ITSS20100007A1 - Metodica per l'utilizzo delle proteine fosforilate in tirosina presenti nelle urine per la diagnostica "in vitro" di carcinoma della vescicca. - Google Patents
Metodica per l'utilizzo delle proteine fosforilate in tirosina presenti nelle urine per la diagnostica "in vitro" di carcinoma della vescicca. Download PDFInfo
- Publication number
- ITSS20100007A1 ITSS20100007A1 IT000007A ITSS20100007A ITSS20100007A1 IT SS20100007 A1 ITSS20100007 A1 IT SS20100007A1 IT 000007 A IT000007 A IT 000007A IT SS20100007 A ITSS20100007 A IT SS20100007A IT SS20100007 A1 ITSS20100007 A1 IT SS20100007A1
- Authority
- IT
- Italy
- Prior art keywords
- phosphoproteins
- urine
- phosphorylated
- urinary
- bladder cancer
- Prior art date
Links
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 title claims description 32
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 24
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 13
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 title description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 title 1
- 102000007982 Phosphoproteins Human genes 0.000 claims description 48
- 108010089430 Phosphoproteins Proteins 0.000 claims description 48
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 claims description 39
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 claims description 36
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 claims description 36
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 claims description 18
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 14
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 9
- 229950006137 dexfosfoserine Drugs 0.000 claims description 9
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 claims description 7
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 claims description 7
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 6
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 claims description 6
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 claims description 6
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 108091005981 phosphorylated proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 4
- BZQFBWGGLXLEPQ-UHFFFAOYSA-N O-phosphoryl-L-serine Natural products OC(=O)C(N)COP(O)(O)=O BZQFBWGGLXLEPQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 claims description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 3
- BZQFBWGGLXLEPQ-REOHCLBHSA-N phosphoserine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)COP(O)(O)=O BZQFBWGGLXLEPQ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 2
- -1 phosphoryl residues Chemical group 0.000 claims description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims 3
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims 2
- 239000000439 tumor marker Substances 0.000 claims 2
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 claims 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 claims 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 claims 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 claims 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 claims 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 claims 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 claims 1
- 230000002980 postoperative effect Effects 0.000 claims 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 10
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 7
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 238000001597 immobilized metal affinity chromatography Methods 0.000 description 6
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 5
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 4
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 230000002380 cytological effect Effects 0.000 description 2
- YVIGPQSYEAOLAD-UHFFFAOYSA-L disodium;dodecyl phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].CCCCCCCCCCCCOP([O-])([O-])=O YVIGPQSYEAOLAD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 238000010422 painting Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- 101710115430 65 kDa phosphoprotein Proteins 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- GYHNNYVSQQEPJS-UHFFFAOYSA-N Gallium Chemical compound [Ga] GYHNNYVSQQEPJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- ZRKWMRDKSOPRRS-UHFFFAOYSA-N N-Methyl-N-nitrosourea Chemical compound O=NN(C)C(N)=O ZRKWMRDKSOPRRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 238000002574 cystoscopy Methods 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000006209 dephosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 229910052733 gallium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000000865 phosphorylative effect Effects 0.000 description 1
- DCWXELXMIBXGTH-UHFFFAOYSA-N phosphotyrosine Chemical compound OC(=O)C(N)CC1=CC=C(OP(O)(O)=O)C=C1 DCWXELXMIBXGTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000009822 protein phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
- G01N33/57488—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds identifable in body fluids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2440/00—Post-translational modifications [PTMs] in chemical analysis of biological material
- G01N2440/14—Post-translational modifications [PTMs] in chemical analysis of biological material phosphorylation
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
DESCRIZIONE
La presente invenzione riguarda l'utilizzo delle fosfoproteine presenti nelle urine per eseguire la diagnosi del carcinoma della vescica.
Il tumore della vescica ? una importante causa di mortalit? nell'uomo perch? la sua diagnosi ? spesso tardiva a causa della mancanza di efficaci markers diagnostici e/o prognostici. Le urine rappresentano il campione biologico di elezione per la ricerca di eventuali markers tumorali nel tumore della vescica in quanto raccolgono le cellule tumorali o sostanze da esse direttamente o indirettamente rilasciate. Le urine sono, inoltre, facilmente reperibili e sono, per questo, adatte a test diagnostici rapidi e non invasivi.
La diagnosi del carcinoma della vescica riveste grande rilevanza in medicina umana in quanto pi? ? tardiva la diagnosi minori sono le probabilit? di guarigione. Purtroppo le lesioni precoci non causano una sintomatologia e quindi spesso sfuggono alla diagnosi. E' inoltre interessante notare che il carcinoma della vescica ? considerato una patologia legata agli ambienti di lavoro, in particolare, la sua aumentata incidenza ? legata ad alcuni cicli produttivi dell'industria chimica o all'uso di una serie di composti chimici quali solventi, composti alogenati, etc., che vengono utilizzati nelle verniciature o lavorazioni delle materie plastiche.
Attualmente il metodo diagnostico di elezione per la diagnosi di carcinoma della vescica ? la cistoscopia transureterale. Questa metodologia ? per? invasiva, causa un disagio per il paziente ed ha costi elevati. Oltre all'analisi citologica delle urine per la ricerca di cellule tumorali, una serie di metodiche diagnostiche si basano invece sulla rivelazione di marcatori tumorali nelle urine. Questo approccio ha il grande vantaggio di non essere invasivo e di essere potenzialmente molto meno costoso della cistoscopla. Alcuni nuovi marcatori urinari del carcinoma della vescica sono stati recentemente scoperti ed hanno trovato applicazione pratica. La sensibilit? e specificit? diagnostica dell'esame citologico delle urine e delle nuove metodiche non invasive risulta comunque inferiore al 50% e quindi il problema della diagnosi precoce e non invasiva del carcinoma delle vescica resta irrisolto.
Per risolvere il problema della diagnosi precoce del carcinoma della vescica, i presenti inventori hanno studiato e verificato la presenza di fosfoproteine nelle urine di soggetti normali e affetti da carcinoma della vescica, allo scopo di verificare se la presenza di fosfoproteine urinarie potesse consentire diagnosi del carcinoma della vescica.
Alterazioni di livelli di alcune fosfoproteine sono state ampiamente riscontrate nelle cellule tumorali ma, nei liquidi biologici quali sangue e plasma, la reazione di defosforilazione delle proteine avviene rapidamente ed ? fortemente accelerata dalla presenza di enzimi con attivit? proteina fosfatasica. Per questo motivo, le fosfoproteine presenti nei campioni biologici sono rapidamente degradate e non sono di aiuto per la diagnosi tumorale.
Nelle urine le fosfoproteine sono stabilizzate dall'alta concentrazione di fosfati e dal pH acido.
La presenza di fosfoproteine nelle urine umane rappresenta quindi un dato nuovo e relativamente inatteso.
Alla luce della letteratura scientifica corrente non risulta precedentemente descritta la presenza di fosfoproteine nelle urine umane n? come dato generale n? in relazione alla diagnosi di tumori.
Mirowski M, et al. (Carcinogenesis 1993 Aug;14(8):165964) hanno dato evidenza di una fosfoproteina del peso di 65 kDa nelle urine di ratti che presentavano adenocarcinoma delle ghiandole mammarie indotto dal trattamento con N-methyl-N-nitrosourea . Nell'articolo sopra citato si specula che la fosfoproteina di 65 kDa possa essere utilizzata nella diagnosi di tumore della mammella ma, questi studi eseguiti in tumori sperimentali dei ratti, non hanno successivamente trovato riscontro nell'uomo.
I presenti inventori hanno ora individuato la presenza di fosfoproteine nelle urine umane e questo risultato ? stato messo in relazione alla presenza di un tumore della vescica. Un aumento della concentrazione delle fosfoproteine ? stata infatti riscontrata nelle urine dei pazienti affetti da carcinoma della vescica.
Come verr? illustrato in dettaglio nella sezione relativa alla parte sperimentale, l'efficacia diagnostica di questi markers tumorali appare superiore rispetto a quello di altri markers urinari del tumore della vescica che non sono entrati a far parte delle metodologie diagnostiche di routine proprio a causa della loro scarsa specificit? e sensibilit?.
La presente invenzione ? pertanto rappresentata dalla ricerca delle fosfoproteine nelle urine per eseguire diagnosi di tumori della vescica.
Come mostrato nei dettagli nella parte sperimentale, le fosfoproteine devono essere distinte per la loro fosforilazione nei residui di serina e di tirosina. Quest'ultima modificazione appare avere una maggiore rilevanza diagnostica rispetto alle fosforilazioni nei residui di serina.
Un primo aspetto della presente invenzione ? quindi rappresentato da alterazioni del quadro elettroforetico delle fosfoproteine urinarie evidenziate mediante ant?corpi antifosfotirosina ed anti-fosfoserina nei soggetti affetti da carcinoma della vescica.
Un secondo aspetto sono i metodi di arricchimento e separazione delle fosfoproteine urinarie finalizzati alla loro evidenziazione per la diagnosi di tumore della vescica.
Un terzo aspetto sono I metodi di rilevazione delle fosfoproteine urinarie ed alla loro caratterizzazione finalizzata alla diagnosi di tumore della vescica.
La composizione dell'invenzione pu? comprendere una qualsiasi metodologia o combinazione di pi? metodologie finalizzate alla misura delle fosfoproteine totali, di classi di fosfoproteine (fosforilate in serina o in tirosina) o di specifiche fosfoproteine nelle urine con la finalit? di eseguire la diagnosi di tumore della vescica.
Parte sperimentale
Dimostrazione della presenza di fosfoproteine nelle urine umane e descrizione di specifici patterns di fosfoproteine che discriminano tra soggetti sani e pazienti affetti da carcinoma della vescica
L'efficacia dell'invenzione ? stata testata su 50 (cinquanta) campioni di urine di soggetti sani e 50 (cinquanta) campioni di urine affetti da carcinoma della vescica a diversi stadi di progressione della malattia.
In primo luogo, le fosfoproteine sono state ricercate e caratterizzate nelle urine in assenza di metodiche cromatografiche atte ad un loro arricchimento pre-analitico. Le proteine sono state isolate dalle urine mediante precipitazione con acido tricloroacetico (Sigma-Aldrich Corporation, Stati Uniti d'America) e risospese in sodio dodecilfosfato (SDS) al 2%. 10 ?? di proteine sono state quindi separate mediante SDS-PAGE al 10% e colorate mediante blu di Comassie. Esperimenti eseguiti in parallelo sono stati utilizzati per trasferire le proteine su nitrocellulosa mediante tecnica di western blotting. Le proteine trasferite sono state incubate con anticorpi anti-fosfoserina o antifosfotirosina (Sigma-Aldrich Corporation, Stati Uniti d'America)diluiti 1:1000 rispetto alla loro concentrazione iniziale. I quadri rappresentativi ottenuti in 5 soggetti sani e 5 soggetti affetti da carcinoma della vescica sono presentati nel disegno 1 (pannelli A e B). E' evidente una diversa rappresentazione delle fosfoproteine marcate con anticorpo anti-fosfotirosina a pi? alto peso molecolare (>75kDa) tra soggetti sani ed affetti da carcinoma della vescica.
L'analisi dei quadri di fosforilazione delle proteine urinarie mostra che i risultati divergono tra soggetti in sani e soggetti affetti da carcinoma della vescica sia in termini quantitativi sia qualitativi.
In particolare, come evidenziato nel disegno 1, in seguito a marcatura con anticorpi anti-fosfotirosina, una serie di bande relative alle fosfoproteine sono pi? intensamente marcate nei soggetti affetti da carcinoma della vescica (pannello B) rispetto ai controlli normali (pannello A).
Nessun soggetto sano ha presentato un quadro delle fosfoproteine simile ai pazienti affetti da tumore della vescica. Alterazioni del quadro fosfoproteico sono state evidenziate anche nei pazienti che presentavano quadri iniziali della patologia. Il quadro ? risultato maggiormente discriminante tra soggetti sani e patologici se le fosfoproteine sono state evidenziate mediante anticorpi anti-fosfotirosina rispetto alla marcatura con anticorpi anti-fosfoserina.
A prova che la marcatura ? altamente specifica per residui fosforilati delle proteine, i campioni sono stati pretrattati con fosfatasi alcalina (Sigma-Aldrich Corporation, Stati Uniti d'America) per 60' a 37?C. Il risultato di questo trattamento ? stato una riduzione del segnale pari a circa il 95% per tutte le bande elettroforetiche marcate con anticorpi anti fosfotirosina e fosfoserina.
Dai dati sopra riportati risulta che un quadro alterato delle fosfoproteine urinarie ? un indice della presenza di carcinoma della vescica. In particolare, appare avere una chiara rilevanza diagnostica la presenza di fosfoproteine fosforilate in tirosina.
In una seconda serie di esperimenti, sia per convalidare la specificit? dei marcatori urinari, sia per evidenziare la possibilit? di ottenere metodiche pi? sensibili, abbiamo sottoposto i campioni urinari a cromatografia per affinit? mediante tecnica IMAC ( immobilised metal affinity chromatography). Sono stati provati diversi metalli quali ferro, rame e gallio. In tutte le condizioni sperimentali abbiamo verificato un arricchimento del segnale generato dalla presenza delle fosfoproteine nei campioni di urine di soggetti affetti da carcinoma della vescica, contemporaneamente, si ? assistito ad una diminuzione relativa dello stesso segnale nei campioni di urine di soggetti sani.
Questo dato conferma che, nei soggetti affetti da carcinoma, alcune proteine sono pi? fortemente fosforilate che nei soggetti sani e che queste possono essere efficacemente purificate mediante tecniche cromatografiche IMAC.
I risultati ottenuti mediante anticorpi anti-fosfoserina hanno fornito risultati di interesse seppur di minore rilievo diagnostico rispetto alle proteine fosforilate in tirosina .
Oltre alla tecnica IMAC le fosfoproteine sono state purificate mediante anticorpi specifici anti fosfotirosina ed anti-fosfoserina . Le proteine purificate sono state separate mediante SDS-PAGE e marcate con gli anticorpi relativi. Il pre-arricchimento con anticorpi anti-fosfotirosina ha mostrato un quadro sovrapponibile agli esperimenti effettuati con purificazione mediante cromatografia IMAC.
La purificazione mediante anticorpi anti-fosfoserina ha fornito risultati di minor rilievo diagnostico.
Anticorpi anti fosfotirosina sono stati inoltre adsorbiti a nitrocellulosa ed utilizzati per catturare proteine che presentano fosforilazioni sui residui di tirosina immergendo la nitrocellulosa direttamente nelle urine. Dopo aver fatto reagire 1'anticorpo con il relativo antigene, la nitrocellulosa ? stata lavata con PBS (NaCl 140 mM, NaHP04- 10 mM, pH 7.4) contenente Tween 20 al 1%. La nitrocellulosa ? stata successivamente incubata con anticorpi anti-fosfotirosina. In corrispondenza dell'area in cui era stato adsorbito 1'anticorpo anti-fosfotirosina ? stata rilevata una maggiore quantit? di fosfoproteine nelle urine di soggetti affetti da carcinoma della vescica. La misura quantitativa delle fosfoproteine mediante l'uso di anticorpi secondari marcati con composti fluorescenti di tutti i campioni oggetto dello studio ha permesso di visualizzare le distribuzioni dei valori nei soggetti sani ed affetti da carcinoma della vescica (disegno 1, pannello 3. Anche questo approccio metodologico ha quindi dimostrato la sua efficacia nel catturare le proteine fosforilate ed ha mostrato la capacit? di discriminare tra soggetti sani e soggetti affetti da carcinoma della vescica. Analizzando 68 soggetti sani e 52 pazienti affetti da carcinoma della vescica ? stato riscontrato un netto incremento medio della quantit? di proteine fosforilate in tirosina. I risultati dell'analisi sono riportati nel disegno 1 in cui sono mostrate le distribuzioni dei risultati ottenuti nei singoli soggetti analizzati. Questa metodica ha evidenziato una sensibilit? diagnostica superiore al 90% ed una specificit? superiore al 95% per 1' evidenziazione di carcinoma della vescica. Non ? stata dimostrata una correlazione tra grado di malignit? delle neoplasie e positivit? al test. Questa osservazione porta a ipotizzate che la metodica sia in grado di evidenziare anche le fasi precoci del carcinoma della vescica.
I dati sopra riportati dimostrano inoltre l'efficacia della metodica cromatografica per immuno-affinit? mediante anticorpi anti fosfoserina e fosfotirosina allo scopo di aumentare la sensibilit? e la specificit? del risultato diagnostico. Questi dati hanno ulteriormente dimostrato che la classe di fosfoproteine cha hanno maggiore potere diagnostico ? rappresentata dalle proteine fosforilate in tirosina. I risultati ottenuti mediante cattura con anticorpi legati a nitrocellulosa dimostrano inoltre la possibilit? di attuare metodiche di detezione rapide tipo Dip-Stick per la diagnosi di carcinoma della vescica.
In conclusione, gli inventori hanno dimostrato un sostanziale aumento delle fosfoproteine presenti nelle urine di pazienti affetti da carcinoma della vescica rispetto ai soggetti sani. In particolare il quadro delle fosfoproteine urinarie ? spiccatamente modificato riguardo alle fosforilazioni che interessano i residui di tirosina. Tecniche di purificazione tipo IMAC o immuno-affinta mediante anticorpi anti-fosfotirosina hanno dimostrato la loro efficacia nell' aumentare la specificit? e la sensibilit? delle metodiche analitiche finalizzate alla diagnostica. L'uso sequenziale di tali metodiche cromatografiche ha inoltre dimostrato la sua efficacia nell'aumentare la sensibilit? analitica di misura delle fosfoproteine urinarie. L'analisi eseguita dopo trattamento con fosfatasi alcalina del campione ha chiaramente dimostrato la specificit? del segnale rilevato, in altri termini: il segnale rilevato nei saggi immunoenzimatici ? specifico per le fosfoproteine e la loro capacit? di agire come markers diagnostici per il tumore della vescica risiede specificamente nelle loro modificazioni fosforilative. Questi risultati indicano pertanto che la ricerca e/o caratterizzazione delle fosfoproteine urinarie pu? essere utilizzata nella diagnosi non-invasiva del tumore della vescica. La specificit? e la sensibilit? diagnostica del nuovo metodo basato sulla ricerca delle fosfoproteine nelle urine risultano superiori ai valori ottenibili con metodiche che utilizzano altri markers tumorali urinari.
Claims (2)
- RIVENDICAZIONI 1). L' uso di un qualsiasi polipeptide fosforilato presente nelle urine come marcatore tumorale per la diagnosi del carcinoma della vescica, indipendentemente dalla loro dimensione, sequenza aminoacidica e dei siti fosforilati. 2). L' uso di un qualsiasi polipeptide fosforilato presente nelle urine come marcatore tumorale per il follow up post operatorio di pazienti affetti da carcinoma della vescica, indipendentemente dalla loro dimensione, sequenza aminoacidica e dei siti di fosforilazione. 3). Le metodiche per la rivelazione delle fosfoproteine nelle urine secondo le rivendicazioni 1 e
- 2. Il metodo potr? essere rivolto alla rivelazione di tutte le fosfoproteine presenti nelle urine o di specifiche proteine e/o di specifiche modificazioni delle stesse come fosforilazioni in tirosina e/o serina. I metodi potranno essere basati sull'uso di una delle seguenti metodiche o molecole e/o sul loro uso sequenziale o combinato. a)purificazione, evidenziazione e/o caratterizzazione delle fosfoproteine urinarie mediante una serie di ligandi: anticorpi rivolti ai residui aminocidici fosforilati (anti-fostotirosina e anti fosfoserina), anticorpi specifici per le sequenze circostanti ai residui aminoacidici fosforilati o anticorpi specifici per le proteine fosforilate, tecniche IMAC (immobilizeded metal ion affinity chromatography) per purificare le fosfoproteine attraverso ligandi che legano specificamente i residui fosforilici. I ligandi sopra menzionati potranno essere differentemente marcati con molecole fluorescenti, enzimi, ed altre molecole atte a permettere la loro individuazione e misura; b) tecniche di spettrometria di massa per l'identificazione delle fosfoproteine urinarie; c) sulla separazione delle fosfoproteine urinarie mediante SDS-PAGE e immunoblotting con anticorpi anti-residuo fosforilato e/o proteina fosforilata; d) tecniche tipo dot-blot basate sulla adesione delle fosfoproteine urinarie a supporti solidi quali nitrocellulosa o nylon o PVDF per legame diretto o mediato da anticorpi e successiva loro rivelazione mediante tecniche di chemiluminescenza, fluorescenza o rivelazione UV-visibile e) l'uso combinato di due o pi? metodologie sopramenzionate per la rivelazione delle fosfoproteine urinarie
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT000007A ITSS20100007A1 (it) | 2010-11-08 | 2010-11-08 | Metodica per l'utilizzo delle proteine fosforilate in tirosina presenti nelle urine per la diagnostica "in vitro" di carcinoma della vescicca. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT000007A ITSS20100007A1 (it) | 2010-11-08 | 2010-11-08 | Metodica per l'utilizzo delle proteine fosforilate in tirosina presenti nelle urine per la diagnostica "in vitro" di carcinoma della vescicca. |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ITSS20100007A1 true ITSS20100007A1 (it) | 2012-05-08 |
Family
ID=43743034
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| IT000007A ITSS20100007A1 (it) | 2010-11-08 | 2010-11-08 | Metodica per l'utilizzo delle proteine fosforilate in tirosina presenti nelle urine per la diagnostica "in vitro" di carcinoma della vescicca. |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| IT (1) | ITSS20100007A1 (it) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007124750A2 (en) * | 2006-04-27 | 2007-11-08 | Syddansk Universitet | Methods for isolation and analysis of sialylated and phosphorylated peptides |
| WO2009021322A1 (en) * | 2007-08-16 | 2009-02-19 | The Royal Institution For The Advancement Of Learning/Mcgill University | Tumor cell-derived microvesicles |
-
2010
- 2010-11-08 IT IT000007A patent/ITSS20100007A1/it unknown
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007124750A2 (en) * | 2006-04-27 | 2007-11-08 | Syddansk Universitet | Methods for isolation and analysis of sialylated and phosphorylated peptides |
| WO2009021322A1 (en) * | 2007-08-16 | 2009-02-19 | The Royal Institution For The Advancement Of Learning/Mcgill University | Tumor cell-derived microvesicles |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| FIORI C ET AL: "RESEARCH AND EVALUATION OF NEW MARKERS IN BLADDER CANCER: A PHOSPHOPROTEOMIC STUDY", EUROPEAN UROLOGY SUPPLEMENTS, XX, XX, vol. 7, no. 3, 1 March 2008 (2008-03-01), pages 290, XP022610874, ISSN: 1569-9056, [retrieved on 20080301], DOI: DOI:10.1016/S1569-9056(08)60874-X * |
| IWAKI H ET AL: "DIAGNOSTIC POTENTIAL IN BLADDER CANCER OF A PANEL OF TUMOR MARKERS (CALRETICULIN, GAMMA-SYNUCLEIN, AND CATECHOL-O-METHYLTRANSFERASE) IDENTIFIED BY PROTEOMIC ANALYSIS", CANCER SCIENCE, JAPANESE CANCER ASSOCIATION, TOKYO, JP, vol. 95, no. 12, 1 December 2004 (2004-12-01), pages 955 - 961, XP009055233, ISSN: 1347-9032, DOI: DOI:10.1111/J.1349-7006.2004.TB03183.X * |
| KHADJAVI AMINA ET AL: "Evidence of Abnormal Tyrosine Phosphorylated Proteins in the Urine of Patients With Bladder Cancer: The Road Toward a New Diagnostic Tool?", JOURNAL OF UROLOGY, vol. 185, no. 5, May 2011 (2011-05-01), pages 1922 - 1929, XP008137033, ISSN: 0022-5347 * |
| VAN RHIJN B W G ET AL: "Urine Markers for Bladder Cancer Surveillance: A Systematic Review", EUROPEAN UROLOGY, ELSEVIER BV, NL, vol. 47, no. 6, 1 June 2005 (2005-06-01), pages 736 - 748, XP004941461, ISSN: 0302-2838, DOI: DOI:10.1016/J.EURURO.2005.03.014 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2020202066B2 (en) | Methods and compositions for detecting pancreatic cancer | |
| CN105785003B (zh) | 用于在受试者中诊断胰腺癌的工具和方法 | |
| US9618512B2 (en) | Biomarker for breast cancer | |
| TWI704228B (zh) | 肝癌的檢查方法 | |
| US20200096516A1 (en) | Nanoplasmonic quantification of tumor-derived extracellular vesicles in plasma microsamples for detection and treatment monitoring | |
| CN101498700A (zh) | 人血液样本中脂类分子含量测定及其结直肠癌诊断试剂盒制备与应用 | |
| JP2011523708A (ja) | ペルオキシソーム増殖の増加を評価する手段及び方法 | |
| US20150285804A1 (en) | Diagnostic method for colorectal cancer | |
| KR101806136B1 (ko) | 대사체 분석을 이용한 베체트병 관절염의 진단방법 | |
| RU2504785C1 (ru) | Способ диагностики рака молочной железы | |
| JP6294118B2 (ja) | 大腸癌マーカー及び大腸癌検出方法 | |
| JP5344211B2 (ja) | 肝癌マーカー | |
| ITSS20100007A1 (it) | Metodica per l'utilizzo delle proteine fosforilate in tirosina presenti nelle urine per la diagnostica "in vitro" di carcinoma della vescicca. | |
| KR20160033580A (ko) | 표면-증강 라만 산란 기반의 면역 분석에 의한 류마티즘 마커 검출 방법 | |
| JP2018179962A (ja) | Ｎ結合型糖鎖を利用した尿路上皮癌の診断方法 | |
| CN110325862B (zh) | 用于检测缺血性发生的慢性脑病理学的诊断试剂盒 | |
| Khorshed et al. | Development of an impedance-based biosensor for determination of IgG galactosylation levels | |
| JP2014020941A (ja) | 大腸癌のマーカーおよびそれを用いた診断 | |
| JP5167541B2 (ja) | アポリポタンパク質ｃｉｉｉ０の血中濃度を指標とした胃癌の診断法 | |
| WO2011037045A1 (ja) | 腎細胞癌の判定法 | |
| KR101001275B1 (ko) | 유방암 진단용 단백질 마커 비오티니다제 및 이에 대한 항체를 포함하는 유방암 진단키트 | |
| US20090233313A1 (en) | Quantification and affinity characterization of antibodies for the diagnosis of disease using optical diffraction | |
| WO2021245413A1 (en) | Methods of determining cancer | |
| JP2011047846A (ja) | 前立腺癌の診断法 | |
| JP2021076410A (ja) | 肺がん罹患のリスクを評価するための方法 |