JP6207505B2 - 有用な代謝産物の生産のための組み換え微生物 - Google Patents
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Description
a)ホスホケトラーゼ活性を有すること;
b)(i)ホスホフルクトキナーゼをコードする遺伝子(単数または複数)の不活性化により、もしくは改変されていない微生物と比較してホスホフルクトキナーゼ活性を低減することにより、減少した、もしくは不活性化されたエムデン−マイヤーホフ−パルナス経路(EMPP)を有すること;または
(ii)ホスホフルクトキナーゼ活性を有しないこと
および
c)(i)グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子(単数または複数)の不活性化により、もしくは改変されていない微生物と比較してグルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を低減することにより、減少した、もしくは不活性化されたペントースリン酸経路(PPP)の酸化分枝を有すること;または
(ii)グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有しないこと;
を特徴とする組換え微生物に関する。
アセチル−CoA+ホルメート = CoA+ピルベート(例えば、ピルベートホルメートリアーゼ(EC 2.3.1.54)としても知られているホルメート C−アセチルトランスフェラーゼにより触媒される;大腸菌−pflBに関して、NCBI−遺伝子ID:945514);
ATP+アセテート = ADP+アセチルリン酸(例えば、アセテートキナーゼ(EC 2.7.2.1)により触媒される;大腸菌−ackAに関して、NCBI−遺伝子ID:946775);
(R)−ラクテート+NAD+ = ピルベート+NADH+H+(例えば、L−ラクテートデヒドロゲナーゼ(EC 1.1.1.28)により触媒される;大腸菌−ldhAに関して、NCBI−遺伝子ID:946315);
ホスフェート+オキサロアセテート = ホスホエノールピルベート+HCO3 −(例えば、ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ(EC 4.1.1.31)により触媒される;大腸菌−ppcに関して、NCBI−遺伝子ID:948457);
ATP+オキサロアセテート = ADP+ホスホエノールピルベート+CO2(例えば、ホスホエノールピルベートカルボキシキナーゼ(ATP)(EC 4.1.1.49)により触媒される;大腸菌−pckに関して、NCBI−遺伝子ID:945667);
スクシネート+アクセプター = フマレート+還元されたアクセプター(例えば、スクシネートデヒドロゲナーゼ(EC 1.3.99.1)により触媒される;frdAおよびfrdBを含む大腸菌に関して、NCBI−遺伝子ID:それぞれ948667および948666);
2−オキソカルボキシレート(例えばピルベート) = アルデヒド(例えばアセトアルデヒド)+CO2(例えば、ピルベートデカルボキシラーゼ(EC 4.1.1.1)により触媒される));
アセトアルデヒド+CoA+NAD+ = アセチル−CoA+NADH+H+(例えば、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ(アセチル化)(EC 1.2.1.10)により触媒される;大腸菌−adhEに関して、NCBI−遺伝子ID:945837);
sn−グリセロール 3−ホスフェート+NAD(P)+ = グリセロンホスフェート(glycerone phosphate)+NAD(P)H+H+(例えば、グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ[NAD(P)+](EC 1.1.1.94)により触媒される;大腸菌−gpsAに関して、NCBI−遺伝子ID:948125);
2ピルベート = 2−アセトラクテート+CO2(例えば、アセトラクテートシンターゼ(EC 2.2.1.6)により触媒される;大腸菌−ilvHおよびilvIに関して、NCBI−遺伝子ID:それぞれ947267および948793);
グリセロンホスフェート = メチルグリオキサール+ホスフェート(例えば、メチルグリオキサールシンターゼ(EC 4.2.3.3)により触媒される;大腸菌−mgsAに関して、NCBI−遺伝子ID:945574);および
ホルメート+H+ = CO2+H2(例えば、ホルメートヒドロゲンリアーゼ(EC 1.12.1.2と一緒でのEC 1.2.1.2)により触媒される;大腸菌−fdhF(EC 1.2.1.2)に関して、NCBI−遺伝子ID:948584)。
−嫌気性増殖の全体的な制御因子であるfnr遺伝子(NCBI−遺伝子ID:945908)を欠失させる;および
−RNAポリメラーゼ、シグマS(シグマ38)因子であるrpoS遺伝子(NCBI−遺伝子ID:947210)を欠失させる。
ライゲーションおよび形質転換に関する手順は当該技術で周知である。以下の実施例における使用に適した技法は、Sambrook J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, Cold Spring Harbor, ニューヨーク, 1989、およびSambrook J.(上記)において見付けることができる。
DNAを染色体の特定の領域中に組み込むために、その挿入するDNAの標的となる染色体部位への相同性および選択可能なマーカーが必要とされる。そのマーカーを組み込み後に容易に除去することができるならば好都合である。FRT/Flpリコンビナーゼ系は、そのマーカーを除去するための機構を提供する。FRT部位はFlpリコンビナーゼに関する認識部位である。Flpは部位特異的リコンビナーゼであり、直列反復する認識部位から間にあるDNAを切り出す。
この節の目的は、GBE1014と名付けられた大腸菌株の構築を記述することであり、それに関してPEP依存性のグルコース取り込みがPTS輸送遺伝子の欠失により不活性化されており、ATP依存性のグルコース取り込みが可能になっており、エムデン−マイヤーホフ−パルナス経路(EMPP)がホスホフルクトキナーゼ遺伝子の欠失により不活性化されており、ペントースリン酸経路(PPP)がグルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の欠失により不活性化されている。
株GBE0901を37℃のLBプレート上に蒔き、単離されたコロニーをグルコースを炭素源として含む(2g/L)MSプレート上でスクリーニングした。37℃で48時間の培養後、コロニーが見えるようになった。1つの分離株は5時間の倍加時間を有しており、GBE0929と名付けられた。
GBE0129と名付けられた株を用いて構築を開始した。GBE0129はMG1655大腸菌細菌(ATCC #700926)である。
この節の目的は、大腸菌株においてラクトコッカス・ラクティスからのホスホケトラーゼYP_003354041.1の発現を可能にするプラスミドの構築を記述することである。
大腸菌におけるアセトン生成の原因となるプラスミドの構築は、Bermejo LL., Welker NE. and Papoutsakis ET., Applied and Environmental Microbiology, 1998, Vol. 64, No. 3, pp. 1076-1085において記述されているプラスミド構築に基づいていた。
プラスミドの関連する株中への形質転換の記述
株GBE0129をエレクトロコンピテントにし、GBE0129エレクトロコンピテント細胞をプラスミドpGBE0096を用いて形質転換した。次いで形質転換体をクロラムフェニコール(25μg/ml)を含有するLBプレート上に蒔き、プレートを30℃で一夜培養して株GBE0329を生成した。
発酵実験に関して、50mMリン酸二カリウムの代わりに200mMのリン酸二カリウムを含むMS培地を用いた。結果として得られた培地をMSPと名付けた。
分割量を濾過し、グルコース濃度をグルコース(HK)アッセイキット(GAHK20−1KT,Sigma)を製造業者の推奨に従って用いて決定した。アセトン濃度を、ガスクロマトグラフ450−GC(Bruker)および以下のプログラムを用いるガスクロマトグラフィーにより決定した:
−カラム:DB−WAX(123−7033,Agilent Technologies)
−インジェクタースプリット/スプリットレス:T°=250℃
−オーブン:
○80℃で6分間
○220℃まで1分ごとに10℃
○220℃で7分間
○カラム流速:1.5ml/分(窒素)
−検出器FID:T°=300℃
結果
[アセトン]生成(mM)/[グルコース]消費(mM)の比率は、株GBE1347に関して株GBE1346に関するよりも高い。
プラスミドの関連する株中への形質転換の記述
株GBE0929をエレクトロコンピテントにし、GBE0929エレクトロコンピテント細胞をpGBE0096と名付けられたプラスミドを用いて形質転換した。次いで形質転換体をクロラムフェニコール(25μg/ml)を補ったLBプレート上に蒔き、プレートを30℃で一夜培養して株GBE1348を得た。
グルコース(10g/L)およびクロラムフェニコール(25μg/ml)を含有する400mlのMSP培地に、株GBE1350の前培養物または株GBE1351の前培養物のどちらかを植え付けた。最初のOD600は0.1であった。その400mlの培養物をスクリューキャップで密封された500mlのボトル中で、30℃、170rpmの速度で培養した。2mlの分割量を1日、2日、3日、6日、7日、および8日後に採取した。それぞれの分割量の試料に関して、ボトルを10秒間開けた。
分割量を濾過し、グルコース濃度をグルコース(HK)アッセイキット(GAHK20−1KT,Sigma)を製造業者の推奨に従って用いて決定した。アセトン濃度を、ガスクロマトグラフ450−GC(Bruker)および以下のプログラムを用いるガスクロマトグラフィーにより決定した:
−カラム:DB−WAX(123−7033,Agilent Technologies)
−インジェクタースプリット/スプリットレス:T°=250℃
−オーブン:
○80℃で6分間
○220℃まで1分ごとに10℃
○220℃で7分間
○カラム流速:1.5ml/分(窒素)
−検出器FID:T°=300℃
結果
[アセトン]生成(mM)/[グルコース]消費(mM)の比率は、株GBE1351に関して株GBE1350に関するよりも高かった。
この節の目的は、大腸菌株においてラクトコッカス・ラクティスからのホスホケトラーゼYP_003354041.1の発現を可能にし、且つアセトンの生成も可能にするプラスミドの構築を記述することである。
この節の目的は、大腸菌株においてアセトンの産生を可能にするプラスミドの構築を記述することである。
プラスミドの関連する株中への形質転換の記述
株GBE0129をエレクトロコンピテントにし、GBE0129エレクトロコンピテント細胞をプラスミドpGBE1021を用いて形質転換した。次いで形質転換体をアンピシリン(100μg/ml)を含有するLBプレート上に蒔き、プレートを30℃で一夜培養して株GBE2262を生成した。
グルコース(10g/L)、酵母抽出物(0.1g/L)およびアンピシリン(100μg/ml)を含有するMSP液体培地(200ml)に、株GBE2264の前培養物または株GBE2265の前培養物のどちらかを植え付けた。最初のOD600は0.1であった。その200mlの培養物をスクリューキャップで密封された250mlのボトル中で、30℃、170rpmの速度で培養した。分割量(2ml)を1日、2日、4日、5日、および6日後に採取した。それぞれの分割量の試料に関して、ボトルを10秒間開けた。
分割量を濾過し、グルコース濃度をAgilent HPLC(1260 Infinity)およびガードカラム(Agilent,PL Hi−Plex Hガードカラム,PL1170−1830)を伴うHi−Plexカラム(Agilent,PL1170−6830)を用いたHPLC分析により決定した。
−溶媒組成:[H2SO4]:5.5mM
−カラムの温度:65℃
−RID(G1362A):温度設定:35℃
アセトンを濾過された分割量から酢酸メチルと混合することにより抽出した(2体積の濾過された分割量に関して1体積の酢酸メチル)。アセトン濃度を、ガスクロマトグラフ450−GC(Bruker)および以下のプログラムを用いるガスクロマトグラフィーにより決定した:
−カラム:DB−WAX(123−7033,Agilent Technologies)
−インジェクター:
○スプリット比:10
○T°=250℃
−オーブン:
○50℃で9分間
○180℃まで1分ごとに20℃
○180℃で5分間
○カラム流速:1.5ml/分(窒素)
−検出器FID:T°=300℃
結果
[アセトン]生成(mM)/[グルコース]消費(mM)の比率は、株GBE2265に関して株GBE2264に関するよりも高かった。
株GBE0929を、グルコースを炭素源として含有する(2g/L)MSプレート上に蒔いた。単離されたコロニーをグルコース(2g/L)を含有するMS液体培地に移し、30℃で3日間培養した。グルコース(2g/L)を含有するMS液体培地(100ml)に、株GBE0929の前培養物を植え付けた。最初のOD600は0.1であった。その100mlの培養物を1Lのエルレンマイヤー中で、30℃、170rpmの速度で培養した。OD600が1を上回った際に、その培養物の分割量を採取し、新しい培養のための種菌として用いた(100mlの培養物を、1Lのエルレンマイヤー中で、30℃、170rpmの速度で培養した)。株GBE0929を10回継代培養して株GBE1283を得た。
実施例12:株GBE2256の構築
株GBE1283をLB培地中で培養し、GBE1283細胞をエレクトロコンピテントにした。エレクトロコンピテントなGBE1283細胞をpKD46プラスミドを用いて形質転換し、次いでアンピシリン(100μg/ml)を含有するLBプレート上に蒔いた。プレートを30℃で一夜培養した。GBE1283細胞のプラスミドpKD46を用いた形質転換は、株GBE1284を生成した。
プラスミドpGBE0688を鋳型としてプライマー0633および1109(それぞれSEQ RC0003およびRC0047として示される)と共に用いて1.3KbpのPCR産物を生成した。この1.3KbpのPCR産物をエレクトロコンピテントなGBE1284細菌中に形質転換し、次いでその形質転換混合物をスペクチノマイシン(50μg/ml)を含有するLBプレート上に蒔き、37℃で一夜培養して株GBE1433を生成した。株GBE1433において、zwf遺伝子により構成されるDNA配列を欠失させた。この欠失したzwf遺伝子を含むDNA配列は、スペクチノマイシン耐性カセットにより置き換えた。zwf遺伝子の有効な欠失を確かめるため、プライマー1036および1110(それぞれSEQ RC0005およびRC0048として示される)を用いてPCR増幅を実施した。最終的な1.5KbpのPCR産物が得られた。この1.5KbpのPCR産物を、同じプライマー1036および1110を用いて配列決定した。
プラスミドpGBE0688を鋳型としてプライマー0633および0634(それぞれSEQ RC0003およびRC0004として示される)と共に用いて1.3KbpのPCR産物を生成した。この1.3KbpのPCR産物をエレクトロコンピテントなGBE1284細菌中に形質転換し、次いでその形質転換混合物をスペクチノマイシン(50μg/ml)を含有するLBプレート上に蒔き、37℃で一夜培養して株GBE1287を生成した。株GBE1287において、zwf、edd、およびeda遺伝子により構成されるDNA配列を欠失させた。この欠失したzwf、edd、およびeda遺伝子を含むDNA配列はスペクチノマイシン耐性カセットにより置き換えた。zwf、edd、およびeda遺伝子の有効な欠失を確かめるため、プライマー1036および1037(それぞれSEQ RC0005およびRC0006として示される)を用いてPCR増幅を実施した。最終的な1.9KbpのPCR産物が得られた。この1.9KbpのPCR産物を、同じプライマー1036および1037を用いて配列決定した。
プラスミドの関連する株中への形質転換の記述
株GBE1283をエレクトロコンピテントにし、GBE1283エレクトロコンピテント細胞をプラスミドpGBE1021を用いて形質転換した。次いで形質転換体をアンピシリン(100μg/ml)を含有するLBプレート上に蒔き、プレートを30℃で一夜培養して株GBE2266を生成した。
グルコース(10g/L)、酵母抽出物(0.1g/L)およびアンピシリン(100μg/ml)を含有するMSP液体培地(200ml)に、株GBE2268の前培養物または株GBE2269の前培養物のどちらかを植え付けた。最初のOD600は0.1であった。その200mlの培養物をスクリューキャップで密封された250mlのボトル中で、30℃、170rpmの速度で培養した。分割量(2ml)を1日、2日、4日、5日、6日、7日および8日後に採取した。それぞれの分割量の試料に関して、ボトルを10秒間開けた。
分割量を濾過し、グルコース濃度をAgilent HPLC(1260 Infinity)およびガードカラム(Agilent,PL Hi−Plex Hガードカラム,PL1170−1830)を伴うHi−Plexカラム(Agilent,PL1170−6830)を用いたHPLC分析により決定した。
−溶媒組成:[H2SO4]:5.5mM
−カラムの温度:65℃
−RID(G1362A):温度設定:35℃
アセトンを濾過された分割量から酢酸メチルと混合することにより抽出した(2体積の濾過された分割量に関して1体積の酢酸メチル)。アセトン濃度を、ガスクロマトグラフ450−GC(Bruker)および以下のプログラムを用いるガスクロマトグラフィーにより決定した:
−カラム:DB−WAX(123−7033,Agilent Technologies)
−インジェクター:
○スプリット比:10
○T°=250℃
−オーブン:
○50℃で9分間
○180℃まで1分ごとに20℃
○180℃で5分間
○カラム流速:1.5ml/分(窒素)
−検出器FID:T°=300℃
結果
[アセトン]生成(mM)/[グルコース]消費(mM)の比率は、株GBE2269に関して株GBE2268に関するよりも高かった。
プラスミドの関連する株中への形質転換の記述
株GBE2256をエレクトロコンピテントにし、GBE2256エレクトロコンピテント細胞をプラスミドpGBE1020を用いて形質転換した。次いで形質転換体をアンピシリン(100μg/ml)を含有するLBプレート上に蒔き、プレートを30℃で一夜培養して株GBE2270を生成した。
グルコース(10g/L)、酵母抽出物(0.1g/L)およびアンピシリン(100μg/ml)を含有するMSP液体培地(200ml)に、株GBE2272の前培養物または株GBE2273の前培養物のどちらかを植え付けた。最初のOD600は0.1であった。その200mlの培養物をスクリューキャップで密封された250mlのボトル中で、30℃、170rpmの速度で培養した。分割量(2ml)を1日、2日、4日、5日および6日後に採取した。それぞれの分割量の試料に関して、ボトルを10秒間開けた。
分割量を濾過し、グルコース濃度をAgilent HPLC(1260 Infinity)およびガードカラム(Agilent,PL Hi−Plex Hガードカラム,PL1170−1830)を伴うHi−Plexカラム(Agilent,PL1170−6830)を用いたHPLC分析により決定した。
−溶媒組成:[H2SO4]:5.5mM
−カラムの温度:65℃
−RID(G1362A):温度設定:35℃
アセトンを濾過された分割量から酢酸メチルと混合することにより抽出した(2体積の濾過された分割量に関して1体積の酢酸メチル)。アセトン濃度を、ガスクロマトグラフ450−GC(Bruker)および以下のプログラムを用いるガスクロマトグラフィーにより決定した:
−カラム:DB−WAX(123−7033,Agilent Technologies)
−インジェクター:
○スプリット比:10
○T°=250℃
−オーブン:
○50℃で9分間
○180℃まで1分ごとに20℃
○180℃で5分間
○カラム流速:1.5ml/分(窒素)
−検出器FID:T°=300℃
結果
[アセトン]生成(mM)/[グルコース]消費(mM)の比率は、株GBE2273に関して株GBE2272に関するよりも高かった。
Claims (20)
- 以下:
a)ホスホケトラーゼ活性を有すること;
b)(i)ホスホフルクトキナーゼをコードする遺伝子(単数または複数)の不活性化により、もしくはホスホフルクトキナーゼ活性を遺伝子改変されていない微生物と比較して低減するように遺伝子改変されていることにより減少した、もしくは不活性化されたエムデン−マイヤーホフ−パルナス経路(EMPP)を有すること;または
(ii)ホスホフルクトキナーゼ活性を有しないこと
および
c)(i)グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子(単数または複数)の不活性化により、もしくはグルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を遺伝子改変されていない微生物と比較して低減するように遺伝子改変されていることにより減少した、もしくは不活性化されたペントースリン酸経路(PPP)の酸化的分岐(oxidative branch)を有すること;または
(ii)グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有しないこと;
を特徴とする組換え微生物。 - さらに以下:
d)フルクトース−1,6−二リン酸ホスファターゼ活性を有すること
を特徴とする、請求項1に記載の組換え微生物。 - 請求項1または2に記載の組換え微生物であって、EMPPがグリセルアルデヒド3−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子(単数または複数)の不活性化により、またはグリセルアルデヒド3−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を遺伝子改変されていない微生物と比較して低減するように遺伝子改変されていることによりさらに減少している、または不活性化されている、前記組換え微生物。
- 増大したホスホケトラーゼ活性を有するように遺伝子改変されている、請求項1〜3のいずれか1項に記載の組換え微生物。
- 前記の微生物が真菌である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の組換え微生物。
- 前記の微生物が細菌である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の組換え微生物。
- PEP依存性PTSトランスポーターをコードしている遺伝子(単数または複数)が不活性化されている、請求項6に記載の組換え微生物。
- さらに:
e)アセチル−CoAをアセトンに変換できること;
を特徴とする、請求項1〜7のいずれか1項に記載の組換え微生物。 - さらに:
f)アセトンをイソブテンに変換できること;
を特徴とする、請求項8に記載の組換え微生物。 - さらに:
g)アセトンをプロペンに変換できること;
を特徴とする、請求項8に記載の組換え微生物。 - グルコースのアセチル−CoAへの変換のための、請求項1〜10のいずれか1項に記載の組換え微生物の使用。
- グルコースのアセトンへの変換のための、請求項8〜10のいずれか1項に記載の組換え微生物の使用。
- グルコースのイソブテンへの変換のための、請求項9に記載の組換え微生物の使用。
- グルコースのプロペンへの変換のための、請求項10に記載の組換え微生物の使用。
- グルコースからアセトンを生成するための方法であって、
請求項8〜10のいずれか1項に記載の微生物を適切な培地中で培養すること;
を含む、前記方法。 - アセトンを培養液から回収することをさらに含む、請求項15に記載の方法。
- グルコースからイソブテンを生成するための方法であって、 請求項9に記載の微生物を適切な培地中で培養すること;
を含む、前記方法。 - イソブテンを回収することをさらに含む、請求項17に記載の方法。
- グルコースからプロペンを生成するための方法であって、 請求項10に記載の微生物を適切な培地中で培養すること;
を含む、前記方法。 - プロペンを回収することをさらに含む、請求項19に記載の方法。
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