JPWO2006137595A1 - Her2発現癌の予防・治療薬 - Google Patents
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Abstract
本発明は、HER2発現癌の予防・治療薬、HER2発現細胞の増殖阻害薬、HER2シグナル阻害薬などとして有用であるエネルギー代謝阻害剤またはエネルギー代謝阻害模倣剤を提供する。
Description
本発明は、エネルギー代謝阻害剤またはエネルギー代謝阻害模倣剤を含有してなるHER2発現癌の予防・治療薬などに関する。さらに詳しくは、HER2発現細胞の増殖阻害薬、HER2シグナル阻害薬、HER2発現癌の予防・治療薬のスクリーニング方法などに関する。
HER2(erbB2と呼ばれることもある)は、EGF受容体ファミリーに属するチロシンリン酸化酵素活性を有する受容体であり、癌の増殖・悪性化に関与する因子である。HER2は、乳癌、肺癌、大腸癌、膵癌、卵巣癌などの種々の腫瘍に高発現しており、HER2発現患者の予後は不良である(Seminar in Oncology.27巻、5号、2000年、Supplment 9、13−19頁)。これより、HER2発現腫瘍に対する抗HER2療法は、腫瘍増殖を抑制するものと期待され、事実、HER2に対するヒト化モノクローナル抗体(トラスツズマブ、ハーセプチン)はHER2高発現の化学療法剤抵抗性、転移性乳癌に対し臨床で効果を示している(Seminar in Oncology.29巻、3号、Supplment 11、2002年、38−43頁)。トラスツズマブ自身は、HER2シグナルの中和活性を持たず、腫瘍細胞のHER2受容体への結合により、受容体の細胞内取り込みを促進し、細胞表面の受容体数を減らし、その結果、抗腫瘍効果を示すといわれており(Cancer Immunology Immunotherapy 37巻、255−263頁、1993年)、その効果は、HER2高発現腫瘍に限定されている(Journal of Clinical Oncology、21巻、15号、2889−2895頁、2003年)。この欠点を補うべく、受容体チロシンリン酸化酵素阻害など、現在、HER2シグナルを中和、阻害し、腫瘍の増殖を抑制する試みが行われている。
一方、癌細胞は、無限増殖能、転移能などの性質を保持するため、多量のエネルギーを必要としている。細胞のエネルギーはATPであるが、それを賄うため癌細胞は糖代謝、脂質代謝、アミノ酸代謝等エネルギー産生に関与する代謝経路を亢進させている。例えば、癌細胞への糖取り込み亢進は、一般的であり(Genomics 84巻、1014−1020頁、2004年、Nature Reviews of Cancer 4巻、891−899頁、2004年)、臨床においてPET診断の技術的基本となっている。増殖因子受容体は、細胞増殖シグナルを伝達する作用に加え、下流mTORなどの情報伝達分子を介して、直接、間接的にミトコンドリアを含めた代謝活性を亢進させ、受容体発現細胞のエネルギー代謝を促進する(Current Opinion of Clinical Nutrition Metabolism Care、8巻、1号、67−72頁、2005年)。
一方、癌細胞は、無限増殖能、転移能などの性質を保持するため、多量のエネルギーを必要としている。細胞のエネルギーはATPであるが、それを賄うため癌細胞は糖代謝、脂質代謝、アミノ酸代謝等エネルギー産生に関与する代謝経路を亢進させている。例えば、癌細胞への糖取り込み亢進は、一般的であり(Genomics 84巻、1014−1020頁、2004年、Nature Reviews of Cancer 4巻、891−899頁、2004年)、臨床においてPET診断の技術的基本となっている。増殖因子受容体は、細胞増殖シグナルを伝達する作用に加え、下流mTORなどの情報伝達分子を介して、直接、間接的にミトコンドリアを含めた代謝活性を亢進させ、受容体発現細胞のエネルギー代謝を促進する(Current Opinion of Clinical Nutrition Metabolism Care、8巻、1号、67−72頁、2005年)。
安全で治療効果の優れたHER2発現癌の予防・治療薬が切望されている。
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、糖代謝の抑制、呼吸の抑制、およびミトコンドリアの活性の抑制によるエネルギー代謝の抑制またはエネルギー代謝抑制の模倣により、HER2のリン酸化が低下すること、HER2発現細胞の増殖が阻害されることを見出し、さらに研究を重ね、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、
〔1〕エネルギー代謝阻害剤またはエネルギー代謝阻害模倣剤を含有してなるHER2発現癌の予防・治療薬、
〔2〕エネルギー代謝阻害剤が、ATP産生阻害剤である上記〔1〕記載の予防・治療薬、
〔3〕ATP産生阻害剤が、糖代謝阻害剤である上記〔2〕記載の予防・治療薬、
〔4〕糖代謝阻害剤が、ミトコンドリア活性阻害剤である上記〔3〕記載の予防・治療薬、
〔5〕ミトコンドリア活性阻害剤が、電子伝達系阻害剤である上記〔4〕記載の予防・治療薬、
〔6〕電子伝達系阻害剤が、呼吸鎖複合体I、II、III、IVおよびVから選ばれる少なくとも一種を阻害する剤である上記〔5〕記載の予防・治療薬、
〔7〕ミトコンドリア活性阻害剤が、TCA回路阻害剤である上記〔4〕記載の予防・治療薬、
〔8〕ミトコンドリア活性阻害剤が、AMP活性化プロテインキナーゼ活性化剤である上記〔4〕記載の予防・治療薬、
〔9〕糖代謝阻害剤が、解糖系阻害剤である上記〔3〕記載の予防・治療薬、
〔10〕エネルギー代謝阻害模倣剤が、AMP活性化プロテインキナーゼ活性化剤である上記〔1〕記載の予防・治療薬、
〔11〕エネルギー代謝阻害模倣剤を含有してなるHER2発現癌の予防・治療薬、
〔12〕エネルギー代謝阻害模倣剤が、AMP活性化プロテインキナーゼ活性化剤である上記〔11〕記載の予防・治療薬、
〔13〕AMP活性化プロテインキナーゼ活性化剤が、ミトコンドリア活性阻害剤である上記〔12〕記載の予防・治療薬、
〔14〕HER2が、配列番号:1、配列番号:3または配列番号:5で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩である上記〔1〕または〔11〕記載の予防・治療薬、
〔15〕HER2発現細胞の増殖阻害薬および(または)HER2シグナル阻害薬である上記〔1〕または〔11〕記載の予防・治療薬、
〔16〕シグナルが、癌細胞の増殖シグナル、抗アポトーシスシグナル、浸潤シグナルおよび転移シグナルから選ばれる少なくとも一種である上記〔15〕記載の予防・治療薬、
〔17〕HER2の脱リン酸化剤である上記〔1〕または〔11〕記載の予防・治療薬、
〔18〕癌の転移・再発抑制薬または癌細胞のアポトーシス促進薬である上記〔1〕または〔11〕記載の予防・治療薬、
〔19〕ミトコンドリア呼吸鎖複合体阻害作用およびAMP活性化プロテインキナーゼ活性化作用を有する物質を含有してなるHER2発現癌の予防・治療薬、
〔20〕試験化合物を細胞に接触させ、細胞内のエネルギー代謝を測定することを特徴とするHER2発現癌の予防・治療薬のスクリーニング方法、
〔20a〕細胞内のエネルギー代謝の指標が、細胞内ATP量である上記〔20〕記載のスクリーニング方法、
〔20b〕細胞内のエネルギー代謝の指標が、ミトコンドリア酸化還元活性である上記〔20〕記載のスクリーニング方法、
〔20c〕細胞内のエネルギー代謝の指標が、AMP活性化プロテインキナーゼ(AMPK)タンパク質のリン酸化または(および)AMPKの基質タンパク質のリン酸化である上記〔20〕記載のスクリーニング方法、
〔21〕エネルギー代謝を阻害またはエネルギー代謝の阻害を模倣することを特徴とするHER2発現癌の予防・治療方法、
〔21a〕エネルギー代謝が、ATP産生である上記〔21〕記載の方法、
〔21b〕ATP産生が、糖代謝である上記〔21a〕記載の方法、
〔21c〕糖代謝が、ミトコンドリア活性である上記〔21b〕記載の方法、
〔21d〕ミトコンドリア活性が、電子伝達系である上記〔21c〕記載の方法、
〔21e〕電子伝達系が、呼吸鎖複合体I、II、III、IVおよびVから選ばれる少なくとも一種である上記〔21d〕記載の方法、
〔21f〕ミトコンドリア活性が、TCA回路である上記〔21d〕記載の方法、
〔21g〕糖代謝が、解糖系である上記〔21b〕記載の方法、
〔21h〕エネルギー代謝の阻害を模倣することが、AMP活性化プロテインキナーゼを活性化することである上記〔21〕記載の方法、
〔21i〕エネルギー代謝の阻害を模倣することを特徴とするHER2発現癌の予防・治療方法、
〔21j〕エネルギー代謝の阻害を模倣することが、AMP活性化プロテインキナーゼを活性化することである上記〔21i〕記載の方法、
〔21k〕AMP活性化プロテインキナーゼを活性化することが、ミトコンドリア活性を阻害することである上記〔21j〕記載の方法、
〔22〕哺乳動物に対し、エネルギー代謝阻害剤またはエネルギー代謝阻害模倣剤の有効量を投与することを特徴とするHER2発現癌の予防・治療方法、
〔23〕HER2発現癌の予防・治療薬を製造するためのエネルギー代謝阻害剤またはエネルギー代謝阻害模倣剤の使用、
〔24〕HER2が発現しており、糖代謝が亢進している患者に対し、エネルギー代謝阻害剤またはエネルギー代謝阻害模倣剤を投与することを特徴とする、HER2発現癌の予防・治療方法などを提供する。
また、本発明は、
〔i〕エネルギー代謝阻害剤またはエネルギー代謝阻害模倣剤を含有してなるHER2に関連する疾患の予防・治療薬、
〔ii〕HER2に関連する疾患が癌または関節リウマチである上記〔i〕記載の予防・治療薬も提供する。
エネルギー代謝阻害剤またはエネルギー代謝阻害模倣剤は、HER2のリン酸化を抑制し、HER2のシグナルを阻害、HER2発現細胞の増殖を阻害するため、例えば、HER2発現癌の予防・治療薬、HER2発現細胞の増殖阻害薬、HER2シグナル阻害薬、HER2の脱リン酸化剤、癌の転移・再発抑制薬、癌細胞のアポトーシス促進薬、関節リウマチの予防・治療薬などとして安全な医薬として使用することができる。さらには、HER2発現癌患者に対し、エネルギー代謝阻害剤またはエネルギー代謝阻害模倣剤を投与することにより、HER2発現癌を予防・治療することができる。試験化合物を細胞に接触させ、細胞内のエネルギー代謝を測定することにより、HER2発現癌の予防・治療薬が効率よくスクリーニングすることができる。
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、糖代謝の抑制、呼吸の抑制、およびミトコンドリアの活性の抑制によるエネルギー代謝の抑制またはエネルギー代謝抑制の模倣により、HER2のリン酸化が低下すること、HER2発現細胞の増殖が阻害されることを見出し、さらに研究を重ね、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、
〔1〕エネルギー代謝阻害剤またはエネルギー代謝阻害模倣剤を含有してなるHER2発現癌の予防・治療薬、
〔2〕エネルギー代謝阻害剤が、ATP産生阻害剤である上記〔1〕記載の予防・治療薬、
〔3〕ATP産生阻害剤が、糖代謝阻害剤である上記〔2〕記載の予防・治療薬、
〔4〕糖代謝阻害剤が、ミトコンドリア活性阻害剤である上記〔3〕記載の予防・治療薬、
〔5〕ミトコンドリア活性阻害剤が、電子伝達系阻害剤である上記〔4〕記載の予防・治療薬、
〔6〕電子伝達系阻害剤が、呼吸鎖複合体I、II、III、IVおよびVから選ばれる少なくとも一種を阻害する剤である上記〔5〕記載の予防・治療薬、
〔7〕ミトコンドリア活性阻害剤が、TCA回路阻害剤である上記〔4〕記載の予防・治療薬、
〔8〕ミトコンドリア活性阻害剤が、AMP活性化プロテインキナーゼ活性化剤である上記〔4〕記載の予防・治療薬、
〔9〕糖代謝阻害剤が、解糖系阻害剤である上記〔3〕記載の予防・治療薬、
〔10〕エネルギー代謝阻害模倣剤が、AMP活性化プロテインキナーゼ活性化剤である上記〔1〕記載の予防・治療薬、
〔11〕エネルギー代謝阻害模倣剤を含有してなるHER2発現癌の予防・治療薬、
〔12〕エネルギー代謝阻害模倣剤が、AMP活性化プロテインキナーゼ活性化剤である上記〔11〕記載の予防・治療薬、
〔13〕AMP活性化プロテインキナーゼ活性化剤が、ミトコンドリア活性阻害剤である上記〔12〕記載の予防・治療薬、
〔14〕HER2が、配列番号:1、配列番号:3または配列番号:5で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩である上記〔1〕または〔11〕記載の予防・治療薬、
〔15〕HER2発現細胞の増殖阻害薬および(または)HER2シグナル阻害薬である上記〔1〕または〔11〕記載の予防・治療薬、
〔16〕シグナルが、癌細胞の増殖シグナル、抗アポトーシスシグナル、浸潤シグナルおよび転移シグナルから選ばれる少なくとも一種である上記〔15〕記載の予防・治療薬、
〔17〕HER2の脱リン酸化剤である上記〔1〕または〔11〕記載の予防・治療薬、
〔18〕癌の転移・再発抑制薬または癌細胞のアポトーシス促進薬である上記〔1〕または〔11〕記載の予防・治療薬、
〔19〕ミトコンドリア呼吸鎖複合体阻害作用およびAMP活性化プロテインキナーゼ活性化作用を有する物質を含有してなるHER2発現癌の予防・治療薬、
〔20〕試験化合物を細胞に接触させ、細胞内のエネルギー代謝を測定することを特徴とするHER2発現癌の予防・治療薬のスクリーニング方法、
〔20a〕細胞内のエネルギー代謝の指標が、細胞内ATP量である上記〔20〕記載のスクリーニング方法、
〔20b〕細胞内のエネルギー代謝の指標が、ミトコンドリア酸化還元活性である上記〔20〕記載のスクリーニング方法、
〔20c〕細胞内のエネルギー代謝の指標が、AMP活性化プロテインキナーゼ(AMPK)タンパク質のリン酸化または(および)AMPKの基質タンパク質のリン酸化である上記〔20〕記載のスクリーニング方法、
〔21〕エネルギー代謝を阻害またはエネルギー代謝の阻害を模倣することを特徴とするHER2発現癌の予防・治療方法、
〔21a〕エネルギー代謝が、ATP産生である上記〔21〕記載の方法、
〔21b〕ATP産生が、糖代謝である上記〔21a〕記載の方法、
〔21c〕糖代謝が、ミトコンドリア活性である上記〔21b〕記載の方法、
〔21d〕ミトコンドリア活性が、電子伝達系である上記〔21c〕記載の方法、
〔21e〕電子伝達系が、呼吸鎖複合体I、II、III、IVおよびVから選ばれる少なくとも一種である上記〔21d〕記載の方法、
〔21f〕ミトコンドリア活性が、TCA回路である上記〔21d〕記載の方法、
〔21g〕糖代謝が、解糖系である上記〔21b〕記載の方法、
〔21h〕エネルギー代謝の阻害を模倣することが、AMP活性化プロテインキナーゼを活性化することである上記〔21〕記載の方法、
〔21i〕エネルギー代謝の阻害を模倣することを特徴とするHER2発現癌の予防・治療方法、
〔21j〕エネルギー代謝の阻害を模倣することが、AMP活性化プロテインキナーゼを活性化することである上記〔21i〕記載の方法、
〔21k〕AMP活性化プロテインキナーゼを活性化することが、ミトコンドリア活性を阻害することである上記〔21j〕記載の方法、
〔22〕哺乳動物に対し、エネルギー代謝阻害剤またはエネルギー代謝阻害模倣剤の有効量を投与することを特徴とするHER2発現癌の予防・治療方法、
〔23〕HER2発現癌の予防・治療薬を製造するためのエネルギー代謝阻害剤またはエネルギー代謝阻害模倣剤の使用、
〔24〕HER2が発現しており、糖代謝が亢進している患者に対し、エネルギー代謝阻害剤またはエネルギー代謝阻害模倣剤を投与することを特徴とする、HER2発現癌の予防・治療方法などを提供する。
また、本発明は、
〔i〕エネルギー代謝阻害剤またはエネルギー代謝阻害模倣剤を含有してなるHER2に関連する疾患の予防・治療薬、
〔ii〕HER2に関連する疾患が癌または関節リウマチである上記〔i〕記載の予防・治療薬も提供する。
エネルギー代謝阻害剤またはエネルギー代謝阻害模倣剤は、HER2のリン酸化を抑制し、HER2のシグナルを阻害、HER2発現細胞の増殖を阻害するため、例えば、HER2発現癌の予防・治療薬、HER2発現細胞の増殖阻害薬、HER2シグナル阻害薬、HER2の脱リン酸化剤、癌の転移・再発抑制薬、癌細胞のアポトーシス促進薬、関節リウマチの予防・治療薬などとして安全な医薬として使用することができる。さらには、HER2発現癌患者に対し、エネルギー代謝阻害剤またはエネルギー代謝阻害模倣剤を投与することにより、HER2発現癌を予防・治療することができる。試験化合物を細胞に接触させ、細胞内のエネルギー代謝を測定することにより、HER2発現癌の予防・治療薬が効率よくスクリーニングすることができる。
図1は、細胞培養時の酸素濃度を20%から7%へと低下させた場合に、HER2のリン酸化量の変化を経時的に測定した結果を表す図である。図中、縦軸は酸素濃度20%で培養した場合のHER2タンパク質リン酸化量を100%として、各時間でのHER2タンパク質リン酸化量を相対比で示す。
(1)エネルギー代謝阻害剤またはエネルギー代謝阻害模倣剤を含有してなるHER2発現癌の予防・治療薬
本発明は、細胞のエネルギー代謝の抑制またはエネルギー代謝抑制の模倣により、HER2発現細胞の増殖が顕著に阻害されることを見出したことに基づいている。したがって、本発明は、一つの局面において、エネルギー代謝阻害剤またはエネルギー代謝阻害模倣剤を含有してなるHER2発現癌の予防・治療薬を提供する。
「エネルギー代謝阻害剤」としては、細胞のエネルギー代謝を阻害する作用を有する物質(例、合成化合物、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿など)が含まれ、これらの物質自体であっても、該物質を含む剤であってもよい。細胞のエネルギー代謝には、ATP産生、トランスポーター、AMP活性化プロテインキナーゼなどが直接または間接的に関与しており、したがって、「エネルギー代謝阻害剤」としては、典型的には、例えば、ATP産生阻害剤、トランスポーター活性阻害剤などが挙げられる。
「細胞」としては、例えば、動物細胞(例、哺乳動物の細胞)、昆虫細胞などが含まれる。好ましくは、動物細胞であり、より好ましくはヒト細胞であり、最も好ましくは、ヒト癌細胞、特にHER2発現細胞である。
「ATP産生阻害剤」としては、ATP産生を阻害する作用を有する物質(例、合成化合物、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿など)自体であっても、該物質を含む剤であってもよく、例えば、糖代謝阻害剤、アミノ酸代謝阻害剤、脂質代謝阻害剤などが挙げられる。
「糖代謝阻害剤」としては、糖代謝を阻害する作用を有する物質(例、合成化合物、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿など)自体であっても、該物質を含む剤であってもよく、例えば、ミトコンドリア活性阻害剤、解糖系阻害剤などが挙げられる。
「ミトコンドリア活性阻害剤」としては、ミトコンドリアの活性・機能を阻害する作用を有する物質(例、合成化合物、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿など)自体であっても、該物質を含む剤であってもよく、例えば、電子伝達系阻害剤、TCA回路阻害剤などが挙げられる。また、例えば、低酸素状態の誘導、糖、脂質、アミノ酸等の栄養供給を制限するなどして、好気的代謝を抑制することは、ミトコンドリア活性阻害剤を使用することと等価なものと考えることができる。
「電子伝達系阻害剤」としては、電子伝達系を阻害する作用を有する物質(例、合成化合物、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿など)自体であっても、該物質を含む剤であってもよく、例えば、呼吸鎖複合体I、II、III、IVおよびVから選ばれる少なくとも一種を阻害する剤などが挙げられる。
「呼吸鎖複合体I、II、III、IVおよびVから選ばれる少なくとも一種を阻害する剤」としては、呼吸鎖複合体I、II、III、IVおよびVから選ばれる少なくとも−種を阻害する作用を有する物質(例、合成化合物、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿など)自体であっても、該物質を含む剤であってもよく、例えば、複合体Iに対するロテノン、ピエリシヂン、ミクソチアゾール、カプサイシン、アセトゲニン、アラキドン酸など;複合体IIに対するマロン酸、ジメチルコハク酸、TTFA(2−Thenoyltrifluoroacetone)など;複合体IIIに対するアンチマイシン、スティグマテリン、アラキドン酸;複合体VIに対するアジ化ナトリウム、シアニド、硫化水素、ハイドロコルチゾン、デクサメサゾンなど;複合体Vに対する2,4−ジニトロフェノール、バリノマイシン、オリゴマイシン;FCCP〔カルボニル シアニド−4−(トリフルオロメトキシ)フェニルヒドラゾン〕などが挙げられる。
「TCA回路阻害剤」としては、TCA回路を阻害する作用を有する物質(例、合成化合物、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿など)自体であっても、該物質を含む剤であってもよく、例えば、トリフルオロ酢酸、サリチル酸などが挙げられる。
「解糖系阻害剤」としては、解糖系を阻害する作用を有する物質(例、合成化合物、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿など)自体であっても、該物質を含む剤であってもよく、例えば、2−デオキシグルコース、フッ化ナトリウム、リチウムヨード酢酸などが挙げられる。
「アミノ酸代謝阻害剤」としては、アミノ酸代謝を阻害する作用を有する物質(例、合成化合物、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿など)自体であっても、該物質を含む剤であってもよく、例えば、アミノ基転移阻害剤(例、アミノオキシアセチル酸など)、脱アミノ基阻害剤、脱カルボン酸阻害剤などが挙げられる。
「脂質代謝阻害剤」としては、脂質代謝を阻害する作用を有する物質(例、合成化合物、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿など)自体であっても、該物質を含む剤であってもよく、例えば、ベータ−酸化阻害剤(例、テトラデシルグリシル酸(Tetradecylglycidic acid)など)などが挙げられる。
「トランスポーター活性阻害剤」としては、細胞のトランスポーター活性を阻害する作用を有する物質(例、合成化合物、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿など)が含まれ、これらの物質自体であっても、該物質を含む剤であってもよい。例えば、グルコーストランスポーター阻害剤(例、フロリジンなど)、ピルビン酸・乳酸トランスポーター阻害剤(例、シアノ−4−ヒドロキシシンナメート(α−cyano−4−hydroxycinnamate)、p−クロロメルクリ安息香酸(p−chloromercuribenzenesulfonic acid)など)、アミノ酸トランスポーター阻害剤(例、2−アミノビシクロヘプタンカルボン酸(2−aminobicyclo−(2,2,1)−heptane−2−carboxylic acid(BCH))など)などが、「トランスポーター活性阻害剤」の例として挙げられるが、これらに限定されず、トランスポーターの活性を阻害し細胞のエネルギー代謝に必要な基質の供給を抑えることによって、細胞のエネルギー代謝を阻害する作用を奏することができる任意の物質が含まれる。
「エネルギー代謝阻害模倣剤」としては、細胞のエネルギー代謝を直接阻害することなく、エネルギー代謝の阻害状態または飢餓状態により生じる細胞の生理反応(例、タンパク質のリン酸化および脱リン酸化、活性酸素産生量の変動、酵素活性の変動、mRNA転写・翻訳の変動、タンパク質分解および合成の変動など)を誘導する物質(例、合成化合物、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿など)が含まれ、これらの物質自体であっても、該物質を含む剤であってもよく、例えば、AMP活性化プロテインキナーゼ活性化剤などが挙げられる。
「AMP活性化プロテインキナーゼ活性化剤」としては、AMP活性化プロテインキナーゼを活性化する作用を有する物質(例、合成化合物、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿など)が含まれ、これらの物質自体であっても、該物質を含む剤であってもよい。例えば、メトフォルミン、フェンフォルミン、ブフォルミン、AICAR(5−アミノイミダゾール−4−カルボキサミドリボヌクレオシド)、インスリン抵抗性改善剤〔例、トログリタゾン(Troglitazone)、ピオグリタゾン(Pioglitazone)またはその塩(好ましくは塩酸塩)、ロシグリタゾン(Rosiglitazone)またはその塩(好ましくはマレイン酸塩)、レグリキサン(Reglixane)、ネトグリタゾン(Netoglitazone)、リボグリタゾン(Rivoglitazone)、エダグリタゾン(Edaglitazone)、テサグリタザール(Tesaglitazar)、ラガグリタザール(Ragaglitazar)、ムラグリタザール(Muraglitazar)、メタグリダセン(Metaglidasen)、ナベグリタザール(Naveglitazar)、バラグリタゾン(Balaglitazone)など〕などが挙げられるが、これらに限定されず、AMP活性化プロテインキナーゼを活性化し、HER2のリン酸化を抑制する任意の物質が含まれる。なお、「AMP活性化プロテインキナーゼ活性化剤」が、上記「ミトコンドリア活性阻害剤」としての作用を有していてもよい。
HER2(以下、本発明のタンパク質または本発明で用いられるタンパク質と称することもある)は、ヒトや温血動物(例、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど)の細胞(例、網膜細胞、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞(例、マクロファージ、T細胞、B細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球、血小板など)、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくは癌細胞など)もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位(例、網膜、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳)、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管(例、大腸、小腸)、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋など、または血球系の細胞もしくはその培養細胞(例えば、MEL、M1、CTLL−2、HT−2、WEHI−3、HL−60、JOSK−1、K562、ML−1、MOLT−3、MOLT−4、MOLT−10、CCRF−CEM、TALL−1、Jurkat、CCRT−HSB−2、KE−37、SKW−3、HUT−78、HUT−102、H9、U937、THP−1、HEL、JK−1、CMK、KO−812、MEG−01など)に由来するタンパク質であってもよく、合成タンパク質であってもよい。
HER2としては、配列番号:1、配列番号:3または配列番号:5で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩が挙げられる。
配列番号:1、配列番号:3または配列番号:5で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号:1、配列番号:3または配列番号:5で表わされるアミノ酸配列と約50%以上、好ましくは約60%以上、さらに好ましくは約70%以上、より好ましくは約80%以上、特に好ましくは約90%以上、最も好ましくは約95%以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
アミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST(National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)を用い、以下の条件(期待値=10;ギャップを許す;マトリクス=BLOSUM62;フィルタリング=OFF)にて計算することができる。
配列番号:1、配列番号:3または配列番号:5で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、前記の配列番号:1、配列番号:3または配列番号:5で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号:1、配列番号:3または配列番号:5で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。
実質的に同質の活性としては、例えばHER2作用などが挙げられる。実質的に同質とは、それらの性質が性質的に(例、生理学的に、または薬理学的に)同質であることを示す。したがって、HER2作用などが同等(例、約0.01〜100倍、好ましくは約0.1〜10倍、より好ましくは0.5〜2倍)であることが好ましいが、これらの活性の程度、タンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
また、本発明のタンパク質としては、例えば、(i)配列番号:1、配列番号:3または配列番号:5で表されるアミノ酸配列中の1または2個以上(例えば1〜100個程度、好ましくは1〜30個程度、好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは数(1〜5)個)のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、(ii)配列番号:1、配列番号:3または配列番号:5で表されるアミノ酸配列に1または2個以上(例えば1〜100個程度、好ましくは1〜30個程度、好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは数(1〜5)個)のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、(iii)配列番号:1、配列番号:3または配列番号:5で表されるアミノ酸配列に1または2個以上(例えば1〜100個程度、好ましくは1〜30個程度、好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは数(1〜5)個)のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、(iv)配列番号:1、配列番号:3または配列番号:5で表されるアミノ酸配列中の1または2個以上(例えば1〜100個程度、好ましくは1〜30個程度、好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは数(1〜5)個)のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または(v)それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質などのいわゆるムテインも含まれる。
上記のようにアミノ酸配列が挿入、欠失または置換されている場合、その挿入、欠失または置換の位置としては、とくに限定されない。
本明細書におけるタンパク質は、ペプチド標記の慣例に従って左端がN末端(アミノ末端)、右端がC末端(カルボキシル末端)である。配列番号:1で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質をはじめとする、本発明で用いられるタンパク質は、C末端がカルボキシル基(−COOH)、カルボキシレート(−COO−)、アミド(−CONH2)またはエステル(−COOR)の何れであってもよい。
ここでエステルにおけるRとしては、例えば、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチルなどのC1−6アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのC3−8シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのC6−12アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−C1−2アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−C1−2アルキル基などのC7−14アラルキル基、ピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
本発明で用いられるタンパク質がC末端以外にカルボキシル基(またはカルボキシレート)を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明で用いられるタンパク質に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したC末端のエステルなどが用いられる。
さらに、本発明で用いられるタンパク質には、N末端のアミノ酸残基(例、メチオニン残基)のアミノ基が保護基(例えば、ホルミル基、アセチル基などのC1−6アルカノイルなどのC1−6アシル基など)で保護されているもの、生体内で切断されて生成するN末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基(例えば−OH、−SH、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など)が適当な保護基(例えば、ホルミル基、アセチル基などのC1−6アルカノイル基などのC1−6アシル基など)で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質なども含まれる。
本発明で用いられるタンパク質の具体例としては、例えば、配列番号:1で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号:3で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号:5で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質などがあげられる。
本発明で用いられるタンパク質の部分ペプチドとしては、前記した本発明で用いられるタンパク質の部分ペプチドであって、好ましくは、前記した本発明で用いられるタンパク質と同様の性質を有するものであればいずれのものでもよい。
例えば、本発明で用いられるタンパク質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも20個以上、好ましくは50個以上、さらに好ましくは70個以上、より好ましくは100個以上、最も好ましくは200個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが用いられる。
また、本発明で用いられる部分ペプチドは、そのアミノ酸配列中の1または2個以上(好ましくは1〜20個程度、より好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは数(1〜5)個)のアミノ酸が欠失し、または、そのアミノ酸配列に1または2個以上(好ましくは1〜20個程度、より好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは数(1〜5)個)のアミノ酸が付加し、または、そのアミノ酸配列に1または2個以上(好ましくは1〜20個程度、より好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは数(1〜5)個)のアミノ酸が挿入され、または、そのアミノ酸配列中の1または2個以上(好ましくは1〜20個程度、より好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは数(1〜5)個)のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。
また、本発明で用いられる部分ペプチドはC末端がカルボキシル基(−COOH)、カルボキシレート(−COO−)、アミド(−CONH2)またはエステル(−COOR)の何れであってもよい。
さらに、本発明で用いられる部分ペプチドには、前記した本発明で用いられるタンパク質と同様に、C末端以外にカルボキシル基(またはカルボキシレート)を有しているもの、N末端のアミノ酸残基(例、メチオニン残基)のアミノ基が保護基で保護されているもの、N端側が生体内で切断され生成したグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
本発明で用いられる部分ペプチドは抗体作成のための抗原としても用いることができる。
本発明で用いられるタンパク質または部分ペプチドの塩としては、生理学的に許容される酸(例、無機酸、有機酸)や塩基(例、アルカリ金属塩)などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸(例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸)との塩、あるいは有機酸(例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸)との塩などが用いられる。
本発明で用いられるタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩は、前述したヒトや温血動物の細胞または組織から自体公知のタンパク質の精製方法によって製造することもできるし、タンパク質をコードするDNAを含有する形質転換体を培養することによっても製造することができる。また、公知のペプチド合成法に準じて製造することもできる。
ヒトや哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、ヒトや哺乳動物の組織または細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出を行ない、該抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができる。
本発明で用いられるタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、前述した本発明で用いられるタンパク質をコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。好ましくはDNAである。DNAとしては、ゲノムDNA、ゲノムDNAライブラリー、前記した細胞・組織由来のcDNA、前記した細胞・組織由来のcDNAライブラリー、合成DNAのいずれでもよい。
ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織よりtotalRNAまたはmRNA画分を調製したものを用いて直接Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction(以下、RT−PCR法と略称する)によって増幅することもできる。
本発明で用いられるタンパク質をコードするDNAとしては、例えば、配列番号:2、配列番号:4または配列番号:6で表される塩基配列を含有するDNA、または配列番号:2、配列番号:4または配列番号:6で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、前記した配列番号:1、配列番号:3または配列番号:5で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするDNAであれば何れのものでもよい。
配列番号:2、配列番号:4または配列番号:6で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるDNAとしては、例えば、配列番号:2、配列番号:4または配列番号:6で表される塩基配列と約50%以上、好ましくは約60%以上、さらに好ましくは約70%以上、より好ましくは約80%以上、特に好ましくは約90%以上、最も好ましくは約95%以上の相同性を有する塩基配列を含有するDNAなどが用いられる。
塩基配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST(National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)を用い、以下の条件(期待値=10;ギャップを許す;フィルタリング=ON;マッチスコア=1;ミスマッチスコア=−3)にて計算することができる。
ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、Molecular Cloning 2nd(J.Sambrook et al.,Cold Spring Harbor Lab.Press,1989)に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行うことができる。
ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約19〜40mM、好ましくは約19〜20mMで、温度が約50〜70℃、好ましくは約60〜65℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約19mMで温度が約65℃の場合が最も好ましい。
より具体的には、配列番号:1で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするDNAとしては、配列番号:2で表される塩基配列を含有するDNAなどが、配列番号:3で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするDNAとしては、配列番号:4で表される塩基配列を含有するDNAなどが、配列番号:5で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするDNAとしては、配列番号:6で表される塩基配列を含有するDNAなどが用いられる。
本発明で用いられる部分ペプチドをコードするDNAとしては、前述した本発明で用いられる部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムDNA、ゲノムDNAライブラリー、前記した細胞・組織由来のcDNA、前記した細胞・組織由来のcDNAライブラリー、合成DNAのいずれでもよい。
本発明で用いられる部分ペプチドをコードするDNAとしては、例えば、配列番号:2、配列番号:4または配列番号:6で表される塩基配列を含有するDNAの一部分を有するDNA、または配列番号:2、配列番号:4または配列番号:6で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、本発明のタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質をコードするDNAの一部分を含有するDNAなどが用いられる。
配列番号:2、配列番号:4または配列番号:6で表される塩基配列とハイブリダイズできるDNAは、前記と同意義を示す。
ハイブリダイゼーションの方法およびハイストリンジェントな条件は前記と同様のものが用いられる。
本発明で用いられるタンパク質、部分ペプチド(以ド、これらをコードするDNAのクローニングおよび発現の説明においては、これらを単に本発明のタンパク質と略記する場合がある)を完全にコードするDNAのクローニングの手段としては、本発明のタンパク質をコードする塩基配列の一部分を有する合成DNAプライマーを用いてPCR法によって増幅するか、または適当なベクターに組み込んだDNAを本発明のタンパク質の一部あるいは全領域をコードするDNA断片もしくは合成DNAを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、Molecular Cloning 2nd Ed(J.Sambrook et al.,Cold Spring Harbor Lab.Press,1989)に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
DNAの塩基配列の変換は、PCR、公知のキット、例えば、MutanTM−super Express Km(宝酒造(株))、MutanTM−K(宝酒造(株))等を用いて、ODA−LA PCR法、Gapped duplex法、Kunkel法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行うことができる。
クローン化されたタンパク質をコードするDNAは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該DNAはその5’末端側に翻訳開始コドンとしてのATGを有し、また3’末端側には翻訳終止コドンとしてのTAA、TGAまたはTAGを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成DNAアダプターを用いて付加することもできる。
本発明のタンパク質の発現ベクターは、公知の方法、例えば、(i)本発明のタンパク質をコードするDNAから目的とするDNA断片を切り出し、(ii)該DNA断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
「HER2発現癌」とは、HER2(好ましくは、配列番号:1、配列番号:3または配列番号:5で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチド)が発現している癌細胞であれば、いずれの癌細胞でもよい。例えば、公知の方法、遺伝子検出方法〔例、FISH(fluorescence in situ hybridization method)、CISH(chromosome in situ hybridization method)、PCR(polymerase chain reaction method)、サザンブロット法など〕、メッセンジャーRNA検出方法〔例、RT−PCR(Reverse Transcriptase PCR)、ISH(in situ hybridization method)、ノーザンブロット法など〕、タンパク質検出方法〔例、IHC(immuno−histo−chemistry method)、ウェスタンブロット法、ELISA(Enzyme−linked immunesorbent assay)など〕などの方法で、HER2遺伝子、HER2のメッセンジャーRNA、HER2タンパク質が検出される癌細胞などが挙げられる。
エネルギー代謝(好ましくは、糖代謝など)を阻害する、またはエネルギー代謝阻害を模倣することにより、HER2発現細胞の増殖が阻害され、HER2の脱リン酸化が起こり、またはHER2のシグナルが阻害される。「HER2のシグナル」としては、例えば、癌細胞の増殖シグナル、抗アポトーシスシグナル、浸潤シグナル、転移シグナルなどが挙げられる。
従って、エネルギー代謝阻害剤およびエネルギー代謝阻害模倣剤は、HER2発現癌の予防・治療薬として有用であり、例えば、癌(例、脳腫瘍、下垂体腺腫、神経膠腫、聴神経鞘腫、網膜肉腫、甲状腺癌、咽頭癌、喉頭癌、舌癌、胸腺腫、中皮腫、乳癌、肺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、胃癌、食道癌、十二指腸癌、大腸癌、結腸癌、直腸癌、肝臓癌、肝細胞癌、膵癌、膵内分泌腫瘍、胆管癌、胆嚢癌、陰茎癌、腎臓癌、腎盂癌、尿管癌、腎細胞癌、精巣腫瘍、前立腺癌、膀胱癌、外陰癌、子宮癌、子宮頚部癌、子宮体部癌、子宮肉腫、絨毛性疾患、膣癌、卵巣癌、卵巣胚細胞腫瘍、皮膚癌、悪性黒色腫、菌状息肉症、基底細胞腫、軟部肉腫、悪性リンパ腫、ホジキン病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、成人T細胞白血病、慢性骨髄増殖性疾患、膵内分泌腫瘍、線維性組織球腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、原発不明癌など、好ましくは乳癌など)、アテローム性動脈硬化症、血管新生(例、固形癌および肉腫の成長にともなう血管新生、腫瘍の転移にともなう血管新生、および糖尿病性網膜症にともなう血管新生など)、ウイルス性疾患(例、HIV感染など)、関節リウマチなどの予防・治療薬などとして、さらには、癌の転移・再発抑制薬、癌細胞のアポトーシス促進薬などとして安全な医薬として使用することができる。
エネルギー代謝阻害剤およびエネルギー代謝阻害模倣剤は、必要に応じ、常套手段に従って製剤化すればよい。
エネルギー代謝阻害剤およびエネルギー代謝阻害模倣剤は、HER2発現癌に対し、より強い増殖阻害作用を示すことより、例えば、HER2が発現しており、糖代謝が亢進している患者に対し、HER2発現癌の予防・治療のために投与されることにより、優れた臨床効果を示す。この結果、不必要な投薬を減らし、副作用の危険を減弱するとともに、該患者に対する治療効果を上げることができる。
HER2が発現しており、糖代謝が亢進している患者としては、例えば、HER2(好ましくは、配列番号:1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチド)が発現しており、公知の方法で糖代謝が亢進していると判断される患者、例えばPET(Positron Emission Tomography)により癌の存在が認識される患者、血管造影、MRI(magnetic resonance imageing)などの方法で癌への血流が認識される患者などが挙げられる。
エネルギー代謝阻害剤およびエネルギー代謝阻害模倣剤は、ホルモン療法剤、抗癌剤(例、化学療法剤、免疫療法剤、または細胞増殖因子ならびにその受容体の作用を阻害する薬剤)など(以下、併用薬物と略記する)と併用して使用することができる。
「ホルモン療法剤」としては、例えば、ホスフェストロール、ジエチルスチルベストロール、クロロトリアニセン、酢酸メドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロール、酢酸クロルマジノン、酢酸シプロテロン、ダナゾール、ジエノゲスト、アソプリスニル、アリルエストレノール、ゲストリノン、ノメゲストロール、タデナン、メパルトリシン、ラロキシフェン、オルメロキシフェン、レポルメロキシフェン、抗エストロゲン(例、クエン酸タモキシフェン、クエン酸トレミフェン等)、ERダウンレギュレーター(例、フルベストラント等)、ヒト閉経ゴナドトロピン、卵胞刺激ホルモン、ピル製剤、メピチオスタン、テストロラクトン、アミノグルテチイミド、LH−RHアゴニスト(例、酢酸ゴセレリン、ブセレリン、リュープロレリン等)、ドロロキシフェン、エピチオスタノール、スルホン酸エチニルエストラジオール、アロマターゼ阻害薬(例、塩酸ファドロゾール、アナストロゾール、レトロゾール、エキセメスタン、ボロゾール、フォルメスタン等)、抗アンドロゲン(例、フルタミド、ビカルタミド、ニルタミド等)、5α−レダクターゼ阻害薬(例、フィナステリド、デュタステリド、エプリステリド等)、副腎皮質ホルモン系薬剤(例、デキサメタゾン、プレドニゾロン、ベタメタゾン、トリアムシノロン等)、アンドロゲン合成阻害薬(例、アビラテロン等)、レチノイドおよびレチノイドの代謝を遅らせる薬剤(例、リアロゾール等)などが挙げられる。LH−RHアゴニスト(例、酢酸ゴセレリン、ブセレリン、リュープロレリン等)が好ましい。
「化学療法剤」としては、例えばアルキル化剤、代謝拮抗剤、抗癌性抗生物質、植物由来抗癌剤などが挙げられる。
「アルキル化剤」としては、例えば、ナイトロジェンマスタード、塩酸ナイトロジェンマスタード−N−オキシド、クロラムブチル、シクロフォスファミド、イホスファミド、チオテパ、カルボコン、トシル酸インプロスルファン、ブスルファン、塩酸ニムスチン、ミトブロニトール、メルファラン、ダカルバジン、ラニムスチン、リン酸エストラムスチンナトリウム、トリエチレンメラミン、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、ピポブロマン、エトグルシド、カルボプラチン、シスプラチン、ミボプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、アルトレタミン、アンバムスチン、塩酸ジブロスピジウム、フォテムスチン、プレドニムスチン、プミテパ、リボムスチン、テモゾロミド、トレオスルファン、トロフォスファミド、ジノスタチンスチマラマー、アドゼレシン、システムスチン、ビゼレシンなどが挙げられる。
「代謝拮抗剤」としては、例えば、メルカプトプリン、6−メルカプトプリンリボシド、チオイノシン、メトトレキサート、エノシタビン、シタラビン、シタラビンオクフォスファート、塩酸アンシタビン、5−FU系薬剤(例、フルオロウラシル、テガフール、UFT、ドキシフルリジン、カルモフール、ガロシタビン、エミテフール等)、アミノプテリン、ロイコボリンカルシウム、タブロイド、ブトシン、フォリネイトカルシウム、レボフォリネイトカルシウム、クラドリビン、エミテフール、フルダラビン、ゲムシタビン、ヒドロキシカルバミド、ペントスタチン、ピリトレキシム、イドキシウリジン、ミトグアゾン、チアゾフリン、アンバムスチンなどが挙げられる。
「抗癌性抗生物質」としては、例えば、アクチノマイシンD、アクチノマイシンC、マイトマイシンC、クロモマイシンA3、塩酸ブレオマイシン、硫酸ブレオマイシン、硫酸ペプロマイシン、塩酸ダウノルビシン、塩酸ドキソルビシン、塩酸アクラルビシン、塩酸ピラルビシン、塩酸エピルビシン、ネオカルチノスタチン、ミスラマイシン、ザルコマイシン、カルチノフィリン、ミトタン、塩酸ゾルビシン、塩酸ミトキサントロン、塩酸イダルビシンなどが挙げられる。
「植物由来抗癌剤」としては、例えば、エトポシド、リン酸エトポシド、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン、硫酸ビンデシン、テニポシド、パクリタキセル、ドセタクセル、ビノレルビンなどが挙げられる。
「免疫療法剤(BRM)」としては、例えば、ピシバニール、クレスチン、シゾフィラン、レンチナン、ウベニメクス、インターフェロン、インターロイキン、マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子、エリスロポイエチン、リンホトキシン、BCGワクチン、コリネバクテリウムパルブム、レバミゾール、ポリサッカライドK、プロコダゾールなどが挙げられる。
「細胞増殖因子ならびにその受容体の作用を阻害する薬剤」における「細胞増殖因子」としては、細胞の増殖を促進する物質であればどのようなものでもよく、通常、分子量が20,000以下のペプチドで、受容体との結合により低濃度で作用が発揮される因子が用いられ、具体的には、(1)EGF(epidermal growth factor)またはそれと実質的に同一の活性を有する物質〔例、EGF、ハレグリン(HER2リガンド)等〕、(2)インシュリンまたはそれと実質的に同一の活性を有する物質〔例、インシュリン、IGF(insulin−like growth factor)−1、IGF−2等〕、(3)FGF(fibroblast growth factor)またはそれと実質的に同一の活性を有する物質〔例、酸性FGF、塩基性FGF、KGF(keratinocyte growth factor)、FGF−10等〕、(4)その他の細胞増殖因子〔例、CSF(colony stimulating factor)、EPO(erythropoietin)、IL−2(interleukin−2)、NGF(nerve growth factor)、PDGF(platelet−derived growth factor)、TGFβ(transforming growth factor β)、HGF(hepatocyte growth factor)、VEGF(vascular endothelial growth factor)等〕などが挙げられる。
「細胞増殖因子の受容体」としては、前記の細胞増殖因子と結合能を有する受容体であればいかなるものであってもよく、具体的には、EGF受容体、ハレグリン受容体(HER2)、インシュリン受容体、IGF受容体、FGF受容体−1またはFGF受容体−2などが挙げられる。
「細胞増殖因子の作用を阻害する薬剤」としては、トラスツズマブ(ハーセプチン(商標);HER2抗体)、メシル酸イマチニブ、ZD1839またはセツキシマブ、VEGFに対する抗体(例、ベバシツマブ)、VEGF受容体に対する抗体、ゲフィチニブ、エルロチニブなどが挙げられる。
前記の薬剤の他に、L−アスパラギナーゼ、アセグラトン、塩酸プロカルバジン、プロトポルフィリン・コバルト錯塩、水銀ヘマトポルフィリン・ナトリウム、トポイソメラーゼI阻害薬(例、イリノテカン、トポテカン等)、トポイソメラーゼII阻害薬(例えば、ソブゾキサン等)、分化誘導剤(例、レチノイド、ビタミンD類等)、血管新生阻害薬(例、サリドマイド、SU11248等)、α−ブロッカー(例、塩酸タムスロシン、ナフトピジル、ウラピジル、アルフゾシン、テラゾシン、プラゾシン、シロドシン等)、セリン・スレオニンキナーゼ阻害薬、エンドセリン受容体拮抗薬(例、アトラセンタン等)、プロテアゾーム阻害薬(例、ボルテゾミブ等)、Hsp90阻害薬(例、17−AAG等)、スピロノラクトン、ミノキシジル、11α−ヒドロキシプロゲステロン、骨吸収阻害・転移抑制薬(例、ゾレドロン酸、アレンドロン酸、パミドロン酸、エチドロン酸、イバンドロン酸、クロドロン酸)なども用いることができる。
前記した中でも、併用薬物としては、LH−RHアゴニスト(例、酢酸ゴセレリン、ブセレリン、リュープロレリン等)、トラスツズマブ(HER2抗体)などが好ましい。
エネルギー代謝阻害剤と併用薬物の投与時期は限定されず、これらを投与対象に対し、同時に投与してもよいし、時間差をおいて投与してもよい。投与量は、臨床上用いられている用量を基準として適宜選択することができる。また、上記エネルギー代謝阻害剤と併用薬物の配合比は、投与対象、投与ルート、対象疾患、症状、組み合わせ等に応じて適宜選択することができる。
(2)試験化合物を細胞に接触させ、細胞内のエネルギー代謝を測定する、HER2発現癌の予防・治療薬のスクリーニング方法
本発明はまた、別の局面において、試験化合物を細胞に接触させ、細胞内のエネルギー代謝を測定することを特徴とするHER2発現癌の予防・治療薬のスクリーニング方法を提供する。
試験化合物を接触させる「細胞」としては、例えば、動物細胞、昆虫細胞などが用いられる。好ましくは、動物細胞、好ましくはヒト培養癌細胞などが用いられる。
動物細胞としては、例えば、サル細胞COS−7、Vero、チャイニーズハムスター細胞CHO、dhfr遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞CHO、マウスL細胞、マウスAtT−20細胞、マウスミエローマ細胞、マウスATDC5細胞、ラットGH3細胞、ヒトFL細胞、ヒト培養癌細胞〔例、ヒト乳癌細胞(例、BT−474、SK−BR−3など)、ヒト肺癌細胞(例、A549など)、ヒト大腸癌細胞(例、HT−29、HCT−116など)、ヒト膵癌細胞(例、AsPC−1、MIA−PaCa−2など)、ヒト卵巣癌細胞(例、OV−CAR−3、CaOV−3など)、ヒト腎臓癌(例、ACHNなど)など〕などが用いられる。
昆虫細胞としては、例えば、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞(Spodoptera frugiperda cell;Sf細胞)、Trichoplusia niの中腸由来のMG1細胞、Trichoplusia niの卵由来のHigh FiveTM細胞、Mamestra brassicae由来の細胞、Estigmena acrea由来の細胞、蚕由来株化細胞(Bombyx mori N細胞;BmN細胞)などが用いられる。該Sf細胞としては、例えば、Sf9細胞(ATCC CRL1711)、Sf21細胞(以上、In Vivo,13,213−217,(1977))などが用いられる。
上記動物細胞を培養する際、培地としては、例えば、約5〜20%の胎児牛血清を含むMEM培地〔Science,122巻,501(1952)〕,DMEM培地〔Virology,8巻,396(1959)〕,RPMI 1640培地〔The Journal of the American Medical Association 199巻,519(1967)〕,199培地〔Proceeding of the Society for the Biological Medicine,73巻,1(1950)〕などが用いられる。pHは約6〜8であるのが好ましい。培養は通常約30℃〜40℃で約15〜60時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
上記昆虫細胞を培養する際、培地としては、Grace′s Insect Medium(Grace,T.C.C.,Nature,195,788(1962))に非動化した10%ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のpHは約6.2〜6.4が好ましい。培養は通常約27℃で約3〜5日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
試験化合物としては、例えば、合成化合物、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などが用いられる。
スクリーニングの例として、以下の方法などが挙げられる。
(i)(a)HER2発現細胞を培養した場合と(b)試験化合物存在下、HER2発現細胞を培養した場合のエネルギー代謝阻害活性をそれぞれ測定し、比較することにより、エネルギー代謝阻害活性を有する化合物を選択する。
(i−1)具体例として、(a−1)HER2発現細胞を培養した場合と(b−1)試験化合物存在下、HER2発現細胞を培養した場合の細胞内ATP量をそれぞれ測定し、比較する方法などが挙げられる。
細胞内ATP量の測定は、公知の方法、例えば、蛍光ATP測定法(Journal of Immunologycal Methds.160巻、81−88頁、1993年)またはそれに準ずる方法などを用いる。
(i−2)具体例として、(a−2)HER2発現細胞を培養した場合と(b−2)試験化合物存在下、HER2発現細胞を培養した場合のミトコンドリア酸化還元活性をそれぞれ測定し、比較する方法などが挙げられる。
ミトコンドリア酸化還元活性の測定は、公知の方法、例えば、MTT測定法(Journal of Immunologycal Methds.65巻、55−63頁、1983年)またはそれに準ずる方法などを用いる。
HER2発現細胞およびHER2非発現細胞は、約1,000〜100,000個/ウェルで播種し、約24〜120時間培養する。
HER2発現細胞としては、例えば、上記「HER2発現癌」細胞などが用いられる。
例えば、上記(b)の場合におけるエネルギー代謝阻害活性が、上記(a)の場合におけるエネルギー代謝阻害活性に比べて、約20%以上、好ましくは30%以上、より好ましくは約50%以上阻害させる化合物を、エネルギー代謝阻害活性を阻害する化合物として選択する。
上記培養の際、培養液のグルコース濃度を減じて行ってもよく、酸素濃度を減じて行ってもよい。
さらに、上記(i)で得られた化合物については、(c)HER2非発現細胞を培養した場合と(d)該化合物存在下、HER2非発現細胞を培養した場合の細胞増殖活性をそれぞれ測定し、比較することにより、非特異的な増殖阻害作用を有する化合物を除いてもよい。例えば、上記(d)の場合における細胞増殖活性が、上記(c)の場合における細胞増殖活性に比べて、約20%以上、好ましくは30%以上、より好ましくは約50%以上減少させる試験化合物を、HER2発現細胞に選択的に増殖阻害作用を有する化合物として選択する。
細胞増殖は、公知の方法、例えば、Sulphorhodamine−B(SRB)色素染色法(Journal of National Cancer Institute.82巻,1107−1112頁,1990年)、BrdU 取込みELISA法(Journal of Immunology Methods.85巻、169−179頁、1985年)などを用いて測定する。
HER2発現細胞およびHER2非発現細胞は、約1,000〜100,000個/ウェルで播種し、約24〜120時間培養する。
HER2発現細胞としては、例えば、上記「HER2発現癌」細胞などが用いられる。
(ii)(e)HER2発現細胞を培養した場合と(f)試験化合物存在下、HER2発現細胞を培養した場合の、AMPKタンパク質の活性をそれぞれ測定し、比較することにより、AMPKタンパク質を活性化する化合物(エネルギー代謝阻害の模倣剤)を選択する。
(ii−1)具体例として、(e−1)HER2発現細胞を培養した場合と(f−1)試験化合物存在下、HER2発現細胞を培養した場合の、AMPKタンパク質のリン酸化をそれぞれ測定し、比較する方法が挙げられる。
(ii−2)具体例として、(e−2)HER2発現細胞を培養した場合と(f−2)試験化合物存在下、HER2発現細胞を培養した場合の、AMPKの基質タンパク質のリン酸化をそれぞれ測定し、比較する方法が挙げられる。
AMPKの基質タンパク質としては、p70 S6Kタンパク質、ACCタンパク質などが挙げられる(Journal of Cell Science.117巻、5479−5487頁、2004年)。
AMPKタンパク質のリン酸化、およびAMPKの基質タンパク質のリン酸化の検出は、公知の方法に従って行う。例えば、培養後、SDSサンプルバッファーを直接、または抽出操作(例、RIPA緩衝液などを用いた抽出など)後に添加し、細胞を溶解する。得られた細胞溶解液をSDS−PAGE法にて分離し、リン酸化AMPKタンパク質に特異的な抗体、またはAMPKの基質タンパク質のリン酸化に特異的な抗体などを用いてウェスタンブロッティング法を行う。
HER2発現細胞は、約1,000〜100,000個/ウェルで播種し、約2〜24時間培養する。
HER2発現細胞としては、例えば、上記「HER2発現癌」細胞などが用いられる。
例えば、上記(f)の場合におけるAMPKタンパク質の活性が、上記(e)の場合におけるAMPKタンパク質の活性に比べて、約20%以上、好ましくは30%以上、より好ましくは約50%以上亢進させる化合物を、AMPKタンパク質を活性化する化合物(エネルギー代謝阻害の模倣剤)として選択する。
上記(i)および(ii)で得られる化合物は、エネルギー代謝阻害活性、またはエネルギー代謝阻害を模倣する活性(例、AMPK活性化作用)を有し、HER2発現細胞に選択的な増殖阻害作用を有するため、HER2発現癌に特異的で安全な低毒性の化合物である。従って、例えば、ヒトまたは温血動物(例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、トリ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど)に対して経口的にまたは非経口的にHER2発現癌の予防・治療薬として、投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、その作用、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、乳癌の治療の目的で該化合物を経口投与する場合、一般的に成人(体重60kgとして)においては、一日につき該化合物またはその塩を約0.1〜100mg、好ましくは約1.0〜50mg、より好ましくは約1.0〜20mg投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物またはその塩の投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、乳癌の治療の目的で該化合物を注射剤の形で通常成人(体重60kgとして)に投与する場合、一日につき該化合物またはその塩を約0.01〜30mg、好ましくは約0.1〜20mg、より好ましくは約0.1〜10mgを癌病変部に注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重60kg当たりに換算した量を投与することができる。
(3)エネルギー代謝を阻害またはエネルギー代謝の阻害を模倣することを特徴とするHER2発現癌の予防・治療方法
本発明はまた、別の局面において、細胞のエネルギー代謝を阻害またはエネルギー代謝の阻害を模倣することを特徴とするHER2発現癌の予防・治療方法を提供する。
細胞のエネルギー代謝には、ATP産生、トランスポーター、AMP活性化プロテインキナーゼなどが直接または間接的に関与しており、したがって、「エネルギー代謝を阻害すること」としては、典型的には、例えば、ATP産生を阻害すること、トランスポーター活性を阻害することなどが含まれる。
好ましい態様では、エネルギー代謝は、ATP産生に直接関与するものであり、これは例えば、糖代謝に関するものである。糖代謝としては、ミトコンドリア活性に関するもの、および解糖系に関するものが含まれる。ミトコンドリア活性には、電子伝達系が関与するもの、およびTCA回路が関与するものが含まれる。また、電子伝達系が関与するものとしては、呼吸鎖複合体I、II、III、IV、およびVから選ばれる少なくとも一種が関与するものが挙げられる。
また、エネルギー代謝の阻害を模倣することには、細胞のエネルギー代謝を直接阻害することなく、エネルギー代謝の阻害状態または飢餓状態により生じる細胞の生理反応(例、タンパク質のリン酸化および脱リン酸化、活性酸素産生量の変動、酵素活性の変動、mRNA転写・翻訳の変動、タンパク質分解および合成の変動など)を、例えば、合成化合物、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などの作用により誘導することが含まれる。好ましい例としては、AMP活性化プロテインキナーゼを活性化する作用を有する物質を細胞または被験体に投与することによって、AMP活性化プロテインキナーゼを活性化することが挙げられる。
上記本発明のHER2発現癌の予防・治療方法は、例えば、上記(1)に記載したエネルギー代謝阻害剤またはエネルギー代謝阻害模倣剤の有効量を被験体(例えば、哺乳動物、好ましくは、ヒト)に対して投与することを含む。あるいは、例えば、上記(2)に記載したスクリーニング方法によって得られた化合物の有効量を被験体(例えば、哺乳動物、好ましくは、ヒト)に投与することを含む。しかしながら、本発明の範囲は、これらの特定の態様に限定されず、細胞内のエネルギー代謝を直接または間接的に阻害する作用を奏する任意の化合物または条件を目的の細胞に提供することによって、該細胞のエネルギー代謝を阻害することもまた、本発明の範囲内である。
本明細書および配列表において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、IUPAC−IUB Commission on Biochemical Nomenclatureによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければL体を示すものとする。
DNA :デオキシリボ核酸
cDNA :相補的デオキシリボ核酸
A :アデニン
T :チミン
G :グアニン
C :シトシン
RNA :リボ核酸
mRNA :メッセンジャーリボ核酸
dATP :デオキシアデノシン三リン酸
dTTP :デオキシチミジン三リン酸
dGTP :デオキシグアノシン三リン酸
dCTP :デオキシシチジン三リン酸
ATP :アデノシン三リン酸
EDTA :エチレンジアミン四酢酸
SDS :ドデシル硫酸ナトリウム
Gly :グリシン
Ala :アラニン
Val :バリン
Leu :ロイシン
Ile :イソロイシン
Ser :セリン
Thr :スレオニン
Cys :システイン
Met :メチオニン
Glu :グルタミン酸
Asp :アスパラギン酸
Lys :リジン
Arg :アルギニン
His :ヒスチジン
Phe :フェニルアラニン
Tyr :チロシン
Trp :トリプトファン
Pro :プロリン
Asn :アスパラギン
Gln :グルタミン
pGlu :ピログルタミン酸
Sec :セレノシステイン(selenocysteine)
本願明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
〔配列番号:1〕
ヒトHER2のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号:2〕
ヒトHER2をコードするcDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号:3〕
マウスHER2のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号:4〕
マウスHER2をコードするcDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号:5〕
ラットHER2のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号:6〕
ラットHER2をコードするcDNAの塩基配列を示す。
本発明は、細胞のエネルギー代謝の抑制またはエネルギー代謝抑制の模倣により、HER2発現細胞の増殖が顕著に阻害されることを見出したことに基づいている。したがって、本発明は、一つの局面において、エネルギー代謝阻害剤またはエネルギー代謝阻害模倣剤を含有してなるHER2発現癌の予防・治療薬を提供する。
「エネルギー代謝阻害剤」としては、細胞のエネルギー代謝を阻害する作用を有する物質(例、合成化合物、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿など)が含まれ、これらの物質自体であっても、該物質を含む剤であってもよい。細胞のエネルギー代謝には、ATP産生、トランスポーター、AMP活性化プロテインキナーゼなどが直接または間接的に関与しており、したがって、「エネルギー代謝阻害剤」としては、典型的には、例えば、ATP産生阻害剤、トランスポーター活性阻害剤などが挙げられる。
「細胞」としては、例えば、動物細胞(例、哺乳動物の細胞)、昆虫細胞などが含まれる。好ましくは、動物細胞であり、より好ましくはヒト細胞であり、最も好ましくは、ヒト癌細胞、特にHER2発現細胞である。
「ATP産生阻害剤」としては、ATP産生を阻害する作用を有する物質(例、合成化合物、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿など)自体であっても、該物質を含む剤であってもよく、例えば、糖代謝阻害剤、アミノ酸代謝阻害剤、脂質代謝阻害剤などが挙げられる。
「糖代謝阻害剤」としては、糖代謝を阻害する作用を有する物質(例、合成化合物、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿など)自体であっても、該物質を含む剤であってもよく、例えば、ミトコンドリア活性阻害剤、解糖系阻害剤などが挙げられる。
「ミトコンドリア活性阻害剤」としては、ミトコンドリアの活性・機能を阻害する作用を有する物質(例、合成化合物、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿など)自体であっても、該物質を含む剤であってもよく、例えば、電子伝達系阻害剤、TCA回路阻害剤などが挙げられる。また、例えば、低酸素状態の誘導、糖、脂質、アミノ酸等の栄養供給を制限するなどして、好気的代謝を抑制することは、ミトコンドリア活性阻害剤を使用することと等価なものと考えることができる。
「電子伝達系阻害剤」としては、電子伝達系を阻害する作用を有する物質(例、合成化合物、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿など)自体であっても、該物質を含む剤であってもよく、例えば、呼吸鎖複合体I、II、III、IVおよびVから選ばれる少なくとも一種を阻害する剤などが挙げられる。
「呼吸鎖複合体I、II、III、IVおよびVから選ばれる少なくとも一種を阻害する剤」としては、呼吸鎖複合体I、II、III、IVおよびVから選ばれる少なくとも−種を阻害する作用を有する物質(例、合成化合物、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿など)自体であっても、該物質を含む剤であってもよく、例えば、複合体Iに対するロテノン、ピエリシヂン、ミクソチアゾール、カプサイシン、アセトゲニン、アラキドン酸など;複合体IIに対するマロン酸、ジメチルコハク酸、TTFA(2−Thenoyltrifluoroacetone)など;複合体IIIに対するアンチマイシン、スティグマテリン、アラキドン酸;複合体VIに対するアジ化ナトリウム、シアニド、硫化水素、ハイドロコルチゾン、デクサメサゾンなど;複合体Vに対する2,4−ジニトロフェノール、バリノマイシン、オリゴマイシン;FCCP〔カルボニル シアニド−4−(トリフルオロメトキシ)フェニルヒドラゾン〕などが挙げられる。
「TCA回路阻害剤」としては、TCA回路を阻害する作用を有する物質(例、合成化合物、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿など)自体であっても、該物質を含む剤であってもよく、例えば、トリフルオロ酢酸、サリチル酸などが挙げられる。
「解糖系阻害剤」としては、解糖系を阻害する作用を有する物質(例、合成化合物、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿など)自体であっても、該物質を含む剤であってもよく、例えば、2−デオキシグルコース、フッ化ナトリウム、リチウムヨード酢酸などが挙げられる。
「アミノ酸代謝阻害剤」としては、アミノ酸代謝を阻害する作用を有する物質(例、合成化合物、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿など)自体であっても、該物質を含む剤であってもよく、例えば、アミノ基転移阻害剤(例、アミノオキシアセチル酸など)、脱アミノ基阻害剤、脱カルボン酸阻害剤などが挙げられる。
「脂質代謝阻害剤」としては、脂質代謝を阻害する作用を有する物質(例、合成化合物、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿など)自体であっても、該物質を含む剤であってもよく、例えば、ベータ−酸化阻害剤(例、テトラデシルグリシル酸(Tetradecylglycidic acid)など)などが挙げられる。
「トランスポーター活性阻害剤」としては、細胞のトランスポーター活性を阻害する作用を有する物質(例、合成化合物、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿など)が含まれ、これらの物質自体であっても、該物質を含む剤であってもよい。例えば、グルコーストランスポーター阻害剤(例、フロリジンなど)、ピルビン酸・乳酸トランスポーター阻害剤(例、シアノ−4−ヒドロキシシンナメート(α−cyano−4−hydroxycinnamate)、p−クロロメルクリ安息香酸(p−chloromercuribenzenesulfonic acid)など)、アミノ酸トランスポーター阻害剤(例、2−アミノビシクロヘプタンカルボン酸(2−aminobicyclo−(2,2,1)−heptane−2−carboxylic acid(BCH))など)などが、「トランスポーター活性阻害剤」の例として挙げられるが、これらに限定されず、トランスポーターの活性を阻害し細胞のエネルギー代謝に必要な基質の供給を抑えることによって、細胞のエネルギー代謝を阻害する作用を奏することができる任意の物質が含まれる。
「エネルギー代謝阻害模倣剤」としては、細胞のエネルギー代謝を直接阻害することなく、エネルギー代謝の阻害状態または飢餓状態により生じる細胞の生理反応(例、タンパク質のリン酸化および脱リン酸化、活性酸素産生量の変動、酵素活性の変動、mRNA転写・翻訳の変動、タンパク質分解および合成の変動など)を誘導する物質(例、合成化合物、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿など)が含まれ、これらの物質自体であっても、該物質を含む剤であってもよく、例えば、AMP活性化プロテインキナーゼ活性化剤などが挙げられる。
「AMP活性化プロテインキナーゼ活性化剤」としては、AMP活性化プロテインキナーゼを活性化する作用を有する物質(例、合成化合物、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿など)が含まれ、これらの物質自体であっても、該物質を含む剤であってもよい。例えば、メトフォルミン、フェンフォルミン、ブフォルミン、AICAR(5−アミノイミダゾール−4−カルボキサミドリボヌクレオシド)、インスリン抵抗性改善剤〔例、トログリタゾン(Troglitazone)、ピオグリタゾン(Pioglitazone)またはその塩(好ましくは塩酸塩)、ロシグリタゾン(Rosiglitazone)またはその塩(好ましくはマレイン酸塩)、レグリキサン(Reglixane)、ネトグリタゾン(Netoglitazone)、リボグリタゾン(Rivoglitazone)、エダグリタゾン(Edaglitazone)、テサグリタザール(Tesaglitazar)、ラガグリタザール(Ragaglitazar)、ムラグリタザール(Muraglitazar)、メタグリダセン(Metaglidasen)、ナベグリタザール(Naveglitazar)、バラグリタゾン(Balaglitazone)など〕などが挙げられるが、これらに限定されず、AMP活性化プロテインキナーゼを活性化し、HER2のリン酸化を抑制する任意の物質が含まれる。なお、「AMP活性化プロテインキナーゼ活性化剤」が、上記「ミトコンドリア活性阻害剤」としての作用を有していてもよい。
HER2(以下、本発明のタンパク質または本発明で用いられるタンパク質と称することもある)は、ヒトや温血動物(例、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど)の細胞(例、網膜細胞、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞(例、マクロファージ、T細胞、B細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球、血小板など)、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくは癌細胞など)もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位(例、網膜、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳)、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管(例、大腸、小腸)、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋など、または血球系の細胞もしくはその培養細胞(例えば、MEL、M1、CTLL−2、HT−2、WEHI−3、HL−60、JOSK−1、K562、ML−1、MOLT−3、MOLT−4、MOLT−10、CCRF−CEM、TALL−1、Jurkat、CCRT−HSB−2、KE−37、SKW−3、HUT−78、HUT−102、H9、U937、THP−1、HEL、JK−1、CMK、KO−812、MEG−01など)に由来するタンパク質であってもよく、合成タンパク質であってもよい。
HER2としては、配列番号:1、配列番号:3または配列番号:5で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩が挙げられる。
配列番号:1、配列番号:3または配列番号:5で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号:1、配列番号:3または配列番号:5で表わされるアミノ酸配列と約50%以上、好ましくは約60%以上、さらに好ましくは約70%以上、より好ましくは約80%以上、特に好ましくは約90%以上、最も好ましくは約95%以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
アミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST(National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)を用い、以下の条件(期待値=10;ギャップを許す;マトリクス=BLOSUM62;フィルタリング=OFF)にて計算することができる。
配列番号:1、配列番号:3または配列番号:5で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、前記の配列番号:1、配列番号:3または配列番号:5で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号:1、配列番号:3または配列番号:5で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。
実質的に同質の活性としては、例えばHER2作用などが挙げられる。実質的に同質とは、それらの性質が性質的に(例、生理学的に、または薬理学的に)同質であることを示す。したがって、HER2作用などが同等(例、約0.01〜100倍、好ましくは約0.1〜10倍、より好ましくは0.5〜2倍)であることが好ましいが、これらの活性の程度、タンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
また、本発明のタンパク質としては、例えば、(i)配列番号:1、配列番号:3または配列番号:5で表されるアミノ酸配列中の1または2個以上(例えば1〜100個程度、好ましくは1〜30個程度、好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは数(1〜5)個)のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、(ii)配列番号:1、配列番号:3または配列番号:5で表されるアミノ酸配列に1または2個以上(例えば1〜100個程度、好ましくは1〜30個程度、好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは数(1〜5)個)のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、(iii)配列番号:1、配列番号:3または配列番号:5で表されるアミノ酸配列に1または2個以上(例えば1〜100個程度、好ましくは1〜30個程度、好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは数(1〜5)個)のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、(iv)配列番号:1、配列番号:3または配列番号:5で表されるアミノ酸配列中の1または2個以上(例えば1〜100個程度、好ましくは1〜30個程度、好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは数(1〜5)個)のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または(v)それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質などのいわゆるムテインも含まれる。
上記のようにアミノ酸配列が挿入、欠失または置換されている場合、その挿入、欠失または置換の位置としては、とくに限定されない。
本明細書におけるタンパク質は、ペプチド標記の慣例に従って左端がN末端(アミノ末端)、右端がC末端(カルボキシル末端)である。配列番号:1で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質をはじめとする、本発明で用いられるタンパク質は、C末端がカルボキシル基(−COOH)、カルボキシレート(−COO−)、アミド(−CONH2)またはエステル(−COOR)の何れであってもよい。
ここでエステルにおけるRとしては、例えば、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチルなどのC1−6アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのC3−8シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのC6−12アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−C1−2アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−C1−2アルキル基などのC7−14アラルキル基、ピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
本発明で用いられるタンパク質がC末端以外にカルボキシル基(またはカルボキシレート)を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明で用いられるタンパク質に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したC末端のエステルなどが用いられる。
さらに、本発明で用いられるタンパク質には、N末端のアミノ酸残基(例、メチオニン残基)のアミノ基が保護基(例えば、ホルミル基、アセチル基などのC1−6アルカノイルなどのC1−6アシル基など)で保護されているもの、生体内で切断されて生成するN末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基(例えば−OH、−SH、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など)が適当な保護基(例えば、ホルミル基、アセチル基などのC1−6アルカノイル基などのC1−6アシル基など)で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質なども含まれる。
本発明で用いられるタンパク質の具体例としては、例えば、配列番号:1で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号:3で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号:5で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質などがあげられる。
本発明で用いられるタンパク質の部分ペプチドとしては、前記した本発明で用いられるタンパク質の部分ペプチドであって、好ましくは、前記した本発明で用いられるタンパク質と同様の性質を有するものであればいずれのものでもよい。
例えば、本発明で用いられるタンパク質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも20個以上、好ましくは50個以上、さらに好ましくは70個以上、より好ましくは100個以上、最も好ましくは200個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが用いられる。
また、本発明で用いられる部分ペプチドは、そのアミノ酸配列中の1または2個以上(好ましくは1〜20個程度、より好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは数(1〜5)個)のアミノ酸が欠失し、または、そのアミノ酸配列に1または2個以上(好ましくは1〜20個程度、より好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは数(1〜5)個)のアミノ酸が付加し、または、そのアミノ酸配列に1または2個以上(好ましくは1〜20個程度、より好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは数(1〜5)個)のアミノ酸が挿入され、または、そのアミノ酸配列中の1または2個以上(好ましくは1〜20個程度、より好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは数(1〜5)個)のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。
また、本発明で用いられる部分ペプチドはC末端がカルボキシル基(−COOH)、カルボキシレート(−COO−)、アミド(−CONH2)またはエステル(−COOR)の何れであってもよい。
さらに、本発明で用いられる部分ペプチドには、前記した本発明で用いられるタンパク質と同様に、C末端以外にカルボキシル基(またはカルボキシレート)を有しているもの、N末端のアミノ酸残基(例、メチオニン残基)のアミノ基が保護基で保護されているもの、N端側が生体内で切断され生成したグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
本発明で用いられる部分ペプチドは抗体作成のための抗原としても用いることができる。
本発明で用いられるタンパク質または部分ペプチドの塩としては、生理学的に許容される酸(例、無機酸、有機酸)や塩基(例、アルカリ金属塩)などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸(例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸)との塩、あるいは有機酸(例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸)との塩などが用いられる。
本発明で用いられるタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩は、前述したヒトや温血動物の細胞または組織から自体公知のタンパク質の精製方法によって製造することもできるし、タンパク質をコードするDNAを含有する形質転換体を培養することによっても製造することができる。また、公知のペプチド合成法に準じて製造することもできる。
ヒトや哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、ヒトや哺乳動物の組織または細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出を行ない、該抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができる。
本発明で用いられるタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、前述した本発明で用いられるタンパク質をコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。好ましくはDNAである。DNAとしては、ゲノムDNA、ゲノムDNAライブラリー、前記した細胞・組織由来のcDNA、前記した細胞・組織由来のcDNAライブラリー、合成DNAのいずれでもよい。
ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織よりtotalRNAまたはmRNA画分を調製したものを用いて直接Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction(以下、RT−PCR法と略称する)によって増幅することもできる。
本発明で用いられるタンパク質をコードするDNAとしては、例えば、配列番号:2、配列番号:4または配列番号:6で表される塩基配列を含有するDNA、または配列番号:2、配列番号:4または配列番号:6で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、前記した配列番号:1、配列番号:3または配列番号:5で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするDNAであれば何れのものでもよい。
配列番号:2、配列番号:4または配列番号:6で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるDNAとしては、例えば、配列番号:2、配列番号:4または配列番号:6で表される塩基配列と約50%以上、好ましくは約60%以上、さらに好ましくは約70%以上、より好ましくは約80%以上、特に好ましくは約90%以上、最も好ましくは約95%以上の相同性を有する塩基配列を含有するDNAなどが用いられる。
塩基配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST(National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)を用い、以下の条件(期待値=10;ギャップを許す;フィルタリング=ON;マッチスコア=1;ミスマッチスコア=−3)にて計算することができる。
ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、Molecular Cloning 2nd(J.Sambrook et al.,Cold Spring Harbor Lab.Press,1989)に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行うことができる。
ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約19〜40mM、好ましくは約19〜20mMで、温度が約50〜70℃、好ましくは約60〜65℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約19mMで温度が約65℃の場合が最も好ましい。
より具体的には、配列番号:1で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするDNAとしては、配列番号:2で表される塩基配列を含有するDNAなどが、配列番号:3で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするDNAとしては、配列番号:4で表される塩基配列を含有するDNAなどが、配列番号:5で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするDNAとしては、配列番号:6で表される塩基配列を含有するDNAなどが用いられる。
本発明で用いられる部分ペプチドをコードするDNAとしては、前述した本発明で用いられる部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムDNA、ゲノムDNAライブラリー、前記した細胞・組織由来のcDNA、前記した細胞・組織由来のcDNAライブラリー、合成DNAのいずれでもよい。
本発明で用いられる部分ペプチドをコードするDNAとしては、例えば、配列番号:2、配列番号:4または配列番号:6で表される塩基配列を含有するDNAの一部分を有するDNA、または配列番号:2、配列番号:4または配列番号:6で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、本発明のタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質をコードするDNAの一部分を含有するDNAなどが用いられる。
配列番号:2、配列番号:4または配列番号:6で表される塩基配列とハイブリダイズできるDNAは、前記と同意義を示す。
ハイブリダイゼーションの方法およびハイストリンジェントな条件は前記と同様のものが用いられる。
本発明で用いられるタンパク質、部分ペプチド(以ド、これらをコードするDNAのクローニングおよび発現の説明においては、これらを単に本発明のタンパク質と略記する場合がある)を完全にコードするDNAのクローニングの手段としては、本発明のタンパク質をコードする塩基配列の一部分を有する合成DNAプライマーを用いてPCR法によって増幅するか、または適当なベクターに組み込んだDNAを本発明のタンパク質の一部あるいは全領域をコードするDNA断片もしくは合成DNAを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、Molecular Cloning 2nd Ed(J.Sambrook et al.,Cold Spring Harbor Lab.Press,1989)に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
DNAの塩基配列の変換は、PCR、公知のキット、例えば、MutanTM−super Express Km(宝酒造(株))、MutanTM−K(宝酒造(株))等を用いて、ODA−LA PCR法、Gapped duplex法、Kunkel法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行うことができる。
クローン化されたタンパク質をコードするDNAは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該DNAはその5’末端側に翻訳開始コドンとしてのATGを有し、また3’末端側には翻訳終止コドンとしてのTAA、TGAまたはTAGを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成DNAアダプターを用いて付加することもできる。
本発明のタンパク質の発現ベクターは、公知の方法、例えば、(i)本発明のタンパク質をコードするDNAから目的とするDNA断片を切り出し、(ii)該DNA断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
「HER2発現癌」とは、HER2(好ましくは、配列番号:1、配列番号:3または配列番号:5で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチド)が発現している癌細胞であれば、いずれの癌細胞でもよい。例えば、公知の方法、遺伝子検出方法〔例、FISH(fluorescence in situ hybridization method)、CISH(chromosome in situ hybridization method)、PCR(polymerase chain reaction method)、サザンブロット法など〕、メッセンジャーRNA検出方法〔例、RT−PCR(Reverse Transcriptase PCR)、ISH(in situ hybridization method)、ノーザンブロット法など〕、タンパク質検出方法〔例、IHC(immuno−histo−chemistry method)、ウェスタンブロット法、ELISA(Enzyme−linked immunesorbent assay)など〕などの方法で、HER2遺伝子、HER2のメッセンジャーRNA、HER2タンパク質が検出される癌細胞などが挙げられる。
エネルギー代謝(好ましくは、糖代謝など)を阻害する、またはエネルギー代謝阻害を模倣することにより、HER2発現細胞の増殖が阻害され、HER2の脱リン酸化が起こり、またはHER2のシグナルが阻害される。「HER2のシグナル」としては、例えば、癌細胞の増殖シグナル、抗アポトーシスシグナル、浸潤シグナル、転移シグナルなどが挙げられる。
従って、エネルギー代謝阻害剤およびエネルギー代謝阻害模倣剤は、HER2発現癌の予防・治療薬として有用であり、例えば、癌(例、脳腫瘍、下垂体腺腫、神経膠腫、聴神経鞘腫、網膜肉腫、甲状腺癌、咽頭癌、喉頭癌、舌癌、胸腺腫、中皮腫、乳癌、肺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、胃癌、食道癌、十二指腸癌、大腸癌、結腸癌、直腸癌、肝臓癌、肝細胞癌、膵癌、膵内分泌腫瘍、胆管癌、胆嚢癌、陰茎癌、腎臓癌、腎盂癌、尿管癌、腎細胞癌、精巣腫瘍、前立腺癌、膀胱癌、外陰癌、子宮癌、子宮頚部癌、子宮体部癌、子宮肉腫、絨毛性疾患、膣癌、卵巣癌、卵巣胚細胞腫瘍、皮膚癌、悪性黒色腫、菌状息肉症、基底細胞腫、軟部肉腫、悪性リンパ腫、ホジキン病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、成人T細胞白血病、慢性骨髄増殖性疾患、膵内分泌腫瘍、線維性組織球腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、原発不明癌など、好ましくは乳癌など)、アテローム性動脈硬化症、血管新生(例、固形癌および肉腫の成長にともなう血管新生、腫瘍の転移にともなう血管新生、および糖尿病性網膜症にともなう血管新生など)、ウイルス性疾患(例、HIV感染など)、関節リウマチなどの予防・治療薬などとして、さらには、癌の転移・再発抑制薬、癌細胞のアポトーシス促進薬などとして安全な医薬として使用することができる。
エネルギー代謝阻害剤およびエネルギー代謝阻害模倣剤は、必要に応じ、常套手段に従って製剤化すればよい。
エネルギー代謝阻害剤およびエネルギー代謝阻害模倣剤は、HER2発現癌に対し、より強い増殖阻害作用を示すことより、例えば、HER2が発現しており、糖代謝が亢進している患者に対し、HER2発現癌の予防・治療のために投与されることにより、優れた臨床効果を示す。この結果、不必要な投薬を減らし、副作用の危険を減弱するとともに、該患者に対する治療効果を上げることができる。
HER2が発現しており、糖代謝が亢進している患者としては、例えば、HER2(好ましくは、配列番号:1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチド)が発現しており、公知の方法で糖代謝が亢進していると判断される患者、例えばPET(Positron Emission Tomography)により癌の存在が認識される患者、血管造影、MRI(magnetic resonance imageing)などの方法で癌への血流が認識される患者などが挙げられる。
エネルギー代謝阻害剤およびエネルギー代謝阻害模倣剤は、ホルモン療法剤、抗癌剤(例、化学療法剤、免疫療法剤、または細胞増殖因子ならびにその受容体の作用を阻害する薬剤)など(以下、併用薬物と略記する)と併用して使用することができる。
「ホルモン療法剤」としては、例えば、ホスフェストロール、ジエチルスチルベストロール、クロロトリアニセン、酢酸メドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロール、酢酸クロルマジノン、酢酸シプロテロン、ダナゾール、ジエノゲスト、アソプリスニル、アリルエストレノール、ゲストリノン、ノメゲストロール、タデナン、メパルトリシン、ラロキシフェン、オルメロキシフェン、レポルメロキシフェン、抗エストロゲン(例、クエン酸タモキシフェン、クエン酸トレミフェン等)、ERダウンレギュレーター(例、フルベストラント等)、ヒト閉経ゴナドトロピン、卵胞刺激ホルモン、ピル製剤、メピチオスタン、テストロラクトン、アミノグルテチイミド、LH−RHアゴニスト(例、酢酸ゴセレリン、ブセレリン、リュープロレリン等)、ドロロキシフェン、エピチオスタノール、スルホン酸エチニルエストラジオール、アロマターゼ阻害薬(例、塩酸ファドロゾール、アナストロゾール、レトロゾール、エキセメスタン、ボロゾール、フォルメスタン等)、抗アンドロゲン(例、フルタミド、ビカルタミド、ニルタミド等)、5α−レダクターゼ阻害薬(例、フィナステリド、デュタステリド、エプリステリド等)、副腎皮質ホルモン系薬剤(例、デキサメタゾン、プレドニゾロン、ベタメタゾン、トリアムシノロン等)、アンドロゲン合成阻害薬(例、アビラテロン等)、レチノイドおよびレチノイドの代謝を遅らせる薬剤(例、リアロゾール等)などが挙げられる。LH−RHアゴニスト(例、酢酸ゴセレリン、ブセレリン、リュープロレリン等)が好ましい。
「化学療法剤」としては、例えばアルキル化剤、代謝拮抗剤、抗癌性抗生物質、植物由来抗癌剤などが挙げられる。
「アルキル化剤」としては、例えば、ナイトロジェンマスタード、塩酸ナイトロジェンマスタード−N−オキシド、クロラムブチル、シクロフォスファミド、イホスファミド、チオテパ、カルボコン、トシル酸インプロスルファン、ブスルファン、塩酸ニムスチン、ミトブロニトール、メルファラン、ダカルバジン、ラニムスチン、リン酸エストラムスチンナトリウム、トリエチレンメラミン、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、ピポブロマン、エトグルシド、カルボプラチン、シスプラチン、ミボプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、アルトレタミン、アンバムスチン、塩酸ジブロスピジウム、フォテムスチン、プレドニムスチン、プミテパ、リボムスチン、テモゾロミド、トレオスルファン、トロフォスファミド、ジノスタチンスチマラマー、アドゼレシン、システムスチン、ビゼレシンなどが挙げられる。
「代謝拮抗剤」としては、例えば、メルカプトプリン、6−メルカプトプリンリボシド、チオイノシン、メトトレキサート、エノシタビン、シタラビン、シタラビンオクフォスファート、塩酸アンシタビン、5−FU系薬剤(例、フルオロウラシル、テガフール、UFT、ドキシフルリジン、カルモフール、ガロシタビン、エミテフール等)、アミノプテリン、ロイコボリンカルシウム、タブロイド、ブトシン、フォリネイトカルシウム、レボフォリネイトカルシウム、クラドリビン、エミテフール、フルダラビン、ゲムシタビン、ヒドロキシカルバミド、ペントスタチン、ピリトレキシム、イドキシウリジン、ミトグアゾン、チアゾフリン、アンバムスチンなどが挙げられる。
「抗癌性抗生物質」としては、例えば、アクチノマイシンD、アクチノマイシンC、マイトマイシンC、クロモマイシンA3、塩酸ブレオマイシン、硫酸ブレオマイシン、硫酸ペプロマイシン、塩酸ダウノルビシン、塩酸ドキソルビシン、塩酸アクラルビシン、塩酸ピラルビシン、塩酸エピルビシン、ネオカルチノスタチン、ミスラマイシン、ザルコマイシン、カルチノフィリン、ミトタン、塩酸ゾルビシン、塩酸ミトキサントロン、塩酸イダルビシンなどが挙げられる。
「植物由来抗癌剤」としては、例えば、エトポシド、リン酸エトポシド、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン、硫酸ビンデシン、テニポシド、パクリタキセル、ドセタクセル、ビノレルビンなどが挙げられる。
「免疫療法剤(BRM)」としては、例えば、ピシバニール、クレスチン、シゾフィラン、レンチナン、ウベニメクス、インターフェロン、インターロイキン、マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子、エリスロポイエチン、リンホトキシン、BCGワクチン、コリネバクテリウムパルブム、レバミゾール、ポリサッカライドK、プロコダゾールなどが挙げられる。
「細胞増殖因子ならびにその受容体の作用を阻害する薬剤」における「細胞増殖因子」としては、細胞の増殖を促進する物質であればどのようなものでもよく、通常、分子量が20,000以下のペプチドで、受容体との結合により低濃度で作用が発揮される因子が用いられ、具体的には、(1)EGF(epidermal growth factor)またはそれと実質的に同一の活性を有する物質〔例、EGF、ハレグリン(HER2リガンド)等〕、(2)インシュリンまたはそれと実質的に同一の活性を有する物質〔例、インシュリン、IGF(insulin−like growth factor)−1、IGF−2等〕、(3)FGF(fibroblast growth factor)またはそれと実質的に同一の活性を有する物質〔例、酸性FGF、塩基性FGF、KGF(keratinocyte growth factor)、FGF−10等〕、(4)その他の細胞増殖因子〔例、CSF(colony stimulating factor)、EPO(erythropoietin)、IL−2(interleukin−2)、NGF(nerve growth factor)、PDGF(platelet−derived growth factor)、TGFβ(transforming growth factor β)、HGF(hepatocyte growth factor)、VEGF(vascular endothelial growth factor)等〕などが挙げられる。
「細胞増殖因子の受容体」としては、前記の細胞増殖因子と結合能を有する受容体であればいかなるものであってもよく、具体的には、EGF受容体、ハレグリン受容体(HER2)、インシュリン受容体、IGF受容体、FGF受容体−1またはFGF受容体−2などが挙げられる。
「細胞増殖因子の作用を阻害する薬剤」としては、トラスツズマブ(ハーセプチン(商標);HER2抗体)、メシル酸イマチニブ、ZD1839またはセツキシマブ、VEGFに対する抗体(例、ベバシツマブ)、VEGF受容体に対する抗体、ゲフィチニブ、エルロチニブなどが挙げられる。
前記の薬剤の他に、L−アスパラギナーゼ、アセグラトン、塩酸プロカルバジン、プロトポルフィリン・コバルト錯塩、水銀ヘマトポルフィリン・ナトリウム、トポイソメラーゼI阻害薬(例、イリノテカン、トポテカン等)、トポイソメラーゼII阻害薬(例えば、ソブゾキサン等)、分化誘導剤(例、レチノイド、ビタミンD類等)、血管新生阻害薬(例、サリドマイド、SU11248等)、α−ブロッカー(例、塩酸タムスロシン、ナフトピジル、ウラピジル、アルフゾシン、テラゾシン、プラゾシン、シロドシン等)、セリン・スレオニンキナーゼ阻害薬、エンドセリン受容体拮抗薬(例、アトラセンタン等)、プロテアゾーム阻害薬(例、ボルテゾミブ等)、Hsp90阻害薬(例、17−AAG等)、スピロノラクトン、ミノキシジル、11α−ヒドロキシプロゲステロン、骨吸収阻害・転移抑制薬(例、ゾレドロン酸、アレンドロン酸、パミドロン酸、エチドロン酸、イバンドロン酸、クロドロン酸)なども用いることができる。
前記した中でも、併用薬物としては、LH−RHアゴニスト(例、酢酸ゴセレリン、ブセレリン、リュープロレリン等)、トラスツズマブ(HER2抗体)などが好ましい。
エネルギー代謝阻害剤と併用薬物の投与時期は限定されず、これらを投与対象に対し、同時に投与してもよいし、時間差をおいて投与してもよい。投与量は、臨床上用いられている用量を基準として適宜選択することができる。また、上記エネルギー代謝阻害剤と併用薬物の配合比は、投与対象、投与ルート、対象疾患、症状、組み合わせ等に応じて適宜選択することができる。
(2)試験化合物を細胞に接触させ、細胞内のエネルギー代謝を測定する、HER2発現癌の予防・治療薬のスクリーニング方法
本発明はまた、別の局面において、試験化合物を細胞に接触させ、細胞内のエネルギー代謝を測定することを特徴とするHER2発現癌の予防・治療薬のスクリーニング方法を提供する。
試験化合物を接触させる「細胞」としては、例えば、動物細胞、昆虫細胞などが用いられる。好ましくは、動物細胞、好ましくはヒト培養癌細胞などが用いられる。
動物細胞としては、例えば、サル細胞COS−7、Vero、チャイニーズハムスター細胞CHO、dhfr遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞CHO、マウスL細胞、マウスAtT−20細胞、マウスミエローマ細胞、マウスATDC5細胞、ラットGH3細胞、ヒトFL細胞、ヒト培養癌細胞〔例、ヒト乳癌細胞(例、BT−474、SK−BR−3など)、ヒト肺癌細胞(例、A549など)、ヒト大腸癌細胞(例、HT−29、HCT−116など)、ヒト膵癌細胞(例、AsPC−1、MIA−PaCa−2など)、ヒト卵巣癌細胞(例、OV−CAR−3、CaOV−3など)、ヒト腎臓癌(例、ACHNなど)など〕などが用いられる。
昆虫細胞としては、例えば、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞(Spodoptera frugiperda cell;Sf細胞)、Trichoplusia niの中腸由来のMG1細胞、Trichoplusia niの卵由来のHigh FiveTM細胞、Mamestra brassicae由来の細胞、Estigmena acrea由来の細胞、蚕由来株化細胞(Bombyx mori N細胞;BmN細胞)などが用いられる。該Sf細胞としては、例えば、Sf9細胞(ATCC CRL1711)、Sf21細胞(以上、In Vivo,13,213−217,(1977))などが用いられる。
上記動物細胞を培養する際、培地としては、例えば、約5〜20%の胎児牛血清を含むMEM培地〔Science,122巻,501(1952)〕,DMEM培地〔Virology,8巻,396(1959)〕,RPMI 1640培地〔The Journal of the American Medical Association 199巻,519(1967)〕,199培地〔Proceeding of the Society for the Biological Medicine,73巻,1(1950)〕などが用いられる。pHは約6〜8であるのが好ましい。培養は通常約30℃〜40℃で約15〜60時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
上記昆虫細胞を培養する際、培地としては、Grace′s Insect Medium(Grace,T.C.C.,Nature,195,788(1962))に非動化した10%ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のpHは約6.2〜6.4が好ましい。培養は通常約27℃で約3〜5日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
試験化合物としては、例えば、合成化合物、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などが用いられる。
スクリーニングの例として、以下の方法などが挙げられる。
(i)(a)HER2発現細胞を培養した場合と(b)試験化合物存在下、HER2発現細胞を培養した場合のエネルギー代謝阻害活性をそれぞれ測定し、比較することにより、エネルギー代謝阻害活性を有する化合物を選択する。
(i−1)具体例として、(a−1)HER2発現細胞を培養した場合と(b−1)試験化合物存在下、HER2発現細胞を培養した場合の細胞内ATP量をそれぞれ測定し、比較する方法などが挙げられる。
細胞内ATP量の測定は、公知の方法、例えば、蛍光ATP測定法(Journal of Immunologycal Methds.160巻、81−88頁、1993年)またはそれに準ずる方法などを用いる。
(i−2)具体例として、(a−2)HER2発現細胞を培養した場合と(b−2)試験化合物存在下、HER2発現細胞を培養した場合のミトコンドリア酸化還元活性をそれぞれ測定し、比較する方法などが挙げられる。
ミトコンドリア酸化還元活性の測定は、公知の方法、例えば、MTT測定法(Journal of Immunologycal Methds.65巻、55−63頁、1983年)またはそれに準ずる方法などを用いる。
HER2発現細胞およびHER2非発現細胞は、約1,000〜100,000個/ウェルで播種し、約24〜120時間培養する。
HER2発現細胞としては、例えば、上記「HER2発現癌」細胞などが用いられる。
例えば、上記(b)の場合におけるエネルギー代謝阻害活性が、上記(a)の場合におけるエネルギー代謝阻害活性に比べて、約20%以上、好ましくは30%以上、より好ましくは約50%以上阻害させる化合物を、エネルギー代謝阻害活性を阻害する化合物として選択する。
上記培養の際、培養液のグルコース濃度を減じて行ってもよく、酸素濃度を減じて行ってもよい。
さらに、上記(i)で得られた化合物については、(c)HER2非発現細胞を培養した場合と(d)該化合物存在下、HER2非発現細胞を培養した場合の細胞増殖活性をそれぞれ測定し、比較することにより、非特異的な増殖阻害作用を有する化合物を除いてもよい。例えば、上記(d)の場合における細胞増殖活性が、上記(c)の場合における細胞増殖活性に比べて、約20%以上、好ましくは30%以上、より好ましくは約50%以上減少させる試験化合物を、HER2発現細胞に選択的に増殖阻害作用を有する化合物として選択する。
細胞増殖は、公知の方法、例えば、Sulphorhodamine−B(SRB)色素染色法(Journal of National Cancer Institute.82巻,1107−1112頁,1990年)、BrdU 取込みELISA法(Journal of Immunology Methods.85巻、169−179頁、1985年)などを用いて測定する。
HER2発現細胞およびHER2非発現細胞は、約1,000〜100,000個/ウェルで播種し、約24〜120時間培養する。
HER2発現細胞としては、例えば、上記「HER2発現癌」細胞などが用いられる。
(ii)(e)HER2発現細胞を培養した場合と(f)試験化合物存在下、HER2発現細胞を培養した場合の、AMPKタンパク質の活性をそれぞれ測定し、比較することにより、AMPKタンパク質を活性化する化合物(エネルギー代謝阻害の模倣剤)を選択する。
(ii−1)具体例として、(e−1)HER2発現細胞を培養した場合と(f−1)試験化合物存在下、HER2発現細胞を培養した場合の、AMPKタンパク質のリン酸化をそれぞれ測定し、比較する方法が挙げられる。
(ii−2)具体例として、(e−2)HER2発現細胞を培養した場合と(f−2)試験化合物存在下、HER2発現細胞を培養した場合の、AMPKの基質タンパク質のリン酸化をそれぞれ測定し、比較する方法が挙げられる。
AMPKの基質タンパク質としては、p70 S6Kタンパク質、ACCタンパク質などが挙げられる(Journal of Cell Science.117巻、5479−5487頁、2004年)。
AMPKタンパク質のリン酸化、およびAMPKの基質タンパク質のリン酸化の検出は、公知の方法に従って行う。例えば、培養後、SDSサンプルバッファーを直接、または抽出操作(例、RIPA緩衝液などを用いた抽出など)後に添加し、細胞を溶解する。得られた細胞溶解液をSDS−PAGE法にて分離し、リン酸化AMPKタンパク質に特異的な抗体、またはAMPKの基質タンパク質のリン酸化に特異的な抗体などを用いてウェスタンブロッティング法を行う。
HER2発現細胞は、約1,000〜100,000個/ウェルで播種し、約2〜24時間培養する。
HER2発現細胞としては、例えば、上記「HER2発現癌」細胞などが用いられる。
例えば、上記(f)の場合におけるAMPKタンパク質の活性が、上記(e)の場合におけるAMPKタンパク質の活性に比べて、約20%以上、好ましくは30%以上、より好ましくは約50%以上亢進させる化合物を、AMPKタンパク質を活性化する化合物(エネルギー代謝阻害の模倣剤)として選択する。
上記(i)および(ii)で得られる化合物は、エネルギー代謝阻害活性、またはエネルギー代謝阻害を模倣する活性(例、AMPK活性化作用)を有し、HER2発現細胞に選択的な増殖阻害作用を有するため、HER2発現癌に特異的で安全な低毒性の化合物である。従って、例えば、ヒトまたは温血動物(例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、トリ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど)に対して経口的にまたは非経口的にHER2発現癌の予防・治療薬として、投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、その作用、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、乳癌の治療の目的で該化合物を経口投与する場合、一般的に成人(体重60kgとして)においては、一日につき該化合物またはその塩を約0.1〜100mg、好ましくは約1.0〜50mg、より好ましくは約1.0〜20mg投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物またはその塩の投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、乳癌の治療の目的で該化合物を注射剤の形で通常成人(体重60kgとして)に投与する場合、一日につき該化合物またはその塩を約0.01〜30mg、好ましくは約0.1〜20mg、より好ましくは約0.1〜10mgを癌病変部に注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重60kg当たりに換算した量を投与することができる。
(3)エネルギー代謝を阻害またはエネルギー代謝の阻害を模倣することを特徴とするHER2発現癌の予防・治療方法
本発明はまた、別の局面において、細胞のエネルギー代謝を阻害またはエネルギー代謝の阻害を模倣することを特徴とするHER2発現癌の予防・治療方法を提供する。
細胞のエネルギー代謝には、ATP産生、トランスポーター、AMP活性化プロテインキナーゼなどが直接または間接的に関与しており、したがって、「エネルギー代謝を阻害すること」としては、典型的には、例えば、ATP産生を阻害すること、トランスポーター活性を阻害することなどが含まれる。
好ましい態様では、エネルギー代謝は、ATP産生に直接関与するものであり、これは例えば、糖代謝に関するものである。糖代謝としては、ミトコンドリア活性に関するもの、および解糖系に関するものが含まれる。ミトコンドリア活性には、電子伝達系が関与するもの、およびTCA回路が関与するものが含まれる。また、電子伝達系が関与するものとしては、呼吸鎖複合体I、II、III、IV、およびVから選ばれる少なくとも一種が関与するものが挙げられる。
また、エネルギー代謝の阻害を模倣することには、細胞のエネルギー代謝を直接阻害することなく、エネルギー代謝の阻害状態または飢餓状態により生じる細胞の生理反応(例、タンパク質のリン酸化および脱リン酸化、活性酸素産生量の変動、酵素活性の変動、mRNA転写・翻訳の変動、タンパク質分解および合成の変動など)を、例えば、合成化合物、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などの作用により誘導することが含まれる。好ましい例としては、AMP活性化プロテインキナーゼを活性化する作用を有する物質を細胞または被験体に投与することによって、AMP活性化プロテインキナーゼを活性化することが挙げられる。
上記本発明のHER2発現癌の予防・治療方法は、例えば、上記(1)に記載したエネルギー代謝阻害剤またはエネルギー代謝阻害模倣剤の有効量を被験体(例えば、哺乳動物、好ましくは、ヒト)に対して投与することを含む。あるいは、例えば、上記(2)に記載したスクリーニング方法によって得られた化合物の有効量を被験体(例えば、哺乳動物、好ましくは、ヒト)に投与することを含む。しかしながら、本発明の範囲は、これらの特定の態様に限定されず、細胞内のエネルギー代謝を直接または間接的に阻害する作用を奏する任意の化合物または条件を目的の細胞に提供することによって、該細胞のエネルギー代謝を阻害することもまた、本発明の範囲内である。
本明細書および配列表において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、IUPAC−IUB Commission on Biochemical Nomenclatureによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければL体を示すものとする。
DNA :デオキシリボ核酸
cDNA :相補的デオキシリボ核酸
A :アデニン
T :チミン
G :グアニン
C :シトシン
RNA :リボ核酸
mRNA :メッセンジャーリボ核酸
dATP :デオキシアデノシン三リン酸
dTTP :デオキシチミジン三リン酸
dGTP :デオキシグアノシン三リン酸
dCTP :デオキシシチジン三リン酸
ATP :アデノシン三リン酸
EDTA :エチレンジアミン四酢酸
SDS :ドデシル硫酸ナトリウム
Gly :グリシン
Ala :アラニン
Val :バリン
Leu :ロイシン
Ile :イソロイシン
Ser :セリン
Thr :スレオニン
Cys :システイン
Met :メチオニン
Glu :グルタミン酸
Asp :アスパラギン酸
Lys :リジン
Arg :アルギニン
His :ヒスチジン
Phe :フェニルアラニン
Tyr :チロシン
Trp :トリプトファン
Pro :プロリン
Asn :アスパラギン
Gln :グルタミン
pGlu :ピログルタミン酸
Sec :セレノシステイン(selenocysteine)
本願明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
〔配列番号:1〕
ヒトHER2のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号:2〕
ヒトHER2をコードするcDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号:3〕
マウスHER2のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号:4〕
マウスHER2をコードするcDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号:5〕
ラットHER2のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号:6〕
ラットHER2をコードするcDNAの塩基配列を示す。
本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
[実施例1]
エネルギー代謝阻害によるHER2発現細胞の増殖阻害
ヒトHER2発現細胞としてBT−474乳癌細胞(ATCCより購入)を、HER2非発現細胞としてMDA−MB−231乳癌細胞(ATCCより購入)を用いた。これら細胞を96穴マルチウェルプレートに播種(BT−474:3.0x104細胞/ウェル、MDA−MB−231:1.5x104細胞/ウェル)し、炭酸ガスインキュベーター(5% CO2、37℃)中で一夜培養した。ミトコンドリア呼吸鎖複合体阻害化合物(複合体I:ロテノン)を終濃度10μmol/Lから4倍の希釈列で10段階を添加し、さらに5日間培養した。培養後、ロテノンを含む培養液を除き、リン酸緩衝液で細胞を洗浄、5%トリクロロ酢酸溶液で固定後、0.4%(W/V)Sulphorhodamine−B(SRB)色素溶液(1% 酢酸に溶解)を加え、細胞タンパク質を染色した。その後、プレートからSRB色素溶液を除き、1% 酢酸溶液にて洗浄した後、100μLの10mM トリス緩衝溶液を加えて色素を抽出溶解し、吸収波長550nmの吸光度を測定し、タンパク質量として細胞量を測定した(Journal of National Cancer Institute.82巻,1107−1112頁,1990年)。ロテノンを加えないウェル(対照)の吸光度を100%とした時に、ロテノンを添加したウェルの吸光度の割合を求め、残存細胞量を対照の50%に抑制するのに必要な化合物濃度(IC50)値を算出した。
その結果、BT−474細胞でのIC50値は0.004μmol/L、MDA−MB−231細胞でのIC50値は0.5μmol/Lであった。
これより、ロテノンが、HER2非発現MDA−MB−231細胞に比べ、HER2発現BT−474細胞の増殖をより強く抑制することがわかる。よって、ミトコンドリアの活性阻害による細胞のエネルギー代謝阻害が、HER2発現細胞に選択的な細胞増殖阻害を示すことが明らかとなった。
[実施例2]
エネルギー代謝阻害によるHER2シグナル抑制
ヒトHER2発現ヒト乳癌細胞株であるBT−474(American Tissue Culture Collection(ATCC)より購入)を24穴マルチウェルプレートに播種(BT−474:1.2x105細胞/ウェル)し、炭酸ガスインキュベーター(5% CO2、37℃)中で一夜培養した。ミトコンドリア呼吸鎖複合体阻害化合物(複合体I:ロテノン、複合体III:アンチマイシン、複合体V:オリゴマイシン:和光純薬)を終濃度1μmol/Lから4倍の希釈列で5段階を添加し培養を続けた。2時間後に培養液を除き、SDSサンプルバッファー(200μL)で細胞を溶解した。ウェスタンブロッティング解析を以下のようにして行った。すなわち、この細胞溶解液(8μL)をSDS−PAGE法(ゲル濃度:7.5−15%)にて分離し(Analytical Biochemistry、166号、368−379頁、1987年)、ニトロセルロース膜(BioRad社製)にトランスファー後、リン酸化HER2に特異的な抗体(Cell signaling technology社製、コード番号2244)、下流抗アポトーシスシグナル伝達分子Aktに特異的な抗リン酸化Akt抗体(Cell signaling technology社製、コード番号9271)および下流増殖シグナル伝達分子MAPKに特異的な抗リン酸化MAPK抗体(Cell signaling technology社製、コード番号9101)を用いて、ECLシステム(アマシャム)にて、抗体を検出し、画像解析によりリン酸化タンパク質量として定量した。
HER2のリン酸化は、溶媒対照群のBT−474細胞で顕著に検出された。このときロテノン、アンチマイシンおよびオリゴマイシンによって、HER2のリン酸化抑制が認められた。また、これに伴い、AktおよびMAPKのリン酸化抑制も認められた。
これより、ミトコンドリアの活性阻害による細胞内エネルギー代謝の阻害は、HER2のリン酸化を抑制し、HER2の下流シグナルを抑制することが明らかとなった。実施例1の結果と併せ、エネルギー阻害によるHER2発現細胞の増殖阻害に、HER2が関与することが明らかである。
[実施例3]
好気的代謝の抑制(酸素供給抑制)によるHER2リン酸化抑制
ヒトHER2発現ヒト癌細胞株BT−474(ATCCより購入)を24穴マルチウェルプレートに播種(1.2x105細胞/ウェル)し、炭酸ガスインキュベーター(20% O2、5% CO2、37℃)中で一夜培養した。プレートは炭酸ガスインキュベーター(7% O2、5% CO2、37℃)へ移し、ウェルにSDSサンプルバッファー(200μL)を経時的に加え、細胞を溶解した。この細胞溶解液(8μL)をSDS−PAGE法(ゲル濃度:7.5−15%)にて分離した(Shagger et al.,Analytical Biochemistry、166号、368−379頁、1987年)。次に、実施例1と同様の方法でウェスタンブロッティング解析を行ない、リン酸化HER2、リン酸化Aktおよびリン酸化MAPKを検出した。
図1に示すように、通常の培養条件(20% O2、5% CO2、37℃)ではBT−474細胞のHER2リン酸化は顕著であったが、低酸素処理(7% O2、5% CO2、37℃)により、時間依存的なHER2のリン酸化抑制が認められた。
これより、低酸素によるエネルギー代謝の阻害により、HER2のリン酸化が抑制されることが明らかになった。
[実施例4]
グルコースの利用阻害によるHER2リン酸化抑制
HER2発現ヒト癌細胞株であるSK−BR−3(ATCCより購入)を24穴マルチウェルプレートに播種(4.0x105細胞/ウェル)し、炭酸ガスインキュベーター(5% CO2、37℃)中で一夜培養した後、含有するグルコース量を0.1mg/mLとした培地に置換し、さらに2時間培養した。グルコース代謝拮抗剤である2−デオキシグルコースを終濃度が5mg/mLとなるよう添加し、2時間後に培養液を除き、SDSサンプルバッファー(200μL)で細胞を溶解した。この細胞溶解液(8μL)をSDS−PAGE法(ゲル濃度:7.5−15%)にて分離した(Shagger et al.,Analytical Biochemistry、166号、368−379頁、1987年)。次に、実施例1と同様の方法でウェスタンブロッティング解析を行ない、リン酸化HER2、リン酸化Aktおよびリン酸化MAPKを検出した。
2−デオキシグルコース未添加のSK−BR−3細胞(対照)でのHER2、AktおよびMAPKのリン酸化は顕著であり、2−デオキシグルコースの添加によって、各タンパク質のリン酸化が抑制された。
これより、解糖系の阻害によるエネルギー代謝の阻害により、HER2のリン酸化、およびその下流シグナルが抑制されることが明らかになった。
[実施例5]
AMPK活性化によるHER2リン酸化抑制
AMPKは、細胞内のエネルギー代謝のセンサーとして働き、エネルギー代謝が阻害される(ADP/ATP比が増加する)ことにより活性化されることが知られている。AMPKの活性化(エネルギー代謝の阻害を模倣する)によるHER2のリン酸化およびそのシグナルが抑制されるか否かを、以下のように調べた。
ヒトHER2発現ヒト癌細胞株BT−474(ATCCより購入)を24穴マルチウェルプレートに播種(1.2x105細胞/ウェル)し、炭酸ガスインキュベーター(20% O2、5% CO2、37℃)中で一夜培養した。AMPKを活性化するメトフォルミン(The Journal of Biological Chemistry、279巻、42号、43940−43951頁、2004年)を終濃度15mmol/Lから3倍の希釈列で5段階を添加し、培養を続けた。2時間後に培養液を除き、SDSサンプルバッファー(200μL)で細胞を溶解した。この細胞溶解液(8μL)をSDS−PAGE法(ゲル濃度:7.5−15%)にて分離した(Analytical Biochemistry、166号、368−379頁、1987年)。次に、実施例1と同様の方法でウェスタンブロッティング解析を行ない、リン酸化HER2、リン酸化Aktおよびリン酸化MAPKを定量した。
HER2のリン酸化は、溶媒対照群のBT−474細胞では顕著に検出され、メトフォルミンの添加によって、濃度依存的なHER2のリン酸化抑制が認められた。また、これに伴い、AktおよびMAPKのリン酸化抑制も認められた。
このように、エネルギー代謝が阻害されている状態を模倣する、AMPKの活性化により、HER2のリン酸化およびその下流シグナルが抑制されることが明らかになった。
[実施例6]
エネルギー代謝阻害とAMPK活性化−HER2リン酸化抑制との相関−
ヒトHER2発現ヒト乳癌細胞株であるBT−474(American Tissue Culture Collection(ATCC)より購入)を24穴マルチウェルプレートに播種(BT−474:1.2x105細胞/ウェル)し、炭酸ガスインキュベーター(5% CO2、37℃)中で一夜培養した。ミトコンドリア呼吸鎖複合体I阻害化合物ロテノン(和光純薬)を終濃度1、0.333、0.111、0.033および0.011μmol/Lの5段階で添加し、培養を続けた。2時間後に培養液を除き、SDSサンプルバッファー(200μL)で細胞を溶解した後、この細胞溶解液を用い、ウェスタンブロッティング解析を行った。すなわち、この細胞溶解液(8μL)をSDS−PAGE法(ゲル濃度:7.5−15%)にて分離し(Analytical Biochemistry、166号、368−379頁、1987年)、ニトロセルロース膜(BioRad社製)にトランスファー後、リン酸化HER2に特異的な抗体(Cell signaling technology社製、コード番号2244)、AMPKに特異的なAMPK抗体(Cell signaling technology社製、コード番号2535)およびリン酸化AMPKに特異的な抗リン酸化AMPK抗体(Cell signaling technology社製、コード番号2532)を用い、ECLシステム(アマシャム)にて、抗体を化学発光検出し、LAS−1000plus画像解析装置(富士写真フィルム)によりリン酸化タンパク質量として定量した。
HER2のリン酸化は、溶媒対照群のBT−474細胞で顕著に検出され、ロテノンの添加により用量依存的に減少した。このとき、AMPKが活性化していることを示すAMPKリン酸化量が、HER2のリン酸化量とは逆に、用量依存的に増加した。またこのとき、AMPKのタンパク質量自身に量的な変化は観察されなかった。
実施例2の結果と併せ、細胞内エネルギー代謝の阻害によりAMPKがリン酸化されるとき、このリン酸化と増殖シグナルであるHER2のリン酸化およびその下流シグナルの抑制とは逆相関することが明らかである。
[実施例7]
エネルギー代謝阻害とAMPK活性化−HER2リン酸化抑制との相関−
ヒトHER2発現ヒト乳癌細胞株であるBT−474(American Tissue Culture Collection(ATCC)より購入)を24穴マルチウェルプレートに播種(BT−474:1.2x105細胞/ウェル)し、炭酸ガスインキュベーター(5% CO2、37℃)中で一夜培養した。ロテノンとは異なる機序のエネルギー代謝阻害剤として、ミトコンドリア呼吸鎖複合体III阻害化合物アンチマイシン(和光純薬)を終濃度1、0.3、0.1、0.03および0.01nmol/Lで添加し、培養を続けた。また別のプレートを用い、ミトコンドリア呼吸鎖複合体V阻害化合物オリゴマイシン(和光純薬)を終濃度100、30、10、3および1ng/mLで添加し、培養を続けた。また2,4−ジニトロフェノールを300、100、30、10および3μmol/Lで添加し、培養を続けた。各々のプレートは、薬物添加2時間後に培養液を除き、SDSサンプルバッファー(200μL)で細胞を溶解した後、この細胞溶解液を用い、ウェスタンブロッティング解析を行った。すなわち、この細胞溶解液(8μL)をSDS−PAGE法(ゲル濃度:7.5−15%)にて分離し(Analytical Biochemistry、166号、368−379頁、1987年)、ニトロセルロース膜(BioRad社製)にトランスファー後、リン酸化HER2に特異的な抗体(Cell signaling technology社製、コード番号2244)、リン酸化アセチルCoAカルボキシラーゼ(ACC)に特異的なpACC抗体(Cell signaling technology社製、コード番号3661)およびリン酸化S6キナーゼ(S6K)に特異的な抗リン酸化S6K抗体(Cell signaling technology社製、コード番号9209)を用い、ECLシステム(アマシャム)にて、抗体を化学発光検出し、LAS−1000plus画像解析装置(富士写真フィルム)によりリン酸化タンパク質量として定量した。
HER2のリン酸化は、溶媒対照群のBT−474細胞で顕著に検出され、アンチマイシン、オリゴマイシン、および2,4−ジニトロフェノールの添加により用量依存的に減少した。このとき、AMPKの基質であり活性の指標となっているACCは、何れの化合物においても、用量依存的にリン酸化が増加した。また下流分子として知られているS6Kのリン酸化が抑制されており、AMPKからのシグナルが、細胞内を伝達されていることも明らかとなった。
実施例2、6の結果と併せ、これよりエネルギー代謝阻害は、HER2のリン酸化とHER2下流シグナルを抑制し、HER2のリン酸化とAMPKのリン酸化、すなわちAMPK活性とは逆相関することが明らかである。
[実施例8]
エネルギー代謝阻害によるHER2発現細胞の増殖阻害
ヒトHER2発現細胞としてBT−474乳癌細胞、MDA−MB−453乳癌細胞、A549非小細胞肺癌細胞、LNCaP前立腺癌細胞を用い、HER2非発現細胞としてMDA−MB−231乳癌細胞、A498腎癌細胞(いずれもATCCより購入)を用いた。各細胞を500cells/150μL/wellで96穴プレートに播種し、一晩培養したものを用いた。アンチマイシン(最終濃度:1,0.1,0.01,0.001μmol/L)、2,4−ジニトロフェノール(最終濃度:0.6,0.2,0.06,0.02mmol/L)、メトフォルミン(最終濃度:25,5,1,0.2mmol/L)、AICAR(最終濃度:25,5,1,0.2mmol/L)の各化合物を培地で希釈し上記最終濃度となるよう50μL/wellずつ加えた。5日間、37℃、5%CO2で培養した後、Cell Counting Kit−F(同仁化学研究所)を用い細胞数を測定した。
Cell Counting Kit−Fを用いた生細胞数測定は、添付文書に従い、以下の方法で行った。5日間の培養を行った96穴プレートから上清を除き、RPMI培地(フェノールレッド不含、血清不含)で1000倍に希釈したCell Counting Kit−Fを100μL/wellずつ加えた。室温で30分間反応させた後、蛍光プレートリーダーによって蛍光(励起波長;480nm、蛍光波長;530nm)を測定した。
測定結果から、化合物を加えないウェル(対照)の蛍光を100%とした時に、化合物を添加したウェルの蛍光の割合を求め、残存細胞量を対照に対する%として求めた。
結果、細胞増殖を50%以上阻害する最小の濃度は以下の通りとなった。
これより、何れの化合物も、HER2非発現癌に比べ、HER2発現癌に10〜100倍以上強く作用することが明らかである。実施例1の結果と併せ、エネルギー代謝阻害またAMPKの活性化により、HER2リン酸化および細胞内シグナル伝達が抑制され、HER2発現癌に特異的に細胞増殖阻害を引き起こすことが明らかとなった。
[実施例9]
エネルギー代謝阻害によるHER2シグナル抑制の特異性
ヒトEGFR発現ヒト類表皮癌細胞株であるA431(American Tissue Culture Collection(ATCC)より購入)を24穴マルチウェルプレートに播種(A431:6x104細胞/ウェル)し、炭酸ガスインキュベーター(5% CO2、37℃)中で一夜培養した。ミトコンドリア複合体阻害化合物(複合体I:ロテノン、和光純薬)を終濃度1μmol/Lから4倍の希釈列で5段階を添加し培養を続けた。2時間後に培養液を除き、SDSサンプルバッファー(200μL)で細胞を溶解した。ウェスタンブロッティング解析を以下のようにして行った。すなわち、この細胞溶解液(8μL)をSDS−PAGE法(ゲル濃度:7.5−15%)にて分離し(Analytical Biochemistry、166号、368−379頁、1987年)、ニトロセルロース膜(BioRad社製)にトランスファー後、リン酸化EGFRに特異的な抗体(Cell signaling technology社製、コード番号2232)を用いて、ECLシステム(アマシャム)にて、抗体を検出し、画像解析によりリン酸化タンパク質量として定量した。
EGFRのリン酸化は、溶媒対照群のA431細胞で顕著に検出された。このときロテノンによるEGFRのリン酸化抑制は認められなかった。
EGFRはHER1とも呼ばれ、HER2と高い相同性を持ち同じファミリーに分類される受容体チロシンリン酸化酵素である。実施例2の結果と併せ、細胞内エネルギー代謝の阻害による受容体チロシンリン酸化抑制は、HER2特異的である事が明らかとなった。
[実施例10]
AMPK活性化によるHER2発現癌細胞増殖阻害
ヒトHER2発現細胞としてBT−474乳癌細胞、MDA−MB−453乳癌細胞、LNCaP前立腺癌細胞を用い、HER2非発現細胞としてMDA−MB−231乳癌細胞、A498腎癌細胞(いずれもATCCより購入)を用いた。各細胞を500cells/150μL/wellで96穴プレートに播種し、一晩培養したものを用いた。トログリタゾン(最終濃度:25,6.25,1.56μmol/L)を培地で希釈し、上記最終濃度となるよう50μL/wellずつ加えた。5日間、37℃、5% CO2で培養した後、Cell Counting Kit−F(同仁化学研究所)を用い細胞数を測定した。
Cell Counting Kit−Fを用いた生細胞数測定は、添付文書に従い、以下の方法で行った。5日間の培養を行った96穴プレートから上清を除き、RPMI培地(フェノールレッド不含、血清不含)で1000倍に希釈したCell Counting Kit−Fを100μL/wellずつ加えた。室温で30分間反応させた後、蛍光プレートリーダーによって蛍光(励起波長;480nm、蛍光波長;530nm)を測定した。
測定結果から、トログリタゾンを加えないウェル(対照)の蛍光を100%とした時に、トログリタゾンを添加したウェルの蛍光の割合を求め、残存細胞量を対照に対する%として求めた。
この結果、トログリタゾンはHER2発現癌細胞に対し、25μmol/Lの濃度で、BT474細胞を50%、MB453細胞を25%、LNCaP細胞を48%にまで増殖阻害した。この増殖阻害は濃度依存的であった。一方、HER2非発現癌細胞では、25μmol/Lの濃度でMDA−MB−231細胞は100%、A498細胞が105%と、まったく増殖阻害活性を示さなかった。
トログリタゾンはAMPKを活性化する事が報告されている。実施例7、8の結果と併せ、AMPKの活性化はHER2リン酸化を抑制し、HER2発現癌特異的な、細胞増殖阻害を引き起こすことが明らかとなった。
[実施例1]
エネルギー代謝阻害によるHER2発現細胞の増殖阻害
ヒトHER2発現細胞としてBT−474乳癌細胞(ATCCより購入)を、HER2非発現細胞としてMDA−MB−231乳癌細胞(ATCCより購入)を用いた。これら細胞を96穴マルチウェルプレートに播種(BT−474:3.0x104細胞/ウェル、MDA−MB−231:1.5x104細胞/ウェル)し、炭酸ガスインキュベーター(5% CO2、37℃)中で一夜培養した。ミトコンドリア呼吸鎖複合体阻害化合物(複合体I:ロテノン)を終濃度10μmol/Lから4倍の希釈列で10段階を添加し、さらに5日間培養した。培養後、ロテノンを含む培養液を除き、リン酸緩衝液で細胞を洗浄、5%トリクロロ酢酸溶液で固定後、0.4%(W/V)Sulphorhodamine−B(SRB)色素溶液(1% 酢酸に溶解)を加え、細胞タンパク質を染色した。その後、プレートからSRB色素溶液を除き、1% 酢酸溶液にて洗浄した後、100μLの10mM トリス緩衝溶液を加えて色素を抽出溶解し、吸収波長550nmの吸光度を測定し、タンパク質量として細胞量を測定した(Journal of National Cancer Institute.82巻,1107−1112頁,1990年)。ロテノンを加えないウェル(対照)の吸光度を100%とした時に、ロテノンを添加したウェルの吸光度の割合を求め、残存細胞量を対照の50%に抑制するのに必要な化合物濃度(IC50)値を算出した。
その結果、BT−474細胞でのIC50値は0.004μmol/L、MDA−MB−231細胞でのIC50値は0.5μmol/Lであった。
これより、ロテノンが、HER2非発現MDA−MB−231細胞に比べ、HER2発現BT−474細胞の増殖をより強く抑制することがわかる。よって、ミトコンドリアの活性阻害による細胞のエネルギー代謝阻害が、HER2発現細胞に選択的な細胞増殖阻害を示すことが明らかとなった。
[実施例2]
エネルギー代謝阻害によるHER2シグナル抑制
ヒトHER2発現ヒト乳癌細胞株であるBT−474(American Tissue Culture Collection(ATCC)より購入)を24穴マルチウェルプレートに播種(BT−474:1.2x105細胞/ウェル)し、炭酸ガスインキュベーター(5% CO2、37℃)中で一夜培養した。ミトコンドリア呼吸鎖複合体阻害化合物(複合体I:ロテノン、複合体III:アンチマイシン、複合体V:オリゴマイシン:和光純薬)を終濃度1μmol/Lから4倍の希釈列で5段階を添加し培養を続けた。2時間後に培養液を除き、SDSサンプルバッファー(200μL)で細胞を溶解した。ウェスタンブロッティング解析を以下のようにして行った。すなわち、この細胞溶解液(8μL)をSDS−PAGE法(ゲル濃度:7.5−15%)にて分離し(Analytical Biochemistry、166号、368−379頁、1987年)、ニトロセルロース膜(BioRad社製)にトランスファー後、リン酸化HER2に特異的な抗体(Cell signaling technology社製、コード番号2244)、下流抗アポトーシスシグナル伝達分子Aktに特異的な抗リン酸化Akt抗体(Cell signaling technology社製、コード番号9271)および下流増殖シグナル伝達分子MAPKに特異的な抗リン酸化MAPK抗体(Cell signaling technology社製、コード番号9101)を用いて、ECLシステム(アマシャム)にて、抗体を検出し、画像解析によりリン酸化タンパク質量として定量した。
HER2のリン酸化は、溶媒対照群のBT−474細胞で顕著に検出された。このときロテノン、アンチマイシンおよびオリゴマイシンによって、HER2のリン酸化抑制が認められた。また、これに伴い、AktおよびMAPKのリン酸化抑制も認められた。
これより、ミトコンドリアの活性阻害による細胞内エネルギー代謝の阻害は、HER2のリン酸化を抑制し、HER2の下流シグナルを抑制することが明らかとなった。実施例1の結果と併せ、エネルギー阻害によるHER2発現細胞の増殖阻害に、HER2が関与することが明らかである。
[実施例3]
好気的代謝の抑制(酸素供給抑制)によるHER2リン酸化抑制
ヒトHER2発現ヒト癌細胞株BT−474(ATCCより購入)を24穴マルチウェルプレートに播種(1.2x105細胞/ウェル)し、炭酸ガスインキュベーター(20% O2、5% CO2、37℃)中で一夜培養した。プレートは炭酸ガスインキュベーター(7% O2、5% CO2、37℃)へ移し、ウェルにSDSサンプルバッファー(200μL)を経時的に加え、細胞を溶解した。この細胞溶解液(8μL)をSDS−PAGE法(ゲル濃度:7.5−15%)にて分離した(Shagger et al.,Analytical Biochemistry、166号、368−379頁、1987年)。次に、実施例1と同様の方法でウェスタンブロッティング解析を行ない、リン酸化HER2、リン酸化Aktおよびリン酸化MAPKを検出した。
図1に示すように、通常の培養条件(20% O2、5% CO2、37℃)ではBT−474細胞のHER2リン酸化は顕著であったが、低酸素処理(7% O2、5% CO2、37℃)により、時間依存的なHER2のリン酸化抑制が認められた。
これより、低酸素によるエネルギー代謝の阻害により、HER2のリン酸化が抑制されることが明らかになった。
[実施例4]
グルコースの利用阻害によるHER2リン酸化抑制
HER2発現ヒト癌細胞株であるSK−BR−3(ATCCより購入)を24穴マルチウェルプレートに播種(4.0x105細胞/ウェル)し、炭酸ガスインキュベーター(5% CO2、37℃)中で一夜培養した後、含有するグルコース量を0.1mg/mLとした培地に置換し、さらに2時間培養した。グルコース代謝拮抗剤である2−デオキシグルコースを終濃度が5mg/mLとなるよう添加し、2時間後に培養液を除き、SDSサンプルバッファー(200μL)で細胞を溶解した。この細胞溶解液(8μL)をSDS−PAGE法(ゲル濃度:7.5−15%)にて分離した(Shagger et al.,Analytical Biochemistry、166号、368−379頁、1987年)。次に、実施例1と同様の方法でウェスタンブロッティング解析を行ない、リン酸化HER2、リン酸化Aktおよびリン酸化MAPKを検出した。
2−デオキシグルコース未添加のSK−BR−3細胞(対照)でのHER2、AktおよびMAPKのリン酸化は顕著であり、2−デオキシグルコースの添加によって、各タンパク質のリン酸化が抑制された。
これより、解糖系の阻害によるエネルギー代謝の阻害により、HER2のリン酸化、およびその下流シグナルが抑制されることが明らかになった。
[実施例5]
AMPK活性化によるHER2リン酸化抑制
AMPKは、細胞内のエネルギー代謝のセンサーとして働き、エネルギー代謝が阻害される(ADP/ATP比が増加する)ことにより活性化されることが知られている。AMPKの活性化(エネルギー代謝の阻害を模倣する)によるHER2のリン酸化およびそのシグナルが抑制されるか否かを、以下のように調べた。
ヒトHER2発現ヒト癌細胞株BT−474(ATCCより購入)を24穴マルチウェルプレートに播種(1.2x105細胞/ウェル)し、炭酸ガスインキュベーター(20% O2、5% CO2、37℃)中で一夜培養した。AMPKを活性化するメトフォルミン(The Journal of Biological Chemistry、279巻、42号、43940−43951頁、2004年)を終濃度15mmol/Lから3倍の希釈列で5段階を添加し、培養を続けた。2時間後に培養液を除き、SDSサンプルバッファー(200μL)で細胞を溶解した。この細胞溶解液(8μL)をSDS−PAGE法(ゲル濃度:7.5−15%)にて分離した(Analytical Biochemistry、166号、368−379頁、1987年)。次に、実施例1と同様の方法でウェスタンブロッティング解析を行ない、リン酸化HER2、リン酸化Aktおよびリン酸化MAPKを定量した。
HER2のリン酸化は、溶媒対照群のBT−474細胞では顕著に検出され、メトフォルミンの添加によって、濃度依存的なHER2のリン酸化抑制が認められた。また、これに伴い、AktおよびMAPKのリン酸化抑制も認められた。
このように、エネルギー代謝が阻害されている状態を模倣する、AMPKの活性化により、HER2のリン酸化およびその下流シグナルが抑制されることが明らかになった。
[実施例6]
エネルギー代謝阻害とAMPK活性化−HER2リン酸化抑制との相関−
ヒトHER2発現ヒト乳癌細胞株であるBT−474(American Tissue Culture Collection(ATCC)より購入)を24穴マルチウェルプレートに播種(BT−474:1.2x105細胞/ウェル)し、炭酸ガスインキュベーター(5% CO2、37℃)中で一夜培養した。ミトコンドリア呼吸鎖複合体I阻害化合物ロテノン(和光純薬)を終濃度1、0.333、0.111、0.033および0.011μmol/Lの5段階で添加し、培養を続けた。2時間後に培養液を除き、SDSサンプルバッファー(200μL)で細胞を溶解した後、この細胞溶解液を用い、ウェスタンブロッティング解析を行った。すなわち、この細胞溶解液(8μL)をSDS−PAGE法(ゲル濃度:7.5−15%)にて分離し(Analytical Biochemistry、166号、368−379頁、1987年)、ニトロセルロース膜(BioRad社製)にトランスファー後、リン酸化HER2に特異的な抗体(Cell signaling technology社製、コード番号2244)、AMPKに特異的なAMPK抗体(Cell signaling technology社製、コード番号2535)およびリン酸化AMPKに特異的な抗リン酸化AMPK抗体(Cell signaling technology社製、コード番号2532)を用い、ECLシステム(アマシャム)にて、抗体を化学発光検出し、LAS−1000plus画像解析装置(富士写真フィルム)によりリン酸化タンパク質量として定量した。
HER2のリン酸化は、溶媒対照群のBT−474細胞で顕著に検出され、ロテノンの添加により用量依存的に減少した。このとき、AMPKが活性化していることを示すAMPKリン酸化量が、HER2のリン酸化量とは逆に、用量依存的に増加した。またこのとき、AMPKのタンパク質量自身に量的な変化は観察されなかった。
実施例2の結果と併せ、細胞内エネルギー代謝の阻害によりAMPKがリン酸化されるとき、このリン酸化と増殖シグナルであるHER2のリン酸化およびその下流シグナルの抑制とは逆相関することが明らかである。
[実施例7]
エネルギー代謝阻害とAMPK活性化−HER2リン酸化抑制との相関−
ヒトHER2発現ヒト乳癌細胞株であるBT−474(American Tissue Culture Collection(ATCC)より購入)を24穴マルチウェルプレートに播種(BT−474:1.2x105細胞/ウェル)し、炭酸ガスインキュベーター(5% CO2、37℃)中で一夜培養した。ロテノンとは異なる機序のエネルギー代謝阻害剤として、ミトコンドリア呼吸鎖複合体III阻害化合物アンチマイシン(和光純薬)を終濃度1、0.3、0.1、0.03および0.01nmol/Lで添加し、培養を続けた。また別のプレートを用い、ミトコンドリア呼吸鎖複合体V阻害化合物オリゴマイシン(和光純薬)を終濃度100、30、10、3および1ng/mLで添加し、培養を続けた。また2,4−ジニトロフェノールを300、100、30、10および3μmol/Lで添加し、培養を続けた。各々のプレートは、薬物添加2時間後に培養液を除き、SDSサンプルバッファー(200μL)で細胞を溶解した後、この細胞溶解液を用い、ウェスタンブロッティング解析を行った。すなわち、この細胞溶解液(8μL)をSDS−PAGE法(ゲル濃度:7.5−15%)にて分離し(Analytical Biochemistry、166号、368−379頁、1987年)、ニトロセルロース膜(BioRad社製)にトランスファー後、リン酸化HER2に特異的な抗体(Cell signaling technology社製、コード番号2244)、リン酸化アセチルCoAカルボキシラーゼ(ACC)に特異的なpACC抗体(Cell signaling technology社製、コード番号3661)およびリン酸化S6キナーゼ(S6K)に特異的な抗リン酸化S6K抗体(Cell signaling technology社製、コード番号9209)を用い、ECLシステム(アマシャム)にて、抗体を化学発光検出し、LAS−1000plus画像解析装置(富士写真フィルム)によりリン酸化タンパク質量として定量した。
HER2のリン酸化は、溶媒対照群のBT−474細胞で顕著に検出され、アンチマイシン、オリゴマイシン、および2,4−ジニトロフェノールの添加により用量依存的に減少した。このとき、AMPKの基質であり活性の指標となっているACCは、何れの化合物においても、用量依存的にリン酸化が増加した。また下流分子として知られているS6Kのリン酸化が抑制されており、AMPKからのシグナルが、細胞内を伝達されていることも明らかとなった。
実施例2、6の結果と併せ、これよりエネルギー代謝阻害は、HER2のリン酸化とHER2下流シグナルを抑制し、HER2のリン酸化とAMPKのリン酸化、すなわちAMPK活性とは逆相関することが明らかである。
[実施例8]
エネルギー代謝阻害によるHER2発現細胞の増殖阻害
ヒトHER2発現細胞としてBT−474乳癌細胞、MDA−MB−453乳癌細胞、A549非小細胞肺癌細胞、LNCaP前立腺癌細胞を用い、HER2非発現細胞としてMDA−MB−231乳癌細胞、A498腎癌細胞(いずれもATCCより購入)を用いた。各細胞を500cells/150μL/wellで96穴プレートに播種し、一晩培養したものを用いた。アンチマイシン(最終濃度:1,0.1,0.01,0.001μmol/L)、2,4−ジニトロフェノール(最終濃度:0.6,0.2,0.06,0.02mmol/L)、メトフォルミン(最終濃度:25,5,1,0.2mmol/L)、AICAR(最終濃度:25,5,1,0.2mmol/L)の各化合物を培地で希釈し上記最終濃度となるよう50μL/wellずつ加えた。5日間、37℃、5%CO2で培養した後、Cell Counting Kit−F(同仁化学研究所)を用い細胞数を測定した。
Cell Counting Kit−Fを用いた生細胞数測定は、添付文書に従い、以下の方法で行った。5日間の培養を行った96穴プレートから上清を除き、RPMI培地(フェノールレッド不含、血清不含)で1000倍に希釈したCell Counting Kit−Fを100μL/wellずつ加えた。室温で30分間反応させた後、蛍光プレートリーダーによって蛍光(励起波長;480nm、蛍光波長;530nm)を測定した。
測定結果から、化合物を加えないウェル(対照)の蛍光を100%とした時に、化合物を添加したウェルの蛍光の割合を求め、残存細胞量を対照に対する%として求めた。
結果、細胞増殖を50%以上阻害する最小の濃度は以下の通りとなった。
これより、何れの化合物も、HER2非発現癌に比べ、HER2発現癌に10〜100倍以上強く作用することが明らかである。実施例1の結果と併せ、エネルギー代謝阻害またAMPKの活性化により、HER2リン酸化および細胞内シグナル伝達が抑制され、HER2発現癌に特異的に細胞増殖阻害を引き起こすことが明らかとなった。
[実施例9]
エネルギー代謝阻害によるHER2シグナル抑制の特異性
ヒトEGFR発現ヒト類表皮癌細胞株であるA431(American Tissue Culture Collection(ATCC)より購入)を24穴マルチウェルプレートに播種(A431:6x104細胞/ウェル)し、炭酸ガスインキュベーター(5% CO2、37℃)中で一夜培養した。ミトコンドリア複合体阻害化合物(複合体I:ロテノン、和光純薬)を終濃度1μmol/Lから4倍の希釈列で5段階を添加し培養を続けた。2時間後に培養液を除き、SDSサンプルバッファー(200μL)で細胞を溶解した。ウェスタンブロッティング解析を以下のようにして行った。すなわち、この細胞溶解液(8μL)をSDS−PAGE法(ゲル濃度:7.5−15%)にて分離し(Analytical Biochemistry、166号、368−379頁、1987年)、ニトロセルロース膜(BioRad社製)にトランスファー後、リン酸化EGFRに特異的な抗体(Cell signaling technology社製、コード番号2232)を用いて、ECLシステム(アマシャム)にて、抗体を検出し、画像解析によりリン酸化タンパク質量として定量した。
EGFRのリン酸化は、溶媒対照群のA431細胞で顕著に検出された。このときロテノンによるEGFRのリン酸化抑制は認められなかった。
EGFRはHER1とも呼ばれ、HER2と高い相同性を持ち同じファミリーに分類される受容体チロシンリン酸化酵素である。実施例2の結果と併せ、細胞内エネルギー代謝の阻害による受容体チロシンリン酸化抑制は、HER2特異的である事が明らかとなった。
[実施例10]
AMPK活性化によるHER2発現癌細胞増殖阻害
ヒトHER2発現細胞としてBT−474乳癌細胞、MDA−MB−453乳癌細胞、LNCaP前立腺癌細胞を用い、HER2非発現細胞としてMDA−MB−231乳癌細胞、A498腎癌細胞(いずれもATCCより購入)を用いた。各細胞を500cells/150μL/wellで96穴プレートに播種し、一晩培養したものを用いた。トログリタゾン(最終濃度:25,6.25,1.56μmol/L)を培地で希釈し、上記最終濃度となるよう50μL/wellずつ加えた。5日間、37℃、5% CO2で培養した後、Cell Counting Kit−F(同仁化学研究所)を用い細胞数を測定した。
Cell Counting Kit−Fを用いた生細胞数測定は、添付文書に従い、以下の方法で行った。5日間の培養を行った96穴プレートから上清を除き、RPMI培地(フェノールレッド不含、血清不含)で1000倍に希釈したCell Counting Kit−Fを100μL/wellずつ加えた。室温で30分間反応させた後、蛍光プレートリーダーによって蛍光(励起波長;480nm、蛍光波長;530nm)を測定した。
測定結果から、トログリタゾンを加えないウェル(対照)の蛍光を100%とした時に、トログリタゾンを添加したウェルの蛍光の割合を求め、残存細胞量を対照に対する%として求めた。
この結果、トログリタゾンはHER2発現癌細胞に対し、25μmol/Lの濃度で、BT474細胞を50%、MB453細胞を25%、LNCaP細胞を48%にまで増殖阻害した。この増殖阻害は濃度依存的であった。一方、HER2非発現癌細胞では、25μmol/Lの濃度でMDA−MB−231細胞は100%、A498細胞が105%と、まったく増殖阻害活性を示さなかった。
トログリタゾンはAMPKを活性化する事が報告されている。実施例7、8の結果と併せ、AMPKの活性化はHER2リン酸化を抑制し、HER2発現癌特異的な、細胞増殖阻害を引き起こすことが明らかとなった。
エネルギー代謝阻害剤またはエネルギー代謝阻害模倣剤は、HER2のリン酸化を抑制し、HER2のシグナルを阻害、HER2発現細胞の増殖を阻害するため、例えば、HER2発現癌の予防・治療薬、HER2発現細胞の増殖阻害薬、HER2シグナル阻害薬、HER2の脱リン酸化剤、癌の転移・再発抑制薬、癌細胞のアポトーシス促進薬、関節リウマチの予防・治療薬などとして安全な医薬として使用することができる。さらには、HER2発現癌患者に対し、エネルギー代謝阻害剤またはエネルギー代謝阻害模倣剤を投与することにより、HER2発現癌を予防・治療することができる。試験化合物を細胞に接触させ、細胞内のエネルギー代謝を測定することにより、HER2発現癌の予防・治療薬が効率よくスクリーニングすることができる。
[配列表]
[配列表]
Claims (24)
- エネルギー代謝阻害剤またはエネルギー代謝阻害模倣剤を含有してなるHER2発現癌の予防・治療薬。
- エネルギー代謝阻害剤が、ATP産生阻害剤である請求項1記載の予防・治療薬。
- ATP産生阻害剤が、糖代謝阻害剤である請求項2記載の予防・治療薬。
- 糖代謝阻害剤が、ミトコンドリア活性阻害剤である請求項3記載の予防・治療薬。
- ミトコンドリア活性阻害剤が、電子伝達系阻害剤である請求項4記載の予防・治療薬。
- 電子伝達系阻害剤が、呼吸鎖複合体I、II、III、IVおよびVから選ばれる少なくとも一種を阻害する剤である請求項5記載の予防・治療薬。
- ミトコンドリア活性阻害剤が、TCA回路阻害剤である請求項4記載の予防・治療薬。
- ミトコンドリア活性阻害剤が、AMP活性化プロテインキナーゼ活性化剤である請求項4記載の予防・治療薬。
- 糖代謝阻害剤が、解糖系阻害剤である請求項3記載の予防・治療薬。
- エネルギー代謝阻害模倣剤が、AMP活性化プロテインキナーゼ活性化剤である請求項1記載の予防・治療薬。
- エネルギー代謝阻害模倣剤を含有してなるHER2発現癌の予防・治療薬。
- エネルギー代謝阻害模倣剤が、AMP活性化プロテインキナーゼ活性化剤である請求項11記載の予防・治療薬。
- AMP活性化プロテインキナーゼ活性化剤が、ミトコンドリア活性阻害剤である請求項12記載の予防・治療薬。
- HER2が、配列番号:1、配列番号:3または配列番号:5で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩である請求項1または11記載の予防・治療薬。
- HER2発現細胞の増殖阻害薬および(または)HER2シグナル阻害薬である請求項1または11記載の予防・治療薬。
- シグナルが、癌細胞の増殖シグナル、抗アポトーシスシグナル、浸潤シグナルおよび転移シグナルから選ばれる少なくとも一種である請求項15記載の予防・治療薬。
- HER2の脱リン酸化剤である請求項1または11記載の予防・治療薬。
- 癌の転移・再発抑制薬または癌細胞のアポトーシス促進薬である請求項1または11記載の予防・治療薬。
- ミトコンドリア呼吸鎖複合体阻害作用およびAMP活性化プロテインキナーゼ活性化作用を有する物質を含有してなるHER2発現癌の予防・治療薬。
- 試験化合物を細胞に接触させ、細胞内のエネルギー代謝を測定することを特徴とするHER2発現癌の予防・治療薬のスクリーニング方法。
- エネルギー代謝を阻害またはエネルギー代謝の阻害を模倣することを特徴とするHER2発現癌の予防・治療方法。
- 哺乳動物に対し、エネルギー代謝阻害剤またはエネルギー代謝阻害模倣剤の有効量を投与することを特徴とするHER2発現癌の予防・治療方法。
- HER2発現癌の予防・治療薬を製造するためのエネルギー代謝阻害剤またはエネルギー代謝阻害模倣剤の使用。
- HER2が発現しており、糖代謝が亢進している患者に対し、エネルギー代謝阻害剤またはエネルギー代謝阻害模倣剤を投与することを特徴とする、HER2発現癌の予防・治療方法。
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