ES2554814T3 - Microorganismo recombinante para la producción de metabolitos útiles - Google Patents

Microorganismo recombinante para la producción de metabolitos útiles Download PDF

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Abstract

Un microorganismo recombinante caracterizado porque: a) tiene actividad de fosfocetolasa; b) (i) tiene una ruta de Embden-Meyerhof-Parnas (EMPP) disminuida o inactivada por inactivación del gen o genes que codifica(n) fosfofructoquinasa o por estar modificado genéticamente para reducir la actividad de fosfofructoquinasa en comparación con un microorganismo no modificado genéticamente; o (ii) no posee actividad de fosfofructoquinasa; y c) (i) tiene una rama oxidativa disminuida o inactivada de la ruta de fosfato de pentosa (PPP) por inactivación del gen o genes que codifica(n) glucosa-6-fosfato deshidrogenasa o por estar modificado genéticamente para reducir la actividad de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa en comparación con un microorganismo no modificado genéticamente; o (ii) no posee actividad de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa.

Description

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procedimientos para medir el nivel de expresión de una proteína dada en una célula son bien conocidos por el experto en la materia. Los ensayos para medir la actividad enzimática reducida de una glucosa-6-fosfato deshidrogenasa se conocen en la técnica.
En otra realización el microorganismo de acuerdo con la presente invención es un microorganismo que no posee una actividad de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa. Esto significa preferentemente que dicho microorganismo no posee de manera natural una actividad de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa. Esto significa que dicho microorganismo no contiene de manera natural en su genoma una secuencia de nucleótido que codifica una enzima con actividad de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa. Algunos ejemplos para dichos microorganismos son Acinetobacter baylyi (Barbe y col., Nucl. Acids Res. 32 (2004), 5766-5779), arqueas del filo hipertermofílico tales como Sulfolobus solfataricus (Nunn y col., J. Biol. Chem. 285 (2010), 33701-33709), Thermoproteus tenax, Thermoplasma acidophilum y Picrophilus torridus (Reher y Schönheit, FEBS Lett. 580 (2006), 1198-1204).
En una realización adicional, el microorganismo de acuerdo con la presente invención también se caracteriza por tener actividad de fructosa-1,6-bisfosfato fosfatasa, preferentemente cuando crece en glucosa. La fructosa-1,6bisfosfato fosfatasa es una enzima que participa en la gluconeogénesis hidrolizando fructosa-1,6-bisfosfato en fructosa-6-fosfato y fosfato libre. Sin embargo, básicamente en todos los organismos en presencia de glucosa, la actividad de fructosa-1,6-bisfosfato fosfatasa se reprime y la glucosa se procesa a través de EMPP (glucólisis). El microorganismo de la presente invención, el cual tiene actividad de fosfocetolasa y el cual no posee actividad de fosfofructoquinasa o en el que la actividad de fosfofructoquinasa está reducida o cuyo gen que codifica la fosfofructoquinasa está inactivado, el rendimiento de acetil-CoA por conversión de fructosa-6-fosfato con la fosfocetolasa (EC 4.1.2.9 o EC 4.1.2.22) se puede incrementar asegurando la presencia de actividad de fructosa1,6-bisfosfato fosfatasa, por ejemplo mediante des-represión de la fructosa-1,6-bisfosfato fosfatasa en presencia de glucosa. La presencia de actividad de fructosa-1,6-bisfosfato fosfatasa da como resultado el reciclado de fructosa1,6-bisfosfato producida por la fructosa-1,6-bisfosfato aldolasa en fructosa-6-fosfato la cual después de nuevo se puede convertir a través de la ruta de fosfocetolasa en acetil-CoA. En efecto, el producto fosfato de acetilo de la fosfocetolasa se interconvierte en acetil-CoA a través de la acción de la enzima fosfato acetiltransferasa EC 2.3.1.8. Por lo tanto, el microorganismo recombinante de la presente invención es capaz de producir acetil-CoA a partir de glucosa a una estequiometría que se aproxima a 3:1. La suma de las reacciones se da en la ecuación 2:
glucosa + ATP + 3 CoA  3 acetil-CoA + ADP + H3PO4 + 2 H2O (Ecuación 2)
La expresión "actividad de fructosa-1,6-bisfosfato fosfatasa" significa una actividad enzimática que convierte fructosa-1,6-bisfosfato y H2O en fructosa-6-fosfato y fosfato (EC 3.1.3.11). Esta actividad enzimática se puede medir usando ensayos conocidos en la técnica como los descritos, por ejemplo, en Hines y col. (J. Biol. Chem. (2007) 282, 11696-11704). Las expresiones "actividad de fructosa-1,6-bisfosfato fosfatasa" y "fructosa-1,6-bisfosfato fosfatasa" también cubren enzimas que son bifuncionales en el sentido que éstas muestran una actividad de fructosa-1-6bisfosfato aldolasa/fosfatasa. Dichas enzimas bifuncionales se expresan en la mayoría de los linajes bacterianos de las arqueas y de ramificación profunda y, en la mayoría de los casos, son estables al calor. Dichas enzimas se informan, por ejemplo, para Thermococcus kodakaraensis, Sulfolobus tokodaii, Ignicoccus hospitalis, Cenarchaeum symbiosum, Sulfolobus solfataricas, Thermus thermophilus, Thermoproteus neutrophilus, Moorelia thermoacetica y muchas otras (véase, por ejemplo, Say y Fuchs (Nature 464 (2010), 1077); Fushinobu y col. (Nature 478 (2011),
538: Du y col. (Nature 478 (2011), 534).
La expresión "actividad de fructosa-1,6-bisfosfato fosfatasa cuando crece en glucosa" significa que el microorganismo expresa una enzima con actividad de fructosa-1,6-bisfosfato fosfatasa cuando el microorganismo se cultiva en glucosa. "Cultivado en glucosa" significa que el microorganismo se cultiva en un medio que contiene, entre otros, glucosa como fuente de carbono. Preferentemente, esta expresión significa que el microorganismo se cultiva en un medio que contenía glucosa como la única fuente de carbono.
En el contexto de la presente invención, un microorganismo que tiene actividad de fructosa-1,6-bisfosfato fosfatasa, en particular cuando crece en glucosa, puede ser, por ejemplo, un microorganismo que de manera natural tiene actividad de fructosa-1,6-bisfosfato fosfatasa, en particular cuando crece en glucosa, o un microorganismo que no tiene de manera natural actividad de fructosa-1,6-bisfosfato fosfatasa, en particular cuando crece en glucosa, y que se ha modificado genéticamente para expresar una fructosa-1,6-bisfosfato fosfatasa, en particular cuando crece en glucosa. Este también podría ser un microorganismo que de manera natural tiene actividad de fructosa-1,6bisfosfato fosfatasa, en particular cuando crece en glucosa, y que se ha modificado genéticamente, por ejemplo transformado con un ácido nucleico, por ejemplo un vector, que codifica una fructosa-1,6-bisfosfato fosfatasa con el fin de incrementar la actividad de fosfocetolasa en dicho microorganismo.
En la técnica se conocen algunos microorganismos que de manera inherente, es decir de forma natural, tienen actividad de fructosa-1,6-bisfosfato fosfatasa, en particular cuando crecen en glucosa, y en el contexto de la presente invención se puede usar cualquiera de los mismos.
También es posible en el contexto de la presente invención que el microorganismo sea un microorganismo que de manera natural no tiene actividad de fructosa-1,6-bisfosfato fosfatasa, en particular cuando crece en glucosa, pero que se modifica genéticamente para que sea capaz de expresar una fructosa-1,6-bisfosfato fosfatasa, en particular,
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cuando crece en glucosa. Esto se puede lograr, por ejemplo, mutando el promotor del gen que codifica la fructosa1,6-bisfosfato fosfatasa en una manera tal que el gen ya no esté reprimido cuando el microorganismo se cultiva en glucosa o el promotor se puede reemplazar por otro promotor por ejemplo un promotor constitutivo que no está regulado cuando el microorganismo se cultiva en glucosa.
De manera similar, el microorganismo también puede ser un microorganismo que de manera natural tiene actividad de fructosa-1,6-bisfosfato fosfatasa, en particular cuando crece en glucosa, pero que se modifica genéticamente para mejorar/incrementar la actividad de fructosa-1,6-bisfosfato fosfatasa, en particular cuando crece en glucosa, por ejemplo mediante la introducción de una secuencia de nucleótido exógena que codifica una fructosa-1,6-bisfosfato fosfatasa.
Más adelante se describe con mayor detalle la modificación genética de microorganismos para expresar una enzima de interés.
La fructosa-1,6-bisfosfato fosfatasa de acuerdo con la invención puede ser una fructosa-1,6-bisfosfato fosfatasa que se produce de manera natural o puede ser una fructosa-1,6-bisfosfato fosfatasa que se obtiene a partir de una fructosa-1,6-bisfosfato fosfatasa que se produce de manera natural, por ejemplo mediante la introducción de mutaciones u otras alteraciones que, por ejemplo, alteran o mejoran la actividad enzimática, la estabilidad, etc. El experto en la materia conoce bien algunos procedimientos para modificar y/o mejorar las actividades enzimáticas deseadas de proteínas y se describieron anteriormente. Las variantes de fructosa-1,6-bisfosfato fosfatasa resultantes se evalúan después respecto a sus propiedades, por ejemplo actividad enzimática o regulación. En la técnica se conocen algunos ensayos para medir la actividad enzimática de una fructosa-1,6-bisfosfato fosfatasa. En una realización la fructosa-1,6-bisfosfato fosfatasa es una enzima que no está regulada por inhibición de retroalimentación.
En una realización preferente, el microorganismo recombinante se ha modificado genéticamente para que tenga una actividad incrementada de fructosa-1,6-bisfosfato fosfatasa. Esto se puede lograr por ejemplo transformando el microorganismo con un ácido nucleico que codifica una fructosa-1,6-bisfosfato fosfatasa. Más adelante se proporciona una descripción detallada de la modificación genética de microorganismos.
En el contexto de la presente invención, una "actividad incrementada" significa que la expresión y/o la actividad de una enzima, en particular de la fructosa-1,6-bisfosfato fosfatasa, en el microorganismo modificado genéticamente cuando crece en glucosa es por lo menos un 10 %, preferentemente por lo menos un 20 %, de manera más preferente por lo menos un 30 % o un 50 %, de manera incluso más preferente por lo menos un 70 % o un 80 % y particularmente preferente por lo menos un 90 % o un 100 % más alta que en el microorganismo no modificado correspondiente cuando crece en glucosa. En realizaciones incluso más preferentes el incremento en la expresión y/o actividad puede ser por lo menos un 150 %, por lo menos un 200 % o por lo menos un 500 %. En realizaciones particularmente preferentes la expresión es por lo menos 10 veces, de manera más preferente por lo menos 100 veces e incluso más preferente por lo menos 1000 veces más alta que en el microorganismo no modificado correspondiente en particular cuando crece en glucosa.
El experto en la materia conoce bien algunos procedimientos para medir el nivel de expresión de una proteína dada en una célula. En una realización, la medición del nivel de expresión se hace midiendo la cantidad de la proteína correspondiente. El experto en la materia conoce bien algunos procedimientos correspondientes e incluyen Western Blot, ELISA etc. En otra realización la medición del nivel de expresión se hace midiendo la cantidad del ARN correspondiente. El experto en la materia conoce bien algunos procedimientos correspondientes e incluyen, por ejemplo. Northern Blot.
En la técnica se conocen algunos procedimientos para medir la actividad enzimática de la fructosa-1,6-bisfosfato.
En otra realización, el microorganismo de acuerdo con la presente invención se caracteriza también porque la EMPP está adicionalmente disminuida o inactivada por inactivación del gen o genes que codifican la gliceraldehído-3fosfato deshidrogenasa o mediante modificación genética para reducir la actividad de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa en comparación con un microorganismo no modificado genéticamente. La disminución adicional de la EMPP en una etapa más corriente abajo disminuyendo o inactivando la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa asegura que ninguno o casi ninguno del gliceraldehído-3-fosfato que se pudiera producir en el microorganismo sea procesado a través de la glucólisis hasta acetil-CoA con lo cual se perdería un átomo de carbono por la liberación de CO2 en la última etapa catalizado por la piruvato deshidrogenasa. Por lo tanto, bloquear la EMPP disminuyendo o inactivando la actividad de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa asegura adicionalmente que el flujo global se dirija hacia la fosfocetolasa.
La "actividad de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa" significa una actividad enzimática que convierte gliceraldehído-3-fosfato, fosfato y NAD+ en 3-fosfo-D-gliceroil fosfato y NADH + H+ (EC 1.2.1.12). Esta actividad se puede medir usando ensayos conocidos en la técnica como los descritos, por ejemplo, en D'Alessio y col. (J. Biol. Chem. (1971) 246, 4326-4333).
La expresión "un microorganismo que se caracteriza por tener una ruta Embden-Meyerhof-Parnas (EMPP) adicionalmente disminuida o inactivada por inactivación del gen o genes que codifican una gliceraldehído-3-fosfato
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Uniprot Q1M911), Lactobacillus casei (número de referencia Uniprot Q03B66), Francisella tularensis (número de referencia Uniprot Q0BLC9), Saccharopolyspora erythreae (número de referencia Uniprot A4FKR9). Korarchaeum cryptofilum (número de referencia Uniprot B1L3N6), Bacillus amyloliquefaciens (número de referencia Uniprot A7Z8K8), Cochliobolus heterostrophus (número de referencia Uniprot Q8NJQ3), Sulfolobus islandicus (número de referencia Uniprot C3ML22) y Francisella tularensis subsp. holarctica (cepa OSU18).
De manera más preferente, el microorganismo se modifica genéticamente para que se transforme con una molécula de ácido nucleico que codifica una enzima que puede catalizar la etapa de reacción 2 de la síntesis de acetona mencionada anteriormente, es decir la conversión de acetoacetil-CoA en acetoacetato.
Incluso de manera más preferente, el microorganismo se modifica genéticamente para que sea transformado con una molécula de ácido nucleico que codifica una enzima que puede catalizar la etapa de reacción 1 de la síntesis de acetona mencionada anteriormente, es decir la condensación de dos moléculas de acetil-CoA en acetoacetatil-CoA.
En una realización particularmente preferente el microorganismo se modifica genéticamente para que se transforme con una molécula de ácido nucleico que codifica una enzima que puede catalizar la etapa de reacción 1 de la síntesis de acetona mencionada anteriormente y con una molécula de ácido nucleico que codifica una enzima que puede catalizar la etapa de reacción 2 de la síntesis de acetona mencionada anteriormente o con una molécula de ácido nucleico que codifica una enzima que puede catalizar la etapa de reacción 1 de la síntesis de acetona mencionada anteriormente y con una molécula de ácido nucleico que codifica una enzima que puede catalizar la etapa de reacción 3 mencionada anteriormente de la síntesis de acetona o con una molécula de ácido nucleico que codifica una enzima que puede catalizar la etapa de reacción 2 de la síntesis de acetona mencionada anteriormente y con una molécula de ácido nucleico que codifica una enzima que puede catalizar la etapa de reacción 3 mencionada anteriormente de la síntesis de acetona o con una molécula de ácido nucleico que codifica una enzima que puede catalizar la etapa de reacción 1 de la síntesis de acetona mencionada anteriormente y con una molécula de ácido nucleico que codifica una enzima que puede catalizar la etapa de reacción 2 de la síntesis de acetona mencionada anteriormente y con una molécula de ácido nucleico que codifica una enzima que puede catalizar la etapa de reacción 3 mencionada anteriormente de la síntesis de acetona.
Los procedimientos para preparar los microorganismos modificados genéticamente mencionados anteriormente se conocen bien en la técnica. Por lo tanto, en términos generales, el microorganismo se transformó con una construcción de ADN que permite la expresión de la enzima respectiva en el microorganismo. Dicha construcción normalmente comprende la secuencia codificadora en cuestión ligada a secuencias reguladoras que permiten la transcripción y traducción en la célula hospedadora respectiva, por ejemplo un promotor y/o incrementador y/o terminador de transcripción y/o sitios de unión a ribosoma, etc. La técnica anterior ya describe microorganismos que se han modificado genéticamente para que sean capaces de producir acetona. En particular los genes provenientes de, por ejemplo, Clostridium acetobutylicum se han introducido en E. coli con lo cual se permite la síntesis de acetona en E. coli, una bacteria que no produce acetona de manera natural (Bermejo y col., Appl. Environ. Microbiol. 64 (1998); 1079-1085; Hanai y col., Appl. Environ. Microbiol. 73 (2007), 7814-7818). En particular Hanai y col. (mencionado anteriormente) muestran que es suficiente introducir una secuencia de ácido nucleico que codifica una acetoacetato descarboxilasa (tal como la que proviene de Clostridium acetobutylicum) con el fin de lograr la producción de acetona en E. coli lo que indica que las enzimas endógenas en E. coli catalizan las etapas de reacción 1 y 2 mencionadas anteriormente (es decir los productos de expresión de los genes atoB y atoAD de E. coli) son suficientes para proporcionar substrato para la producción de acetona.
En otro aspecto de la presente invención, el microorganismo recombinante también se caracteriza porque es capaz de convertir acetil-CoA en acetona y convertir acetona en isobuteno. Algunos procedimientos para proporcionar dicho microorganismo recombinante se describen por ejemplo en los documentos EP-A 2 295 593 (EP 09 17 0312), WO 2010/001078 y EP 10 18 8001.
En otro aspecto de la presente invención, el microorganismo recombinante se caracteriza porque es capaz de convertir acetil-CoA en acetona y convertir acetona en propeno. Algunos procedimientos para proporcionar dicho microorganismo recombinante se describen por ejemplo en Hanai y col., Appl. Environ. Microbiol. 73 (2007), 78147818.
Un experto en la materia reconocerá que algunas modificaciones genéticas adicionales a los microorganismos de la presente invención podrían llevar a mejoras en la eficacia mediante las cuales los microorganismos de la presente invención convierten el material de abastecimiento en producto. Por ejemplo, algunos microorganismos naturales comúnmente producen productos tales como formiato, acetato, lactato, succinato, etanol, glicerol, 2,3-butanodiol, metilglioxal e hidrógeno; de los cuales todos podrían ser perjudiciales para la producción de, por ejemplo, acetona, isobuteno o propeno a partir de azúcares. La eliminación o reducción sustancial de dichos subproductos no deseados se puede lograr mediante eliminación o reducción de las actividades de enzimas clave que llevan a su producción. Dichas actividades incluyen, pero no se limitan a, el grupo que consiste en:
-acetil-CoA + formiato = CoA + piruvato (por ejemplo, catalizado por la formiato C-acetiltransferasa, también
conocida como piruvato formiato-liasa (EC 2.3.1.54); para E. coli-pfIB, ID de Gen de NCBI: 945514); -ATP + acetato = ADP + fosfato de acetilo (por ejemplo, catalizado por acetato quinasa (EC 2.7.2.1); para E. coli
5
15
25
35
45
55
ackA, ID de Gen de NCBI: 946775); -(R)-lactato + NAD+ = piruvato + NADH + H+ (por ejemplo, catalizado por L-lactato deshidrogenasa (EC 1.1.1.28); para E. coli-IdhA, ID de Gen de NCBI: 946315); -fosfato + oxaloacetato = fosfoenolpiruvato + HCO3 -(por ejemplo, catalizado por fosfoenolpiruvato carboxilasa (EC 4.1.1.31); para E. coli-ppc, ID de Gen de NCBI: 948457); -ATP + oxaloacetato = ADP + fosfoenolpiruvato + CO2 (por ejemplo, catalizado por fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (ATP) (EC 4.1.1.49); para E. coli-pck, ID de Gen de NCBI: 945667); -succinato + aceptor = fumarato + aceptor reducido (por ejemplo, catalizado por succinato deshidrogenasa (EC 1.3.99.1); para E. coli-que comprende frdA y frdB, ID de Gen de NCBI: 948667 y 948666, respectivamente); -un 2-oxo carboxilato (por ejemplo piruvato) = un aldehído (por ejemplo acetaldehído + CO2 (por ejemplo, catalizado por piruvato descarboxilasa (EC 4.1.1.1)); -acetaldehído + CoA + NAD+ = acetil-CoA + NADH + H+ (por ejemplo, catalizado por acetaldehído deshidrogenasa (acetiladora) (EC 1.2.1.10); para E. coli-adhE, ID de Gen de NCBI: 945837); -sn-glicerol 3-fosfato + NAD(P)+ = glicerona fosfato + NAD(P)H + H+ (por ejemplo, catalizado por glicerol-3-fosfato deshidrogenasa [NAD(P)+] (EC 1.1.1.94); para E. coli-gpsA, ID de Gen de NCBI: 948125); -2 piruvato = 2-acetolactato + CO2 (por ejemplo, catalizado por acetolactato sintetasa (EC 2.2.1.6); para E. coliilvH e ilvl, ID de Gen de NCBI: 947267 y 948793, respectivamente); -glicerona fosfato = metilglioxal + fosfato (por ejemplo, catalizado por metilglioxal sintetasa (EC 4.2.3.3); para E. coli-mgsA, ID de Gen de NCBI: 945574); y -formiato + H+ = CO2 + H2 (por ejemplo, catalizado por formiato hidrogenoliasa (EC 1.2.1.2 junto con EC 1.12.1.2); para E. coli-fdhF (EC 1.2.1.2), ID de Gen de NCBI: 948584).
Por lo tanto, en una realización preferente, el microorganismo de acuerdo con la invención se caracteriza porque una
o más de las actividades enzimáticas listadas anteriormente se eliminan o se reducen.
Un experto en la materia también reconocería que las modificaciones genéticas a los elementos reguladores en los microorganismos de la presente invención podrían llevar a mejoras en la eficacia con las cuales los microorganismos de la presente invención convierten el material de abastecimiento en producto. Dentro de E. coli, dichas modificaciones genéticas incluyen, pero no se limitan a, el grupo que consiste en:
-eliminar el gen fnr (ID de Gen de NCBI: 945908), un regulador global de crecimiento anaeróbico; y -eliminar el gen rpoS (ID de Gen de NCBI: 947210), una ARN polimerasa, factor sigma S (sigma 38).
Por lo tanto, en otra realización preferente el microorganismo de acuerdo con la invención muestra por lo menos una de estas supresiones.
Un aspecto adicional de la presente invención es el uso del microorganismo recombinante de la presente invención para la conversión de glucosa en acetil-CoA. La acetil-CoA (también conocida como acetil-Coenzima A) en la estructura química es el tioéster entre la coenzima A (un tiol) y ácido acético y es una molécula precursora importante para la producción de metabolitos útiles. La acetil-CoA después se puede convertir adicionalmente por el microorganismo recombinante en metabolitos útiles tales como ácido L-glutámico, L-glutamina, L-prolina, L-arginina, L-leucina, succinato y polihidroxibutirato.
Otro aspecto de la presente invención es el uso del microorganismo recombinante de la presente invención que es capaz de convertir acetil-CoA en acetona para la conversión de glucosa en acetona.
Un aspecto adicional de la presente invención es el uso del microorganismo recombinante de la presente invención que es capaz de convertir acetil-CoA en acetona y acetona en isobuteno para la conversión de glucosa en isobuteno.
De nuevo un aspecto adicional de la presente invención es el uso del microorganismo recombinante de la presente invención que es capaz de convertir acetil-CoA en acetona y acetona en propeno para la conversión de glucosa en propeno.
Por consiguiente, la presente invención también se refiere a un procedimiento para la producción de acetona y/o isobuteno y/o propeno a partir de glucosa en el que el microorganismo recombinante mencionado anteriormente se cultiva bajo condiciones que permitan la producción de acetona y/o isobuteno y/o propeno y en el que se aíslan la acetona y/o isobuteno y/o propeno. Los microorganismos se cultivan bajo condiciones de cultivo apropiadas que permitan que ocurran las reacciones enzimáticas. Las condiciones de cultivo específicas dependen del microorganismo específico empleado pero son bien conocidas por el experto en la materia. Las condiciones de cultivo generalmente se eligen de tal manera que éstas permitan la expresión de los genes que codifican las enzimas para las reacciones respectivas. El experto en la materia conoce varios procedimientos para mejorar y afinar la expresión de ciertos genes en ciertas etapas del cultivo tal como la inducción de la expresión de genes mediante inductores químicos o mediante un cambio de temperatura.
En otra realización preferente el procedimiento de acuerdo con la invención comprende también la etapa de recolectar los productos gaseosos, en particular isobuteno o propeno, mediante desgasificación de la reacción, es decir recuperar los productos que desgasifican, por ejemplo, fuera del cultivo. Por lo tanto en una realización
preferente, el procedimiento se realiza en presencia de un sistema para recolectar isobuteno o propeno bajo forma gaseosa durante la reacción.
De hecho, los alquenos cortos tales como isobuteno y propeno adoptan el estado gaseoso a temperatura ambiente y presión atmosférica. El procedimiento de acuerdo con la invención por lo tanto no requiere la extracción del producto
5 a partir del medio de cultivo líquido, una etapa que siempre es muy costoso cuando se realiza a escala industrial. La evacuación y almacenamiento de los hidrocarburos gaseosos y su posible separación física posterior y conversión química se pueden efectuar de acuerdo con cualquier procedimiento conocido por el experto en la materia.
La presente invención se describe adicionalmente por referencia a las siguientes figuras y ejemplos no limitantes.
La Figura 1 muestra dos esquemas para la producción de acetil-CoA a partir de glucosa-6-fosfato a través de la ruta 10 de fosfocetolasa usando cualquiera o ambas actividades de fosfocetolasa EC 4.1.2.9 y EC 4.1.2.22.
Ejemplos
PROCEDIMIENTOS GENERALES Y MATERIALES
En la técnica se conocen bien algunos procedimientos para las ligaciones y transformaciones. Las técnicas apropiadas para uso en los siguientes ejemplos se pueden encontrar en Sambrook J., y col., Molecular Cloning: A
15 Laboratory Manual, 2ª Edición, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989, y Sambrook J., mencionado anteriormente.
En la técnica se conocen bien algunos materiales y procedimientos apropiados para el mantenimiento y crecimiento de los cultivos bacterianos. Algunas técnicas apropiadas para uso en los siguientes ejemplos se pueden encontrar en Manual of Methods for General Bacteriology (Philipp Gerhardt, R.G.E. Murray, Ralph N. Costilow, Eugene W, Nester, Willis A. Wood, Noel R. Krieg y G. Briggs Philips, eds).
20 Todos los reactivos y materiales usados para el crecimiento y mantenimiento de las células bacterianas se obtienen a partir de Sigma-Aldrich Company (St. Louis, MO) a menos que se especifique de otra manera.
TABLA 1: Plásmidos usados y construidos
Nombre del Plásmido
Descripción
pKD46
Datsenko KA. y Wanner BL., Proceedings of the National Academy of Sciences, 2000, Vol. 97, Nº 12, pp. 6640-6645
pCP20
Datsenko KA. y Wanner BL., Proceedings of the National Academy of Sciences, 2000, Vol. 97, Nº 12, pp. 6640-6645
pGBE0687
El plásmido pGBE0687 presenta un gen de resistencia a apramicina colocado bajo el control de su propio promotor
pGBE0688
El plásmido pGBE0688 presenta un gen de resistencia a espectinomicina colocado bajo el control de su propio promotor
pGBE0421
Plásmido de GeneArt® (Invitrogen) que codifica fosfocetolasa de L. lactis
pGBE0123
Una versión modificada del plásmido pUC18 (New England Biolabs) el cual contiene un Sitio de Clonación Múltiple (MCS) modificado.
pGBE0457
Plásmido que permite la expresión de la fosfocetolasa de L. lactis
pGBE0689
Fagémidos pBluescript II, Agilent Technologies
pGBE0690
Genes ctfA y ctfB provenientes de Clostridium acetobutylicum clonados en pGBE0689
pGBE0691
Gen adc proveniente de Clostridium acetobutylicum clonado en pGBE0690
pGBE0051
pUC19, New England Biolabs
pGBE0692
Genes ctfA, ctfB y adc provenientes de Clostridium acetobutylicum clonados en pGBE0051
pGBE0693
Gen thI proveniente de Clostridium acetobutylicum clonado en pGBE0692
pGBE0124
Una versión modificada del plásmido pSU18 (Borja Bartolomé, Yolanda Jubete, Eduardo Martinez y Fernando de la Cruz, Gene, 1991, Vol. 102, Fascículo 1, pp. 75-78)
(continuación)
Nombre del Plásmido
Descripción
pGBE0096
Genes thl, ctfA, ctfB y adc provenientes de Clostridium acetobutylicum clonados en pGBE0124
pGBE0928
Plásmido que permite la expresión de la fosfocetolasa de L. lactis
pGBE1020
Plásmido que permite la expresión de la fosfocetolasa de L. lactis y la producción de acetona
pGBE1021
Plásmido que permite la producción de acetona
TABLA 2: Cepas usadas y construidas
FRT : objetivo de reconocimiento de FLP
Nombre de cepa
Genotipo Cepa de origen de la construcción
GBE0219
F-lambda-ilvG-rfb-50 rph-1 Escherichia coli K12 MG1655 de tipo silvestre
GBE0170
pKD46 GBE0129 Transformación de la cepa GBE0129 con el plásmido pKD46
GBE0329
pGBE0096 GBE0129 Transformación de la cepa GBE0129 con el plásmido pGBE0096
GBE0901
ΔptsHI::FRT GBE0129
GBE0902
ΔptsHI::FRT pKD46 GBE0901 Transformación de la cepa GBE0901 con el plásmido pKD46
GBE0903
ΔptsHI::FRT Δzwf_edd_eda::aad+ GBE0902
GBE0929
ΔptsHI::FRT GBE0901 Selección de la cepa GBE0901 en medio MS con glucosa como la fuente de carbono.
GBE1000
ΔptsHI::FRT Δzwf_edd_eda::aad+ GBE0903. Selección de la cepa GBE0903 en medio MS con glucosa como la fuente de carbono.
GBE1001
ΔptsHI::FRT Δzwf_edd_eda::aad+ pKD46 GBE1000 Transformación de la cepa GBE1000 con el plásmido pKD46
GBE1005_ pKD46
ΔptsHI::FRT Δzwf_edd_eda::aad+ ΔpfkA::aac+ GBE1001
GBE1005
ΔptsHI::FRT Δzwf_edd_eda::aad+ ΔpfkA::aac+ GBE1005 pKD46. Se ha verificado la pérdida del plásmido pKD46.
GBE1005_ P
ΔptsHI::FRT Δzwf_edd_eda::aad+ ΔpfkA::aac+ pCP20 GBE1005 Transformación de la cepa GBE1005 con el plásmido pCP20
GBE1006
ΔptsHI::FRT Δzwf_edd_eda::FRT ΔpfkA::FRT GBE1005_p Se ha verificado la pérdida del plásmido pCP20.
GBE1010
ΔptsHI::FRT Δzwf_edd_eda::FRT ΔpfkA::FRT pKD46 GBE1006 Transformación de la cepa GBE1006 con el plásmido pKD46
GBE1014_ pKD46
ΔptsHI::FRT Δzwf_edd_eda::FRT ΔpfkA::FRT ΔpfkB::aad+ GBE1010
GBE1014
ΔptsHI::FRT Δzwf_edd_eda::FRT ΔpfkA::FRT ΔpfkB::aad+ GBE1014_pKD46 Se ha verificado la pérdida del plásmido pKD46.
(continuación)
FRT : objetivo de reconocimiento de FLP
Nombre de cepa
Genotipo Cepa de origen de la construcción
GBE1283
ΔptsHI::FRT GBE0929 Cultivos sucesivos de la GBE0929 en medio MS con glucosa como la fuente de carbono.
GBE1284
ΔptsHI::FRT pKD46 GBE1283 Transformación de la cepa GBE1283 con el plásmido pKD46
GBE1287
ΔptsHI::FRT Δzwf_edd_eda::aad+ GBE1284
GBE1337
ΔptsHI::FRT Δzwf_edd_eda::aad+ pKD46 GBE1287 Transformación de la cepa GBE1287 con el plásmido pKD46
GBE1339
Δzwf_edd_eda::aac+ GBE0170
GBE1340
Δzwf_edd_eda::aac+ pKD46 GBE1339 Transformación de la cepa GBE1339 con el plásmido pKD46
GBE1341_ pKD46
Δzwf_edd_eda::aac+ ΔpfkA::aad+ GBE1340
GBE1341
Δzwf_edd_eda::aac+ ΔpfkA::aad+ GBE1341_pKD46 Se ha verificado la pérdida del plásmido pKD46.
GBE1341_p
Δzwf_edd_eda::aac+ ΔpfkA::aad+ pCP20 GBE1341 Transformación de la cepa GBE1341 con el plásmido pCP20
GBE1342
Δzwf_edd_eda::FRT ΔpfkA::FRT GBE1341_p Se ha verificado la pérdida del plásmido pCP20.
GBE1343
Δzwf_edd_eda::FRT ΔpfkA::FRT pKD46 GBE1342 Transformación de la cepa GBE1342 con el plásmido pKD46
GBE1344_ pKD46
Δzwf_edd_eda::FRT ΔpfkA::FRT ΔpfkB::aad+ GBE1343
GBE1344
Δzwf_edd_eda::FRT ΔpfkA::FRT ΔpfkB::aad+ GBE1344_pKD46 Se ha verificado la pérdida del plásmido pKD46.
GBE1345
Δzwf_edd_eda::FRT ΔpfkA::FRT ΔpfkB::aad+ pGBE457 pGBE0096 GBE1344 Transformación de la cepa GBE1344 con ambos plásmidos pGBE96 y pGBE457
GBE1346
pGBE0096 GBE0329 Adaptación de la cepa GBE0329 al medio MS + glucosa (2 g/l) + Cloranfenicol (25 ug/ml)
GBE1347
Δzwf_edd_eda::FRT ΔpfkA::FRT ΔpfkB::aad+ pGBE457 pGBE96 GBE1345 Adaptación de la cepa GBE1345 al medio MS + glucosa (2 g/l) + Cloranfenicol (25 ug/ml)
GBE1348
ΔptsHI::FRT pGBE96 GBE0929 Transformación de la cepa GBE0929 con ambos plásmidos pGBE96 y pGBE457
GBE1349
ΔptsHI::FRT Δzwf_edd_eda::FRT ΔpfkA::FRT ΔpfkB::aad+ pGBE457 pGBE0096 GBE1014 Transformación de la cepa GBE1014 con ambos plásmidos pGBE96 y pGBE457
GBE1350
ΔptsHI::FRT pGBE96 GBE1348 Adaptación de la cepa GBE1348 al medio MS + glucosa (2 g/l) + Cloranfenicol (25 ug/ml)
(continuación)
FRT : objetivo de reconocimiento de FLP
Nombre de cepa
Genotipo Cepa de origen de la construcción
GBE1351
ΔptsHI::FRT Δzwf_edd_eda::FRT ΔpfkA::FRT ΔpfkB::aad+ pGBE457 pGBE0096 GBE1349 Adaptación de la cepa GBE1349 al medio MS + glucosa (2g/l) + Cloranfenicol (25 ug/ml)
GBE1353_ pKD46
ΔptsHI::FRT Δzwf_edd_eda::aad+ ΔpfkA::aac+ GBE1337
GBE1353
ΔptsHI::FRT Δzwf_edd_eda::aad+ ΔpfkA::aac+ GBE1353 _pKD46 Se ha verificado la pérdida del plásmido pKD46.
GBE1353_p
ΔptsHI::FRT Δzwf_edd_eda::aad+ ΔpfkA::aac+ pCP20 GBE1353 Transformación de la cepa GBE1353 con el plásmido pCP20
GBE1368
ΔptsHI::FRT Δzwf_edd_eda::FRT ΔpfkA::FRT GBE1353_P Se ha verificado la pérdida del plásmido pCP20.
GBE1371
ΔptsHI::FRT Δzwf_edd_eda::FRT ΔpfkA::FRT pKD46 GBE1368 Transformación de la cepa GBE1368 con el plásmido pKD46
GBE1420_ pKD46
ΔptsHI::FRT Δzwf_edd_eda::FRT ΔpfkA::FRT ΔpfkB::aad+ GBE1371
GBE1420
ΔptsHI::FRT Δzwf_edd_eda::FRT ΔpfkA::FRT ΔpfkB::aad+ GBE1420_pKD46 Se ha verificado la pérdida del plásmido pKD46.
GBE1433
ΔptsHI::FRT Δzwf::aad+ GBE1284
GBE1436
ΔptsHI::FRT Δzwf::aad+ pKD46 GBE1433 Transformación de la cepa GBE1433 con el plásmido pKD46
GBE1441_ pKD46
ΔptsHI::FRT Δzwf::aad+ ΔpfkA::aac+ GBE1436
GBE1441
ΔptsHI::FRT Δzwf::aad+ ΔpfkA::aac+ GBE1441_pKD46 Se ha verificado la pérdida del plásmido pKD46.
GBE1441_p
ΔptsHI::FRT Δzwf::aad+ ΔpfkA::aac+ pCP20 GBE1441 Transformación de la cepa GBE1441 con el plásmido pCP20
GBE1448
ΔptsHI::FRT Δzwf::FRT ΔpfkA::FRT GBE1441_p Se ha verificado la pérdida del plásmido pCP20.
GBE1449
ΔptsHI::FRT Δzwf::FRT ΔpfkA::FRT pKD46 GBE1448 Transformación de la cepa GBE1448 con el plásmido pKD46
GBE1518_ pKD46
ΔptsHI::FRT Δzwf::FRT ΔpfkA::FRT ΔpfkB:: aad+ GBE1449
GBE1518
ΔptsHI::FRT Δzwf::FRT ΔpfkA::FRT ΔpfkB:: aad+ GBE1518_pKD46 Se ha verificado la pérdida del plásmido pKD46.
GBE2252_ pKD46
ΔptsHI::FRT ΔpfkA::aad+ GBE1284
GBE2252
ΔptsHI::FRT ΔpfkA::aad+ GBE2252 pKD46 Se ha verificado la pérdida del plásmido pKD46.
GBE2253
ΔptsHI::FRT ΔpfkA::aad+ pKD46 GBE2252 Transformación de la cepa GBE2252 con el plásmido pKD46
GBE2256_ pKD46
ΔptsHI::FRT ΔpfkA::aad+ ΔpfkB:: aac+ GBE2253
GBE2256
ΔptsHI::FRT ΔpfkA::aad+ ΔpfkB:: aac+ GBE2256_pKD46 Se ha verificado la pérdida del plásmido pKD46.
(continuación)
FRT : objetivo de reconocimiento de FLP
Nombre de cepa
Genotipo Cepa de origen de la construcción
GBE2262
F-lambda-ilvG-rfb-50 rph-1 pGB1021 GBE0129 Transformación de la cepa GBE0129 con plásmido pGB1021
GBE2263
Δzwf_edd_eda::FRT ΔpfkA::FRT ΔpfkB::aad+ pGB1020 GBE1344 Transformación de la cepa GBE1344 con plásmido pGB1020
GBE2264
F-lambda-ilvG-rfb-50 rph-1 pGB1021 GBE2262 Adaptación de la cepa GBE2262 al medio MS + glucosa (2 g/l) + ampicilina (100 ug/ml).
GBE2265
Δzwf_edd_eda::FRT ΔpfkA::FRT ΔpfkB::aad+ pGB1020 GBE2263 Adaptación de la cepa GBE2263 al medio MS + glucosa (2 g/l) + ampicilina (100 ug/ml).
GBE2266
ΔptsHI::FRT pGB1021 GBE1283 Transformación de la cepa GBE1283 con plásmido pGB1021
GBE2267
ΔptsHI::FRT Δzwf_edd_eda::FRT ΔpfkA::FRT ΔpfkB::aad+ pGB1020 GBE1420 Transformación de la cepa GBE1420 con plásmido pGB1020
GBE2268
ΔptsHI::FRT pGB1021 GBE2266 Adaptación de la cepa GBE2266 al medio MS + glucosa (2 g/l) + ampicilina (100 ug/ml).
GBE2269
ΔptsHI::FRT Δzwf_edd_eda::FRT ΔpfkA::FRT ΔpfkB::aad+ pGB1020 GBE2267 Adaptación de la cepa GBE2267 al medio MS + glucosa (2 g/l) + ampicilina (100 ug/ml).
GBE2270
ΔptsHI::FRT ΔpfkA::aad+ ΔpfkB:: aac+ pGB1020 GBE2256 Transformación de la cepa GBE2256 con plásmido pGB1020
GBE2271
ΔptsHI::FRT Δzwf::FRT ΔpfkA::FRT ΔpfkB::aad+ pGB1020 GBE1518 Transformación de la cepa GBE1518 con plásmido pGB1020
GBE2272
ΔptsHI::FRT ΔpfkA::aad+ ΔpfkB:: aac+ pGB1020 GBE2270 Adaptación de la cepa GBE2270 al medio MS + glucosa (2 g/l) + ampicilina (100 ug/ml).
GBE2273
ΔptsHI::FRT Δzwf::FRT ΔpfkA::FRT ΔpfkB::aad+ pGB1020 GBE2271 Adaptación de la cepa GBE2266 al medio MS + glucosa (2 g/l) + ampicilina (100 ug/ml).
TABLA 3: Secuencias de regiones cromosómicas bacterianas, genes usados, regiones de plásmidos
Nombre
Secuencia de nucleótidos Descripción SEC ID Nº
secuencia de nucleótido proveniente de la cepa GBE0901, desde los pares de bases 2531736 hasta 2531870
imagen11 La región FRT está subrayada SQ 0001
(continuación)
Nombre
Secuencia de nucleótidos Descripción SEC ID Nº
Cassette de resistencia a espectinomicina
imagen12 Las regiones FRT están subrayadas SQ 0002
Cassette de resistencia a apramicina
imagen13 Las regiones FRT están subrayadas SQ 0003
(continuación)
Nombre
Secuencia de nucleótidos Descripción SEC ID Nº
imagen14
MCS del plásmido pGB0123
imagen15 Los sitios de restricción para HindIII y EcoRI están subrayados. SQ 0004
(continuación)
Nombre
Secuencia de nucleótidos Descripción SEC
ID
Nº
Gen de
Los sitios de SQ
fosfocetolasa
restricción 0005
optimizado de
para PacI y
Lactococcus lactis
NotI están
flanqueado por
subrayados.
sitios de
restricción de PacI
y NotI
imagen16
(continuación)
Nombre
Secuencia de nucleótidos Descripción SEC ID Nº
imagen17
MCS del plásmido pGB0124
imagen18 SQ 0006
TABLA 4 Secuencia de cebador
Nombre
Secuencia Descripción SEC ID Nº:
0635
imagen19 Cebador para determinar la secuencia de la región cromosómica de E. coli que incluye los genes ptsHI RC0001
0638
imagen20 Cebador para determinar la secuencia de la región cromosómica de E. coli que incluye los genes ptsHI RC0002
(continuación)
Nombre
Secuencia Descripción SEC ID Nº:
0633
imagen21 Cebador para supresión de los genes zwf_edd_eda RC0003
0634
imagen22 Cebador para supresión de los genes zwf_edd_eda RC0004
1036
imagen23 Cebador para determinar la secuencia de la región cromosómica de E. coli que incluye los genes zwf_edd_eda RC0005
1037
imagen24 Cebador para determinar la secuencia de la región cromosómica de E. coli que incluye los genes zwf_edd_eda RC0006
0629
imagen25 Cebador para supresión del gen pfkA RC0007
0630
imagen26 Cebador para supresión del gen pfkA RC0008
0619
imagen27 Cebador para determinar la secuencia de la región cromosómica de E. coli que incluye el gen pfkA RC0009
0620
imagen28 Cebador para determinar la secuencia de la región cromosómica de E. coli que incluye el gen pfkA RC0010
0631
imagen29 Cebador para supresión del gen pfkB RC0011
0632
imagen30 Cebador para supresión del gen pfkB RC0012
0621
imagen31 Cebador para determinar la secuencia de la región cromosómica de E. coli que incluye el gen pfkB. RC0013
0622
imagen32 Cebador para determinar la secuencia de la región cromosómica de E. coli que incluye el gen pfkB. RC0014
pUC1 8_24 6
imagen33 Cebador para determinar la secuencia del gen de fosfocetolasa proveniente de Lactococcus lactis clonado en el pGB0123. RC0015
pUC1 8_38 00_rev
imagen34 Cebador para determinar la secuencia del gen de fosfocetolasa proveniente de Lactococcus lactis clonado en el pGB0123. RC0016
(continuación)
Nombre
Secuencia Descripción SEC ID Nº:
Pkt lacto_ 700_dir
imagen35 Cebador para determinar la secuencia del gen de fosfocetolasa proveniente de Lactococcus lactis clonado en el pGB0123. RC0017
Pkt_l acto_ mil_di r
imagen36 Cebador para determinar la secuencia del gen de fosfocetolasa proveniente de Lactococcus lactis clonado en el pGB0123. RC0018
Pkt_l acto_ mil_re v
imagen37 Cebador para determinar la secuencia del gen de fosfocetolasa proveniente de Lactococcus lactis clonado en el pGB0123. RC0019
0070
imagen38 Cebador para amplificar los genes ctfA y ctfB provenientes de Clostridium acetobutylicum cepa ATCC 824. RC0020
0071
imagen39 Cebador para amplificar los genes ctfA y ctfB provenientes de Clostridium acetobutylicum cepa ATCC 824. RC0021
1066
imagen40 Cebador general para determinación de secuencia RC0022
1067
imagen41 Cebador general para determinación de secuencia RC0023
0072
imagen42 Cebador para amplificar el gen adc proveniente de Clostridium acetobutylicum cepa ATCC 824. RC0024
0073
imagen43 Cebador para amplificar el gen adc proveniente de Clostridium acetobutylicum cepa ATCC 824. RC0025
1068
imagen44 Cebador para determinar la secuencia de los genes ctfA y ctfB RC0026
1069
imagen45 Cebador para determinar la secuencia de los genes ctfA y ctfB RC0027
0074
imagen46 Cebador para amplificar el gen thl proveniente de Clostridium acetobutylicum cepa ATCC 824 RC0028
0075
imagen47 Cebador para amplificar el gen thl proveniente de Clostridium acetobutylicum cepa ATCC 824 RC0029
1070
imagen48 Cebador para determinar la secuencia del operón de acetona proveniente de Clostridium acetobutylicum (ATCC 824) RC0030
1071
imagen49 Cebador para determinar la secuencia del operón de acetona proveniente de Clostridium acetobutylicum (ATCC 824) RC0031
1072
imagen50 Cebador para determinar la secuencia del operón de acetona proveniente de Clostridium acetobutylicum (ATCC 824) RC0032
1073
imagen51 Cebador para determinar la secuencia del operón de acetona proveniente de Clostridium acetobutylicum (ATCC 824) RC0033
(continuación)
Nombre
Secuencia Descripción SEC ID Nº:
1074
imagen52 Cebador para determinar la secuencia del operón de acetona proveniente de Clostridium acetobutylicum (ATCC 824) RC0034
1516
imagen53 Cebador para amplificar el gen de fosfocetolasa (YP_003354041.1) proveniente de Lactococcus lactis. RC0035
1517
imagen54 Cebador para amplificar el gen de fosfocetolasa (YP_003354041.1) proveniente de Lactococcus lactis. RC0036
1994
imagen55 Cebador para determinar la secuencia del operón de acetona proveniente de Clostridium acetobutylicum (ATCC 824) RC0037
1995
imagen56 Cebador para determinar la secuencia del operón de acetona proveniente de Clostridium acetobutylicum (ATCC 824) RC0038
1996
imagen57 Cebador para determinar la secuencia del operón de acetona proveniente de Clostridium acetobutylicum (ATCC 824) RC0039
1997
imagen58 Cebador para determinar la secuencia del operón de acetona proveniente de Clostridium acetobutylicum (ATCC 824) RC0040
1998
imagen59 Cebador para determinar la secuencia del operón de acetona proveniente de Clostridium acetobutylicum (ATCC 824) RC0041
1999
imagen60 Cebador para determinar la secuencia del operón de acetona proveniente de Clostridium acetobutylicum (ATCC 824) RC0042
2000
imagen61 Cebador para determinar la secuencia del operón de acetona proveniente de Clostridium acetobutylicum (ATCC 824) RC0043
2001
imagen62 Cebador para determinar la secuencia del operón de acetona proveniente de Clostridium acetobutylicum (ATCC 824) RC0044
2002
imagen63 Cebador para determinar la secuencia del operón de acetona proveniente de Clostridium acetobutylicum (ATCC 824) RC0045
2003
imagen64 Cebador para determinar la secuencia del operón de acetona proveniente de Clostridium acetobutylicum (ATCC 824) RC0046
1109
imagen65 Cebador para supresión del gen zwf. RC0047
1110
imagen66 Cebador para determinar la secuencia de la región cromosómica de E. coli que incluye el gen zwf. RC0048
Integración cromosómica para expresiones suprimidas de gen Para integrar el ADN en una región específica del cromosoma, se requieren homología del ADN que se inserta al sitio cromosómico elegido como blanco y un marcador seleccionable. Es conveniente que el marcador se puede 27
imagen67
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Claims (1)

  1. imagen1
    imagen2
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