1, 000〜100， 000個 Zゥェル で播種し、 約 24〜120時間培養する。
HER2発現細胞としては、 例えば、 上記 「HER2発現癌」 細胞などが用い られる。
例えば、 上記 （b) の場合におけるエネルギー代謝阻害活性が、 上記 （ a) の場合におけるエネルギー代謝阻害活性に比べて、 約 20%以上、 好ま しくは 30%以上、 より好ましくは約 50%以上阻害させる化合物を、 エネ ルギ一代謝阻害活性を阻害する化合物として選択する。
上記培養の際、 培養液のグルコース濃度を減じて行ってもよく、 酸素 濃度を減じて行ってもよい。
さらに、 上記 （i) で得られた化合物については、 （c) HER2非発現細 胞を培養した場合と （d) 該化合物存在下、 HER2非発現細胞を培養した場 合の細胞増殖活性をそれぞれ測定し、 比較することにより、 非特異的な 増殖阻害作用を有する化合物を除いてもよい。 例えば、 上記 （d) の場合 における細胞増殖活性が、 上記 （c) の場合における細胞増殖活性に比べ て、 約 20%以上、 好ましくは 30%以上、 より好ましくは約 50%以上減少 させる試験化合物を、 HER2発現細胞に選択的に増殖阻害作用を有する化 合物として選択する。
細胞増殖は、 公知の方法、 例えば、 Sulphorhodamine- B (SRB) 色素染 色法 （Journal of National Cancer Institute. 82巻， 1107- 1112頁， 1990 年）、 BrdU 取込み ELISA法（Journal of Immunology Methods. 85巻、 169 - 179 頁、 1985年） などを用いて測定する。
HER2発現細胞および HER2非発現細胞は、 約 1， 000〜100， 000個 Zゥェル で播種し、 約 24〜120時間培養する。
HER2発現細胞と.しては、 例えば、 上記 「HER2発現癌」 細胞などが用い られる。
(ii) (e) HER2発現細胞を培養した場合と （f) 試験化合物存在下、 HER2 発現細胞を培養し 場合の、 AMPKタンパク質の活性をそれぞれ測定し、 比較することにより、 AMPKタンパク質を活性化する化合物 （エネルギー 代謝阻害の模倣剤） を選択する。
(ii-1) 具体例として、 （e-1) HER2発現細胞を培養した場合と （f-1) 試験化合物存在下、 HER2発現細胞を培養した場合の、 AMPKタンパ夕質の リン酸化をそれぞれ測定し、 比較する方法が挙げられる。
(ii- 2) 具体例として、 （e- 2) HER2発現細胞を培養した場合と （f - 2) 試験化合物存在下、 HER2発現細胞を培養した場合の、 AMPKの基質タンパ ク質のリン酸化をそれぞれ測定し、 比較する方法が挙げられる。
AMPKの基質タンパク質としては、 p70 S6Kタンパク質、 ACCタンパク質 などが挙げられる （Journal of Cell Science. 117巻、 5479- 5487頁、 2004 年） 。
AMPKタンパク質のリン酸化、 および AMPKの基質タンパク質のリン酸化 の検出は、 公知の方法に従って行う。 例えば、 培養後、 SDSサンプルバッ ファーを直接、 または抽出操作 （例、 RIPA緩衝液などを用いた抽出など ) 後に添加し、 細胞を溶解する。 得られた細胞溶解液を SDS- PAGE法にて 分離し、 リン酸化 AMPKタンパク質に特異的な抗体、 または AMPKの基質夕 ンパク質のリン酸化に特異的な抗体などを用いてウエスタンプロッティ ング法を行う。
HER2発現細胞は、 約 1, 000〜100， 000個/ゥエルで播種し、 約 2〜24時間 培養する。
HER2発現細胞としては、 例えば、 上記 「HER2発現癌」 細胞などが用い られる。
例えば、 上記 （ί) の場合における AMPKタンパク質の活性が、 上記 （e ) の場合における AMPKタンパク質の活性に比べて、 約 20 %以上、 好まし くは 30 %以上、 より好ましくは約 50 %以上亢進させる化合物を、 AMPK夕 ンパク質を活性化する化合物 （エネルギー代謝阻害の模倣剤） として選 択する。
上記 （i) および （i i ) で得られる化合物は、 エネルギー代謝阻害活性 、 またはエネルギー代謝阻害を模倣する活性 （例、 AMPK活性化作用） を 有し、 HER2発現細胞に選択的な増殖阻害作用を有するため、 HER2発現癌 に特異的で安全な低毒性の化合物である。 従って、 例えば、 ヒ卜または 温血動物 （例えば、 マウス、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ゥ マ、 トリ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 チンパンジーなど） に対して経口的にま たは非経口的に HER2発現癌の予防 ·治療薬として、 投与することができ る。
該化合物またはその塩の投与量は、 その作用、 対象疾患、 投与対象、 投与ルートなどにより差異はあるが、 例えば、 乳癌の治療の目的で該化 合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重 60kgとして）においては、 一日につき該化合物またはその塩を約 0. l〜100mg、 好ましくは約 1. 0〜 50mg、 より好ましくは約 1. 0〜20mg投与する。非経口的に投与する場合は 、 該化合物またはその塩の投与量は投与対象、 対象疾患などによっても 異なるが、 例えば、 乳癌の治療の目的で該化合物を注射剤の形で通常成 人 （体重 60kgとして） に投与する場合、 一日につき該化合物またはその 塩を約 0. 0 1〜30mg、好ましくは約 0. l〜20mg、より好ましくは約 0. 1〜 10mg を癌病変部に注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、 体重 60kg当たりに換算した量を投与することができる。
( 3 ) エネルギー代謝を阻害またはエネルギー代謝の阻害を模倣するこ とを特徴とする H E R 2発現癌の予防 ·治療方法
本発明はまた、 別の局面において、 細胞のエネルギー代謝を阻害また はエネルギー代謝の阻害を模倣することを特徴とする H E R 2発現癌の 予防，治療方法を提供する。
細胞のエネルギー代謝には、 A T P産生、 トランスポーター、 A M P 活性化プロティンキナーゼなどが直接または間接的に関与しており、 し たがって、 「エネルギー代謝を阻害すること」 としては、 典型的には、 例えば、 A T P産生を阻害すること、 トランスポーター活性を阻害する ことなどが含まれる。
好ましい態様では、 エネルギー代謝は、 A T P産生に直接関与するも のであり、 これは例えば、糖代謝に関するものである。糖代謝としては、 ミ トコンドリア活性に関するもの、 および解糖系に関するものが含まれ る。 ミ トコンドリア活性には、 電子伝達系が関与するもの、 および T C A回路が関与するものが含まれる。 また、 電子伝達系が関与するものと しては、 呼吸鎖複合体 I 、 I I 、 I I I 、 I V、 および Vから選ばれる 少なくとも一種が関与するものが挙げられる。
また、 エネルギー代謝の阻害を模倣することには、 細胞のエネルギー 代謝を直接阻害することなく、 エネルギー代謝の阻害状態または飢餓状 態により生じる細胞の生理反応 （例、 タンパク質のリン酸化および脱リ ン酸化、 活性酸素産生量の変動、 酵素活性の変動、 mRNA転写 · 翻訳の変 動、 タンパク質分解および合成の変動など） を、 例えば、 合成化合物、' ペプチド、 タンパク質、 抗体、 非ペプチド性化合物、 発酵生産物、 細胞 抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液、 血漿などの作用により誘導する ことが含まれる。 好ましい例としては、 AMP活性化プロテインキナー ゼを活性化する作用を有する物質を細胞または被験体に投与することに よって、 AMP活性化プロティンキナーゼを活性化することが挙げられ る。
上記本発明の HE R 2発現癌の予防 ·治療方法は、 例えば、 上記 （ 1 ) に記載したエネルギー代謝阻害剤またはエネルギー代謝阻害模倣剤の 有効量を被験体 （例えば、 哺乳動物、 好ましくは、 ヒト） に対して投与 することを含む。 あるいは、 例えば、 上記 （2) に記載したスクリー二 ング方法によって得られた化合物の有効量を被験体（例えば、哺乳動物、 好ましくは、 ヒト） に投与することを含む。 しかしながら、 本発明の範 囲は、 これらの特定の態様に限定されず、 細胞内のエネルギー代謝を直 接または間接的に阻害する作用を奏する任意の化合物または条件を目的 の細胞に提供することによって、 該細胞のエネルギー代謝を阻害するこ ともまた、 本発明の範囲内である。 本明細書および配列表において、 塩基やアミノ酸などを略号で表示す る場合、 IUPAC-IUB Commission on Biochemical Noienclature による略 号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、 その例を下 記する。 またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、 特に明示し なければ L体を示すものとする。
DN A ： デォキシリポ核酸
c DNA ：相補的デォキシリポ核酸
A ： アデニン
T ： チミン
G ： グァニン
C ： シ卜シン
RNA ： リポ核酸
mRNA ： メッセンジャーリボ核酸 d AT P ： デォキシアデノシン三リン酸 d TTP ： デォキシチミジン三リン酸
d GT P ： デォキシグアノシン三リン酸 d CTP ： デォキシシチジン三リン酸
ATP ： アデノシン三リン酸
EDTA ： エチレンジァミン四酢酸
. S D S ： ドデシル硫酸ナトリウム
G 1 y ： グリシン
A 1 a ： ァラニン
V 1 ： ノ リン
L e u ： ロイシン
l i e ： ィソロイシン
S e r ： セリン
T h r ： スレオニン
C y s ： システィン
M e t ： メチォニン
G 1 u ： ダルタミン酸
A s p ： ァスパラギン酸
L y s ： リジン
A r g ： アルギニン
' H i s ： ヒスチジン
P h e ： フエ二ルァラニン
T y r ： チロシン
T r ρ ： トリブトファン
P r o ： プロリン
A s n ： ァスパラギン
G i n ： ダルタミン
p G 1 u ： ピロダルタミン酸
S e c ： セレノシスティン elenocysteine) 本願明細書の配列表の配列番号は、 以下の配列を示す。
〔配列番号： 1〕
ヒト HER2のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 2〕
ヒト HER2をコードする cMAの塩基配列を示す。
.〔配列番号： 3〕
マウス HER2のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 4〕
マウス HER2をコードする cMAの塩基配列を示す。
〔配列番号： 5〕
ラット HER2のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号 ： 6〕
ラッ ト HER2をコードする cMAの塩基配列を示す。 実施例
本発明は、 以下の実施例に限定されるものではない。 実施例 1
エネルギー代謝阻害による HER2発現細胞の増殖阻害
ヒト HER2発現細胞として BT- 474乳癌細胞 （ATCCより購入） を、 HER2非 発現細胞として MDA-MB-231乳癌細胞 （ATCCより購入） を用いた。 これら 細胞を 96穴マルチウエルプレートに播種 （BT-474 : 3. 0 x 104細胞/ゥェ ル、 MDA-MB-231： 1. 5 x 104細胞/ゥエル） し、 炭酸ガスインキュベータ ― ( 5% C02、 37°C ) 中で一夜培養した。 ミ トコンドリア呼吸鎖複合体阻 害化合物 （複合体 I： ロテノン） を終濃度 10 mol/L から 4倍の希釈列で 10段階を添加し、 さらに 5日間培養した。 培養後、 ロテノンを含む培養液 を除き、 リン酸緩衝液で細胞を洗浄、 5%トリクロ口酢酸溶液で固定後、 0. 4% (W/V) Su lphorhodamine-B (SRB) 色素溶液 （1% 酢酸に溶解） を加 え、 細胞タンパク質を染色した。 その後、 プレートから SRB色素溶液を除 き、 1% 酢酸溶液にて洗浄した後、 IOO Lの lOmM トリス緩衝溶液を加え て色素を抽出溶解し、 吸収波長 550nmの吸光度を測定し、 タンパク質量と して細胞量を測定した （Journal of National Cancer Institute. 82巻， 1107- 1112頁， 1990年） 。 ロテノンを加えないゥエル （対照） の吸光度を 100%とした時に、 ロテノンを添加したゥエルの吸光度の割合を求め、 残 存細胞量を対照の 50%に抑制するのに必要な化合物濃度 （IC5Q) 値を算 出した。
その結果、 BT - 474細胞での IC5。値は 0.004 mol/L、 MDA- MB-231細胞で の IC5。値は 0.5 xmol/Lであった。
これより、 ロテノンが、 ΗΕΠ非発現 MDA- MB-231細胞に比べ、 HER2発現 BT-474細胞の増殖をより強く抑制することがわかる。 よって、 ミ トコン ドリアの活性阻害による細胞のエネルギー代謝阻害が、 HER2発現細胞に 選択的な細胞増殖阻害を示すことが明らかとなった。 実施例 2
エネルギー代謝阻害による HER2シグナル抑制
ヒト HER2発現ヒト乳癌細胞株である BT- 474 (American Tissue Culture Collection(ATCC)より購入）を 24穴マルチウエルプレートに播種（BT-474 ： 1.2 X 105細胞/ゥエル） し、 炭酸ガスインキュベーター （5% C02、 37 °C) 中で一夜培養した。 ミ トコンドリア呼吸鎖複合体阻害化合物 （複合 体 I： ロテノン、 複合体 III： アンチマイシン、 複合体 V： オリゴマイシン ：和光純薬） を終濃度 1 mol/L から 4倍の希釈列で 5段階を添加し培養 を続けた。 2時間後に培養液を除き、 SDSサンプルバッファー （200 L) で細胞を溶解した。 ウェスタンブロッテイング解析を以下のようにして 行った。 すなわち、 この細胞溶解液 を SDS-PAGE法 （ゲル濃度： 7.5-15%) にて分離し (Analytical Biochemistry, 166号、 368- 379頁、 1987年） 、 ニトロセルロース膜 （BioRad社製） にトランスファー後、 リ ン酸化 HER2に特異的な抗体 （Cell signaling technology社製、 コード番 号 2244) 、下流抗アポト一シスシグナル伝達分子 Aktに特異的な抗リン酸 化 Akt抗体 （Cell signaling technology社製、 コード番号 9271) および 下流増殖シグナル伝達分子 MAPKに特異的な抗リン酸化 MAPK抗体 （Cell signaling technology社製、 コード番号 9101) を用いて、 ECレンステム （ アマシャム） にて、 抗体を検出し、 画像解析によりリン酸化タンパク質 量として定量した。
HER2のリン酸化は、 溶媒対照群の BT- 474細胞で顕著に検出された。 こ のときロテノン、 アンチマイシンおよびオリゴマイシンによって、 HER2 のリン酸化抑制が認められた。 また、 これに伴い、 Aktおよび MAPKのリン 酸化抑制も認められた。
これより、 ミ トコンドリァの活性阻害による細胞内エネルギー代謝の 阻害は、 HER2のリン酸化を抑制し、 HER2の下流シグナルを抑制すること が明らかとなった。.実施例 1の結果と併せ、 エネルギー阻害による HER2 発現細胞の増殖阻害に、 HER2が関与することが明らかである。 実施例 3
好気的代謝の抑制 （酸素供給抑制） による HER2リン酸化抑制
ヒト HER2発現ヒト癌細胞株 BT-474 (ATCCより購入） を 24穴マルチゥェ ルプレートに播種 （1.2 X 105細胞/ゥエル） し、 炭酸ガスインキュベー 夕一 （20% 02、 5% C02、 37°C) 中で一夜培養した。 プレートは炭酸ガス インキュベータ一 （7% 02、 5% COい 37°C) へ移し、 ゥエルに SDSサンプ ルバッファー （200 L) を経時的に加え、 細胞を溶解した。 この細胞溶 解液 （8 xL) を SDS- PAGE法 （ゲル濃度： 7.5- 15%) にて分離した （Shagger et al. , Analytical Biochemistry, 166号、 368 - 379頁、 1987年) 。 次に 、 実施例 1 と同様の方法でウェス夕ンブロッテ'イング解析を行ない、 リ ン酸化 HER2、 リン酸化 Aktおよびリン酸化 MAPKを検出した。
図 1に示すように、 通常の培養条件（20% 02、 5% C02、 37°C)では BT- 474 細胞の HER2リン酸化は顕著であつたが、 低酸素処理 （7% 02、 5% C02、 37 °C) により、 時間依存的な HER2のリン酸化抑制が認められた。 これより、 低酸素によるエネルギー代謝の阻害により、 HER2のリン酸 化が抑制されることが明らかになった。 実施例 4
グルコースの利用阻害による HER2リン酸化抑制
HER2発現ヒト癌細胞株である SK- BR- 3 (ATCCより購入） を 24穴マルチウ ： ルプレー卜に播種 （4. 0 X 105細胞/ゥエル） し、 炭酸ガスインキュべ 一夕一 （5% C02、 37°C ) 中で一夜培養した後、 含有するグルコース量を 0. lmg/mLとした培地に置換し、 さらに 2時間培養した。 グルコース代謝拮 抗剤である 2-デォキシグルコースを終濃度が 5mg/mLとなるよう添加し、 2 時間後に培養液を除き、 SDSサンプルバッファー （200 ^ L) で細胞を溶解 した。 この細胞溶解液 を SDS- PAGE法 （ゲル濃度： 7. 5-15%) にて 分離した (Shagge r. e t al. , Analyt ical B iochemi s t ry, 166号、 368-379 頁、 1987年） 。 次に、 実施例 1と同様の方法でウエスタンブロッテイン グ解析を行ない、 リン酸化 HER2、 リン酸化 Aktおよびリン酸化 MAMを検出 した。
2 -デォキシグルコース未添加の SK- BR-3細胞 （対照） での HER2、 Aktお よび MAPKのリン酸化は顕著であり、 2-デォキシグルコースの添加によつ て、 各タンパク質のリン酸化が抑制された。
これより、 解糖系の阻害によるエネルギー代謝の阻害により、 HER2の リン酸化、およびその下流シグナルが抑制されることが明らかになった。 実施例 5
AMPK活性化による HER2リン酸化抑制
AMPKは、 細胞内のエネルギー代謝のセンサー'として働き、 エネルギー 代謝が阻害される （ADP/ATP比が増加する） ことにより活性化されること が知られている。 AMPKの活性化 （エネルギー代謝の阻害を模倣する） に よる HER2のリン酸化およびそのシグナルが抑制されるか否かを、 以下の ように調べた。 ヒト HER2発現ヒト癌細胞株 BT-474 (ATCCより購入） を 24穴マルチゥェ ルプレートに播種 （1.2 x 105細胞/ゥエル） し、 炭酸ガスインキュベー 夕一 （20% 02、 5¾ C02、 37°C) 中で一夜培養した。 AMPKを活性化するメ トフオルミン （The Journal of Biological Chemistry, 279巻、 42号、 43940- 43951頁、 2004年） を終濃度 15minol/L から 3倍の希釈列で 5段階を 添加し、 培養を続けた。 2時間後に培養液を除き、 SDSサンプルバッファ 一 (200 D で細胞を溶解した。 この細胞溶解液 （8 L) を SDS - PAGE法 (ゲル濃度： 7.5-15%) にて分離した （Analytical Biochemistry, 166 号、 368- 379頁、 1987年） 。 次に、 実施例 1と同様の方法でウェスタンブ ロッテイング解析を行ない、 リン酸化 HER2、 リン酸化 Aktおよびリン酸化 MAPKを定量した。
HER2のリン酸化は、 溶媒対照群の BT- 474細胞では顕著に検出され、 メ トフオルミンの添加によって、 濃度依存的な HER2のリン酸化抑制が認め られた。 また、 これに伴い、 Aktおよび MAPKのリン酸化抑制も認められた 。
このように、 エネルギー代謝が阻害されている状態を模倣する、 AMPK の活性化により、 HER2のリン酸化およびその下流シグナルが抑制される ことが明らかになった。 実施例 6
エネルギー代謝阻害と AMPK活性化— HER2リン酸化抑制との相関一
ヒト HER2発現ヒト乳癌細胞株である BT- 474 (American Tissue Culture Collection (ATCC) より購入） を 24穴マルチウエルプレートに播種
(BT-474: 1.2 X 105細胞/ゥエル）し、炭酸ガスィンキュベー夕一（5% C02、 37°C ) 中で一夜培養した。 ミ トコンドリァ呼吸鎖複合体 I阻害化合物ロテ ノン （和光純薬） を終濃度 1、 0.333、 0. 111、 033.および 0. Oll mol/L の 5段階で添加し、 培養を続けた。 2時間後に培養液を除き、 SDSサンプル バッファー （200 zL) で細胞を溶解した後、 この細胞溶解液を用い、 ゥ エスタンブロッテイング解析を行った。 すなわち、 この細胞溶解液 （8 til) を SDS- PAGE法 （ゲル濃度： 7.5- 15%) にて分離し （Analytical Biochemistry, 166号、 368- 379頁、 1987年)、二トロセルロース膜 (Bio ad 社製） にトランスファ一後、 リン酸化 HER2に特異的な抗体 （Cell signaling technology社製、 コード番号 2244) 、 AMPKに特異的な AMPK抗 体 （Cell signaling technology社製、 コード番号 2535) およびリン酸化 AMPKに特異的な抗リン酸化 AMPK抗体 (Cell signaling technology社製、 コード番号 2532) を用い、 ECLシステム （アマシャム） にて、 抗体を化学 発光検出し、 LAS-1000 plus 画像解析装置 （富士写真フィルム） により リン酸化タンパク質量として定量した。
HER2のリン酸化は、 溶媒対照群の BT- 474細胞で顕著に検出され、 ロテ ノンの添加により用量依存的に減少した。 このとき、 AMPKが活性化して いることを示す AMPKリン酸化量が、 HER2のリン酸化量とは逆に、 用量依 存的に増加した。 またこのとき、 AMPKのタンパク質量自身に量的な変化 は観察されなかった。
実施例 2の結果と併せ、 細胞内エネルギー代謝の阻害により AMPKがリ ン酸化されるとき、 このリン酸化と増殖シグナルである HER2のリン酸化 およびその下流シグナルの抑制とは逆相関することが明らかである。 実施例 7
エネルギー代謝阻害と AMPK活性化— HER2リン酸化抑制との相関一 ' ヒト HER2発現ヒト乳癌細胞株である BT- 474 (American Tissue Culture Collection (ATCC) より購入） を 24穴マルチウエルプレートに播種
(BT-474: 1.2 x'105細胞/ゥエル）し、炭酸ガスィンキュベ一夕一（5% C02、 37°C) 中で一夜培養した。 ロテノンとは異なる機序のエネルギー代謝阻 害剤として、ミ トコンドリァ呼吸鎖複合体 III阻害化合物アンチマイシン (和光純薬） を終濃度 1、 0.3、 0.1、 0, 03および 0. Olnmol/L で添加し、 培養を続けた。 また別のプレートを用い、 ミ トコンドリア呼吸鎖複合体 V 阻害化合物オリゴマイシン （和光純薬） を終濃度 100、 30、 10、 3および lng/mL で添加し、 培養を続けた。 また 2， 4 -ジニトロフエノールを 300、 100、 30、 10および 3 DIO1/Lで添加し、培養を続けた。各々のプレートは、 薬物添加 2時間後に培養液を除き、 SDSサンプルバッファー （200 L) で 細胞を溶解した後、 この細胞溶解液を用い、 ウエスタンブロッテイング 解析を行った。 すなわち、 この細胞溶解液 （8 L) を SDS-PAGE法 （ゲル 濃度： 7.5- 15%) にて分離し (Analytical Biochemistry, 166号、 368-379 頁、 1987年） 、 ニトロセルロース膜 （BioRad社製） にトランスファー後、 リン酸化 HER2に特異的な抗体 （Cell signaling technology社製、 コード 番号 2244) 、 リン酸化ァセチル CoAカルポキシラーゼ （ACC) に特異的な pACC抗体 （Cell signaling technology社製、 コード番号 3661) およびリ ン酸化 S6キナーゼ（S6K) に特異的な抗リン酸化 S6K抗体（Cell signaling technology社製、 コード番号 9209) を用い、 ECぃンステム (アマシャム) にて、 抗体を化学発光検出し、 LAS-1000 plus 画像解析装置 （富士写真 フィルム) によりリン酸化タンパク質量として定量した。
HER2のリン酸化は、 溶媒対照群の BT-474細胞で顕著に検出され、 アン チマイシン、 オリゴマイシン、 および 2, 4 -ジニトロフエノールの添加に より用量依存的に減少した。 このとき、 AMPKの基質であり活性の指標と なっている ACCは、 何れの化合物においても、用量依存的にリン酸化が増 加した。また下流分子として知られている S6Kのリン酸化が抑制されてお り、 AMPKからのシグナルが、 細胞内を伝達されていることも明らかとな つた。
実施例 2、 6の結果と併せ、 これよりエネルギー代謝阻害は、 HER2の リン酸化と HER2下流シグナルを抑制し、 HER2のリン酸化と AMPKのリン酸 化、 すなわち AMPK活性とは逆相関することが明らかである。 実施例 8
エネルギー代謝阻害による HER2発現細胞の増殖阻害
ヒト HER2発現細胞として BT- 474乳癌細胞、 MDA-MB- 453乳癌細胞、 A549 非小細胞肺癌細胞、 LNCaP前立腺癌細胞を用い、 HER2非発現細胞として MDA- MB- 231乳癌細胞、 A498腎癌細胞（いずれも ATCCより購入）を用いた。 各細胞を 500 cells/150 L/wel 1で 96穴プレートに播種し、 一晩培養し たものを用いた。 アンチマイシン （最終濃度： 1， 0. 1, 0.01， 0.001 mol/L) 、 2， 4 -ジニトロフエノール（最終濃度： 0.6, 0.2， 0.06, 0.02 匪 ol/L)、 メ トフオルミン （最終濃度： 25， 5, 1, 0.2匪 ol/U、 AICAR (最 終濃度： 25, 5, 1, 0.2 mmol/L) の各化合物を培地で希釈し上記最終濃 度となるよう 50 xL/wellずつ加えた。 5日間、 37°C、 5%C02で培養した後、 Cell Counting Ki t_F (同仁化学研究所）を用い細胞数を測定した。
Cell CountingKit- Fを用いた生細胞数測定は、 添付文書に従い、 以下 の方法で行った。 5日間の培養を行った 96穴プレー卜から上清を除き、 RPMI培地 (フエノールレツ ド不含、 血清不含） で 1000倍に希釈した Cell CountingKit-Fを 100 L/wel 1ずつ加えた。室温で 30分間反応させた後、 蛍光プレートリーダ一によって蛍光（励起波長； 480ηιη、蛍光波長； 530nm) を測定した。
測定結果から、 化合物を加えないゥエル （対照） の蛍光を 100%とした 時に、 化合物を添加したゥエルの蛍光の割合を求め、 残存細胞量を対照 に対する％として求めた。
結果、 細胞増殖を 50%以上阻害する最小の濃度は以下の通りとなった。 アンチマイシン ジニトロフエノール メトフオルミン (nmol/L) (m ol/L) (mmol/L)
HER2発現癌
BT474 1 <0.02 1
MB453 1 く 0.02 1
A549 10 く 0.02 5
LNCaP 1 く 0.02 ' 1
HER2非発現癌
DU145 〉100 0.067 〉25
A498 〉100 0.2 >25
MB231 10 0.2 〉25 これより、 何れの化合物も、 HER2非発現癌に比べ、 HER2発現癌に 10〜 100倍以上強く作用することが明らかである。実施例 1の結果と併せ、 ェ ネルギ一代謝阻害また AMPKの活性化により、 HER2リン酸化および細胞内 シグナル伝達が抑制され、 HER2発現癌に特異的に細胞増殖阻害を引き起 こすことが明らかとなった。 実施例 9
エネルギー代謝阻害による HER2シグナル抑制の特異性
ヒト EGFR発現ヒト類表皮癌細胞株である A431 (American Tissue
Culture Collection (ATCC) より購入） を 24穴マルチウエルプレートに 播種（A431: 6 X 104細胞/ゥエル）し、炭酸ガスィンキュベータ一（5% C02、 37°C) 中で一夜培養した。 ミ トコンドリァ複合体阻害化合物 （複合体 I ： ロテノン、 和光純薬） を終濃度 1 xmol/L から 4倍の希釈列で 5段階を添 加し培養を続けた。 2時間後に培養液を除き、 SDSサンプルバッファー（200 ill) で細胞を溶解した。 ウエスタンプロッティング解析を以下のように して行った。 すなわち、 この細胞溶解液 （8 xL) を SDS- PAGE法 （ゲル濃 度： 7· 5-15%) にて分離し （Analytical Biochemistry, 166号、 368-379 頁、 1987年） 、 ニトロセルロース膜（BioRad社製） にトランスファ一後、 リン酸化 EGFRに特異的な抗体 （Cell signaling technology社製、 コード 番号 2232) を用いて、 ECLシステム （アマシャム） にて、 抗体を検出し、 画像解析によりリン酸化タンパク質量として定量した。
EGFRのリン酸化は、 溶媒対照群の A431細胞で顕著に検出された。 この ときロテノンによる EGFRのリン酸化抑制は認められなかった。
EGFRは HER1とも呼ばれ、 HER2と高い相同性を持ち同じファミリ一に分 類される受容体チロシンリン酸化酵素である。 実施例 2の結果と併せ、 細胞内エネルギー代謝の阻害による受容体チロシンリン酸化抑制は、 HER2特異的である事が明らかとなった。 実施例 1 0
AMPK活性化による HER2発現癌細胞増殖阻害
ヒト HER2発現細胞として BT- 474乳癌細胞、 MDA- MB-453乳癌細胞、 LNCaP 前立腺癌細胞を用い、 HER2非発現細胞として MDA-MB- 231乳癌細胞、 A498 腎癌細胞（いずれも ATCCより購入） を用いた。 各細胞を 500 cells/150 L/wellで 96穴プレートに播種し、 ー晚培養したものを用いた。 トロダリ 夕ゾン （最終濃度： 25， 6.25, 1.56 n \/l) を培地で希釈し、 上記最 終濃度となるよう 50 L/wellずつ加えた。 5日間、 37°C、 5¾ C02で培養 した後、 Cell CountingKit-F (同仁化学研究所）を用い細胞数を測定した。
Cell CountingKit- Fを用いた生細胞数測定は、 添付文書に従い、 以下 の方法で行った。 5日間の培養を行った 96穴プレートから上清を除き、 RPMI培地 （フエノールレッ ド不含、 血清不含） で 1000倍に希釈した Cell CountingKit- Fを 100 L/wellずつ加えた。室温で 30分間反応させた後、 蛍光プレートリーダ一によって蛍光（励起波長； 480nm、蛍光波長； 530nm) を測定した。
測定結果から、トロダリ夕ゾンを加えないゥエル（対照）の蛍光を 100% とした時に、 トロダリ夕ゾンを添加したゥエルの蛍光の割合を求め、 残 存細胞量を対照に対する％として求めた。
この結果、 トログリ夕ゾンは HER2発現癌細胞に対し、 25 IHO1/Lの濃度 で、 BT474細胞を 50%、 MB453細胞を 25%、 LNCaP細胞を 48%にまで増殖阻 害した。 この増殖阻害は濃度依存的であった。 一方、 HER2非発現癌細胞 では、 25/xniol/Lの濃度で MDA- MB- 231細胞は 100%、 A498細胞が 105 %と、 まったく増殖阻害活性を示さなかった。
トログリタゾンは AMPKを活性化する事が報告されている。 実施例 7、 8の結果と併せ、 AMPKの活性化は HER2リン酸化を抑制し、 HER2発現癌特 異的な、 細胞増殖阻害を引き起こすことが明らかとなった。 産業上の利用可能性
エネルギー代謝阻害剤またはエネルギー代謝阻害模倣剤は、 HER2のリ ン酸化を抑制じ、 HER2のシグナルを阻害、 HER2発現細胞の増殖を阻害す るため、 例えば、 HER2発現癌の予防 ·治療薬、 HER2発現細胞の増殖阻害 薬、 HER2シグナル阻害薬、 HER2の脱リン酸化剤、癌の転移'再発抑制薬、 癌細胞のアポトーシス促進薬、 関節リゥマチの予防 ·治療薬などとして 安全な医薬として使用することができる。 さらには、 HER2発現癌患者に 対し、 エネルギー代謝阻害剤またはエネルギー代謝阻害模倣剤を投与す ることにより、 HER2発現癌を予防 ·治療することができる。 試験化合物 を細胞に接触させ、細胞内のエネルギー代謝を測定することにより、HER2 発現癌の予防 ·治療薬が効率よくスクリーニングすることができる。

Claims

請求の範囲
I . エネルギー代謝阻害剤またはエネルギー代謝阻害模倣剤を含有して なる HER 2発現癌の予防 ·治療薬。
5 2. エネルギー代謝阻害剤が、 AT P産生阻害剤である請求項 1記載の 予防 ·治療薬。
.
3. AT P産生阻害剤が、 糖代謝阻害剤である請求項 2 己載の予防 ·治 療薬。
4. 糖代謝阻害剤が、 ミ トコンドリア活性阻害剤である請求項 3記載の 10 予防 ·治療薬。
5. ミ トコンドリア活性阻害剤が、 電子伝達系阻害剤である請求項 4記 載の予防 ·治療薬。
6. 電子伝達系阻害剤が、 呼吸鎖複合体 I、 I I、 I I I、 I Vおよび Vから選ばれる少なくとも一種を阻害する剤である請求項 5記載の予
15 防 ·治療薬。 '
7. ミ トコンドリア活性阻害剤が、 TC A回路阻害剤である請求項 4記 載の予防 ·治療薬。
' 8. ミ トコンドリア活性阻害剤が、 AMP活性化プロテインキナーゼ活 性化剤である請求項 4記載の予防 ·治療薬。
20 9.糖代謝阻害剤が、解糖系阻害剤である請求項 3記載の予防 ·治療薬。
1 0. エネルギー代謝阻害模倣剤が、 AMP活性化プロテインキナーゼ 活性化剤である請求項 1記載の予防 ·治療薬。
I I . エネルギー代謝阻害模倣剤を含有してなる HE R 2発現癌の予 防 ·治療薬。
25 1 2. エネルギー代謝阻害模倣剤が、 AMP活性化プロテインキナーゼ 活性化剤である請求項 1 1記載の予防 ·治療薬。
1 3. AMP活性化プロテインキナーゼ活性化剤が、 ミ トコンドリア活 性阻害剤である請求項 1 2記載の予防 ·治療薬。
1 4. HE R 2が、 配列番号： 1、 配列番号： 3または配列番号： 5で 表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含 有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩である請求項
1または 1 1記載の予防 ·治療薬。
1 5. HE R 2発現細胞の増殖阻害薬および （または） HER 2シグナ 5 ル阻害薬である請求項 1または 1 1記載の予防 ·治療薬。
1 6. シグナルが、 癌細胞の増殖シグナル、 抗アポト一シスシグナル、 浸潤シグナルおよび転移シグナルから選ばれる少なくとも一種である請 求項 1 5記載の予防 ·治療薬。 ，
1 7. HE R 2の脱リン酸化剤である請求項 1または 1 1記載の予防 · 10 治療薬。
1 8. 癌の転移 ·再発抑制薬または癌細胞のアポトーシス促進薬である 請求項 1または 1 1記載の予防 ·治療薬。
1 9. ミ トコンドリァ呼吸鎖複合体阻害作用および AMP活性化プロテ ィンキナーゼ活性化作用を有する物質を含有してなる HE R 2発現癌の
15 予防 ·治療薬。
2 0. 試験化合物を細胞に接触させ、 細胞内のエネルギー代謝を測定す ることを特徴とする HER 2発現癌の予防 ·治療薬のスクリーニング方
' 法。
2 1. エネルギー代謝を阻害またはエネルギー代謝の阻害を模倣するこ 20 とを特徴とする HER 2発現癌の予防 ·治療方法。
2 2. 哺乳動物に対し、 エネルギー代謝阻害剤またはエネルギー代謝阻 害模倣剤の有効量を投与することを特徴とする HE R 2発現癌の予防 · 治療方法。
2 3. HE R 2発現癌の予防 ·治療薬を製造するためのエネルギー代謝 25 阻害剤またはエネルギー代謝阻害模倣剤の使用。
2 4. HE R 2が発現しており、 糖代謝が亢進している患者に対し、 ェ ネルギー代謝阻害剤またはエネルギー代謝阻害模倣剤を投与することを 特徴とする、 HE R 2発現癌の予防 ·治療方法。
30
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010537158A (ja) * 2007-08-16 2010-12-02 ザ ロイヤル インスティチューション フォー ザ アドバンスメント オブ ラーニング／マギル ユニバーシティ 腫瘍細胞由来微小胞
US10352935B2 (en) 2007-08-16 2019-07-16 The Royal Institution For The Advancement Of Learning/Mcgill University Tumor cell-derived microvesicles
WO2021162126A1 (ja) * 2020-02-13 2021-08-19 シーシーアイホールディングス株式会社 腫瘍細胞におけるアスパラギン酸合成の阻害剤、腫瘍細胞のスフェロイド形成阻害剤、腫瘍細胞の転移抑制剤、解糖系阻害剤の作用増強剤、並びに腫瘍の転移の抑制および／または予防用医薬組成物

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010103040A1 (en) * 2009-03-10 2010-09-16 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) 5'-adenosine monophosphate-activated protein kinase (ampk) activators for treating pulmonary hypertension

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004062604A2 (en) * 2003-01-10 2004-07-29 Threshold Pharmaceuticals, Inc. Treatment of cancer with 2-deoxyglucose
WO2006024491A1 (en) * 2004-08-30 2006-03-09 Interstitial Therapeutics Methods and compositions for the treatment of cell proliferation

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2431319A1 (en) * 2000-12-11 2002-06-20 Hiroto Bando Pharmaceutical composition having an improved water solubility

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004062604A2 (en) * 2003-01-10 2004-07-29 Threshold Pharmaceuticals, Inc. Treatment of cancer with 2-deoxyglucose
WO2006024491A1 (en) * 2004-08-30 2006-03-09 Interstitial Therapeutics Methods and compositions for the treatment of cell proliferation

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANISIMOV V.N. ET AL.: "Metformin Decelerates Aging and Development of Mammary Tumours in HER-2/neu Transgenic Mice", BULLETIN OF EXPERIMENTAL BIOLOGY AND MEDICINE, vol. 139, no. 6, 2005, pages 721 - 723, XP003002914 *
CONSTANTINI P. ET AL.: "Mitochondrion as a Novel Target of Anticancer Chemotherapy", JOURNAL OF THE NATIONAL CANCER INSTITUTE, vol. 92, no. 13, 2000, pages 1042 - 1053, XP003001196 *
See also references of EP1902732A4 *
YANG Z. ET AL.: "HER-2 Regulation of Peroxisome Proliferator-activated Receptor gamma (PPARgamma) Expression and Sensitivity of Breast Cancer Cells to PPARgamma Ligand Therapy", CLINICAL CANCER RESEARCH, vol. 9, 2003, pages 3198 - 3203, XP003002913 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010537158A (ja) * 2007-08-16 2010-12-02 ザ ロイヤル インスティチューション フォー ザ アドバンスメント オブ ラーニング／マギル ユニバーシティ 腫瘍細胞由来微小胞
JP2015111155A (ja) * 2007-08-16 2015-06-18 ザ ロイヤル インスティチューション フォー ザ アドバンスメント オブ ラーニング／マギル ユニバーシティ 腫瘍細胞由来微小胞
US9186405B2 (en) 2007-08-16 2015-11-17 The Royal Institution For The Advancement Of Learning/Mcgill University Tumor cell-derived microvesicles
JP2017161550A (ja) * 2007-08-16 2017-09-14 ザ ロイヤル インスティチューション フォー ザ アドバンスメント オブ ラーニング／マギル ユニバーシティ 腫瘍細胞由来微小胞
US10317407B2 (en) 2007-08-16 2019-06-11 The Royal Institution For The Advancement Of Learning/Mcgill University Tumor cell-derived microvesicles
US10352935B2 (en) 2007-08-16 2019-07-16 The Royal Institution For The Advancement Of Learning/Mcgill University Tumor cell-derived microvesicles
WO2021162126A1 (ja) * 2020-02-13 2021-08-19 シーシーアイホールディングス株式会社 腫瘍細胞におけるアスパラギン酸合成の阻害剤、腫瘍細胞のスフェロイド形成阻害剤、腫瘍細胞の転移抑制剤、解糖系阻害剤の作用増強剤、並びに腫瘍の転移の抑制および／または予防用医薬組成物

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