CN106255759A - 从甲醛经酶促产生乙酰磷酸 - Google Patents
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Abstract
描述了一种使用磷酸转酮酶或磺基乙醛乙酰转移酶从甲醛经酶促产生乙酰磷酸的方法。
Description
本发明涉及一种从甲醛经酶促产生乙酰磷酸的方法,所述方法利用磷酸转酮酶(phosphoketolase)或磺基乙醛乙酰转移酶,以及涉及磷酸转酮酶或磺基乙醛乙酰转移酶或表达磷酸转酮酶或磺基乙醛乙酰转移酶的微生物用于从甲醛产生乙酰磷酸的用途。
在过去的数十年,代谢工程实践者已经致力于探索生物解决方案以生产化学品,因此,提供更传统化学方法的替代。通常而言,生物解决方案允许利用可再生原料(例如糖)并且与基于现有石油化学的方法竞争。一种用于生产化学品的多步骤生物解决方案一般包含微生物作为将原料转化成靶分子的催化剂。用于产生特定靶分子的全套酶反应可以划分成属于中心碳途径的那些酶反应和属于产物特异性途径的那些酶反应。属于中心碳途径和产物特异性途径的反应是关联的,因为必须在有助于该方法的竞争力总体权衡下考虑每种酶反应的氧化还原约束条件(一般是NAD(P)H)和能量学约束条件(一般是ATP)。历史上,将糖上生长的异养生物的中心碳途径描述为Embden-Meyerhoff-Parnas途径(EMPP;即“糖酵解”)、磷酸戊糖途径(PPP)、Entner-Doudoroff途径(EDP)和磷酸转酮酶途径(PKP)(见Gottschalk(1986),Bacterial Metabolism,第2版Springer-Verlag,New York)。每个中心途径或中心途径组合相对于特定靶分子提供优点和缺点。为了提供有竞争力的生物加工,已经描述了具有涉及EMPP,PPP和EDP的修饰的重组微生物(M.Emmerling等人,Metab.Eng.1:117(1999);L.O.Ingram等人,Appl.Environ.Microbiol.53:2420(1987);C.T.Trinh等人,Appl.Environ.Microbiol.74:3634(2008))。最近,已经描述了具有涉及PKP的修饰的重组微生物(见Sonderegger等人,Appl.Environ.Microbiol.70(2004),2892-2897,美国专利7,253,001,Chinen等人,J.Biosci.Bioeng.103(2007),262-269,美国专利7,785,858;Fleige等人,Appl.Microbiol.Cell Physiol.91(2011),769-776)。
EMPP(糖酵解)将1mol葡萄糖转化成2mol丙酮酸(PYR)。当需要乙酰-CoA时,1molPYR可以转化成1mol乙酰-CoA(AcCoA),同时生成1mol CO2和1mol NADH。在方程1中给出对反应的总结。
葡萄糖+2ADP+2H3PO4+2CoA+4NAD+→
2乙酰-CoA+2CO2+2ATP+2H2O+4NADH+4H+(方程1)
PPP提供将1mol葡萄糖转化成1mol CO2和2mol NADPH的手段,同时产生0.67mol果糖-6-磷酸(F6P)和0.33mol甘油醛-3-磷酸(GAP)。如此形成的F6P和GAP必须由其他反应途径代谢,例如由EMPP代谢。EDP将1mol葡萄糖转化成1mol GAP和1mol PYR,同时产生1molNADPH。与PPP相同,如此形成的GAP必须由其他反应途径代谢。PKP提供将1mol葡萄糖转化成1mol GAP和1.5mol乙酰磷酸(AcP)的手段。当需要乙酰-CoA时,1当量AcP外加1当量辅酶A(CoA)可以由磷酸转乙酰酶的作用转化成1当量乙酰-CoA和1当量无机磷酸(Pi)。
本领域已经描述了用于遗传修饰微生物的多种方案,从而能够将多种原料如液化玉米粉、甘油或合成气(氢和一氧化碳的混合物)或化合物如甲烷转化成所需化合物如液态燃料或丁醇(参见,例如,WO 2012/053905和Peralta-Yahya等人,Nature 488(2012),320-328)。例如,Conrado和Gonzalez(Science 343(2014),621-623)讨论了转化甲烷成液态燃料的可能选项并且在这种情况下提到,甲烷营养菌可以通过直接利用甲醛的核酮糖单磷酸(RuMP)循环或从充分氧化的甲醛通过Calvin-Benson-Bassham-(CBB)CO2-固定循环,将甲醛转化成丙酮酸。但是,据称这类方法的效率低并且据称这些方法涉及高的代谢能量损耗。
考虑到对利用可再生资源生产所有种类化合物的方法的需求日益增加,需要提供允许高效生产中心代谢物如乙酰-CoA或其前体的手段和方法,因而建立开发其他方法将这些代谢物转化成有用化合物的平台。
因此,需要提供这样的方法,所述方法包括通过最佳容忍酶反应的氧化还原约束条件和能量学约束条件而将原料最大限度转化成产物的中心碳途径和产物特异性途径,因而允许能量学高效地产生乙酰-CoA前体,所述乙酰-CoA是许多生物的、尤其可以用于从可再生资源产生多种工业重要化合物的的微生物的分解代谢的大部分中心代谢物之一。申请人已经通过提供如权利要求书中定义的实施方案满足这种需求。
需要提供这样的方法,所述方法因而允许能量学高效地产生乙酰-CoA前体,所述乙酰-CoA是许多生物的、尤其可以用于从可再生资源产生多种工业重要化合物的的微生物的分解代谢的大部分中心代谢物之一。本发明通过提供如权利要求书中定义的实施方案解决这种需求。
因此,本发明涉及通过利用磷酸转酮酶或磺基乙醛乙酰转移酶从甲醛产生乙酰磷酸的方法。
发明人令人惊讶地发现,划归为磷酸转酮酶的酶能够根据以下反应方案从甲醛和磷酸催化形成乙酰磷酸:
2CH2O+磷酸→乙酰磷酸+H2O。
这种反应强烈地放能,在生理条件下比ATP水解发散更多能量。
不同类型的磷酸转酮酶是已知的并且它们均可以用于本发明的方法中。通常,就其天然催化的反应而言基于底物偏好性,磷酸转酮酶划分成两个类型:木酮糖-5-磷酸(X5P)磷酸转酮酶,其归属于EC 4.1.2.9并且天然利用X5P和果糖-6-磷酸(F6P)作为底物,但偏好X5P,以及X5P/果糖-6-磷酸(F6P)磷酸转酮酶,其归属于EC 4.1.2.22并且可以可比较的活性同时利用X5P和F6P作为底物(Suzuki等人,J.Biol.Chem.44(2010),34279-34287)。在下文,术语“磷酸转酮酶”总是指这两个类型。
因此,X5P磷酸转酮酶是归属于EC 4.1.2.9并且能够催化以下反应的酶:
D-木酮糖-5-磷酸+磷酸→D-甘油醛-3-磷酸+乙酰磷酸+H2O
另一归属于EC 4.1.2.22类型的磷酸转酮酶一般称作果糖-6-磷酸磷酸转酮酶并且天然地能够催化以下反应:
D-果糖6-磷酸+磷酸→乙酰磷酸+D-赤藓糖4-磷酸+H2O
还存在其中磷酸转酮酶划归至两个类型的磷酸转酮酶的情况,例如,在磷酸转酮酶来自Nitrolancetus hollandicus Lb的情况下,或其中鉴定的磷酸转酮酶尚未划归至两个类型的任一类型,而通常单纯地划归为磷酸转酮酶。在本文中使用时,术语“磷酸转酮酶”还指全部这些磷酸转酮酶。
因此,在本发明方法的一个实施方案中,通过利用划归为EC 4.1.2.9的磷酸转酮酶的磷酸转酮酶,实现甲醛和磷酸根据上文所示反应方案经酶促转化成乙酰磷酸。已经在多种生物、尤其微生物如细菌和真菌中鉴定了这种酶。在一个优选的实施方案中,磷酸转酮酶(EC 4.1.2.9)源自原核生物、优选地细菌。例如,已经描述该酶出现在以下细菌中:乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)(Uniprot登录号Q88S87;Q88U67)、戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)(Uniprot登录号Q937F6)、路氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)(Uniprot登录号A0PAD9)、动物双歧杆菌乳酸亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)(Uniprot登录号Q9AEM9)、溶纤维丁酸弧菌(Butyrovibrio fibrisolvens)、肠道丝状杆菌(Fibrobacter intestinalis)、琥珀酸丝状杆菌(Fibrobacter succinogene)、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、酒类酒球菌(Oenococcus oeni)、Starkeya novella、硫杆菌属物种(Thiobacillus sp.)、双孢高温双孢菌(Thermobispora bispora)(菌株ATCC19993/DSM 43833/CBS 139.67/JCM 10125/NBRC 14880/R51;Uniprot登录号D6YAD9)、Thermobaculum terrenum(菌株ATCCBAA-798/YNP1;Uniprot登录号D1CI63)和Nitrolancetus hollandicus Lb(Uniprot登录号I4EJ52)。
在另一个优选的实施方案中,磷酸转酮酶(EC 4.1.2.9)源自真核生物、优选地真菌,例如酵母,如酿酒酵母(S.cerevisiae)。已经描述了该酶出现在以下真菌中:构巢裸胞壳(Emericella nidulans)(Uniprot登录号:Q5B3G7)、金龟子绿僵菌(Metarhiziumanisopliae)(Uniprot登录号:C1K2N2)、博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)、弯假丝酵母(Candida curvata)、无名假丝酵母(Candida famata)、土生假丝酵母(Candidahumicola)、近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)、近平滑假丝酵母(Candidaparapsilosis)NCYC926、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、Cyberlindnera jadinii、Cyberlindnera saturnus、Debaromyces robertsiae、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、Kluyveromyces phaseolosporus、斯达氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi)、Ogataea angusta、嗜单宁管囊酵母(Pachysolentannophilus)、Priceomyces medius、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、Rhodospiridium toruloides、粘红酵母(Rhodotorula glutinis)、禾本红酵母(Rhodotorula graminisyi)、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)、皮状丝孢酵母(Trichosporon cutaneum)和解脂耶罗维亚酵母(Yarrowia lipolytica)。
可以用本领域技术人员已知的方法评估磷酸转酮酶(EC 4.1.2.9)的酶活性。这类方法例如在Meile等人(J.Bacteriol.183(2001),2929-2936)中和Suzuki等人(ActaCryst.F66(2010),941–943)中描述。
在结构和功能上充分地定义了磷酸转酮酶(EC 4.1.2.9)。例如,Petrareanu等人(Acta Crystallographica F66(2010),805-807)描述了来自乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)的木酮糖-5-磷酸磷酸转酮酶的X射线结晶学分析。
在本发明方法的另一个实施方案中,通过利用划归为EC 4.1.2.22中果糖-6-磷酸磷酸转酮酶的磷酸转酮酶,实现甲醛和磷酸根据上文所示反应方案经酶促转化成乙酰磷酸。这种酶已经在多种生物、尤其微生物如细菌和真菌中鉴定。在一个优选的实施方案中,果糖-6-磷酸磷酸转酮酶(EC 4.1.2.22)源自原核生物、优选地细菌。已经描述了该酶出现在以下细菌中:青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、动物双歧杆菌乳酸亚种(Uniprot登录号:Q9AEM9)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、假长双歧杆菌(Bifidobacterium pseudolongum)、尤其假长双歧杆菌球形亚种(Bifidobacteriumpseudolongum subsp.globosum)、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、齿双歧杆菌(Bifidobacterium dentium)、Bifidobacteriummongoliense、Bifidobacterium bombi、钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)、阴道加德纳菌(GardnereHa vaginalis)、木葡糖醋杆菌(Gluconacetobacter xylinus)、类植物乳杆菌(Lactobacillus paraplantarum)、肠膜明串珠菌和Nitrolancetus hollandicus Lb(Uniprot登录号I4EJ52)。
在另一个优选实施方案中,果糖-6-磷酸磷酸转酮酶(EC 4.1.2.22)源自真核生物、优选地真菌,例如酵母,如巴斯德酵母(S.pastorianus)。已经描述了该酶出现在以下酵母中:假丝酵母属物种(Candida sp.)、假丝酵母属物种107(Candida sp.107)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、粘红酵母(Rhodotorula glutinis)、禾本红酵母(Rhodotorulagraminisyi)和巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus)。
在结构和功能上充分地定义了该酶。例如,Suzuki等人(Acta CrystallographicaF66(2010),941-943;J.Biol.Chem.285(2010)描述了来自短双歧杆菌的磷酸转酮酶的过量表达、结晶和X射线分析。编码来自乳酸双歧杆菌的木酮糖-5-磷酸/果糖-6-磷酸磷酸转酮酶的基因例如在Meile等人(J.Bacteriol.183(2001),2929-2936)中描述。
可以用本领域技术人员已知的方法评估果糖-6-磷酸磷酸转酮酶(EC 4.1.2.22)的酶活性。这类方法例如在Meile等人(J.Bacteriol.183(2001),2929-2936)中和Suzuki等人(Acta Cryst.F66(2010),941–943)中描述。
尚未归属为EC 4.2.1.9或EC 4.2.1.22并且可以用于本发明方法中的其他磷酸转酮酶例如是来自Thermosynechococcus elongatus(菌株BP-1;Uniprot登录号:Q8DJN6)的磷酸转酮酶、来自凝固芽孢杆菌(Bacillus coagulans)36D1(Uniprot登录号:G2TIL0)的磷酸转酮酶、来自乳酸乳球菌乳酸亚种(菌株KF147;Uniprot登录号:A9QST6)的磷酸转酮酶、来自假长双歧杆菌球形亚种(Uniprot登录号:Q6R2Q6)的磷酸转酮酶和来自丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)(菌株ATCC824;Uniprot登录号:Q97JE3;Servisky等人(J.Ind.Microbiol.Biotechnol.39(2012),1859-1867);SEQ ID NO:2)的磷酸转酮酶。
在所附实施例中,显示假长双歧杆菌球形亚种(Uniprot登录号:Q6R2Q6;SEQ IDNO:1)、丙酮丁醇梭菌(菌株ATCC824;Uniprot登录号:Q97JE3;SEQ ID NO:2)和乳酸乳球菌乳酸亚种(菌株KF147;Uniprot登录号:A9QST6;SEQ ID NO:3)的磷酸转酮酶能够转化甲醛和磷酸成乙酰磷酸和H2O。
在一个优选实施方案中,本发明方法中使用的磷酸转酮酶具有如SEQ ID NO:1至3任一者中所示的氨基酸序列或显示SEQ ID NO:1至3任一者同源至少x%并具有磷酸转酮酶活性的氨基酸序列,其中x是30和100之间的整数,优选地是35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99,其中这种酶能够如上文中所述那样将甲醛和磷酸转化成乙酰磷酸。优选地,通过将各自序列与上述SEQ ID NOs任一个的氨基酸序列比较,确定同一性的程度。当比较的序列不具有相同的长度时,同一性程度优选地指较短序列中与较长序列内氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分数或指较长序列中与较短序列内氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分数。可以根据本领域熟知的方法,优选地使用合适的计算机算法(如CLUSTAL)确定序列同一性程度。
当使用Clustal分析方法来确定特定序列是否与参考序列例如80%同一时,对于氨基酸序列的比较,可以使用默认设置或者设置优选如下:矩阵:blosum 30;开放空位罚分:10.0;延伸空位罚分:0.05;延迟发散(Delay divergent):40;空位分隔距离:8。对于核苷酸序列比较,延伸空位罚分优选地设置至5.0。
优选地,在序列的整个长度范围内计算同一性的程度。
已经描述了磷酸转酮酶序列的多重比对结果显示出几个高度保守的区域并且使用这些区域中的两个区域作为磷酸转酮酶的特征标识样式(http://prosite.expasy.org/PDOC60002)。第一特征标识样式是E-G-G-E-L-G-Y并且第二特征标识样式是G-x(3)-[DN]-x-P-x(2)-[LIVFT]-x(3)-[LIVM]-x-G-D-G-E。仍不知第一特征标识样式的功能,而第二特征标识样式对应于焦磷酸硫胺素结合位点。因此,在优选的实施方案中,如上文定义的磷酸转酮酶具有这样的氨基酸序列,所述氨基酸序列含有上文提到的两个特征标识样式至少之一、优选地含有至少第二特征标识样式并且甚至更优选地含有两种特征标识样式。
序列比对显示,来自不同起源的磷酸转酮酶之间的总体序列同一性可以低到约26%。例如,Meile等人(J.Biol.Chem.183(2001),2929-2936)报道,乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)的D-木酮糖5-磷酸/D-果糖6-磷酸磷酸转酮酶基因(xfp)揭示与其他生物的基因组中序列的26%至55%同一性。
可以例如通过如所附实施例中所述的测定法评定选择的磷酸转酮酶是否能够催化甲醛和磷酸转化成乙酰磷酸和H2O。
如联系本发明方法所用的术语“磷酸/磷酸盐”指这样的化合物,所述化合物对转化甲醛和磷酸成乙酰磷酸和H2O的方法中使用的酶而言可接受作为磷酸/磷酸盐来源。一个可能性是提供磷酸形式(即H3PO4)的磷酸/磷酸盐。然而,还可构思其他形形式,尤其磷酸(H3PO4)的盐,其中一个,两个或三个氢原子由其他离子(如钠离子)替换。磷酸转酮酶是二磷酸硫胺素依赖性酶,即它们需要二磷酸硫胺素(也称作ThDP或TPP)作为辅因子。因此,在本发明的方法中有利的是在反应期间提供TPP。另外,一些磷酸转酮酶需要离子,如Mg2+或Ca2+作为辅因子。在这种情况下,本发明的方法还包括在如上文所述的转化期间存在这类离子。
还可以通过利用磺基乙醛乙酰转移酶(EC 2.3.3.15),实现甲醛和磷酸根据上文所示反应方案经酶促转化成乙酰磷酸。磺基乙醛乙酰转移酶(EC 2.3.3.15)是可以催化以下反应的酶:
2-磺基乙醛+磷酸→乙酰磷酸+亚硫酸盐
这种酶已经在多种生物、尤其细菌中鉴定。在一个优选的实施方案中,磺基乙醛乙酰转移酶(EC 2.3.3.15)源自原核生物、优选地细菌。已经描述了该酶出现在以下细菌中:解芳烃卡斯特罗尼氏菌(Castellaniella defragrans)(Uniprot登录号:Q84H44;先前称为解芳烃产碱杆菌(Alcaligenes defragrans)(Ruff等人,Biochem.J.369(2003),275-285))、木糖氧化产碱菌木糖氧化亚种(Alcaligenes xylosoxydans xylosoxydans)(Uniprot登录号:Q84H41)、Desulfonispora thiosulfatigenes(Uniprot登录号:Q93PS3)、草木樨根瘤菌(Rhizobium meliloti)(菌株1021)(Uniprot登录号:Q92UW6)、Ruegeriapomeroyi(Uniprot登录号:Q5LMK2)、钩虫贪铜菌(Uniprot登录号:Q0K022)、Roseovariusnubinhibens(Uniprot登录号:A3SR25)、不动杆菌属物种(Acinetobacter sp.)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。
原则上,任何磺基乙醛乙酰转移酶(EC 2.3.3.15)均可以用于本发明方法中来转化甲醛和磷酸成乙酰磷酸。
如同磷酸转酮酶,磺基乙醛乙酰转移酶是焦磷酸硫胺素(TPP)依赖性酶并且因此特征在于它们含有TPP结合结构域。在已知的磺基乙醛乙酰转移酶当中,TPP结合结构域是高度保守的(参见,例如,Ruff等人,Biochem.J.369(2003),275-285)。总之,已知的磺基乙醛乙酰转移酶在N末端附近显示高程度的序列保守性,包括TPP结合结构域(参见Ruff等人,见上述引文)。可以在酶本身N末端中和在解芳烃卡斯特罗尼氏菌(C.defragrans)酶接近氨基酸400的区域中观察到序列趋异性。Ruff等人(见上述引文)描述了磺基乙醛乙酰转移酶形成3个亚组(参见所述出版物的图4)。据称亚组2和亚组3显示符合PROSITE共有序列的TPP结合结构域
(L/I/V/M/F)(G/S/A)X5PX4(L/I/V/M/F/Y/W)X(L/I/V/M/F)XGD(G/S/A)(G/S/A/C)),而亚组1略微地悖离共有序列:
(L/I/V/M/F)(G/S/A)X5PX4(L/I/V/M/F/Y/W)X(L/I/V/M/F/Y)XGD(G/S/A)(G/S/A/C)。
除这些区域之外,不同磺基乙醛乙酰转移酶之间的序列同一性能相当低(低至约44%)。
在一个优选的实施方案中,在本发明方法中使用的磺基乙醛乙酰转移酶是显示如SEQ ID NO:4中所述氨基酸序列的解芳烃卡斯特罗尼氏菌磺基乙醛乙酰转移酶或显示如SEQ ID NO:5中所述氨基酸序列的木糖氧化产碱杆菌磺基乙醛乙酰转移酶或显示如SEQ IDNO:6中所述氨基酸序列的Desulfonispora thiosulfatigenes磺基乙醛乙酰转移酶或显示如SEQ ID NO:7中所述氨基酸序列的草木樨根瘤菌(菌株1021)磺基乙醛乙酰转移酶或显示如SEQ ID NO:8中所述的氨基酸序列或显示相关氨基酸序列的Roseovarius nubinhibens磺基乙醛乙酰转移酶。
因此,在一个优选的实施方案中,本发明方法中使用的磺基乙醛乙酰转移酶具有如SEQ ID NO:4至8任一者中所示的氨基酸序列或显示与SEQ ID NO:4至8任一者同源至少x%并具有磺基乙醛乙酰转移酶活性的氨基酸序列,其中x是30和100之间的整数,优选地是35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99,其中这种酶能够如上文中所述那样将甲醛和磷酸转化成乙酰磷酸。优选地,如上文所述确定同一性程度。
可以用本领域技术人员已知的方法评估磺基乙醛乙酰转移酶(EC 2.3.3.15)的酶活性。这类方法例如在Ruff等人(Biochem.J.369(2003),275-285)中描述。
根据本发明方法产生的乙酰磷酸可以进一步转化成所需的分子如大多数生物内作为中心代谢物的乙酸或乙酰-辅酶A(也称作乙酰-CoA)。
在体外自发地发生乙酰磷酸水解成乙酸,因为乙酰磷酸相当不稳定。
乙酰磷酸也可以例如通过利用乙酸激酶(EC 2.7.2.1)、丙酸激酶(EC 2.7.2.15)、丁酸激酶(EC 2.7.2.7)或(二磷酸)乙酸激酶(EC 2.7.2.12),在体外或在体内经酶促转化成乙酸。
乙酸激酶是催化以下反应的酶:
由于这种反应是可逆的,酶可以用来转化乙酰磷酸成乙酸。可以通过从反应连续移走ATP,例如通过其他酶促转化或通过本领域技术人员已知的手段和方法从反应移走ATP,将反应推向乙酸方向。这种酶存在于庞大种类的生物中,尤其原核生物、真核生物和古细菌中。它是糖酵解中的重要酶并且酶水平在过量葡萄糖存在时通常增加。原则上,任何乙酸激酶(EC 2.7.2.1)均可以在本发明的方法中用来转化乙酰磷酸成乙酸。
另外,也已经描述了丙酸激酶(EC 2.7.2.15)能够根据以下反应方案转化乙酰磷酸成乙酸:
这种酶存在于肠杆菌科(Enterobacteriaceae),如大肠杆菌或肠道沙门氏菌肠道亚种鼠伤寒血清型变种(Salmonella enteric subsp.enterica serovar.thyphimurium)中。
也可以通过利用丁酸激酶(EC 2.7.2.7)实现乙酰磷酸转化成乙酸。丁酸激酶是催化以下反应的酶:
但是,已经显示对于一些丁酸激酶,例如来自丁酸芽胞梭菌(Clostridiumbutyricum)和来自丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)的那些,它们还可以催化以下反应:
因此,也能够催化ATP+乙酸可逆转化成ADP+乙酰磷酸的任何丁酸激酶可以在本发明方法中用于转化乙酰磷酸成乙酸。
另外,也可以通过利用(二磷酸)乙酸激酶(EC 2.7.2.12)实现乙酰磷酸转化成乙酸。(二磷酸)乙酸激酶(EC 2.7.2.12)是催化以下反应的酶:
已经描述了这种酶出现在溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)中。
也可以通过利用酰基磷酸酶(EC 3.6.1.7)实现乙酰磷酸经酶促水解成乙酸和H3PO4。酰基磷酸酶(AcP;EC 3.6.1.7)是在真核生物和(嗜温和极端嗜热)原核生物中广泛表达的胞质酶(分子量约为10kDa)。AcP可以在脊椎动物物种的许多组织中存在,在骨骼肌中和心脏中作为肌肉型AcP(MT-AcP)和在红细胞、脑和睾丸中作为(器官)共有型AcP(CT-AcP)存在(Zuccotti等人,Acta Cryst.61(2005),144-146)。酰基磷酸酶催化以下反应:
乙酰磷酸+H2O→乙酸+H3PO4
已经在庞大种类的生物中描述这种酶。优选地,本发明方法中使用的酰基磷酸酶衍生自原鸡(Gallus gallus)、豚鼠(Cavia porcellus)(Liguri等人,Biochem.J.217(1984),499-505)、智人(Homo sapiens)、猪(Sus scrofa)、普通牛(Bos taurus)、欧洲野兔(Oryctolagus cuniculus)、马(Equus cacallus)或Pyrococcus hirokoshii(Miyazoo等人,Acta Crystallographica D60(2004),1135-1136)。
这些酶的结构特征和功能特征已经过充分地研究并且例如在以下中描述:Liguri等人(Biochem.J.217(1984),499-505)、Miyazoo等人(Acta Crystallographica D60(2004),1135-1136)和Taddei等人(FEBS Letters 362(1995),175-179)。
可以例如通过利用磷酸乙酰转移酶(EC 2.3.1.8)酶促实现乙酰磷酸转化成乙酰-CoA(体外或体内)。这种酶天然地催化以下反应:
这种酶存在于多种生物中,即原核生物、真核生物和古细菌中。原则上,任何已知的磷酸乙酰转移酶(EC 2.3.1.8)均可以用于这种转化。
根据本发明方法转化成乙酰磷酸的甲醛可以通过外部方式提供给反应或可以通过另一个化学反应或酶促反应提供。
已经长久已知甲醛的化学产生并且通常,工业上通过甲醇的催化性氧化产生甲醛。在这种情况下的最常见催化剂是银金属或铁氧化物和钼氧化物或钒氧化物的混合物。在常用的Formox工艺中,甲醇和氧在大约250℃至400℃在与钼和/或钒组合的氧化铁存在下反应以根据以下化学方程产生甲醛:
2CH3OH+O2→2CH2O+2H2O
银基催化剂通常在较高温度(约650℃)运行。该催化剂上的两个化学反应同时产生甲醛:上文所示反应和脱氢反应:
CH3OH→H2CO+H2
也可以通过氧化甲烷产生甲醛。另外,已经描述,可以通过一氧化碳和氢在中性Fe2S2簇上气相中反应而产生甲醛(和甲醇)(参见Yin等人,Phys.Chem.Chem.Phys.15(2013),4699-4706)。
在一个优选实施方案中,本发明的方法还包括步骤:提供待通过甲醇酶促转化的甲醛。催化甲醇转化成甲醛的酶是已知的并且包括,例如甲醇脱氢酶(EC 1.1.1.244)。甲醇脱氢酶(EC 1.1.1.244)催化以下反应:
这种酶已经在甲基营养芽孢杆菌属物种甲醇芽胞杆菌(Bacillus methanolicus)中鉴定(Arfman等人,Arch.Microbiol.152(1989),280-288)。还可以催化甲醇转化成甲醛的酶是划归为EC 1.1.2.7(甲醇脱氢酶(细胞色素c))的酶。这些酶是含有PQQ的II型醇脱氢酶,即NAD(P)非依赖性甲醇脱氢酶。这类酶例如已知来自几种
变形菌门(Proteobacteria)细菌如扭脱甲基杆菌(Methylobacteriumextorquens)、食甲基嗜甲基菌(Methylophilus methylotrophus)或脱氮生丝微菌(Hyphomicrobium denitrificans)。另外,醇氧化酶(EC 1.1.3.13)也可以用于转化甲醇成甲醛。醇氧化酶(EC 1.1.3.13)是催化以下反应的酶:
伯醇+O2→醛+H2O2
已经在庞大种类的生物中例如,在使用甲醇作为唯一碳源和能量源的甲基营养酵母如毕赤酵母(Pichia)、假丝酵母(Candida)和汉逊酵母(Hansenula)(Hartner和Glieder,Microbial Cell Factories 5(2006),39)和在一些真菌例如曲霉属(Aspergillus)(Kumar和Goswami,Appl.Microbiol.Biotechnol.72(2006),906-911)中鉴定到这些酶。Arnaud等人(FEBS 296(1992),259-262)描述,航海假单胞菌(Pseudomonas nautica)菌株617的纯化终末氧化酶将CO还原成甲醛。
可以转化成甲醛的甲醇本身可以从甲烷通过酶促反应提供。特别地,例如甲烷单加氧酶(MMO)催化甲烷转化成甲醇。已经描述这种酶的两种类型,即EC 1.14.13.25甲烷单加氧酶(可溶性)和EC 1.14.18.3甲烷单加氧酶(颗粒状)。催化的反应是:
CH4+NADH+H++O2→CH3OH+NAD+H2O(其中NADH作为辅因子)
CH4+NADPH+H++O2→CH3OH+NADP+H2O(其中NADPH作为辅因子)
已经鉴定到相应酶,例如,在甲醇营养细菌如荚膜甲基球菌(Methylococcuscapsulatus)(Pilkington和Dalton,Methods Enzymology 188(1990),181-190)和发孢甲基弯曲菌(Methylosinus trichosporium)(Fox等人,J.Biol.Chem.266(1991),540-550)中鉴定到。这些酶已经通过体外研究表征,包括晶体结构分析(Sazinsky等人,Biochemistry43(2004),16263-16276)。
本发明的方法可以在体外或在体内实施。体外反应理解为其中不使用细胞的反应,即无细胞反应。因此,体外优选地意指在无细胞系统中。在一个实施方案中,术语“在体外”意指在分离的酶(或酶系统,任选地包含可能要求的辅因子)存在下。在一个实施方案中,该方法中所用的酶以纯化形式使用。
为在体外实施该方法,将反应的底物和酶在允许酶有活性并允许酶促转化发生的条件下(缓冲液、温度、辅底物、辅因子等)温育。允许该反应推进足以产生相应产物的时间。可以通过本领域已知的方法,如可能与质谱法检测连接的液相色谱(HPLC),测量相应产物的产生。
酶可以处于允许酶促反应发生的任何合适形式。它们可以是纯化或部分纯化的或处于细胞粗提物或部分纯化的提取物形式。酶还可能固定在合适的载体上。
根据本发明使用来自不同起源的磷酸转酮酶,实施例显示了体外反应。
在另一个实施方案中,如上文所述,本发明的方法在生物、优选微生物存在的情况下以培养方式实施,所述生物至少产生磷酸转酮酶或磺基乙醛乙酰转移酶和任选地为提供甲醛而必需的酶或为进一步转化产生的乙酰磷酸成其他化合物(如乙酸或乙酰-CoA)而必需的酶。利用微生物实施本发明方法的方法称作“体内”方法。甲醛可以外部提供或可以通过所用的本身表达磷酸转酮酶或磺基乙醛乙酰转移酶的微生物产生。这种微生物表达如上文所述的为酶促产生甲醛而必需的至少一种酶。还可能共培养能够产生甲醛的微生物和表达磷酸转酮酶和/或磺基乙醛乙酰转移酶的微生物,从而转化由第一微生物产生的甲醛。
因此,在本发明的这类实施方案中,使用如上文所述的至少产生磷酸转酮酶或磺基乙醛乙酰转移酶的微生物。可以使用天然产生磷酸转酮酶或磺基乙醛乙酰转移酶的微生物或已经过基因修饰,从而表达(或过量表达)磷酸转酮酶和/或磺基乙醛乙酰转移酶的微生物。因此,微生物可以是天然表达磷酸转酮酶和/或磺基乙醛乙酰转移酶的微生物,即在其基因组中天然具有编码磷酸转酮酶或磺基乙醛乙酰转移酶的核苷酸序列并表达它/它们的微生物。表达可以按组成型方式或按诱导或受调节的方式发生。内在地即天然地具磷酸转酮酶活性或磺基乙醛乙酰转移酶活性的微生物是本领域已知的,并且它们的任一种可以用于本发明的上下文中。
在另一个实施方案中,该微生物可以是已经通过引入含有核苷酸序列的核酸分子进行基因修饰的微生物,所述核苷酸序列编码磷酸转酮酶或磺基乙醛乙酰转移酶。该核酸分子可以稳定地整合到该微生物的基因组中或可以按染色体外方式例如在质粒上存在。
这种基因修饰的微生物可以例如是这样的微生物,所述微生物天然地不具有磷酸转酮酶活性或磺基乙醛乙酰转移酶活性并且已经过基因修饰以表达磷酸转酮酶或磺基乙醛乙酰转移酶,或这样的微生物,所述微生物天然地具有磷酸转酮酶活性或磺基乙醛乙酰转移酶活性并且已经过基因修饰,例如通过用编码磷酸转酮酶或磺基乙醛乙酰转移酶的核酸(例如载体)转化以增加所述微生物中磷酸转酮酶活性或磺基乙醛乙酰转移酶活性和/或通过在编码酶的内源核苷酸序列前方插入启动子,以增加所述微生物中相应的活性。
然而,本发明优选地排除如自然界中所存在那样的天然存在的微生物,所述微生物按照自然界中存在的水平表达如上文所述的酶。相反,本发明的和在本发明方法中使用的微生物优选地是非天然存在的微生物,无论它是否已经过基因修饰以表达(包括过量表达)正常情况下不存在于其基因组中的本发明外源酶或无论它是否已经过工程化以过量表达外源酶。
因此,联系本发明使用的酶和(微)生物优选地是非天然存在的酶或(微生物),即它们是与天然存在的酶或微生物显著不同并且在自然界中不存在的酶或(微)生物。就这些酶而言,它们优选地是天然存在酶的变体,所述变体本身不存在于自然界中。这类变体例如包括显示改善的特性,如更高酶活性、更高底物专一性、更高温度抗性等的突变体,尤其通过分子生物学方法制备的突变体。就(微)生物而言,它们优选地是因基因修饰而不同于天然存在生物的如上文所述的基因修饰生物。基因修饰生物是不天然存在的,即,不能在自然界中发现并且因引入外来核酸分子而与天然存在生物实质上不同的生物。
通过过量表达如上文所述的外源酶或内源酶,酶浓度实质上高于自然界中存在的浓度,这随后可以出乎意料地迫使利用相应非天然酶的本发明反应进行。优选地,过量表达的酶的浓度是至少5%、10%、20%、30%或40%的总宿主细胞蛋白。
将“非天然”底物理解为这样的分子,所述分子不受自然界中相应的酶作用,即使它可以实际上与内源酶一起共存于微生物中。这种“非天然”底物不被自然界中的微生物转化,因为其他底物是优选的(例如“天然底物”)。因此,本发明构思了用上文描述的酶在自然界中不存在的环境下利用非天然底物。
因此,在本发明的上下文中该微生物也可能是天然不具有磷酸转酮酶活性或磺基乙醛乙酰转移酶活性,但经基因修饰从而包含允许磷酸转酮酶或磺基乙醛乙酰转移酶表达的核苷酸序列的微生物。类似地,该微生物也可以是天然具有磷酸转酮酶活性或磺基乙醛乙酰转移酶活性,但是经基因修饰从而增强磷酸转酮酶活性或磺基乙醛乙酰转移酶活性(例如例如通过引入编码磷酸转酮酶或磺基乙醛乙酰转移酶的外源核苷酸序列或通过引入用于编码所述酶的内源性基因的启动子以增加内源产量至过量表达(非天然)水平)的微生物。
如果使用天然表达酸转酮酶或磺基乙醛乙酰转移酶的微生物,可以如此修饰这种微生物,从而在微生物中过量表达相应的活性。可以例如通过以下方式实现这一点:在相应基因的启动子区中实施突变或引入高表达性启动子,从而导致确保更高基因表达的启动子。备选地,还可能是基因如此突变,从而导致显示更高活性的酶。
通过使用表达磷酸转酮酶或磺基乙醛乙酰转移酶的微生物,可能在不需要分离或纯化酶的情况下,在培养基中直接实施本发明的方法。
在一个实施方案中,本发明方法中使用的生物是已经过基因修饰以含有编码磷酸转酮酶或磺基乙醛乙酰转移酶的外来核酸分子的微生物。在这种语境下,术语“外来”或“外源”意指核酸分子不天然地存在于所述微生物中。这意味着它不出现在微生物中的相同结构内或在相同位置处。在一个优选的实施方案中,外来核酸分子是包含启动子和编码相应酶的编码序列的重组分子,其中驱动编码序列表达的启动子相对于编码序列是异源的。在这种语境下,“异源”意指该启动子不是天然驱动所述编码序列表达的启动子,而是天然驱动不同编码序列表达的启动子,即,它衍生自另一个基因,或是合成的启动子或嵌合启动子。优选地,启动子是相对于微生物为异源的启动子,即在相应的微生物中不天然存在的启动子。甚至更优选地,启动子是诱导型启动子。在不同类型的生物中、尤其在微生物中驱动表达的启动子是本领域技术人员熟知的。
在又一个实施方案中,核酸分子相对于微生物是外来的,因为编码的酶相对于微生物不是内源的,即当微生物未经基因修饰时不由微生物天然表述。换句话说,编码的酶相对于微生物是异源的。外来核酸分子可以在微生物中以染色体外形式存在,例如作为质粒,或稳定整合在染色体中。优选稳定整合。因此,基因修饰可以例如在于整合编码酶的相应基因至染色体中,或在于从含有酶编码序列上游的启动子的质粒表达所述酶,所述启动子和编码序列优选地源自不同生物;或本领域技术人员已知的任何其他方法。
在本发明的上下文中,术语“微生物”指细菌,以及指真菌,如酵母,并且也指藻类和古细菌。在一个优选的实施方案中,微生物是细菌。原则上可以使用任何细菌。在本发明方法中待使用的优选细菌是芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、发酵单胞菌属(Zymomonas)或埃希氏菌属(Escherichia)的细菌。在一个特别优选的实施方案中,细菌属于埃希氏菌属并且甚至更优选地属于大肠杆菌物种。在另一个优选实施方案中,细菌属于恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)物种,或属于运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)物种,或属于谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)物种或属于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)物种。
还可能使用极端嗜热细菌如嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)或来自梭菌科(Clostridiae)的厌氧细菌。
在另一个优选实施方案中,微生物是真菌,更优选地是酵母属、裂殖酵母属(Schizosaccharomyce)、曲霉属(Aspergillus)、木霉属(Trichoderma)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)或毕赤酵母属(Pichia)的真菌,并且甚至更优选地是以下物种:酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、黑曲霉(Aspergillus niger)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、Pichia torula或Pichia utilis。
在另一个实施方案中,本发明的方法利用至少表达磷酸转酮酶和/或磺基乙醛乙酰转移酶的光合微生物。优选地,微生物是光合细菌或微藻。在又一个实施方案中,微生物是藻,更优选地属于硅藻类(diatomeae)的藻。
还可构思在本发明方法中使用微生物的组合,其中不同微生物表达如上文所述的不同酶。
在一个特别优选的实施方案中,本发明方法中使用的微生物是甲醇营养或甲基营养细菌或甲醇营养或甲基营养酵母。这类微生物优选地在本发明方法中使用,因为它们天然地具有代谢甲醇和/或甲烷以通过上文所述的酶促反应产生甲醛的能力。甲醇营养细菌及它们的可能用途例如在Jiang等人(Biochemical Engineering J.49(2010),277-288)、Schrader等人(Trends in Biotechnology 27(2008),107-115)、Chistoserdova等人(Anu.Rev.Microbiol.63(2009)、477-499)和Kalyuzhnaya等人(Nature Commun.4(2013)中描述。这些细菌的多样性例如在Chistoserdova等人(参见上述引文)和Jiang等人(参见上述引文)中描述。Schrader等人(参见上述引文)和Kalyuzhnaya等人(参见上述引文)描述了这类微生物作为甲烷转化用催化剂的用途。最后,Schrader等人(参见上述引文)还描述了允许操纵甲基营养细菌(如扭脱甲基杆菌)的代谢以形成所需产物的遗传工具。甲烷营养菌或甲基营养细菌的例子包括但不限于嗜甲基菌科(Methylophilaceae)细菌和以下属的细菌:甲基细菌属(Methylobacter)、甲基杆菌属(Methylobacterium)(例如,扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)、嗜有机甲基杆菌(Methylobacterium organophilum)和罗得西亚甲基杆菌(Methylobacterium rhodesianum)、甲基芽孢杆菌属(Methylobacillus)(例如,鞭毛甲基芽孢杆菌(Methylobacillus flagellatus)和产糖甲基芽孢杆菌(Methylobacillus glycogenes))、甲基单胞菌属(Methylomonas)(例如,甲烷甲基单胞菌(Methylomonas methanica))、甲基球形菌属(Methylosoma)、甲基微菌属(Methylomicrobium)(例如,嗜盐甲基微菌(Methylomicrobium alcaliphilum))、甲基热菌属(Methylothermus)、甲基盐菌属(Methylohalobius)、甲基八叠球菌(Methylosarcina)、甲基球形菌属(Methylosphaera)、甲基孢囊菌属(Methylocystis)、甲基弯曲菌属(Methylosinus)(例如,发孢甲基弯曲菌(Methylosinus trichosporium)、甲基帽菌属(Methylocapsa)、甲基细胞菌属(Methylocella)、甲基球菌属(Methylococcus)(例如,荚膜甲基球菌(Methylococcus capsulatus))、甲基暖菌属(Methylocaldum)、嗜甲基菌属(Methylophilus)(例如,食甲基嗜甲基菌(Methylophilus methylotrophus))、嗜酸嗜甲基菌属(Methylacidiphilum)、生丝微菌属(Hyphomicrobium)(例如,Hyphomicrobiummethylovorum或查氏生丝微菌属(Hyphomicrobium zavarzinii))、芽孢杆菌属(Bacillus)(例如,甲醇芽胞杆菌(Bacillus methanolicus))、假单胞菌属(Pseudomonas)、副球菌属(Paracoccus)(例如,脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans))、玫瑰杆菌属(Silicibacter)(例如,Silicibacter pomeroyi)或Granulibacter(例如,Granulibacterbethesdensis)。
在一个优选实施方案中,本发明方法中使用的微生物是表达甲醇脱氢酶(MDH)和尤其催化甲醇氧化成甲醛的含有吡咯并喹啉-醌(PQQ)的酶(醌蛋白)的微生物(Anthony,Adv.Microbila Physiol.27(1986),113-120;Duine和Frank,Methanol dehydrogenase:Aquinoprotein;引自:Microbial Growth on C1Compounds;编者Dalton,H.,Heyden&SonLtd.,London(1981),31-41;Duine等人,Eur.J.Biochem.108(1980),187-192)。
在一个特别优选的实施方案中,本发明方法中使用的微生物是酸单胞菌属微生物,优选地甲醇酸单胞菌物种(以前名称为:甲醇醋酸杆菌)生物。甲醇酸单胞菌是能够依赖甲醇作为唯一碳源生长的独特乙酸细菌。这种细菌特别地可用于本发明的方法中,因为它高效地摄取甲醇。甲醇由这种细菌转化成甲醛,原因是表达甲醇脱氢酶(由MxaF基因编码;参见,例如,Suzuki等人,J.Gen.Appl.Microbiol.55(2009),101-110)。这种生物的基因组DNA序列草图已经由Higashiura等人(FEMS Microbiol.Lett.351(2014),9-13)报告。甲醇酸单胞菌的甲醇脱氢酶是醌蛋白并且已经详细描述了其特性(Frébortova等人,Biochim.Biophys.Acta 1363(1998),24-34)。
其他例子是属于疣微菌门(Verrucomicrobia)的细菌或伯克氏菌目(Burkholderiales)、尤其丛毛单胞菌科(Comamonadaceae)或红环菌科(Rhodocyclaceae)、例如Methylibium属(例如Methylibium petroleiphilum)和伯克霍尔德菌属(Burkholderia)(例如,瘤状伯克霍尔德菌(Burkholderia phymatum))的细菌。其他例子是丝状细菌,例如泉发菌属(Crenothrix)(例如多孢泉发菌(Crenothrix polyspora))、细枝发菌属(Clonothrix)(例如褐色细枝发菌(Clonothrix fusca))或贝氏硫菌属(例如白色贝氏硫菌(Beggiatoa alba))的丝状细菌。
甲醇营养或甲基营养酵母例如包括毕赤酵母属(Pichia)酵母、优选地巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris))、假丝酵母属酵母(例如博伊丁假丝酵母)、Ogataea属酵母、Kuraishia、Komagatealla属酵母(参见,例如,Yurimoto等人,Intern.J.Microbiol.2011(2011),ID101298),掷孢酵母属(Sporobolomyces)酵母(例如玫瑰掷孢酵母(Sporobolomyces roseus)Y株)或红酵母属酵母(Rhodotorula)(例如粘红酵母(Rhodotorula glutinis)株CY)、汉逊酵母属(Hansenula)酵母(例如多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha))。
下文还将进一步详细描述为了表达目的酶对微生物的基因修饰。
本发明方法中所用的磷酸转酮酶和/或磺基乙醛乙酰转移酶可以是天然存在的磷酸转酮酶或磺基乙醛乙酰转移酶或它可以是从天然存在的磷酸转酮酶/磺基乙醛乙酰转移酶衍生的磷酸转酮酶/磺基乙醛乙酰转移酶,例如通过引入突变或例如,改变或改善酶活性、稳定性等的其他改变。
用于修饰和/或改善蛋白质的所需酶活性的方法是本领域技术人员熟知的并且包括例如随机诱变或位点定向诱变并随后选择具有所需特性的酶,或所谓“定向进化”方案。
例如,对于原核细胞中的基因修饰,可以将编码磷酸转酮酶或磺基乙醛乙酰转移酶的核酸分子引入质粒中,所述质粒允许通过DNA序列重组诱变或序列修饰。标准方法(见Sambrook和Russell(2001),Molecular Cloning:A Laboratory Manual,CSH Press,ColdSpring Harbor,NY,USA)允许进行碱基交换或添加天然或合成序列。可以通过使用与片段互补的衔接头和接头连接DNA片段。另外,可以使用提供合适限制性位点或除去多余DNA或限制性位点的工程化措施。在其中可能插入,缺失或置换的那些情况下,可以使用体外诱变、“引物修复”、限制作用或连接。通常而言,实施序列分析、限制分析和其他生物化学和分子生物学方法作为分析方法。随后用如上文所述的测定法,对所产生的磷酸转酮酶/磺基乙醛乙酰转移酶变体测试所需的活性,例如,酶活性,并且特别地是测试它们增加的酶活性。
如上文所述,本发明方法中所用或本发明组合物中所含的微生物可以是已经通过导入编码磷酸转酮酶和/或磺基乙醛乙酰转移酶的核酸分子进行基因修饰的微生物。因此,在一个优选的实施方案中,微生物是已经过基因修饰以具有增加的磷酸转酮酶活性和/或增加的磺基乙醛乙酰转移酶活性的重组微生物。这可以例如通过用编码核酸磷酸转酮酶和/或磺基乙醛乙酰转移酶的核酸转化该微生物来实现。下文将进一步详细描述对微生物的基因修饰。优选地,引入微生物中的核酸分子是相对于该微生物是异源的核酸分子,即,它天然地不存在于所述微生物中。
在本发明的上下文中,“增加的活性”意指基因修饰的微生物中酶的、尤其是磷酸转酮酶或磺基乙醛乙酰转移酶的表达和/或活性比相应未修饰的微生物中高至少10%、优选地至少20%、更优选地至少30%或50%、甚至更优选地至少70%或80%并且特别优选高至少90%或100%。在甚至更优选的实施方案中,表达和/或活性的增加可以是至少150%、至少200%或至少500%。在特别优选的实施方案中,表达比相应未修饰的微生物中高至少10倍、更优选地至少100倍和甚至更优选至少1000倍。
术语“增加的”表达/活性也涵盖如下情况,其中相应未修饰的微生物不表达相应的酶,例如磷酸转酮酶或磺基乙醛乙酰转移酶,从而未修饰的微生物中的相应表达/活性是零。优选地,过量表达的酶的浓度是至少5%、10%、20%、30%或40%的总宿主细胞蛋白。
用于测量细胞中给定蛋白质的表达水平的方法是本领域技术人员熟知的。在一个实施方案中,通过测量相应蛋白质的量进行表达水平的测量。相应方法是本领域技术人员熟知的并且包括蛋白质印迹法、ELISA等。在另一个实施方案中,通过测量相应RNA的量进行表达水平的测量。相应方法是本领域技术人员熟知的并且包括例如RNA印迹。
用于测量磷酸转酮酶或磺基乙醛乙酰转移酶的酶活性的方法是本领域已知的并且已经在上文描述。
在本发明的上下文中,术语“重组”意指微生物经基因修饰,从而与野生型或未修饰的微生物相比,含有编码如上文定义的酶的核酸分子。编码如上文定义的酶的核酸分子可以单独使用或作为载体的部分使用。
所述核酸分子还可以包含与包含于该核酸分子中的多核苷酸有效连接的表达控制序列。如本说明书自始至终使用,术语“有效连接的”或“有效连接”指在一个或多个表达控制序列和多核苷酸中待表达的编码区之间以如此方式连接,从而在与表达控制序列相容的条件下实现表达。
表达包括异源DNA序列的转录,优选地,转录成可翻译的mRNA。确保在真菌中以及在细菌中表达的调节元件是本领域技术人员熟知的。它们涵盖启动子、增强子、终止信号、靶向信号等。在下文与相关载体的解释相联系时进一步给出实例。
相对于核酸分子的来源和/或相对于待表达的基因,用于与核酸分子连接的启动子可以是同源或异源的。合适的启动子是例如自身导致组成型表达的启动子。然而,也可以使用仅在由外部影响所决定的时间点激活的启动子。在本上下文中,可以使用人工启动子和/或化学诱导型启动子。
所述载体还可以包含与包含于该载体中的所述多核苷酸有效连接的表达控制序列。这些表达控制序列可以适用于确保可翻译的RNA在细菌或真菌中的转录和合成。
此外,可以通过分子生物学中常规的方法将不同突变插入多核苷酸(见例如Sambrook和Russell(2001),Molecular Cloning:A Laboratory Manual,CSH Press,ColdSpring Harbor,NY,USA),导致合成可能具有改变的生物学特性的多肽。可构思在位置处导入点突变,其中在所述位置处的氨基酸序列的修饰例如影响多肽的生物活性或多肽的调节。
另外,可以制备拥有修饰的底物或产物特异性的突变体。优选地,这类突变体显示增加的活性。备选地,可以制备在不丧失底物结合活性的情况下消除其催化活性的突变体。
另外,将突变引入编码如上文定义的酶的多核苷酸中允许减少或增加所述多核苷酸编码的酶的基因表达速率和/或活性。
为了遗传地修饰细菌或真菌,可以将将编码如上文定义的酶的多核苷酸或这些分子的部分引入质粒中,这允许通过DNA序列重组诱变或序列修饰。标准方法(见Sambrook和Russell(2001),Molecular Cloning:A Laboratory Manual,CSH Press,Cold SpringHarbor,NY,USA)允许进行碱基交换或添加天然或合成序列。可以通过使用针对片段的衔接头和接头相互连接DNA片段。另外,可以使用提供合适限制性位点或除去多余DNA或限制性位点的工程化措施。在可能插入,缺失或置换的那些情况下,可以使用体外诱变、“引物修复”、限制作用或连接。通常而言,实施序列分析、限制分析和其他生物化学和分子生物学方法作为分析方法。
因而,根据本发明,可以通过遗传地修饰真菌或细菌来产生重组微生物,包括将上述多核苷酸、核酸分子或载体导入真菌或细菌中。
表达编码相应酶、尤其编码磷酸转酮酶或磺基乙醛乙酰转移酶的多核苷酸,以导致具有上文描述的任一种活性例如磷酸转酮酶活性或磺基乙醛乙酰转移酶活性的多肽产生。不同表达系统的综述例如含于Methods in Enzymology 153(1987),385-516中,引自Bitter等人(Methods in Enzymology153(1987),516-544)并含于Sawers等人,(AppliedMicrobiology and Biotechnology 46(1996),1-9)、Billman-Jacobe(Current Opinionin Biotechnology 7(1996),500-4)、Hockney(Trends in Biotechnology 12(1994),456-463)、Griffiths等人,(Methods in Molecular Biology 75(1997),427-440)中。酵母表达系统的综述例如由Hensing等人(Antonie van Leuwenhoek 67(1995),261-279),Bussineau等人(Developments in Biological Standardization 83(1994),13-19)、Gellissen等人(Antonie van Leuwenhoek 62(1992),79-93)、Fleer(Current Opinion inBiotechnology 3(1992),486-496)、Vedvick(Current Opinion in Biotechnology 2(1991),742-745)和Buckholz(Bio/Technology 9(1991),1067-1072)给出。
已经在文献中广泛描述了表达载体。原则上,它们不仅含有选择标记基因和确保在选择的宿主中复制的复制起点,还含有细菌启动子或病毒启动子,和在大多数情况下转录终止信号。在启动子和终止信号之间通常存在至少一个使得插入编码性DNA序列成为可能的限制性位点或多接头。如果天然控制相应基因的转录的DNA序列在选择的宿主生物中有活性,则该天然控制相应基因的转录的DNA序列可以用作启动子序列。然而,这种序列也可以交换为其他启动子序列。可以使用确保基因组成型表达的启动子和允许人为控制基因表达的诱导型启动子。文献中详述了拥有这些特性的细菌启动子和病毒启动子序列。文献中充分描述了用于微生物(例如大肠杆菌、酿酒酵母)中表达的调节序列。允许特别高地表达下游序列的启动子例如是T7启动子(Studier等人,Methods in Enzymology 185(1990),60-89)、lacUV5、trp、trp-lacUV5(DeBoer等人,引自Rodriguez和Chamberlin(编著),Promoters,Structure and Function;Praeger,New York,(1982),462-481;DeBoer等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1983),21-25)、lp1、rac(Boros等人,Gene 42(1986),97-100)。诱导型启动子优选地用于多肽的合成。这些启动子经常导致比组成型启动子更高的多肽产量。为了获得最佳多肽量,经常使用两阶段方法。首先,将宿主细胞在最佳条件下培养直至相对高的细胞密度。在第二步骤中,根据使用的启动子的类型,诱导转录。在这个方面,tac启动子是特别合适的,所述tac启动子可以由乳糖或IPTG(=异丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷)诱导(deBoer等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80(1983),21-25)。文献中也描述了转录的终止信号。
可以通过例如Sambrook和Russell(2001),Molecular Cloning:A LaboratoryManual,CSH Press,Cold Spring Harbor,NY,USA;Methods in Yeast Genetics,ALaboratory Course Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1990中描述的标准方法,用如上所述的多核苷酸或载体实施宿主细胞的转化。将宿主细胞在满足(尤其在pH值、温度、盐浓度、通气、抗生素、维生素、微量元素等方面满足)所用具体宿主细胞要求的营养培养基中培养。
当本发明方法通过使用提供相应酶活性的生物/微生物在体内实施时,在允许酶促反应出现的合适培养条件下培育生物、优选地微生物。特定培养条件取决于所用的特定生物/微生物,但是为本领域技术人员熟知。通常以如此方式选择培养条件,从而它们允许编码用于相应反应的酶的基因的表达。多种方法是本领域技术人员已知的,以便在某些培养阶段改进并精细调节某些基因的表达,如通过化学诱导物或通过温度变动诱导基因表达。
在另一个实施方案中,本发明的方法包括步骤:以(细胞)培养物形式、优选地液态细胞培养物形式提供携带相应酶活性的生物,优选地微生物,后续步骤是在发酵器(经常也称作生物反应器)中于允许相应酶表达的合适条件下培育所述生物,优选地微生物,并且还包括步骤:实现如本文上述的本发明方法的酶促转化。合适的发酵器或生物反应器装置和发酵条件是本领域技术人员已知的。生物反应器或发酵器指支持生物活性环境的本领域已知的任何制造或工程化的装置或系统。因此,生物反应器或发酵器可以是实施化学/生物化学过程如本发明方法的容器,所述化学/生物化学过程涉及生物、优选地微生物和/或生物化学活性物质,即,从此类生物衍生的上述酶或携带上述酶的生物。在生物反应器或发酵器中,这种过程可以是需氧的或厌氧的。这些生物反应器常见是圆柱状,并且可以具有从数升至若干立方米的一系列规格,并经常由不锈钢制成。在这个方面,不受理论约束,发酵器或生物反应器可以按照这样的方式设计,从而它适合以例如分批培养、补料分批培养、灌流培养或化学培养方式来培养生物,优选地微生物,全部培养方法通常均是本领域已知的。
培养基可以是适于培养相应生物或微生物的任何培养基。
本发明还涉及一种组合物,所述组合物含有
(a)甲醛和磷酸转酮酶;或
(b)甲醛和磺基乙醛乙酰转移酶;或
(c)甲醛和磷酸转酮酶和磺基乙醛乙酰转移酶;或
(d)甲醛和表达磷酸转酮酶的微生物;或
(e)甲醛和表达磺基乙醛乙酰转移酶的微生物;或
(f)甲醛和表达磷酸转酮酶和磺基乙醛乙酰转移酶的微生物。
磷酸转酮酶/磺基乙醛乙酰转移酶可以是如上文联系本发明方法定义的磷酸转酮酶/磺基乙醛乙酰转移酶。组合物中所含微生物可以是表达磷酸转酮酶和/或磺基乙醛乙酰转移酶的任何合适的微生物,尤其如上文联系本发明方法所述的微生物。
本发明另外涉及磷酸转酮酶或磺基乙醛乙酰转移酶的用途或表达磷酸转酮酶和/或磺基乙醛乙酰转移酶的微生物的用途,用于从甲醛产生乙酰磷酸。就磷酸转酮酶/磺基乙醛乙酰转移酶和微生物而言,它们如上文已经与本发明方法相联系时所述那样适用。
图1显示使用来自乳酸乳球菌(L.lactis)的磷酸转酮酶从甲醛产生乙酰磷酸的酶促反应的质谱图(A)和无酶情况下对照反应的质谱图(B)。
图2显示在磷酸存在下由磷酸转酮酶转化甲醛形成的乙酸的峰强度。
在本说明书中,引用了包括专利申请的众多文件。这些文献的公开内容,尽管不认为与本发明可专利性相关,通过引用的方式完整结合在此。更具体地,参考的全部文献通过引用的方式以相同的程度结合,如同专门且个别地指出通过引用的方式结合每份单独的文献。
现在将参以下实施例描述本发明,所述实施例仅是示意性的并且不得解释为限制本发明的范围。
实施例
实施例1:磷酸转酮酶的克隆、表达和纯化
重组酶的基因合成、克隆和表达
通过寡核苷酸串联法产生了从原核生物基因组推断的磷酸转酮酶序列,以符合大肠杆菌的密码子选择(基因由商业合成)。将一段6组氨酸密码子插入甲硫氨酸起始密码子后,以提供用于纯化的亲和标签。将由此合成的基因克隆于含有修饰的多克隆位点(MCS)的改良pUC18表达载体(New England Biolabs)中。将目的基因克隆在PacI和NotI限制性位点处。
使用标准热休克法,用这些载体转化感受态MG1655大肠杆菌细胞。将转化的细胞在30℃在LB-氨苄青霉素培养基中培育24小时,160转/分钟振摇。
通过在4℃,10,000转/分钟离心20分钟收集细胞并且在-80℃贮存细胞沉淀物。
蛋白质纯化和浓缩
来自200ml培养的细胞的沉淀物在冰上融化并且重悬于3ml含有300mM NaCl、5mMMgCl2、1mM DTT和10mM咪唑的50mM Tris-HCl pH7.5中。添加10μl lysonase(Merck)。将细胞在室温孵育10分钟并且随后返回冰上20分钟。通过超声波处理2x 30秒完成细胞裂解。随后通过在4℃,10,000转/分钟离心20分钟使细菌提取物澄清。将澄清的细菌裂解物加载于允许吸附加6-His标签的蛋白质的PROTINO-1000Ni-TED柱(Macherey-Nagel)上。将柱洗涤并且将目的酶用4ml含有300mM NaCl、5mM MgCl2、1mM DTT、250mM咪唑的50mM Tris-HCl pH7.5洗脱。将洗脱物随后在Amicon Ultra-4 10kDa滤器单元(Millipore)上浓缩和脱盐,并且将酶重悬于50mM Tris-HCl pH 7.5中。在长期储存之前,向酶制品补充10%甘油。通过在NanoDrop 1000分光光度计(Thermo Scientific)上直接紫外280nm测量,对蛋白质浓度定量。如此纯化的蛋白质纯度在70%至90%变动。
实施例2:从甲醛经酶催化产生乙酰磷酸的研究
乙酰磷酸对水解是特别不稳定的,释放乙酸。因此,使用质谱(MS)和HPLC分析监测从甲醛经酶催化产生乙酸。
质谱(MS)分析
在以下条件下实施酶促反应:
50mM磷酸钠pH 7.5
1mM焦磷酸硫胺素(TPP)
10mM MgCl2
50mM甲醛(Sigma)
将pH调节至7.5
磷酸转酮酶(PKT)浓度是10mg/ml。
在不添加酶或不添加甲醛的情况下进行对照测定法。酶促反应在37℃以0.2ml总体积运行40小时伴以振摇。一般地,取出200μl等分试样的反应,离心并将上清液转移至一个清洁小瓶。使用以流速2ml/小时运行的注射泵,通过样品的直接上样,在离子阱质谱仪(Ion Trapp Mass Spectrometer,Esquire3000,Bruker)上以负离子模式获得MS谱。评价乙酸的存在。MS分析显示来自酶促样品但是不来自对照的在m/z 59.4处对应于乙酸的[M-H]-离子(图1A和B、图2)。
基于HPLC的分析
在以下条件下实施酶促反应:
50mM磷酸钠pH 7.5
5mM焦磷酸硫胺素(TPP)
5mM MgCl2
1.9mM L-半胱氨酸盐酸盐
23mM氟化钠
50mM甲醛(Sigma)
将pH调节至7.5
磷酸转酮酶(PKT)按浓度5mg/ml添加。
平行运行由(a)甲醛和磷酸在无酶情况下、(b)甲醛和酶在无磷酸情况下组成的对照反应。
酶促反应在37℃以0.3ml总体积运行48小时伴以振摇,并通过在80℃温育5分钟终止。随后将分析管离心并且将100μl澄清的上清液转移至一个清洁小瓶中。使用商业乙酸钠(Sigma-Aldrich)作为参考。使用配备折射探测器和柱加热模块的1260Inifinity LC系统(Agilent),进行HPLC分析。在配备PL Hi-Plex H保护柱(50x 7.7mm)的Hi-Plex H柱(300x7.7mm,8μm粒度,柱温度65℃)上分离10μl样品。由硫酸溶液(5.5mM)组成的流动相以流速0.6ml/分钟运行。在这些条件下乙酸的保留时间是18.4分钟。
表1中显示HPLC分析的结果。
表1:随反应混合物中存在磷酸而变化的从甲醛形成乙酸。
这些数据显示,在磷酸和磷酸转酮酶存在下通过形成乙酰磷酸而推进,发生从甲醛产生乙酸。
实施例3:磺基乙醛乙酰转移酶催化从甲醛产生乙酰磷酸的研究
乙酰磷酸对水解是特别不稳定的,释放乙酸。因此,使用HPLC分析监测从甲醛经酶催化产生乙酸。
基于HPLC的分析
在以下条件下实施酶促反应:
50mM磷酸钠pH7.5
5mM焦磷酸硫胺素(TPP)
5mM MgCl2
1.9mM L-半胱氨酸盐酸盐
23mM氟化钠
50mM甲醛(Sigma-Aldrich)
1-10mg/ml酶
这项研究中使用以下酶:
来自木糖氧化产碱杆菌木糖氧化亚种(Alcaligenes xylosoxydansxylosoxydans)(Uniprot登录号:Q84H41)的磺基乙醛乙酰转移酶
来自Roseovarius nubinhibens ISM(Uniprot登录号:A3SR25)的磺基乙醛乙酰转移酶
来自解芳烃卡斯特罗尼氏菌(Uniprot登录号:Q84H44)的磺基乙醛乙酰转移酶
来自Desulfonispora thiosulfatigenes(Uniprot登录号:Q93PS3)的磺基乙醛乙酰转移酶
平行运行由(a)甲醛和磷酸在无酶情况下、(b)甲醛和酶在无磷酸情况下组成的对照反应。
酶促反应在37℃以0.3ml总体积进行48小时伴以振摇,并通过在80℃温育5分钟终止。随后将分析管离心并且将100μl澄清的上清液转移至一个清洁小瓶中。使用商业乙酸钠(Sigma-Aldrich)作为参考。使用配备折射探测器和柱加热模块的1260Inifinity LC系统(Agilent),进行HPLC分析。在配备PL Hi-Plex H保护柱(50x 7.7mm)的Hi-Plex H柱(300x7.7mm,8μm粒度,柱温度65℃)上分离10μl样品。由硫酸溶液(5.5mM)组成的流动相以流速0.6ml/分钟运行。在这些条件下乙酸的保留时间是18.4分钟。
Claims (11)
1.从甲醛和磷酸经酶促产生乙酰磷酸的方法,其中通过使用磷酸转酮酶或磺基乙醛乙酰转移酶(EC 2.3.3.15)根据以下反应方案实现从甲醛和磷酸转化成乙酰磷酸:
2CH2O+磷酸→乙酰磷酸+H2O。
2.根据权利要求1所述的方法,其中磷酸转酮酶是
(a)磷酸转酮酶(EC 4.1.2.9),或
(b)果糖-6-磷酸磷酸转酮酶(EC 4.1.2.22)。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其还包括步骤:将产生的乙酰磷酸转化成乙酸。
4.根据权利要求3所述的方法,其中通过利用乙酸激酶(EC 2.7.2.1)或丁酸激酶(EC2.7.2.7)或(二磷酸)乙酸激酶(EC 2.7.2.12)或丙酸激酶(EC 2.7.2.15)或酰基磷酸酶(EC3.6.1.7)实现乙酰磷酸转化成乙酸。
5.根据权利要求1或2所述的方法,其还包括步骤:酶促转化产生的乙酰磷酸成乙酰-辅酶A。
6.根据权利要求5所述的方法,其中通过利用磷酸乙酰转移酶(EC 2.3.1.8)实现乙酰磷酸转化成乙酰-辅酶A。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法,其还包括步骤:通过酶促转化甲醇成甲醛,提供待转化成乙酰磷酸的甲醛。
8.根据权利要求7所述的方法,其中通过利用甲醇脱氢酶(EC 1.1.1.244)或甲醇脱氢酶(细胞色素c)(EC 1.1.2.7)或醇氧化酶(EC 1.1.3.13)实现酶促转化甲醇成甲醛。
9.组合物,其含有
(a)甲醛和磷酸转酮酶和/或磺基乙醛乙酰转移酶;或
(b)甲醛和表达磷酸转酮酶和/或磺基乙醛乙酰转移酶的微生物。
10.磷酸转酮酶或磺基乙醛乙酰转移酶的用途,用于从甲醛产生乙酰磷酸。
11.表达磷酸转酮酶和/或磺基乙醛乙酰转移酶的微生物的用途,用于从甲醛产生乙酰磷酸。
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