KR20180043242A - 작용화된 알파-치환된 아크릴레이트 및 c4-다이카복실산의 생체-기반 생성 - Google Patents

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Abstract

본 설명은, 특히 재조합 미생물들, 조작된 대사 경로들, 화학 촉매들, 및 기재된 방법들 및 물질들의 사용을 통하여 생성된 생성물들을 제공한다. 생성된 생성물들은 작용화된 알파 치환된 C4 다이카복실산들 및 작용화된 아크릴산들, 및 이의 염들, 에스테르들 및 락톤들을 포함한다.

Description

작용화된 알파-치환된 아크릴레이트 및 C4-다이카복실산의 생체-기반 생성
이 출원은 2015년 6월 4일자로 출원된 미국 가특허출원 제62/171,019호 및 2015년 6월 4일자로 출원된 미국 가특허출원 제62/171,029호의 이점을 청구하고 있으며, 이들 둘다는 본원에 참고로 통합되어 있다.
분야
명세서는, 특히 재조합 미생물들, 조작된 대사 경로들, 화학 촉매들, 및 기재된 방법들 및 물질들의 사용을 통하여 생성된 생성물들을 제공한다. 생성된 생성물들은 작용화된 알파 치환된 C4 다이카복실산들 및 작용화된 아크릴산들, 및 이의 염들, 에스테르들 및 락톤들을 포함한다.
배경
현재, 다수의 탄소-함유 화학물질들은 석유 기반의 소오스들로부터 유래된다. 석유-유래된 공급원료에 대한 의존은 석유 매장량의 고갈 및 석유 시추와 관련된 유해한 환경 영향에 기여한다.
당 발효의 특정 탄소성 생성물들은 탄소-함유 화학물질들의 제조를 위한 공급원료들로서 사용되는 석유-유래된 물질들에 대한 대체물들로서 간주된다. 이러한 생성물들은 작용화된 알파 치환된 아크릴산들, 예를 들어 하이드록시메틸 아크릴산, 하이드록시에틸 아크릴산, 아이소프로필 아크릴산 등을 포함한다. 작용화된 아크릴산들은, 현재 모든 상업적 생성이 석유-유래되는 성장하는 시장을 대변한다.
개요
개시내용은 작용화된 알파 치환된 C4 다이카복실산들 및 작용화된 알파 치환된 3-하이드록시프로피온산을 생성하도록 고안된 재조합 미생물들을 제공한다. 상세한 설명 및 청구범위를 통해, 유기산의 언급은, 문맥상 다르게 지시하지 않는 한, 이의 염들, 에스테르들 및 락톤들을 포함해야 한다. 이 경로들에서의 중간체들뿐만 아니라 이 경로들로부터의 최종 생성물들은 다른 것들 중에서 화학 산업에서 예컨대 중합체의 성분으로서 사용하기에 유용하다. 이 경로들의 생성물들 및 중간체들은 추가 화학 반응들을 위한 기질들로서 보호된 또는 비보호된 형태로 또한 유용하다. 예를 들어, 화학 반응을 통해 제조될 수 있는 작용화된 알파 치환된 C4 카복실산의 유도체들이 묘사된다. 일부 예들에서, 작용화된 알파 치환된 아크릴산들은 금속 촉매들 및/또는 탈수 반응들의 사용을 통해 생성된다.
일부 경우들에서, 재조합 미생물들은 작용화된 알파 치환된 다이카복실산 및/또는 작용화된 알파 치환된 3HP를 생성하는 경로를 포함하도록 조작된다. 당해 분야의 통상의 기술자는, 주어진 경로의 발현시, 경로의 최종 생성물뿐만 아니라 경로 내의 중간체들 중 일부가 발효로부터 생성되고 격리될 것이라는 것을 이해할 것이다. 일부 경우들에서, 이러한 생성물들의 혼합물은 후속 반응에서 최종 생성물을 생성하는 데 사용될 수 있다. 본원에서 기재된 조작된 경로들의 일부는 디카복실라제 활성(도 11 및 도 12, I열 참조) 또는 3HP CoA 디하이드라타제(도 13 및 도 14, G열 참조)를 갖는 하나 이상의 폴리펩타이드의 발현을 포함한다.
다른 실시양태들은 2-메틸렌-석시닐 세미알데하이드, 알파-하이드록시에틸 아크릴레이트 및 툴리팔린 A로부터 선택된 화합물들을 생성하도록 조작된 재조합 미생물들을 포함한다. 이러한 재조합 미생물들은 하기 활성들을 갖는 하나 이상의 효소들을 인코딩하는 핵산 서열들을 포함한다: 옥시-리덕타제, 리덕타제, 사이클라제, 락토나제 및 락타마제 활성. 또한, 이 활성들 및 재조합 미생물들에 도달하는 데 사용될 수 있는 특정 아미노산 서열들, 예컨대 옥시-리덕타제(도 18, A열), 리덕타제(도 18, B열), 사이클라제(도 18, C열), 락토나제(도 18, C열) 및 락타마제(도 18, C열)가 본원에 교시된다. 이들 재조합 미생물은, 이들이 2-메틸렌-석시닐 세미알데하이드, 알파-하이드록시에틸 아크릴레이트 및 툴리팔린 A로부터 선택된 화합물 적어도 0.5, 0.75, 1.0, 3.0, 5.0, 7.0 또는 10 g/L의 존재 하에서 생존 가능하게 잔존하도록(remain viable) 선택되거나 가공될 수 있다. 이들 재조합 미생물은 하기 생성물들 중 하나 이상: 이타콘산, 2-메틸렌-석시닐 세미알데하이드, 알파-하이드록시에틸 아크릴레이트 또는 툴리팔린 A를 적어도 0.02, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 1.5, 3.0, 5.0, 7.0 또는 10.0 g/L/hr의 속도로 생성할 수 있다. 이들 생성물의 제조방법은 발효 브로쓰에서 재조합 미생물을 발효시키는 단계 및 발효 브로쓰로부터 생성물(들)을 분리하는 단계를 포함한다.
당해 분야의 통상의 기술자는, 불순물들이 원하는 생성물들과 동시에 정제되고, 이온 교환, 증류, 결정화 등과 같은 하나 이상의 처리 단계들이 불순물 수준들을 감소시키는 데 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 원하는 순도의 실제 수준은 불순물에 대한 정제화 비용과 최종 사용자의 톨러런스(tolerance) 사이의 균형일 것이다. 예를 들어, 0.01 ppm 미만의 불순물이 일부 용도에 필요할 수 있지만, 0.01, 50, 100, 150, 200 또는 300 ppm보다 큰 범위의 불순물들이 허용될 수 있다. 불순물들은 탄수화물들, 염들, 금속들, 기체들, 유기 물질, 세포 파편(debris) 및 이들의 조합의 형태일 수 있다. 일부 경우에서, 불순물들은 바람직한 부작용들을 가질 수 있다.
본원에서 기재된 재조합 미생물들은 특정 효소 활성을 갖는 폴리펩타이드를 발현 또는 과발현하도록 조작되었다. 효소 활성은 일반적으로 기질을 생성물로 변환시키는 능력으로서 묘사된다. 당해 분야의 통상의 기술자는, 효소들이 구조적으로 관련이 없고, 확산적 보조인자(divergent cofactor)들을 사용하고, 상이한 조상(ancestry)을 가질 수 있지만, 동일한 기질들을 동일한 생성물들로 변환시킬 수 있다는 것을 이해할 것이다. 이 관점에서, 본 개시내용은, 동일한 활성을 갖는 다른 폴리펩타이드에 대한 구조적 유사성에 상관없이 재조합 기술을 통해 특정 효소 활성(예컨대, 도 4 및 도 6의 표들 참조)을 포함하는 재조합 미생물을 포함한다. 이들 재조합 미생물은 또한 네이티브(native) 호스트 미생물에서 발견된 것보다 높은 농도로 생성된 생성물을 포함할 것이다. 일부 경우들에서, 생성물은 네이티브 호스트 미생물에서는 발견되지 않을 것이다.
예시적인 재조합 미생물들은, 작용성 알파 치환이 (메틸보다 긴) 알킬, 하이드록시, 하이드록시알킬, 분지된 하이드록시알킬, 알콕시, 분지된 알킬, 아미노, 분지된 아미노 알킬, 페닐, 알킬 치환된 페닐, -S-, -SH, -SeH, -Se-, 하이드록시방향족(hydroxyaromatic), 아미노방향족(aminoaromatic), 폼일, 카바모일, 인돌릴, 구아니디닐, 및 n>2, n>3 또는 n>4 인 경우의 카복실레이트로부터 선택되는 작용화된 알파 치환된 C4 다이카복실산들; 및 트랜스아미나제(도 4, A열), 신타제(도 4, B열), 디하이드라타제(도 4, C열), 하이드라타제(도 4, D열), 디하이드로게나제(도 4, E열), 시스-트랜스 아이소머라제(도 4, F열), 사이클라제, 락토나제, 락타마제(도 4, G열), 에스테라제(도 4, H열), 리덕타제(도 6, C열), 디카복실라제(도 6, D열), 및 알데하이드 리덕타제(도 6, E열)로부터 선택되는 적어도 하나의 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 재조합 핵산 서열과 같은 생성물들을 포함한다. 당해 기술 분야의 숙련자는, 사이클라제, 락토나제, 락타마제 및/또는 에스테라제가 알파 치환된 아크릴산 생성물을 촉매 반응에 따라 이의 락톤 또는 에스테르 형태로 효소적으로 변환시키는 데 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 작용화된 알파 치환된 C4 다이카복실산은 알파-(하이드록시메틸) 말산, 알파-(2-하이드록시프로필) 말산, 알파-(1-하이드록시에틸) 말산 및/또는 알파-(2-하이드록시에틸) 말산일 수 있다. 조작된 경로에 의존하여, 재조합 미생물은 1, 2, 3, 4, 또는 그 이상의 작용화된 알파 치환된 C4 다이카복실산들을 포함할 수 있다(도 3 및 도 9에서의 경로들 참조). 당해 분야의 통상의 기술자는, 알파 치환기를 연장시키는 데 스페이서 경로가 사용되는 경우들에서, 몇 개의 구별된 작용화된 알파 치환된 C4 다이카복실산들이 존재할 수 있음을 이해할 것이다. 다수의 경우들에서, 주어진 재조합 미생물은 말산, 푸마르산 등과 같은 다수의 작용화된 알파 치환된 C4 다이카복실산들을 포함할 것이며, 이들 다수의 작용화된 알파 치환된 C4 다이카복실산들은 동일한 작용성 알파 치환을 함유할 것이다. (도 3, 5, 9 및 10 참조).
예시적인 재조합 미생물들은, 작용성 알파 치환이 (메틸보다 긴) 알킬, 하이드록시, 하이드록시알킬, 분지된 하이드록시알킬, 알콕시, 분지된 알킬, 아미노, 분지된 아미노 알킬, 페닐, 알킬 치환된 페닐, -SH, -SH, -SeH, -Se-, 하이드록시방향족, 아미노방향족, 폼일, 카바모일, 인돌릴, 구아니디닐, 및 n>2, n>3 또는 n>4인 경우의 카복실레이트로부터 선택되는 작용화된 알파 치환된 C4 다이카복실산들; 및 트랜스아미나제(도 12, A열), 신타제(도 12, B열), 디하이드라타제(도 12, C열), 하이드라타제(도 12, D열), 디하이드로게나제(도 12, E열), 시스-트랜스 아이소머라제(도 12, F열), 사이클라제, 락토나제, 락타마제(도 12, G열), 에스테라제(도 12, H열), 디카복실라제(도 12, I열), 리덕타제(도 14, C열), 디카복실라제(도 14, D열), 리덕타제(도 14, E열), CoA 트랜스퍼라제(도 14, F열) 및 3HP-CoA 디하이드라타제(도 14, G열)로부터 선택된 적어도 하나의 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 재조합 핵산 서열과 같은 생성물들을 포함한다. 작용화된 알파 치환된 아크릴산은 알파-(하이드록시메틸) 아크릴산, 알파-(2-하이드록시프로필) 아크릴산, 알파-(1-하이드록시에틸) 아크릴산 및/또는 알파-(2-하이드록시에틸) 아크릴산일 수 있다. 당해 분야의 통상의 기술자는, 알파 치환기를 연장시키는 데 스페이서 경로가 사용되는 경우들에서, 작용기에서 다양한 탄소 쇄 길이들을 갖는 수 개의 구별된 작용화된 알파 치환된 아크릴산들이 존재할 수 있음을 이해할 것이다.
일부 실시양태들에서, 작용화된 알파 치환된 C4 다이카복실산에 존재하는 작용기는 아미노산으로부터 유래될 수 있다. 도 7은 이러한 작용기들을 나타내며, 당해 분야의 통상의 기술자는, 작용화된 알파 치환된 C4 다이카복실산이 주어진 아미노산으로부터 생성되고, 작용화된 알파 치환된 C4 다이카복실산이 후속적으로 아크릴레이트로 촉진적으로 변환되는 경우, 메틸렌기가 아미노산에서 원래의 아민의 위치를 차지할 것이라는 것을 이해할 것이다. 조작된 경로를 위한 기질로서 아미노산이 선택되는 경우들에서, 아미노산을 과생성하도록 미리 조작되어 있거나 또는 자연적으로 아미노산을 과생성하는 미생물을 선택하는 것이 편리할 수 있다.
일부 실시양태들에서, 작용화된 알파 치환된 아크릴산에 존재하는 작용기는 아미노산으로부터 유래될 수 있다. 도 7은 이들 작용기들을 나타내며, 당해 분야의 통상의 기술자는 작용화된 알파 치환된 아크릴산에서의 메틸렌기가 아미노산으로부터의 아미노기와 동일한 위치를 차지하는 것을 이해할 것이다. 조작된 경로를 위한 기질로서 아미노산이 선택되는 경우, 아미노산을 과생성하도록 미리 조작되어 있거나 또는 자연적으로 아미노산을 과생성하는 미생물을 선택하는 것이 편리할 수 있다.
일부 실시양태들에서, 재조합 미생물은 작용화된 알파 치환된 C4 아크릴산으로의 후속적인 변환을 위한 기질로서 자연적으로 발생하는 다이카복실산을 사용할 것이다. 예를 들어, 호스트 생명체는 자연적으로 3-포스포하이드록시피루베이트(도 9 참조) 또는 이타콘산(도 9 참조) 또는 이타타르타르산(도 9 참조)을 생성시키고, 증가된 포스파타제(EC 3.1.3.21) 또는 이타코닉 옥시다제 활성을 포함한다. 이타타르타르산을 생성하는 호스트들로는 아스페르길루스 테레우스(Aspergillus terreus) 및 우스틸라고 메이디스(Ustilago maydis)가 있다(Jakubowska 등, 1974; Guevarra 및 Tabuchi, 1990 a and b; Geiser 등, 2014). 그 다음, 이 출발 생성물들은 3HP 기질에서 도 3, 5, 9, 10, 11, 13 및 15에서 제시된 바와 같은 경로로 가해지고 조작될 수 있다.
일부 실시양태에서, 재조합 미생물은 작용화된 알파 치환된 C4 다이카복실산으로의 후속적인 변환을 위한 기질로서 자연적으로 발생하는 다이카복실산을 사용할 것이다. 예를 들면, 호스트 생명체는 자연적으로 3-포스포하이드록시피루베이트(도 9 참조) 또는 이타콘산(도 9 참조) 또는 이타타르타르산(도 9 참조)을 생성할 수 있다. 이타타르타르산을 생성하는 호스트들로는 아스페르길루스 테레우스(Aspergillus terreus) 및 우스틸라고 메이디스(Ustilago maydis)가 있다(Jakubowska 등, 1974; Guevarra 및 Tabuchi, 1990 a and b; Geiser 등, 2014). 그 다음, 이러한 출발 생성물들은 조작된 경로로 가해질 수 있다.
Geiser , Wiebach , Wierckx 및 Blank의 문헌 [부가가치 화학물질들의 생성을 위한 우스틸라기나세아에 진균 과의 생물다양성에 대한 전망 (Prospecting the biodiversity of the fungal family Ustilaginaceae for the production of value-added chemicals). Fulgal Biology and Biotechnology 2014, 1: 2.]
Guevarra 및 Tabuchi의 문헌 [우스틸라고 속의 균주에 의한 이타콘산 , 2- 하이드록 시파라콘산, 이타타르타르산 및 말산의 축적(Accumulation of Itaconic , 2-hydroxyparaconic, itatartaric , and malic acids by strains of the genus Ustilago). Agric. Biol. Chem. 1990 , 54 (9), 2353-2358.]
Guevarra 및 Tabuchi의 문헌 [우스틸라고 시노돈티스에 의한 2- 하이드록시파라콘산 및 이타타르타르산의 생성, 및 산들의 단순 회수 공정(Production of 2-hydroxyparaconic and itatartaric acids by Ustilago cynodontis and simple recovery process of the acids). Agric. Biol. Chem ., 1990, 54 (9), 2359-2365.]
Jakubowska 및 Metodiewa의 문헌 [아스페르길루스 테레우스 II에 의한 이타타르타르산 형성을 위한 대사 경로에 대한 연구. 세포 -부재 추출물들에 의한 (-)-시트라말레이트, 시트라코네이트 및 이타코네이트의 사용(Studies on the metabolic pathway for itatartaric acid formation by Aspergillus terreus II. Use of (-)-citramalate, citraconate and itaconate by cell-free extracts). Acta Microbiologica Polonica Ser. B 1974, Vol. 6 (23), No.2, 51-61.]
당해 분야의 통상의 기술자 중 하나는, 본원에서 기재된 조작된 호스트 세포들이 본원에 제공된 표들에서 확인된 효소들에 더하여 유전적 변형들을 포함할 수 있음을 또한 이해할 것이다. 예를 들어, 생산성(생성물 농도/부피/시간), 수율(생명체에 공급된 생성물 농도/탄소 소오스) 또는 역가(titer)(생성된 총 생성물)를 최적화하기 위해 하나 이상의 효소들이 약화되거나, 또는 활성이 증가 될 수 있다. 재조합 미생물의 추가적인 조작을 위해 트랜스크립토믹스(transcriptomics), 메타볼로믹스(metabolomics) 등과 같이 다양한 공지된 기술들의 사용은 세포를 통해 정확한 탄소 및 보조인자 플럭스(ATP, NADH, NADPH, CO2, O2 등)를 가하도록 허용하여서 생성을 최적화한다.
전술된 바와 같이, 본원에서 기재된 재조합 미생물들은 유의적인 양의 목적하는 중간체를 미리 생성하는 미생물로부터 유래될 수 있다(모 균주 또는 호스트 균주). 호스트 균주는 유의적인 양의 중간체를 생성하도록 미리 조작될 수 있거나, 또는 이것은 자연적으로 유의적인 양의 중간체를 생성할 수 있다. 예를 들어, 호스트 세포는 아미노산, 작용화된 알파 치환된 C4 다이카복실산, 작용화된 베타 치환된 알파 케토산, 작용화된 알파 치환된 푸마르산, 알파 치환된 말로닐 CoA, 3-하이드록시 프로피온산, 하이드록시메틸 말론산, 3-하이드록시프로피오닐-CoA, 하이드록시메틸 말로닐-CoA, 2-폼일 3HP-CoA, 2-하이드록시메틸 3HP CoA, 하이드록시메틸 말로닉 세미알데하이드, 2-(하이드록시메틸) 3HP, 알파-하이드록시메틸 아크릴릴산, 작용화된 알파 치환된 말레산 및/또는 작용화된 알파 치환된 말산을 적어도 0.1 g/L/hr 생성시킬 수 있다. 다른 실시양태들에서, 호스트 세포는 선택된 중간체를 0.5, 0.75, 1.0, 1.5, 2.0 g/L/hr 또는 그 이상 생성할 수 있다. 중간체들은 다른 것들 중에서 히스티딘, 아르기닌, 아스파라긴, 리신, 메티오닌, 시스테인, 페닐알라닌, 트레오닌, 글루타메이트, 글루타민, 트립토판, 셀레노시스테인, 세린, 호모세린, 호모트레오닌, 티로신, 발린, 류신 및 이소류신을 포함하는 유기산들인 중추 대사 생성물들을 포함할 수 있다.
도면들에 지적되고 특별히 첨부된 표들에서 식별된 효소 활성들에 더하여, 재조합 미생물은 또한 US6274311에서의 쉬조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) 효소와 같은 유기산 트랜스포터(transporter) 또는 프레메아제(premease)를 발현할 수 있다. 또한, 탄수화물 흡수(uptake)는 다른 트랜스포터의 발현을 통해 변경될 수 있다.
다양한 재조합 서열들이 도입되는 호스트 세포는 하나 이상의 중간체들에 대한 또는 생성물들에 대한 이들의 톨러런스를 위해 선택될 수 있다. 예를 들어, 호스트 세포는 그 생성물의 존재 하에서 생성 능력을 위해 선택될 수 있다. 일부 경우들에서, 호스트 세포는 낮은 pH에 대한 톨러런스가 있을 것이다. 호스트 세포는 원핵생물 또는 진핵생물일 수 있다.
다양한 작용화된 알파 치환된 C4 다이카복실산 또는 작용화된 알파 치환된 3-하이드록시프로피온산을 제조하는 방법들이 기재되어 있다. 이들 방법은, 탄수화물 소오스의 존재 하에 재조합 미생물을 배양하는 단계, 및 발효 브로쓰로부터 작용화된 알파 치환된 C4 다이카복실산 또는 작용화된 알파 치환된 3-하이드록시프로피온산을 분리하는 단계를 포함한다.
다양한 작용화된 알파 치환된 아크릴산들을 제조하는 방법들이 기재되어 있다. 이들 방법은, 탄수화물 소오스의 존재 하에 재조합 미생물을 배양하는 단계, 및 작용화된 알파 치환된 아크릴산을 발효 브로쓰로부터 분리하는 단계를 포함한다.
본원에서 기재된 작용화된 알파 치환된 C4 다이카복실산들은, 작용화된 알파 치환된 아크릴산으로의 촉매 변환을 통해(도 1 참조) 또는 작용화된 알파 치환된 아크릴산들로의 효소 변환을 통해(도 11 및 13 참조) 변환될 수 있다. 화학적 변환들은 도 3, 9 및 10에서 촉매 단계들로서 식별된다. 유사하게, 작용화된 알파 치환된 3HP 산들은 작용화된 알파 치환 아크릴산으로 단순 탈수 단계를 통해 화학적으로 변환될 수 있다(도 5 참조).
알파 치환된 C4 다이카복실산의 촉매 변환들은 적어도 화학식 I의 화합물 또는 이의 염을 생성할 것이며,
화학식 I
Figure pct00001
상기 식에서,
각각의 R1은 (메틸보다 긴) 알킬, 하이드록시, 하이드록시알킬, 분지된 하이드록시알킬, 알콕시, 분지된 알킬, 아미노, 분지된 아미노 알킬, 페닐, 알킬 치환된 페닐, -S-, -SH, -SeH, -Se-, 하이드록시방향족, 아미노방향족, 폼일, 카바모일, 인돌릴, 구아니디닐, 및 n>1 경우의 카복실레이트로부터 선택되고, R2는 개별적으로 H 및 보호기로부터 선택되고, n은 1 이상이며,
상기 방법은 화학식 II, III 또는 IV의 화합물 또는 이의 염을 포함하는 조성물과 금속 촉매를 접촉시키는 단계를 포함한다:
화학식 II, III 및 IV
Figure pct00002
상기 식에서,
각각의 R1은 (메틸보다 긴) 알킬, 하이드록시, 하이드록시알킬, 분지된 하이드록시알킬, 알콕시, 분지된 알킬, 아미노, 분지된 아미노 알킬, 페닐, 알킬 치환된 페닐, -S-, -SH, , -SeH, -Se-, 하이드록시방향족, 아미노방향족, 폼일, 카바모일, 인돌릴, 구아니디닐, 및 n>1 경우의 카복실레이트, 및 이의 보호기들로부터 선택되고, R2, R3 및 R4는 개별적으로 H 및 보호기로부터 선택되고, n은 1 이상이다.
특정 예들에서, 하이드록시 작용화된 알파 치환된 아크릴산들은 하나 이상의 작용화된 알파 치환된 C4 다이카복실산들의 촉매 변환을 통해 형성될 수 있다. 이들 하이드록시 작용화된 알파 치환된 아크릴산들은 화학식 V 또는 이의 염을 가질 수 있다:
화학식 V
Figure pct00003
상기 식에서,
각각의 R1은 H 또는 CH3으로부터 선택되고, R2 및 R3은 H 또는 보호기로부터 선택되고, n은 1 이상이다.
화학식 V를 갖는 화합물을 형성하는 방법들은 화학식 VI, VII, VIII의 화합물 또는 이의 염을 포함하는 조성물과 금속 촉매를 접촉시키는 단계를 포함한다:
화학식 VI, VII, VIII
Figure pct00004
상기 식에서,
각각의 R1은 H 또는 CH3으로부터 선택되고, R2, R3 및 R4는 개별적으로 H 또는 보호기로부터 선택되고, n은 1 이상이다.
또한, 하기 표 A에 나타낸 바와 같이, 작용화된 알파 치환된 C4 다이카복실산들의 유도체들을 제조하는 방법들이 본원에 기재되어 있다. 이들 방법은 화학식 II, III 및 IV로부터 선택된 화합물, 또는 이의 염, 에스테르 또는 락톤을 금속 촉매와 접촉시키는 단계를 포함한다.
[표 A]
Figure pct00005
Figure pct00006
표 A에서 제시된 구조에서 R 기들은, R1이 (메틸보다 긴) 알킬, 하이드록시, 하이드록시알킬, 분지된 하이드록시알킬, 알콕시, 분지된 알킬, 아미노, 분지된 아미노 알킬, 페닐, 알킬 치환된 페닐, -S-, -SH, -SeH, -Se-, 하이드록시방향족, 아미노방향족, 폼일, 카바모일, 인돌릴, 구아니디닐, 및 n>1 경우의 카복실레이트로부터 선택되고, R2가 개별적으로 H 및 보호기로부터 선택되고, R2가 개별적으로 H 및 보호기로부터 선택되고, n이 1 이상인 것으로 정의된다.
화학식 I의 화합물들 또는 이의 염, 및 표 A에서 제시된 작용화된 알파 치환된 C4 카복실산의 유도체들 중 적어도 하나, 적어도 2개 또는 적어도 3개를 제조하는 방법들이 본원에 기재되고 있다:
화학식 I
Figure pct00007
상기 식에서,
각각의 R1은 (메틸보다 긴) 알킬, 하이드록시, 하이드록시알킬, 분지된 하이드록시알킬, 알콕시, 분지된 알킬, 아미노, 분지된 아미노 알킬, 페닐, 알킬 치환된 페닐, -S-, -SH, -SeH, -Se-, 하이드록시방향족, 아미노방향족, 폼일, 카바모일, 인돌릴, 구아니디닐, 및 n>1 경우의 카복실레이트, 및 보호기로부터 선택되고, R2는 개별적으로 H 및 보호기로부터 선택되고, n은 1 이상이고, R1은 n이 1보다 큰 경우 카복실레이트 또는 메틸로부터 선택될 수 있다.
이들 방법은, 아래에 각각 나타낸 바와 같이 화학식 II, III 또는 IV의 화합물 또는 이의 염을 포함하는 조성물과 금속 촉매를 접촉시키는 단계를 포함한다:
화학식 II, III 및 IV
Figure pct00008
상기 식에서,
각각의 R1은 (메틸보다 긴) 알킬, 하이드록시, 하이드록시알킬, 분지된 하이드록시알킬, 알콕시, 분지된 알킬, 아미노, 분지된 아미노 알킬, 페닐, 알킬 치환된 페닐, -S-, -SH, -SeH, -Se-, 하이드록시방향족, 아미노방향족, 폼일, 카바모일, 인돌릴, 구아니디닐, 및 n>1 경우의 카복실레이트, 및 보호기로부터 선택되고, R2, R3 및 R4는 개별적으로 H 및 보호기로부터 선택되고, n은 1 이상이다.
또 다른 실시양태들에서, 화학식 I의 화합물 또는 이의 염의 형성을 포함하는 방법들이 제공된다:
화학식 I
Figure pct00009
여기서, 각각의 R1은 (메틸보다 긴) 알킬, 하이드록시, 하이드록시알킬, 분지된 하이드록시알킬, 알콕시, 분지된 알킬, 아미노, 분지된 아미노 알킬, 페닐, 알킬 치환된 페닐, -S-, -SH, -SeH, -Se-, 하이드록시방향족, 아미노방향족, 폼일, 카바모일, 인돌릴, 구아니디닐, 및 카복실레이트, 및 이의 보호기들로부터 선택되고, n은 1 이상이다. 이들 방법은, 이러한 기질을 촉매와 접촉시킴으로써, 화학식 II, III 또는 IV로부터 선택되는 작용화된 알파 치환된 다이카복실산 또는 이의 염들 또는 에스테르들로부터 베타 카복실레이트의 선택적 탈카복실화를 포함한다.
도 9에서 제시된 그리고 실시예 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 14에서 기재된 것과 같은 실시양태들에서, 하이드록시알킬 알파 치환된 아크릴산, 또는 이의 염, 에스테르 또는 락톤을 제조하는 방법들이 교시되며, 상기 방법은 하이드록시알킬 알파 치환된 C4 다이카복실산, 또는 이의 염, 에스테르 또는 락톤을 금속 촉매와 접촉시키는 단계를 포함한다.
또 다른 특정 실시양태들에서, 화학식 I을 갖는 화합물 또는 이의 염을 제조하기 위한 방법들이 제공되며, 이들 방법은 시트르산, 호모시트르산, 아이소프로필 말산, 또는 이의 염, 에스테르 또는 락톤을 포함하는 조성물과 금속 촉매를 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서 각각의 R1은 (메틸보다 긴) 알킬, 하이드록시, 하이드록시알킬, 분지된 하이드록시알킬, 알콕시, 분지된 알킬, 아미노, 분지된 아미노 알킬, 페닐, 알킬 치환된 페닐, -S-, -SH, -SeH, -Se-, 하이드록시방향족, 아미노방향족, 폼일, 카바모일, 인돌릴, 구아니디닐, 및 n>1인 경우의 카복실레이트, 및 이의 보호기들로부터 선택되고, R2는 개별적으로 H 및 보호기로부터 선택되고, n은 1 이상이다.
본원에서 기재된 금속 촉매들은 이종일 수 있다. 금속 촉매들은 Ni, Pd, Pt, Cu, Zn, Rh, Ru, Bi, Fe, Co, Os, Ir, V 및 이들 금속의 2개 이상의 혼합물을 포함할 수 있다. 특정 예들에서, 금속 촉매는 Cu, Pt 또는 이들의 조합들이다. 금속 촉매들은 지지될 수 있으며, 프로모터 또는 개질제와 함께 사용될 수 있다. 프로모터는 존재한다면 황을 포함할 수 있다.
본원에서 교시된 방법들에 기술되는 금속 촉매와 기질을 접촉시키는 단계는, 기질이 원하는 생성물로 변환될 수 있게 허용하는 임의의 온도에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 접촉 단계는 적어도 약 100 ℃의 온도에서 또는 약 100 ℃ 내지 약 250 ℃의 온도에서, 또는 약 150 ℃ 내지 약 200 ℃의 온도에서 수행될 수 있다. 몇몇 경우들에서, 촉매는 기질 또는 기질들과 접촉하기 전에 활성화된다. 활성화는 촉매를 수소 기체로 처리하는 것을 포함할 수 있으며, 이는 약 100 ℃ 내지 약 200 ℃와 같은 상승된 온도들에서의 활성화를 포함할 수 있다. 다른 실시양태들에서, 금속 촉매에는 수소가 실질적으로 없다.
일 실시양태에서, 본 출원은, 하이드록시메틸 말로닐-CoA; 및 CoA 트랜스퍼라제(도 16, A열), CoA 카복실라제(도 16, B열), CoA 트랜스퍼라제(도 16, C열), 리덕타제(도 16, D열), 디하이드로게나제(도 16, D열), 3HP CoA-디하이드라타제(도 16, E열), CoA 트랜스퍼라제(도 16, F열), 카복실라제(도 16, G열), CoA 트랜스퍼라제(도 16, H열), 옥시-리덕타제(도 16, I열), 리덕타제(도 16, J열), 디하이드라타제(도 16, K열) 및 CoA 트랜스퍼라제(도 16, L열)로부터 선택된 효소를 인코딩하는 재조합 핵산 서열을 포함하는 재조합 미생물에 관한 것이다. 예를 들어, 재조합 핵산 서열은 CoA 트랜스퍼라제, CoA 카복실라제, CoA 트랜스퍼라제, 리덕타제, 디하이드로게나제, 3HP CoA-디하이드라타제, CoA 트랜스퍼라제, 카복실라제, CoA 트랜스퍼라제, 옥시-리덕타제, 리덕타제 및 CoA 트랜스퍼라제로부터 선택된 효소를 인코딩한다. 대안적으로, 재조합 핵산 서열은 CoA 트랜스퍼라제, CoA 카복실라제, CoA 트랜스퍼라제, 리덕타제, 디하이드로게나제, 카복실라제, CoA 트랜스퍼라제, 옥시-리덕타제 및 리덕타제로부터 선택된 효소를 인코딩한다.
다른 실시양태에서, 출원은, 알파-치환된 3-하이드록시프로피온산; 및 CoA 트랜스퍼라제, CoA 카복실라제, CoA 트랜스퍼라제, 리덕타제, 디하이드로게나제, 카복실라제, CoA 트랜스퍼라제, 옥시-리덕타제 및 리덕타제로부터 선택된 효소를 인코딩하는 재조합 핵산 서열을 포함하는 재조합 미생물에 관한 것이다. 또한 출원은, 알파-치환된 말로닐-CoA; 및 CoA 트랜스퍼라제, CoA 카복실라제, CoA 트랜스퍼라제, 리덕타제, 디하이드로게나제, 카복실라제, CoA 트랜스퍼라제, 옥시-리덕타제 및 리덕타제로부터 선택된 효소를 인코딩하는 재조합 핵산 서열을 포함하는 재조합 미생물에 관한 것이다. 또한 출원은, 알파-치환 말로닉 세미알데하이드; 및 CoA 트랜스퍼라제, CoA 카복실라제, CoA 트랜스퍼라제, 리덕타제, 디하이드로게나제, 카복실라제, CoA 트랜스퍼라제, 옥시-리덕타제 및 리덕타제로부터 선택된 효소를 인코딩하는 재조합 핵산 서열을 포함하는 재조합 미생물에 관한 것이다.
일 실시양태에서, 미생물은 예컨대 대장균(Escherichia coli)(이 콜라이(E. coli)), 엔테로박터(Enterobacter), 아조토박터(Azotobacter), 에르위니아(Erwinia), 바실루스(Bacillus), 슈도모나스(Pseudomonas), 클렙시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 살모넬라(Salmonella), 세라티아(Serratia), 쉬겔라(Shigella), 리조비아(Rhizobia), 비트레오실라(Vitreoscilla) 및 파라코쿠스(Paracoccus)로부터 선택된 원핵생물이다. 다른 실시양태에서, 미생물은 예컨대 칸디다(Candida), 피치아(Pichia), 사카로미세스(Saccharomyces), 쉬조사카로미세스(Schizosaccharomyces), 지고사카로미세스(Zygosaccharomyces), 클루이베로미세스(Kluyveromyces), 데바리오미세스(Debaryomyces), 피치아(Pichia), 이사트첸키아(Issatchenkia), 야로위아(Yarrowia) 및 한센눌라(Hansenula)로부터 선택된 진핵생물이다. 특정 호스트 효모 세포의 예들로는 씨 소노렌시스(C. sonorensis), 케이 마륵시아누스(K. marxianus), 케이 테르모톨레란스(K. thermotolerans), 씨 메타네소르보사(C. methanesorbosa), 사카로미세스 불데리(Saccharomyces bulderi)(에스 불데리(S. bulderi)), 아이 오리엔탈리스(I. orientalis), 씨 람비카(C. lambica), 씨 소르복실로사(C. sorboxylosa), 씨 젬플리니나(C. zemplinina), 씨 게오차레스(C. geochares), 피 멤브라니파시엔스(P. membranifaciens), 지 콤부차엔시스(Z. kombuchaensis), 씨 소르보시보란스(C. sorbosivorans), 씨 반데르왈티이(C. vanderwaltii), 씨 소르보필라(C. sorbophila), 지 비스포루스(Z. bisporus), 지 렌투스(Z. lentus), 사카로미세스 바이야누스(Saccharomyces bayanus)(에스 바이야누스(S. bayanus)), 디 카스텔리이(D. castellii), 씨 보이디니이(C, boidinii), 씨 에트첼시이(C. etchellsii), 케이 락티스(K. lactis), 피 자디니이(P. jadinii), 피 아노말라(P. anomala), 사카로미세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae)(에스 세레비시아에(S. cerevisiae)), 피치아 갈레이포르미스(Pichia galeiformis), 피치아 종(Pichia sp.) YB-4149(NRRL 명칭), 칸디다 에찬톨리카(Candida ethanolica), 피 데세르티콜라(P. deserticola), 피 멤브라니파시엔스(P. membranifaciens), 피 페르멘탄스(P. fermentans) 및 사카로미콥시스 크라타에겐시스(Saccharomycopsis crataegensis)(에스 크라타에겐시스(S. crataegensis))가 포함된다.
다른 실시양태에서, 출원은 또한, 상기 실시양태들 중 임의의 하나에서 정의된 재조합 미생물을 탄수화물의 존재 하에서 배양하는 단계; 및 알파-치환된 3-하이드록시프로피온산 또는 이의 에스테르 또는 염을 분리하는 단계를 포함하는, 하기 식의 알파-치환된 3-하이드록시프로피온산 또는 이의 염을 제조하는 방법에 관한 것이다:
Figure pct00010
상기 식에서,
각각의 R1은 (메틸보다 긴) 알킬, 하이드록시, 하이드록시알킬, 분지된 하이드록시알킬, 알콕시, 분지된 알킬, 아미노, 분지된 아미노 알킬, 페닐, 알킬 치환된 페닐, -S-, -SH, , -SeH, -Se-, 하이드록시방향족, 아미노방향족, 폼일, 카바모일, 인돌릴, 구아니디닐, 및 n>1 경우의 카복실레이트로부터 선택되고, n은 1 이상이다.
다른 실시양태에서, 출원은 또한, 하기 식의 알파-치환된 아크릴산 또는 이의 염을 제조하는 방법으로서, 알파-치환된 아크릴산을 제조하기 위해 알파 치환된 3-하이드록시프로피온산을 탈수하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다:
Figure pct00011
상기 식에서,
각각의 R1은 (메틸보다 긴) 알킬, 하이드록시, 하이드록시알킬, 분지된 하이드록시알킬, 알콕시, 분지된 알킬, 아미노, 분지된 아미노 알킬, 페닐, 알킬 치환된 페닐, -S-, -SH, , -SeH, -Se-, 하이드록시방향족, 아미노방향족, 폼일, 카바모일, 인돌릴, 구아니디닐, 및 n>1 경우의 카복실레이트로부터 선택되고, n은 1 이상이다.
예를 들어, 방법은 상기 실시양태에서 정의된 방법에 의해 알파-치환된 3-하이드록시프로피온산을 생성하는 단계를 추가로 포함한다.
다른 실시양태에서, 출원은 하기 식의 화합물 또는 이의 염: 또는
Figure pct00012
상기 식에서,
각각의 R1은 (메틸보다 긴) 알킬, 하이드록시, 하이드록시알킬, 분지된 하이드록시알킬, 알콕시, 분지된 알킬, 아미노, 분지된 아미노 알킬, 페닐, 알킬 치환된 페닐, -S-, -SH, , -SeH, -Se-, 하이드록시방향족, 아미노방향족, 폼일, 카바모일, 인돌릴, 구아니디닐, 및 n>1 경우의 카복실레이트로부터 선택되고, n은 1 이상이다.
하기 식의 화합물 또는 이의 염에 관한 것이다:
Figure pct00013
상기 식에서,
각각의 R1은 (메틸보다 긴) 알킬, 하이드록시, 하이드록시알킬, 분지된 하이드록시알킬, 알콕시, 분지된 알킬, 아미노, 분지된 아미노 알킬, 페닐, 알킬 치환된 페닐, -S-, -SH, , -SeH, -Se-, 하이드록시방향족, 아미노방향족, 폼일, 카바모일, 인돌릴, 구아니디닐, 및 n>1 경우의 카복실레이트로부터 선택되고, n은 1 이상, 예컨대 1 내지 6이다.
일 실시양태에서, R1은 하이드록시이다. 다른 실시양태에서, n은 1 또는 2이다. 예를 들어, R1은 하이드록시이고, n은 1이거나, 또는 R1은 하이드록시이고, n은 2이다.
당해 분야의 통상의 기술자는, 조성물들은 또한 본원에 제공되며, 이들 조성물들은 하나 초과의 화합물, 예컨대 작용화된 알파 치환된 아크릴산, 또는 이의 염, 에스테르 또는 락톤, 및 알파-(하이드록시메틸) 말산, 알파-(2-하이드록시프로필) 말산, 알파-(1-하이드록시에틸) 말산 및 알파-(2-하이드록시에틸) 말산 또는 이의 염들 또는 에스테르들로부터 선택된 하나 이상의 화합물을 포함한다는 것을 이해할 것이다. 본원에서 기재된 다른 조성물들은 작용화된 알파 치환된 아크릴산의 조합들, 및 작용화된 알파 치환된 C4 카복실산들의 하나 이상의 유도체들을 포함한다.
더욱 구체적으로, 본 발명은 광학 물질들, 도료, 반응성 희석제들, 계면활성제를 위한 출발물질들, 약제/농약의 제조를 위한 중간체들, 수지들을 위한 출발물질들, 중합체에서 메틸 아크릴레이트를 위한 공단량체 등과 같이 다양한 용도들에 유용한 유기 화합물질들을 제조하는 방법, 및 이에 위해 얻어진 다른-치환된 아크릴레이트 에스테르들에 관한 것이다.
본 발명의 이들 및 다른 양태들은 도면들 및 실시예들을 포함하는 다음의 상세한 설명에 비추어 명백해질 것이다.
도 1은, 보호기(R2)를 갖거나 또는 갖지 않는, 일 실시양태에 따른 작용화된(R1) 알파 치환된 아크릴산의 일반 구조를 나타낸다.
도 2(a) 내지 2(d)는 (중간체들로서도 지칭되는) 작용화된 알파 치환된 유기산들의 구조를 나타낸다. 도 2(a)는, 보호기(들)(R2, R3, 및/또는 R4)를 갖거나 또는 갖지 않는, 작용화된(n개의 탄소(들)를 갖거나 또는 갖지 않는 R1) 알파 치환된 말산의 구조를 나타내고; 도 2(b)는, 보호기(들)(R2 및/또는 R3)를 갖거나 또는 갖지 않는, 작용화된(n개의 탄소(들)를 갖거나 또는 갖지 않는 R1) 알파 치환된 말레산의 구조를 나타내고; 도 2(c)는, 보호기(들)(R2 및/또는 R3)를 갖거나 또는 갖지 않는, 작용화된(n개의 탄소(들)를 갖거나 또는 갖지 않는 R1) 알파 치환된 푸마르산의 구조를 나타내고; 도 2(d)는, 보호기(들)(R2 및/또는 R3)를 갖거나 또는 갖지 않는, 작용화된 알파 치환된 3-하이드록시프로피온산의 구조를 나타낸다. 도 2(a) 내지 2(d)에서 제시된 R 기들은 상세한 설명에 추가로 기재되어 있다.
도 3은, 알파 치환된 아크릴산으로 화학적으로 변환될 수 있는, 작용화된 알파 치환된 다이카복실산들(작용화된 중간체들)을 제조하기에 유용한 경로들을 나타낸다.
도 4는, 작용화된 알파 치환된 다이카복실산들 및 작용화된 알파 치환된 3-하이드록시프로피온산들 및 이의 염들 및 에스테르들을 생성하도록 조작되는, 원핵 및 진핵 세포들을 포함하는, 재조합 세포들에 포함될 수 있는 예시적인 효소들, 예컨대 도 3에서 예시된 경로에서 사용될 수 있는 효소들을 제공하는 표를 나타낸다.
도 5는 알파 치환된 3-하이드록시프로피온산을 제조하기에 유용한 경로들을 나타낸다. 이러한 작용화된 알파 치환된 3-하이드록시프로피온산은 다른 것들 중에서 아크릴레이트로의 화학적 변환을 위한 기질로서 사용될 수 있다.
도 6은, 예를 들어, 도 5에서 예시되지만, 작용화된 알파 치환된 3-하이드록시프로피온산을 생성하도록 조작되는, 원핵 및 진핵 세포들을 포함하는, 재조합 세포에 포함될 수 있는 예시적인 효소들을 열거하는 표를 제시한다. 일부 경우들에서, 작용화된 알파 치환된 3-하이드록시프로피온산은 알파 치환된 아크릴산으로 화학적으로 변환될 수 있다.
도 7은, 작용화된 알파 치환된 다이카복실산, 작용화된 (R1) 알파 치환된 3-하이드록시프로피온산에 포함되도록 조작될 수 있으며 따라서 작용화된 알파 치환된 아크릴레이트들에 포함될 수 있는 잠재적인 작용기들의 다양성을 나타낸다. 당해 분야의 통상의 기술자 중 하나에게는, 도 3 및 5에서 제시된 경로들에서 아미노산의 사용으로부터 초래되는 임의의 아크릴레이트는, 메틸렌기가 초기 아미노산 잔기에서의 아미노산과 동일한 위치에 존재하는 아크릴레이트일 것을 이해할 것이다. 하나 이상의 스페이서 탄소들을 포함하도록 설계된 경로들에서, 스페이서 탄소들은 메틸렌기와 원래의 아미노산 측쇄 사이에 삽입될 것이다.
도 8은 상세한 설명에서 다양한 화합물들을 묘사하는 데 사용되는 명명법을 제공하는 표를 제시한다. 당해 분야의 통상의 기술자는, 단일 화합물이 IUPAC 명칭으로부터 통상 명칭까지의 다양한 명칭들에 의해 식별될 수 있는 것으로 이해할 것이다.
도 9는 하이드록시메틸 치환된 C4 다이카복실산 및 하이드록시에틸 치환된 C4 다이카복실산을 제조하기 위한 예시적인 경로를 나타낸다. 이들 생성물은 하이드록시알킬 치환된 아크릴산들(예를 들어, HMA 및 HEA)로 화학적 변환되며, 다시 툴리팔린으로 효소적으로 또는 화학적으로 변환될 수 있다. 또한, 실시예 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 14을 참조한다.
도 10은 메틸-2-메틸렌 4 뷰티로락톤(MeMBL)을 제조하기 위한 예시적인 경로들을 나타낸다. 도 10에서 식별된 특정 효소들은 실시예 8 및 15에서 추가로 묘사된다. 특정 효소 단계들을 식별하는 데 사용되는 문자는 도 4의 표에서 식별된 효소들에 상응한다.
도 11는 작용화된 알파 치환된 아크릴산들 및 작용화된 중간체들을 제조하는 생물학적 경로들을 완전하게 제시한다. 이들 완전히 생물학적 경로는 "I"로 지정된 촉매 단계들의 포함에 의해 식별될 수 있다. 작용화된 알파 치환된 아크릴산에 대한 완전한 생물학적 경로의 포함은 또한 순환된 생성물 및 에스터들에 대한 완전한 생물학적 경로들을 허용한다.
도 12는 도 4의 표와 실질적으로 유사한 표를 제시하지만, 도 12의 표는 도 11에서 제시된 완전한 생물학적 경로들에 유용한 특정 효소들을 포함한다.
도 13은, 알파 치환된 3HP 중간체를 사용하는, 알파 치환된 아크릴산들에 대한 완전한 생물학적 경로들을 제시한다. 이 도면은 도 5에서 제시된 것과 유사하되, 이것은 생성물에 대한 완전한 생물학적 경로를 제공한다.
도 14는, 도 13에서 묘사되는 바와 같이 알파 치환된 3HP 중간체로부터 작용화된 알파 치환된 아크릴산들을 생성하는 재조합 미생물들을 제조하는 데 사용될 수 있는 특정 효소들을 포함하는 표를 제시한다.
도 15는, 알파-치환된 말로닐 CoA 경로를 통해 알파 하이드록시메틸 아크릴산 또는 이의 중간체를 제조하는 완전한 또는 부분적인 생물학적 경로를 제시한다.
도 16은, 도 15 또는 도 19에서 예시되는 경로들을 사용하여, 3HP로부터 작용화된 알파 치환된 아크릴산들을 생성하는 재조합 미생물들을 제조하는 데 사용될 수 있는 특정 효소들을 포함하는 표를 제시한다.
도 17은, 이타콘산 중간체를 사용하는, 알파 하이드록시에틸 아크릴산에 대한 완전한 생물학적 경로를 제시한다. 알파 하이드록시에틸 아크릴산은, 도 18, C열의 표에서 기재된 활성을 갖는 효소에 의해, 툴리팔린 A의 락톤 형태로 변환될 수 있다.
도 18은, 예컨대 도 17에서 예시된 경로를 통해, 이타콘산으로부터 알파 하이드록시에틸 아크릴산 및/또는 툴리팔린 A를 생성하는 재조합 미생물을 제조하는 데 사용될 수 있는 특정 효소들을 포함하는 표를 제시한다.
도 19는, 도 15에서 제시된 경로와 유사하게, 알파 치환된 아크릴산 또는 이의 중간체를 생성하는 완전한 또는 부분적인 생물학적 경로를 제시한다.
도 20은 실시예 2에서 기재된 실험들로부터의 신타제 활성 결과들을 제시한다: (a) 빈(empty) 벡터를 함유하는 세포들과 비교되는, 기질로서 하이드록시피루베이트를 사용하는 신타제 유전자를 포함하는 다양한 후보 세포들의 신타제 활성들; (b) 하이드록시피루베이트를 사용하는 돌연변이 신타제 활성들 및 야생형의 비교 결과들.
도 21은, (a) pH 3, pH 5 및 pH 7에서의 유 메이디스(U. maydis); 및 (b) pH 3에서의 아스페르길루스 테레우스(Aspergillus terreus)에서의 하이드록시파라콘산 생성을 제시한다(또한, 실시예 4 참조).
도 22는, 이타타르타르산(ITT)을 갖는 디하이드라타제 후보들의 활성을 나타내며, 여기서 각 군에서, 오른쪽 바아는 "기질 없음"을 나타내고, 왼쪽 바아는 ITT를 나타낸다: (a) 디하이드라타제 후보물들을 발현하는 세포들에서의 기질이 없는 대조군과 비교되는, ITT 탈수된 생성물의 수준들(30 ℃에서 밤새도록 존재하는 이타타르타르산(ITT)의 유무 하에서 항온처리된 용해물, HPLC에 의해 분석된 샘플들); 및 (b) 탈수된 ITT 생성물을 함유하는 용해물 및 표준 ITT의 NMR 결과(최상부 2 줄), 및 ITT의 유사체 및 이들의 탈수된 생성물의 NMR 결과들, 시트라말산 -> 시트라콘산, 시트르산 -> 시스-아코니트산, 말산 -> 말레산, 호모시트르산 -> 호모아코니트산 - 최상부 바아는 탈수 생성물들의 특징적인 피크의 영역을 지적함(실시예 5 참조).
도 23은, acnA 또는 acnB가 결실되거나, 빈 벡터(ptrc)를 발현하거나, 또는 내인성 이 콜라이 디하이드라타제들을 발현하는 플라스미드, acnA 또는 acnB를 갖는 이 콜라이 세포들에서 기질이 없는 대조군과 비교되는, 디하이드라타제 생성물의 수준들을 제시한다(30 ℃에서 밤새도록 이타타르타르산(ITT)의 유무 하에서 항온처리된 용해물, HPLC에 의해 분석된 샘플들).
도 24는 Pt/Al2O3에 의해 촉매된 소듐 호모시트레이트에 의해 생성된 결과들의 GC/MS 크로마토그램을 제시한다(또한 실시예 12 참조).
도 25(a) 및 (b)는 도 24의 크로마토그램에서 6.68 분의 체류 시간을 갖는 2-메틸글루타르산 피크의 질량 스펙트럼을 제시한다.
도 26은 도 24의 크로마토그램에서 9.612 분의 체류 시간을 갖는 1,2,4-뷰테인 카복실산 피크의 질량 스펙트럼을 제시한다.
도 27은, (a) Cu계 촉매 및 소듐 호모시트레이트에 의해 촉매된 반응으로부터 실시예 12로부터의 2-메틸렌글루타르산의 GC-MS 크로마토그램; (b) 및 (c) Cu계 촉매 및 소듐 호모시트레이트로 얻어진 2-메틸렌 글루타르산의 질량 스펙트럼을 나타낸다.
도 28은, H2 하에서 2-아이소프로필말산과 Cu계 촉매의 반응으로부터 실시예 13에서 얻어진 결과들을 제시하며(반응 조건들: 180 ℃, 금속 Cu(50 중량%), 16 h, 450 psi H2, 기질(0.121 밀리몰), H2O), 이는 (a)은 GC/MS 크로마토그램; 및 (b) 및 (c) 3.901 분의 체류 시간으로 뷰타노산 2,3-다이메틸, 메틸 에스테르의 질량 스펙트럼을 나타낸다.
도 29는, H2O 하에서 2-아이소프로필말산과 Cu계 촉매의 반응으로부터 실시예 13에서 얻어진 결과들을 제시하며(반응 조건들: 2-아이소프로필말산(0.12 밀리몰), Cu #2 촉매(CU-0860, 산화물로서 공급, BASF); 180 ℃, 16 h, H2O(1 mL), N2(450 psi)), 이는 (a)은 반응 생성물의 GC/MS 크로마토그램; (b) 2-아이소프로필아크릴산(메틸 에스테르 유도체)의 GC/MS 크로마토그램; 및 (c) ((b)에서) 3.967 분의 체류 시간을 갖는 2-아이소프로필아크릴산(메틸 에스테르 유도체)의 질량 스펙트럼을 나타낸다.
도 30은 (a) GC-MS 크로마토그램 및 (b) 7.329 분의 체류 시간을 갖는 2-아이소프로필말산(메틸 에스테르 유도체)의 질량 스펙트럼을 제시한다(실시예 13 참조).
도 31은 (a) GC-MS 크로마토그램 및 (b) 4-메틸-2-펜테노산(유도체화 후 진짜(authentic) 샘플)의 질량 스펙트럼을 제시한다(실시예 13 참조).
도 32는, (a) 및 (b) 메틸 에스테르 유도체화 후 반응 혼합물로부터의 4-메틸-2-펜타노산의 질량 스펙트럼; 및 (c) 피크 6.975 분의 체류 시간을 갖는 2-(1-메틸에틸)-2-뷰텐다이오산 메틸 에스테르 유도체의 질량 스펙트럼을 제시한다(실시예 13 참조).
도 33(a)는 3-하이드록시메틸-3-하이드록시프로피온산(HM3HP)에 대한 잠재적 호스트 생명체의 비교 톨러런스(tolerance) 데이터를 제시하며, 여기서 Km = 케이 마륵시아누스(K. marxianus), Sc = 에스 세레비시아에(S. cerevisiae), Ec = 이 콜라이드(E. coli)(실시예 17). 도 33(b)는 실시예 21로부터 PCC 피루베이트 축적 커플링된 분석을 사용하여 얻어진 결과들을 제시한다.
상세한 설명
정의
하기 실시예들에서 완충액들, 용액들 및 배지들에 대한 분자 생물학 절차들 및 조치들에 대한 일반적인 방법들은 J. Sambrook, 및 D.W. Russell의 문헌 [분자 클로닝(Molecular Cloning): A Laboratorv Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001]에 기재되어 있다. 열거하면, 개별 제조업자들로부터의 지시사항들은 일부 절차들에 사용되었다. 달리 특정화되지 않는 한, 제한 효소들은 New England Biolabs(Ipswich, MA)에서 구입하고, 제조업자에 의해 제안된 대로 적절한 완충액들에 사용되었다. 달리 특정화되지 않는 한, 모든 화학물질들은 Sigma Aldrich (St. Louis, MO)에서 구입하였다.
이 출원의 목적들로 인해, 대사 경로와 관련하여 본원에서 사용된 바와 같이, "네이티브 (native)"는 현존하며 야생형 호스트 균주에서 활성인 대사 경로를 지칭한다. 코딩 구역들, 유전자들, 프로모터들 및 터미네이터들과 같은 유전 물질은, 상기 유전 물질이 야생형 호스트 세포의 게놈에 존재하는 유전 구성요소와 동일한 서열을 갖는 경우(기능에 영향을 주지 않는 개체-개체 돌연변이와는 구별됨), 이 출원의 목적을 위해 "네이티브"이다(즉, 외인성 유전 구성요소는 내인성 유전 구성요소와 동일하다).
이 설명의 목적을 위해, 코딩 구역들, 유전자들, 프로모터들 및 터미네이터들과 같은 유전 물질은, 이것이 (i) 세포에 대해 네이티브이고, (ii) 유전 물질이 야생형 세포에서 존재하는 것과 동일한 위치에서 존재하고, (iii) 이의 네이티브 프로모터 및 이의 네이티브 터미네이터의 규칙적인 제어 하에서 존재하고, 그리고 (iv) 직접적으로 또는 직접 선택 과정을 통해 변경되지 않는다면, 세포에 대해 "내인성(endogenous)"인 것이다.
이 출원의 목적을 위해, 코딩 서열, 유전자들, 프로모터들 및 터미네이터들과 같은 유전 물질은, 그들이 (i) 세포에 대해 비-네이티브이고/이거나, (ii) 세포에 대해 네이티브이며, 유전 물질이 야생형 세포에서 존재하는 것과 상이한 위치에서 존재하고/하거나, (iii) 비-네이티브 프로모터들 및/또는 비-네이티브 터미네이터의 규칙적인 제어 하에서 존재한다면, 세포에 대해 "외인성(exogenous)"인 것이다. 심지어 유전 물질이 야생형 호스트 균주에서 존재하는 것과 동일한 궤적(locus)에서 네이티브 유전 물질의 여분의 복사물들이 존재하고/하거나, (iv) 그들이 직접적으로 또는 직접 선택 과정을 통해 변경된다면, 이러한 여분의 복사물은 이 설명의 목적을 위해 "외인성"으로서 간주된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "제어 서열(control sequence)"은 인핸서(enhancer) 서열들, 터미네이터 서열들 및 프로모터들을 포함하였다. 본원에서 사용된 바와 같이, "프로모터( promotor )"는, 유전자의 전사의 개시를 제어하는 (일반적으로 약 1 내지 1500 염기쌍(bp), 바람직하게는 약 100 내지 1,000 bp, 특히 약 200 내지 1000 bp의 서열의) 유전자의 번역 개시 코돈에 대해 업스트림(즉, 5')에 위치하는 비-번역된 서열을 지칭한다. 프로모터들이 비-네이티브인 경우, 이들은 하나 이상의 네이티브 프로모터들과 동일하거나 또는 이것과 높은 수준의 서열 완전성(identity)(즉, 적어도 약 80 %, 적어도 약 85 %, 적어도 약 90 %, 적어도 약 95 %, 또는 적어도 약 99 %)을 공유할 수 있다. 다른 적합한 프로모터들 및 터미네이터들은 예컨대 W099/14335, WO00/71738, WO02/42471, WO03/102201, WO03/102152 및 WO03/049525에서 기재된 것들을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "터미네이터(terminator)"는, 유전자의 전사의 종결을 제어하는 (일반적으로 약 1 내지 1500 bp, 바람직하게는 약 100 내지 1000 bp, 특히 약 200 내지 500 bp의 서열의) 유전자의 번역 종결 코돈에 대해 다운스트림(즉, 3')에 위치하는 비-번역된 서열을 지칭한다. 본원에서 제공되는 효모 세포에서 하나 이상의 외인성 유전자들에 연결될 수 있는 터미네이터들의 예들로는, PDC1, XR, XDH, 트랜스알돌라제(transaldolase)(TAL), 트랜스케톨라제(transketolase)(TKL), 리보스 5-포스페이트 케톨-아이소머라제(RKI), CYB2 또는 아이소-2-시토크롬 c(CYC) 유전자들 또는 유전자들의 갈락토스 과에 대한 터미네이터(특히 GAL 10 터미네이터)뿐만 아니라, 후속되는 다양한 실시예들에서 기재된 것과 같은 임의의 것들을 포함하지만 이에 국한되지 않는다. 터미네이터들이 비-네이티브인 경우, 이들은 하나 이상의 네이티브 터미네이터들과 동일하거나 또는 이것과 높은 수준의 서열 완전성(즉, 적어도 약 80 %, 적어도 약 85 %, 적어도 약 90 %, 적어도 약 95 %, 또는 적어도 약 99 %)을 공유할 수 있다.
프로모터 또는 터미네이터는, 프로모터 또는 터미네이터가 경우에 따라 이의 전사 제어 기능을 수행하도록, 코딩 서열의 것과 비교되는 게놈에서의 이의 위치가 존재하는 경우, 코딩 서열에 대해 "작동 가능하게 연결된다(operatively linked)". 당해 분야에서의 통상의 기술자는, 또한 번역을 조절하는 RNA 서열을 생기게 하는 구역들을 DNA 서열이 포함할 수 있음을 이해할 것이다.
효소 활성들과 관련되는 "증가하는 또는 감소하는(increasing or decreasing)" 활성은, 야생형 균주에서 발견되는 효소 활성보다 큰 활성을 지칭하거나(증가하는 활성), 또는 야생형 균주에서 발견되는 효소 활성보다 적은 활성을 지칭한다(감소하는 활성 또는 다르게는 감쇠하는(attenuating) 것으로 지칭됨). 당해 분야에서의 통상의 기술자는, (i) 폴리펩타이드:폴리펩타이드 상호작용들, (ii) 폴리펩타이드:대사 상호작용들(피드백 억제), (iii) 폴리펩타이드/핵산 상호작용들을 제어함으로써, (iv) 아미노산 서열을 변형하여 효소 활성 및 (v) 핵산 상호작용들을 증가시킴으로써 달성될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
유전자와 관련하는 "결실(deletion) 또는 파괴(disruption)"는, 유전자의 전체 코딩 구역 중 하나가 삭제되거나(결실), 유전자의 코딩 구역, 이의 프로모터 및/또는 이의 터미네이터 구역이 (예컨대, 결실, 삽입 또는 돌연변이에 의해) 개질되어서 유전자가 활성 효소를 생성시키거나, 또는 심각하게 감소된(적어도 75 % 감소된, 바람직하게는 적어도 85 % 감소된, 더욱 바람직하게는 적어도 95 % 감소된) 활성을 생성하는 것을 의미한다. 유전자의 결실 또는 파괴는 예컨대 강제된 진화, 돌연변이 또는 유전 조작 방법들에 의해, 이어서 원하는 돌연변이체들을 식별하는 적절한 선택 또는 스크리닝하여 달성될 수 있다.
"과발현( overexpress )"은 증가된 양의 효소의 인공적 발현을 의미한다. 효소의 과발현은 하나 이상의 외인성 유전자(들)의 존재, 내인성 유전자의 발현을 증가시키는 유전 공학의 존재, 또는 다른 조건에 기인할 수 있다. 발명의 목적을 위해, 적어도 하나의 외인성 유전자를 함유하는 효모 세포는 이러한 외인성 유전자(들)에 의해 인코딩된 효소(들)를 과발현하는 것으로 간주된다.
"재조합 미생물(recombinant microorganism)"은, 전구(progenitor) 미생물에서 발견된 것과 동일하지 않은 서열을 포함하는, 인간의 개입에 의해 변형된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 진핵 또는 원핵 미생물이다. 당해 분야의 통상의 기술자는, 이러한 핵산 서열의 변경(alteration)들은 예컨대 돌연변이 및 선택, 변형(transformation), 메이팅(mating), 상동성 재조합 등을 포함하는 다양한 방법들을 통해 도입될 수 있음을 이해할 것이다. 당해 분야에 공지된 임의의 방법은 이러한 재조합 미생물을 생성하는 데 사용될 수 있다. 또한, 핵산 서열의 변경은 염색체 또는 염색체외(extrachromosomal)일 수 있다.
재조합 진핵 세포는 특정 유전자 개질들을 포함하는 효모 또는 진균 세포일 수 있다. 호스트 효모 또는 진균 세포는 야생형 균주로서 피루베이트로의 적어도 하나의 당을 네이티브하게 대사시킬 수 있는 것이다. 적합한 호스트 효모 세포들은 속 칸디다(Candida), 피치아(Pichia), 사카로미세스(Saccharomyces), 쉬조사카로미세스(Schizosaccharomyces), 지고사카로미세스(Zygosaccharomyces), 클루이베로미세스(Kluyveromyces), 데바리오미세스(Debaryomyces), 피치아(Pichia), 이사트첸키아(Issatchenkia), 야로위아(Yarrowia) 및 한센눌라(Hansenula)를 포함하지만 이에 국한되지 않는다. 특정 호스트 효모 세포의 예들은 씨 소노렌시스(C. sonorensis), 케이 마륵시아누스(K. marxianus), 케이 테르모톨레란스(K. thermotolerans), 씨 메타네소르보사(C. methanesorbosa), 사카로미세스 불데리(Saccharomyces bulderi)(에스 불데리(S. bulderi)), 아이 오리엔탈리스(I. orientalis), 씨 람비카(C. lambica), 씨 소르복실로사(C. sorboxylosa), 씨 젬플리니나(C. zemplinina), 씨 게오차레스(C. geochares), 피 멤브라니파시엔스(P. membranifaciens), 지 콤부차엔시스(Z. kombuchaensis), 씨 소르보시보란스(C. sorbosivorans), 씨 반데르왈티이(C. vanderwaltii), 씨 소르보필라(C. sorbophila), 지 비스포루스(Z. bisporus), 지 렌투스(Z. lentus), 사카로미세스 바이야누스(Saccharomyces bayanus)(에스 바이야누스(S. bayanus)), 디 카스텔리이(D. castellii), 씨 보이디니이(C, boidinii), 씨 에트첼시이(C. etchellsii), 케이 락티스(K. lactis), 피 자디니이(P. jadinii), 피 아노말라(P. anomala), 사카로미세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae)(에스 세레비시아에(S. cerevisiae)), 피치아 갈레이포르미스(Pichia galeiformis), 피치아 종(Pichia sp.) YB-4149(NRRL 명칭), 칸디다 에찬톨리카(Candida ethanolica), 피 데세르티콜라(P. deserticola), 피 멤브라니파시엔스(P. membranifaciens), 피 페르멘탄스(P. fermentans) 및 사카로미콥시스 크라타에겐시스(Saccharomycopsis crataegensis)(에스 크라타에겐시스(S. crataegensis))를 포함한다. 케이 마륵시아누스(K. marxianus) 및 씨 소노렌시스(C. sonorensis)의 적합한 균주들은 WO 00/71738 A2, WO 02/42471 A2, WO 03/049525 A2, WO 03/102152 A2 및 WO 03/102201 A2에서 기재된 것들을 포함한다. 아이 오리엔탈리스(I. orientalis)의 적합한 균주들은 ATCC 균주 32196 및 ATCC 균주 PTA-6648이다. 또한, 진균은 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger), 아스페르길루스 테레우스(Aspergillus terreus), 아스페르길루스 오리자에(Aspergillus oryzae), 우스틸라고 메이디스(Ustilago maydis), 우스틸라고 시노돈티스(Ustilago cynodontis), 또는 다른 진균을 포함할 수 있다.
발명의 몇몇 실시양태들에서, 호스트 세포는 야생형 균주로서 크랩트리 네거티브(Crabtree negative)이다. 크랩트리(Crabtree) 효과는, 높은 특정 성장률들에서(장기간 효과) 또는 고농도의 글루코스의 존재 하에서(단기간 효과) 배양되는 경우, 미생물에 의한 산소 소모의 억제로 인해 호기성 조건들 하에서 발효 대사의 발생으로서 정의된다. 크랩트리 네거티브 표현형은 이 효과를 나타내지 않으며, 따라서 고농도의 글루코스의 존재에서 또는 높은 성장률에서도 산소를 소모할 수 있다.
본원에서 기재된 호스트 세포의 게놈에 대한 개질들(삽입, 결실 및/또는 파괴)은 당해 분야에 공지된 방법들을 사용하여 수행될 수 있다. 외인성 유전자들은 예컨대 잘 알려진 전기천공(electroporation) 및 (염화칼슘 및/또는 리튬 아세테이트 방법들을 포함하는) 화학적 방법들을 사용하는 표적화된 또는 랜덤 방식으로 게놈에 혼입될 수 있다. 외인성 유전자가 표적화된 방식으로 혼입되는 실시양태들에서, 외인성 유전자의 혼입이 네이티브 유전자의 결실 또는 파괴와 커플링되도록, 특정 네이티브 유전자에 대한 궤적에 혼입될 수 있다. 대안적으로, 외인성 유전자는, 유전자에 상응하지 않는 네이티브 게놈의 일부분으로 혼입될 수 있다. 외인성 구조체로 효모 세포를 형질전환하는 방법들은, W099/14335, WO00/71738, WO02/42471, WO03/102201, WO03/102152, WO03/049525, WO2007/061590, WO 2009/065778 및 PCT/US2011/022612에 기재되어 있다. 외인성 유전자의 삽입은 일반적으로 하나 이상의 통합 구조체 또는 단편으로 세포를 형질전환함으로써 수행된다. 용어 "구조체(construct)" 및 "단편(fragment)"은 세포를 형질전환하는 데 사용되는 DNA 서열을 지칭하는 데 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 구조체 또는 단편은 예컨대 원형 플라스미드 또는 벡터, 원형 플라스미드 또는 벡터의 일부(예컨대, 제한 효소 분해 생성물), 선형화된 플라스미드 또는 벡터, 또는 주형으로서 플라스미드 또는 게놈 DNA를 사용하여 제조된 PCR 생성물일 수 있다. 통합 구조체는 삽입 부위 표적으로부터 2개의 클로닝된 표적 DNA 서열들을 사용하여 조립될 수 있다. 2개의 표적 DNA 서열들은 네이티브 호스트 게놈에서 인접하거나 또는 비-인접할 수 있다. 이러한 맥락에서, "비-인접하는(non-contiguous)"은, DNA 서열들이 네이티브 게놈에서 서로 바로 인접하지 않지만, 대신에 결실되는 구역에 의해 분리되는 것을 의미한다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "인접하는(contiguous)" 서열들은 네이티브 게놈에서 서로 직접적으로 인접한다(adjacent). 표적화된 통합이 표적 유전자의 결실 또는 파괴와 커플링될 경우, 통합 구조체는 또한 결실 구조체로서 기능한다. 이러한 통합/결실 구조체에서, 표적 서열들 중 하나는 표적 유전자 프로모터에 대한 구역 5', 프로모터 구역의 전부 또는 일부, 표적 유전자 코딩 서열의 전부 또는 일부, 또는 이의 일부 조합을 포함할 수 있다. 다른 표적 서열은 표적 유전자 터미네이터에 대한 구역 3', 터미네이터 구역의 전부 또는 일부, 및/또는 표적 유전자 코딩 서열의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다. 표적화된 통합이 네이티브 유전자의 결실 또는 파괴에 커플링되지 않는 경우, 표적 서열들은 개입 서열의 삽입이 네이티브 유전자 발현을 방해하지 않도록 선택된다. 통합 또는 결실 구조체는, 호스트 세포의 게놈에서 네이티브적으로 나타남에 따라, 2개의 표적 서열들이 서로에 대하여 동일한 방향으로 배향되도록 제조된다. 유전자 발현 카세트(cassette)는 외인성 유전자의 발현을 허용하는 2개의 표적 유전자 서열들 사이의 구조체로 클로닝된다. 유전자 발현 카세트는 외인성 유전자를 포함하며, 외인성 유전자에 작동 가능하게 연결된 프로모터들 또는 터미네이터들과 같은 하나 이상의 조절 서열들을 추가로 포함할 수 있다.
결실 구조체는 기능 선택 마커(marker) 카세트를 또한 포함할 수 있다는 것이 통상적으로 바람직하다. 단일 결실 구조체를 사용하는 경우, 마커 카세트는 표적 궤적으로부터 5' 서열의 벡터 다운스트림(즉, 3' 방향)에 그리고 표적 궤적으로부터 3' 서열의 업스트림(즉, 5' 방향)에 존재한다. 성공적인 형질전환체들은, 성공적으로 형질전환된 세포에 선택을 위한 기준을 제공하는 몇 가지 특성을 부여하는 선택 마커 카세트를 함유할 것이다.
세포는, 이것이 물질의 존재에서 생존 가능하게 잔존할 수 있는 경우, 화합물에 대해 "내성(resistant)"인 것으로 간주된다. 일부 경우들에서, 내성 세포는 화합물의 존재 하에서 성장하고 증식할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 작용화된 알파 치환된 C4 다이카복실산들을 생성하도록 조작되는 재조합 미생물과 같은 호스트 세포는, 이것이 작용화된 알파 치환된 C4 다이카복실산의 존재에서 생존 가능하게 잔존한다면, 작용화된 알파 치환된 C4 다이카복실산에 대해 내성이다. 예를 들어, 재조합 미생물은, 이것이 작용화된 알파 치환된 C4 다이카복실산의 적어도 1 %, 3 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 % 또는 10 %를 함유하는 배지의 존재에서 생존 가능한 잔존한다면, 작용화된 알파 치환된 C4 다이카복실산에 대해 내성이다. 화합물들에 대한 미생물의 내성을 결정하기 위한 시험 방법들은 당해 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 WO 2012/103261의 실시예 1A에서 기재된 시험 방법 및 하기 제공된 실시예 1이 사용될 수 있다.
유사하게는, 하나 이상의 작용화된 알파 치환된 아크릴산들을 생성하도록 조작되는 재조합 미생물과 같은 호스트 세포는, 이것이 작용화된 알파 치환된 아크릴산의 존재에서 생존 가능하게 잔존한다면, 작용화된 알파 치환된 아크릴산에 대해 내성이다. 예를 들어, 재조합 미생물은, 이것이 작용화된 알파 치환된 아크릴산의 적어도 1 %, 3 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 % 또는 10 %를 함유하는 배지의 존재에서 생존 가능한 잔존한다면, 작용화된 알파 치환된 아크릴산에 대해 내성이다. 화합물들에 대한 미생물의 내성을 결정하기 위한 시험 방법들은 당해 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 WO 2012/103261의 실시예 1A에서 기재된 시험 방법 및 하기 제공된 실시예 17이 사용될 수 있다.
"선택 마커 유전자(selection marker gene)"는 선택적 배양 배지에서 형질전환된 세포의 생존 및/또는 성장에 필요한 단백질을 인코딩할 수 있다. 전형적인 선택 마커 유전자들은, (a) 항생제들 또는 기타 독소들에 대해 내성을 부여하거나(예를 들어, 제오신(zeocin)(스트렙토알로테이추스 힌두스타누스 블레 블레오마이신(Streptoalloteichus hindustanus ble bleomycin) 내성 유전자), G418(Tn903의 카나마이신(kanamycin)-내성 유전자) 또는 하이그로마이신(hygromycin)(이 콜라이로부터의 아미노글리코사이드 항생제 내성 유전자), (b) 세포의 영양 요구성 결핍들을 보완하거나(예를 들어, 아미노산 류신 결핍(케이 마륵시아누스(K. marxianus) LEU 2 유전자) 또는 우라실 결핍{예를 들어, 케이 마륵시아누스(K. marxianus) 또는 에스 세레비시아에(S. cerevisiae)); (c) 단일 배지로부터 입수 불가능한 중요한 영양분을 세포가 합성하게 하거나, 또는 (d) 특정 탄소 소오스 상에서 성장하는 능력을 부여하는(예를 들어, 알파-갈락토시다제(멜리비아제) 효소를 인코딩하고 유일한 탄소 소오스으로서 멜리비오제 상에서 성장하는 능력을 부여하는 에스 세레비시아에(S. cerevisiae)로부터의 MEL5 유전자) 단백질을 인코딩한다. 바람직한 선택 마커들은 제오신 내성 유전자, G418 내성 유전자, MEL5 유전자, URA3 유전자 및 하이그로마이신 내성 유전자를 포함한다. 또 다른 바람직한 선택 마커는 L-락테이트:페리시토크롬 C 옥시리덕타제(CYB2) 유전자 카세트이며, 호스트 세포는 네이티브하게 이러한 유전자가 부족하거나, 또는 이의 네이티브 CYB2 유전자(들)가 먼저 결실 또는 파괴되어 있다.
선택 마커 카세트가 후속적인 상동성(homologous) 재조합 사건의 결과로서 자발적으로 결실될 수 있도록 구조체를 설계할 수 있다. 이것을 달성하는 편리한 방법은, 선택 마커 유전자 카세트가 직접 반복 서열들에 의해 플랭킹되도록(flank) 벡터를 설계하는 것이다. 직접 반복 서열들은 동일한 DNA 서열들이고, 호스트 세포에 대해 네이티브 또는 비-네이티브이고, 서로에 대하여 동일한 방향으로 구조체에 대해 배향된다. 직접 반복 서열들은 유리하게는 길이 약 50-1500 bp이다. 직접 반복 서열들은 아무것도 인코딩할 필요는 없다. 이 구조체는 상동성 재조합 사건을 발생시키도록 허용한다. 이 사건은 일부 낮은 빈도로 발생하며, 이로 인해 선택 마커 유전자의 결실 및 직접 반복 서열들 중 하나를 함유하는 세포들에서 생성된다. 일부 세포들에서 발생하는 자발적인 상동성 재조합이 허용하도록, 비-선택적 또는 선택적 배지 상에서 여러 라운드(round)에 대해 형질전환체을 성장시킬 필요가 있다. 선택 마커 유전자가 자발적으로 결실되는 세포들은, 선택 마커 유전자에 의해, 또는 선택 마크의 손실을 확인하는 PCR 또는 서던 분석(Southern Analysis) 방법들을 사용함으로써, 부여되는 선택 특성들의 이들 손실에 기초하여 선택 또는 스크리닝될 수 있다.
일부 실시양태들에서, 외인성 유전자는 단일 단편보다는 오히려 하나 이상의 통합 단편들로부터의 DNA를 사용하여 삽입될 수 있다. 이들 실시양태들에서, 하나의 통합 단편의 3' 말단은 다른 통합 단편의 5' 단부와 상동성의 구역을 함유한다. 단편들 중 하나는 표적 궤적에 대해 상동성의 제 1 구역을 함유하고, 다른 단편은 표적 궤적에 대해 상동성의 제 2 구역을 함유할 것이다. 삽입되는 유전자 카세트는 어느 단편에 존재할 수 있거나, 또는 단편들 중에서 각 단편의 3' 및 5' 말단에서 상동성의 구역으로 분리될 수 있으므로, 전체적으로는, 작용성 유전자 카세트는 크로스오버 사건(crossover event)에 따라 생성된다. 세포는 동시에 이들 단편으로 형질전환된다. 선택 마커는 단편들 중 어느 하나에 존재할 수 있거나, 또는 기재된 바와 같이 상동성 구역을 갖는 단편들 사이에서 분리될 수 있다. 다른 실시양태들에서, 3 개 이상의 구조체들로부터의 형질전환은 외인성 유전 물질을 통합하기 위해 유사한 방식으로 사용될 수 있다.
네이티브 유전자의 결실 및/또는 파괴는 형질전환 방법들에 의해, 돌연변이에 의해 및/또는 강제된 진화 방법들에 의해 수행될 수 있다. 돌연변이 방법들에서, 세포는 세포의 높은 치사율(60 내지 99.9 %, 바람직하게는 90 내지 99.9 %)을 달성하기에 충분한 조건들 하에서, 자외선 조사 또는 돌연변이 유발 물질에 노출된다. 그 다음, 생존하는 세포들은 도말되고, 결실된 또는 파괴된 대사 활성을 갖는 세포들에 대해 선택 또는 스크리닝된다. 원하는 네이티브 유전자(들)의 파괴 또는 결실은 PCR 또는 서던 분석 방법들을 통해 확인될 수 있다.
발명의 세포들은 중간체들, 작용화된 알파 치환된 C4 다이카복실산들, 및/또는 작용화된 알파 치환된 아크릴산들, 및 이의 상응하는 에스테르 또는 락톤을 자유 산 형태로 또는 염 형태로 (또는 둘다) 생성하기 위해 배양될 수 있다. 재조합 세포는 세포에 의해 발효될 수 있는 적어도 하나의 탄소 소오스을 포함하는 배지에서 배양된다. 예들로는, 12 탄소 당, 예컨대 수크로스, 헥소스 당, 예컨대 글루코스 또는 프럭토스, 글리칸, 전분, 또는 글루코스의 다른 중합체, 글루코스 올리고머, 예컨대 말토스, 말토트리오스 및 아이소말토트리오스, 파노스, 및 프럭토스 올리고머, 및 펜토스 올리고머, 예컨대 자일로스, 자일란, 자일로스의 다른 올리고머들, 또는 아라비노스가 포함되지만 이에 국한되지 않는다.
배지는 전형적으로, 탄소 소오스에 더하여, 질소의 소오스을 포함하는, 특정 세포에 의해 요구되는 영양분들(예컨대 아미노산, 단백질, 무기 질소 소오스, 예컨대 암모니아 또는 암모늄 염 등), 및 각종 비타민, 미네랄 등을 함유할 것이다. 일부 실시양태들에서, 발명의 세포들은 화학적으로 정의된 배지에서 배양될 수 있다.
다른 배양 조건들, 예컨대 온도, 세포 밀도, 기질(들)의 선택, 영양분들의 선택 등은 발명에 중요한 것으로 간주되지 않으며, 일반적으로 경제적인 방법을 제공하도록 선택된다. 상승된 온도들을 톨러런스할 수 있는 균주의 능력에 어느 정도 의존하지만, 각 성장 단계 및 생성 단계의 동안의 온도들은 배지의 동결 온도로부터 약 50 ℃까지일 수 있다. 바람직한 온도는 특히 제조 단계 동안 약 27 내지 45 ℃이다.
배양 도중, 통기 및 교반 조건들은 원하는 산소 흡수(uptake) 속도를 생성하기 위해 선택될 수 있다. 배양은 경로 요건들에 따라 호기적으로, 미세호기적으로(microaerobically) 또는 혐기적으로 수행될 수 있다. 일부 실시양태들에서, 배양 조건들은 약 2 내지 25 밀리몰/L/h, 바람직하게는 약 5 내지 20 밀리몰/L/h, 더욱 바람직하게는 8 내지 15 밀리몰/L/h의 산소 흡수 속도를 생성하도록 선택된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "산소 흡수 속도(Oxygen uptake rate)" 또는 "OUR"은 발효 동안 산소가 소모되는 부피 비율을 지칭한다. 유입구 및 유출구의 산소 농도는 예컨대 질량 분광계들에 의한 배기 기체 분석으로 측정될 수 있다. OUR은 문헌 [Bioreaction Engineering Principles 2nd Edition, 2003, Kluwer Academic/Plenum Publishers, p. 449, equation I]에서 기재된 직접 방법(Direct Method)을 사용하여 계산될 수 있다.
배양은, 탄소 소오스 상의 원하는 생성물의 수율이 예컨대 이론적 수율의 적어도 10 %, 적어도 20 %, 적어도 30 %, 적어도 40 %, 적어도 50 %, 적어도 60 %, 적어도 70 % 또는 70 % 초과될 때까지 계속될 수 있다. 생성물의 수율은 이론적 수율의 적어도 80 % 또는 적어도 90 %일 수 있다. 배양에서 생성된 생성물의 농도 또는 역가(titer)는 수율의 함수일 뿐만 아니라, 탄소 소오스의 출발 농도일 것이다. 특정 실시양태에서, 역가는 발효 도중 임의의 지점에서, 바람직하게는 발효의 말단에서 적어도 1, 적어도 3, 적어도 5, 적어도 10, 적어도 20, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 또는 50 g/L 초과에 도달할 수 있다.
용어 "변환(convert)"은 제 1 중간체를 제 2 중간체로 변화시키는 반응에서 화학적 수단 또는 폴리펩타이드들 중 하나의 사용을 지칭한다. 용어 "화학적 변환(chemical conversion)"은 폴리펩타이드들에 의해 활성적으로 촉진되지 않는 반응들을 지칭한다. 용어 "생물학적 변환(biological conversion)"은 폴리펩타이드들에 의해 활성적으로 촉진되는 반응들을 지칭한다. 변환들은 생체 내에서 또는 시험관 내에서 일어날 수 있다. 생물학적 변환들이 사용되는 경우, 폴리펩타이드 및/또는 세포들은 지지체 상에 예컨대 중합체 지지체에 대한 화학적 부착에 의해 고정화될 수 있다. 변환은 당해 분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 반응기를 사용하여 예컨대 회분식 또는 연속 반응기에서 달성될 수 있다.
또한, 제 1 폴리펩타이드를 기질과 접촉시키고, 제 1 생성물을 제조한 후, 제 1 생성물을 제 2 폴리펩타이드와 접촉시키고, 제 2 생성물을 생성하고, 그 다음, 생성된 제 2 생성물을 제 3 폴리펩타이드와 접촉시키고, 제 3 생성물 등을 생성하는 것을 포함하는 방법들이 제공된다. 경로에서 중간체를 다음 생성물 또는 다음 중간체로 변환시키는 데 사용된 폴리펩타이드는, 도 4(도 3, 9 및 10에서 지적된 변환들에 사용될 수 있는 효소를 묘사함) 및 도 6(도 5에서 지적된 변환들에 사용될 수 있는 효소를 묘사함) 및 도 12, 14, 16 및 18에서 묘사되고 있다.
용어 "염(salt)"은 화합물 및 하나 이상의 반대 이온 종(양이온들 및/또는 음이온들) 중 임의의 이온 형태를 포함한다. 염들은 또한 쯔비터이온성 화합물들을 포함한다(즉, 예를 들어, 하나 이상의 양이온성 및 음이온성 종을 함유하는 분자, 쯔비터이온성 아미노산들). 염에 존재하는 반대 이온들은 임의의 양이온성, 음이온성 또는 쯔비터이온성 종류를 포함할 수 있다. 대표적인 음이온들은 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 나이트레이트, 설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 포스페이트, 산 포스페이트, 퍼클로레이트, 클로레이트, 클로라이트, 하이포클로라이트, 퍼아이오데이트, 아이오데이트, 하이포아이오데이트, 카보네이트, 바이카보네이트, 아이소니코티네이트, 아세테이트, 트라이클로로아세테이트, 트라이플루오로아세테이트, 락테이트, 살리실레이트, 시트레이트, 타르트레이트, 판토테네이트, 바이타르트레이트, 아스코르베이트, 석시네이트, 말레에이트, 겐티시네이트, 푸마레이트, 글루코네이트, 글루카로네이트, 사카레이트, 포르메이트, 벤조에이트, 글루타메이트, 메테인설포네이트, 트라이플루오르메테인설포네이트, 에테인설포네이트, 벤젠설포네이트, p-톨루엔설포네이트, p-트라이플루오로메틸벤젠설포네이트, 하이드록사이드, 알루미네이트 및 보레이트들을 포함하지만 이에 국한되지 않는다. 예시적인 양이온들은 1가 알칼리 금속 양이온, 예컨대 리튬, 나트륨, 칼륨 및 세슘, 및 2가 알칼리토 금속, 예컨대 베릴륨, 마그네슘, 칼슘, 스트론튬 및 바륨을 포함하지만 이에 국한되지 않는다. 또한, 전이 금속 양이온들, 예컨대 금, 은, 구리 및 아연, 뿐만 아니라 비-금속 양이온들, 예컨대 암모늄염들이 포함된다. 당해 분야의 통상의 기술자는, 완전한 생물학적 경로들이 화합물들을 생성하는 데 사용되는 경우, 화합물이 화합물의 pKa 및 배지의 pH에 따라 실질적으로 산 형태로 또는 염 형태로 존재할 것이라고 이해할 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, "에스테르(ester)"는, 제한적인 예들로서, 상응하는 카복실 잔기에 대한 보호기의 첨가로부터 얻어지는, 메틸 에스테르, 에틸 에스테르, 아이소프로필 에스테르 및 에스테르를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "락톤( lactone )"은 본원에서 제공되는 화합물들에 대한 알코올 기와 카복실산 기의 축합으로부터 얻어진 사이클릭 에스테르 화합물들을 지칭한다. 비한정적인 예는 호모시트르산 또는 이의 염들의 축합으로부터 얻어지는 락톤이다(즉, 호모시트르산 락톤).
본원에 사용된 바와 같이, 볼드(bold) 및 대쉬(dashed) 결합들로 나타낸 하나 이상의 입체중심(stereocenter)들을 함유하는 화학 구조들(즉,
Figure pct00014
)은, 화학 구조에 존재하는 입체중심(들)의 절대 입체화학을 나타내는 것을 의미한다. 본원에 사용된 바와 같이, 단순한 선으로 기호화된 결합들은 입체-선호(stereo-preference)를 표시하지 않는다. 달리 반대로 지시되지 않는 한, 절대적 또는 상대적 입체화학이 표시되지 않고서 본원에서 예시된 하나 이상의 입체중심들을 포함하는 화학 구조들은, 화합물의 모든 가능한 입체이성질체 형태들(예를 들어, 부분입체 이성질체, 거울상 이성질체) 및 이의 혼합물들을 포함한다. 단일 볼드 또는 대쉬 선, 및 적어도 하나의 부가적인 단순 선을 갖는 구조체들은 모든 가능한 입체이성질체의 단일 거울상 이성질체 시리즈를 포함한다.
본원에서 기재된 바와 같이, 화합물들은 또한 중간체들 또는 최종 화합물들에서 발생하는 원자들의 모든 동위원소들을 포함할 수 있다. 동위원소들은 동일한 원자 번호를 갖지만 상이한 질량수를 갖는 원자들을 포함한다. 예를 들면, 수소의 동위원소들은 삼중수소(tritium) 및 중수소(deuterium)를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "화합물(compound)"은 표시된 구조체들의 모든 입체 이성질체, 기하 이성질체, 호변 이성질체 및 동위원소를 포함하는 것을 의미한다. 달리 언급하지 않는 한, 하나의 특정 호변 이성질체 형태로서 본원에서 명칭 또는 구조가 식별된 화합물들은 다른 호변 이성질체 형태들을 포함하는 것으로 의도된다. 모든 화합물들, 이의 염들, 에스테르들 및 락톤들은 물 및 용매들과 같은 물질들(예컨대, 수화물 및 용매화물)과 함께 확인될 수 있다.
일부 실시양태들에서, 본원에서 기재된 화합물들, 또는 이의 염들, 에스테르들 또는 락톤들은 실질적으로 격리된다. "실질적으로 격리된(substantially isolated)"은, 화합물이 형성되거나 검출된 환경으로부터 적어도 부분적으로 또는 실질적으로 그것이 분리되어 있음을 의미한다. 부분적인 분리는 예컨대 본 발명의 화합물이 풍부한 조성물을 포함할 수 있다. 실질적인 분리는 발명의 화합물들 또는 이의 염의 적어도 약 50 중량%, 적어도 약 60 중량%, 적어도 약 70 중량%, 적어도 약 80 중량%, 적어도 약 90 중량%, 적어도 약 95 중량%, 적어도 약 97 중량%, 또는 적어도 약 99 중량%를 함유하는 조성물을 포함할 수 있다. 화합물들 및 그들의 염들을 격리하는 방법들은 당해 분야에서 정례적이다(routine).
명확성을 위해, 별도의 실시양태들의 내용에서 기재된 개시내용의 특정 특징들은 또한 단일 실시양태에서 조합하여 제공될 수 있다고 이해된다. 반대로, 간결성을 위해, 단일 실시양태의 내용에서 기재된 발명의 다양한 특징들은 또한 별도로 또는 임의의 적합한 하위 조합으로 제공될 수 있다.
용어 "예를 들어(for example)" 및 "~같은 또는 예컨대(such as)", 이의 문법적 동등성, 및 문구 "제한없이 (and without limitation)"는, 명시적으로 달리 언급하지 않는 한, 뒷따라 수행하는 것으로 이해된다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약(about)"은 실험 오차에 의한 변동(variation)들을 고려하기 위한 것이다. 본원에 보고된 모든 측정들은, 명시적으로 달리 명시되지 않는 한, 용어가 명시적으로 사용 여부에 따라, 용어 "약(about)"에 의해 수식될 것으로 이해된다. 본원에 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥이 명확하게 달리 지시하지 않는 한 복수의 대상들을 포함한다.
I. 조작된 경로
본원에서 기재된 재조합 미생물들은 도 2에서 제시된 바와 같이 비-자연적인 양의 작용화된 알파 치환된 C4 다이카복실산들을 제조할 수 있게 하는 효소 활성들을 표시한다. 일부 경우들에서, 재조합 미생물은 하나 초과 유형의 알파 치환된 다이카복실산, 예컨대 도 2(a), 2(b) 및 2(c)에서 제시된 것들을 생성한다. 문구 "비-자연적인(non-natural)" 양은, 재조합 핵산 서열들을 도입하기 위한 시작 지점으로서 사용된 출발 호스트 세포와 비교하여, 본원에서 기재된 재조합 미생물들이 알파 치환된 C4 다이카복실산을 높은 농도로 생성한다는 사실을 지칭한다.
본원에서 기재된 재조합 미생물들은 이들이 비-자연적인 양의 작용화된 알파 치환된 아크릴산 및/또는 이의 염 및 임의의 상응하는 에스테르 또는 락톤을 제조할 수 있게 하는 효소 활성들을 표시한다. 일부 경우들에서, 재조합 미생물은 하나 초과의 유형을 생성한다. 문구 "비-자연적인" 양은, 재조합 핵산 서열들을 도입하기 위한 시작 지점으로서 사용된 출발 호스트 세포와 비교하여, 본원에서 기재된 재조합 미생물들이 알파 치환된 아크릴산을 높은 농도로 생성한다는 사실을 지칭한다.
용어 "작용화된 알파 치환된 C4 다이카복실산(functionalized alpha substituted C4 dicarboxylic acid)"은, 본원에서 사용되는 바와 같이, 알파 작용화된 다이카복실산에서 카복실산에 대해 알파인 탄소가 수소 이외의 원자들에 대해 적어도 4개의 결합들을 포함하는 사실을 지칭한다. 예를 들어, 도 2(a)를 참조하면, 작용화된 말산이 제시되고, 카복실산으로부터의 알파 탄소는 하기 결합들, -COOH, -CH2, -OR4 및 -[n]R1을 포함한다. 대조적으로, 비-작용화된 말산은 하기 결합들, -COOH, -CH2, -H 및 -OH를 포함하는 알파 탄소를 갖는다. 작용화된 기, -[n]R1은 (메틸보다 긴) 알킬, 하이드록시, 하이드록시알킬, 분지된 하이드록시알킬, 알콕시, 분지된 알킬, 아미노, 분지된 아미노 알킬, 페닐, 알킬 치환된 페닐, -S-, -SH,, -SeH, -Se-, 하이드록시방향족(hydroxyaromatic), 아미노방향족(aminoaromatic), 폼일, 카바모일, 인돌릴, 구아니디닐, 및 n>2 경우의 카복실레이트로부터 선택된 임의의 기, 및 도 7 및 8에서 제시된 것들을 포함하는 알파 탄소를 갖는다. 다른 예에서, 도 2(b) 및 도 2(c)를 참조하면, 알파 작용화된 말레산(시스) 및 알파 작용화된 말레산(트랜스)는 각각 제시되고, 카복실산으로부터의 알파 탄소는 하기 결합들, -COOH, =CH- 및 -[n]R1을 포함한다. 대조적으로, 비-작용화된 말레산 및 푸마르산은 하기 결합들, -COOH, =CH- 및 -H를 포함하는 알파 탄소를 갖는다. 작용화된 기, -[n]R1은 (메틸보다 긴) 알킬, 하이드록시, 하이드록시알킬, 분지된 하이드록시알킬, 알콕시, 분지된 알킬, 아미노, 분지된 아미노 알킬, 페닐, 알킬 치환된 페닐, -S-, -SH, -SeH, -Se-, 하이드록시방향족, 아미노방향족, 폼일, 카바모일, 인돌릴, 구아니디닐, 및 n>2 경우의 카복실레이트로부터 선택된 임의의 기, 및 도 7 및 8에서 제시된 것들을 포함하는 알파 탄소를 갖는다. 당해 분야의 통상의 기술자 중 하나는 유기산의 참조가 명백히 다르게 제시하지 않는 한 산 뿐만 아니라, 이의 염 또는 상응하는 에스테르 및 보호기를 포함하는 것으로 이해할 것이다. 예를 들어, 도 2(a), 2(b) 및 2(c)는 이들 가능성을 나타내기 위해 R2 및 R3을 사용한다. 또한, 당해 분야의 통상의 기술자 중 하나는, 하이드록실이 존재하는 경우, 알코올의 참조는 보호기를 갖는 알코올의 참조를 포함하는 것으로 이해할 것이다.
용어 "작용화된 알파 치환된 3-하이드록시프로피온산(functionalized alpha substituted 3-hydroxypropionic acid)(3HP)"은, 본원에 사용된 바와 같이, 작용화된 알파 치환된 3HP에서 카복실산에 대해 알파인 탄소가 수소 이외의 원자들에 대해 적어도 3개의 결합들을 포함하는 사실을 지칭한다. 예를 들어, 도 2(d)를 참조하면, 작용화된 알파 치환된 3HP가 제시되고, 카복실산으로부터의 알파 탄소는 하기 결합들, -COOH, -CH2OH, -H 및 -[n]R1을 포함한다. 대조적으로, 비-작용화된 3HP는 하기 결합들, -COOH, -CH2OH, -H 및 -H를 포함하는 알파 탄소를 갖는다. 작용화된 기, -[n]R1은 (메틸보다 긴) 알킬, 하이드록시, 하이드록시알킬, 분지된 하이드록시알킬, 알콕시, 분지된 알킬, 아미노, 분지된 아미노 알킬, 페닐, 알킬 치환된 페닐, -S-, -SH,, -SeH, -Se-, 하이드록시방향족, 아미노방향족, 폼일, 카바모일, 인돌릴, 구아니디닐, 및 n>2 경우의 카복실레이트로부터 선택된 임의의 기, 및 도 7 및 8에서 제시된 것이다. 앞서 진술된 바와 유사하게, 유기산의 참조가 명백히 다르게 제시하지 않는 한 산 뿐만 아니라, 이의 염 또는 상응하는 에스테르 및 보호기를 포함하는 것으로 이해할 것이다. 작용화된 알파 치환된 3HP의 경우, 제 3 탄소 상의 하이드록실 기의 참조는 또한 보호기가 존재하는 경우들을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
용어 "작용화된 알파-치환된 아크릴산(functionalized alpha-substituted acrylic acid)"은, 본원에 사용된 바와 같이, 작용화된 알파-치환된 아크릴산에서 카복실산에 대해 알파인 탄소가 수소 이외의 원자들에 대해 4개의 결합들을 포함하는 사실을 지칭한다. 예를 들어, 도 1을 참조하면, 작용화된 알파-치환된 아크릴산이 제시되고, 메틸렌 기로부터의 알파 탄소는 하기 결합들, -COOH, =CH2 및 -[n]R1을 포함한다. 대조적으로, 비-작용화된 3HP는 하기 결합들, -COOH, =CH2 및 -H를 포함하는 알파 탄소를 갖는다. 작용화된 기, -[n]R1은 (메틸보다 긴) 알킬, 하이드록시, 하이드록시알킬, 분지된 하이드록시알킬, 알콕시, 분지된 알킬, 아미노, 분지된 아미노 알킬, 페닐, 알킬 치환된 페닐, -S-, -SH, -SeH, -Se-, 하이드록시방향족, 아미노방향족, 폼일, 카바모일, 인돌릴, 구아니디닐, 및 n>2 경우의 카복실레이트로부터 선택된 임의의 기, 및 도 7 및 8에서 제시된 것이다. 앞서 진술된 바와 유사하게, 유기산의 참조가 명백히 다르게 제시하지 않는 한 산 뿐만 아니라, 이의 염 또는 상응하는 에스테르 및 보호기를 포함하는 것으로 이해할 것이다. 도 1로부터 명백한 바와 같이, R2는 보호기일 수 있으며, R1이 산성 잔기 또는 하이드록실을 포함하는 경우, R2는 염 또는 보호기를 추가로 포함할 수 있는 것으로 이해된다.
대사 조작(metabolic engineering)의 분야의 통상의 기술자는, 본원에 제공된 도면들이 동일한 작용화된 알파 치환된 아크릴레이트들, 다이카복실산들 및 이의 중간체들에 도달하는 데 사용될 수 있는 다수의 여러 경로들을 묘사하는 것을 이해할 것이다. 이러한 경로들은 예컨대 도 3 단계 A를 참조하여 내인성 효소의 활성에 의존하는 효소 단계들을 포함할 수 있고, 호스트 세포가 이 콜라이 세포이면, 초기 트랜스아미나제 단계는 내인성 이 콜라이 트랜스아미나제에 의존할 수 있다(GenBank 번호 CAA27279). 유사하게, 내인성 유전자의 활성은 호스트 세포에서 내인성 트랜스아미나제 활성을 증가 또는 감소시키는 재조합 기술을 통해 변경될 수 있다.
도 3, 5, 9 및 10은 작용화된 알파 치환된 다이카복실산들 및 작용화된 알파 치환된 3HP와 같은 중간체들 및 최종 생성물들을 제조하는 경로들을 제시한다. 하나의 중간체로부터 다른 중간체까지의 변환, 예컨대 아미노산으로부터 알파 케토산, 알파 케토산으로부터 알파 치환된 말산, 알파 치환된 말산으로부터 알파 치환된 말레산, 알파 치환된 말레산으로부터 베타-치환된 말산, 베타 치환된 말산으로부터 베타 치환된 옥살로아세테이트 산, 베타 치환된 옥살로아세테이트 산으로부터 치환된 말로닉 세미알데하이드, 치환된 말로닉 세미알데하이드로부터 알파 치환된 3HP, 알파 치환된 말레산으로부터 알파 치환된 푸마르산 및 베타 치환된 말산으로부터 알파 케토산. 이러한 변환은 화학적 또는 생물학적으로 촉진될 수 있다.
도 11, 13, 15, 17 및 19는, 예컨대 도 3, 5, 9 및 10을 참조하여 전술된 바와 같이, 중간체들 및 최종 생성물들을 생성하는 경로들을 제시한다. 그러나, 도 11, 13, 15, 17 및 19는 또한 작용화된 알파 치환된 아크릴산들, 뿐만 아니라 이의 염들, 에스테르들 및 락톤들을 제조하는 데 유용한 완전한 생물학적 대사 경로들을 제시한다. 관련 도면들에서 식별된 변환들은 화학적 또는 생물학적으로 촉진될 수 있다.
예를 들어, 도 15는 알파 하이드록시메틸 아크릴산을 제조하는 완전한 또는 부분적인 생물학적 경로를 제시한다. 이 경로는 3-하이드록시 프로피온산으로 조작되거나 또는 이것을 자연적으로 제조하는 임의의 호스트로 조작될 수 있다. 3HP는 각각 도 16, G열 및 A열에서 기재된 효소 활성들을 갖는 폴리펩타이드들을 사용하여 하이드록시메틸 말론산 및/또는 3-하이드록시프로피오닐-CoA로 변환될 수 있다. 하이드록시메틸 말론산 및/또는 3-하이드록시프로피오닐-CoA는 각각 도 16, H열 및 B열에서 기재된 효소 활성들을 갖는 폴리펩타이드들을 사용하여 하이드록시메틸 말로닐-CoA로 변환될 수 있다. 하이드록시메틸 말로닐-CoA는 도 16, I열에서 기재된 효소 활성들을 갖는 폴리펩타이드들을 사용하여 하이드록시메틸 말로닉 세미알데하이드로 변환될 수 있다.
하이드록시메틸 말로닉 세미알데하이드는 도 16, C열에서 기재된 활성을 갖는 폴리펩타이드를 사용하여 2-폼일 3HP-CoA로 변환될 수 있다. 2-폼일 3HP-CoA는 도 16, D열에서 기재된 활성을 갖는 폴리펩타이드를 사용하여 2-하이드록시메틸 3HP-CoA로 변환될 수 있다. 2-하이드록시메틸 3HP-CoA는 도 16, E열에서 기재된 활성을 갖는 폴리펩타이드를 사용하여 알파 하이드록시메틸 아크릴릴 산으로 변환될 수 있다. 알파 하이드록시메틸 아크릴릴 산은 도 16, F열에서 기재된 활성을 갖는 폴리펩타이드를 사용하여 알파 하이드록시메틸 아크릴산으로 변환될 수 있다.
하이드록시메틸 말로닉 세미알데하이드는 도 16, J열에서 기재된 활성을 갖는 폴리펩타이드를 사용하여 2-(하이드록시메틸) 3HP로 변환될 수 있다. 2-(하이드록시메틸) 3HP는 각각 도 16, K열 및 L열에서 기재된 활성을 갖는 폴리펩타이드들을 사용하여 알파 하이드록시메틸 아크릴릭 및/또는 2-하이드록시메틸 3HP-CoA로 변환될 수 있다. 2-하이드록시메틸 3HP-CoA는 전술된 경로를 따라 알파 치환된 아크릴산에 이를 수 있다. 알파-하이드록시메틸-아크릴산으로의 2-(하이드록시메틸) 3HP의 변환은 도 16, K열에서 기재된 활성을 갖는 효소를 사용하여 실시될 수 있다.
하나의 대안에서, 2-(하이드록시메틸) 3HP는 격리되고, 화학적 탈수를 통해 알파-하이드록시메틸 아크릴산으로 변환되며, 예컨대 여기서 도 15에서의 단계 K는 화학적 탈수 단계이다.
유사하게는, 도 19는 알파-치환된 아크릴산들 또는 이의 중간체를 제조하는 완전한 또는 부분적인 생물학적 경로를 제시한다. 예를 들어, 단계 A 내지 L은 도 16에서 제시된 바와 같다. 하나의 대안으로, 중간체 알파-치환된 3-하이드록시프로피온산은 격리되고, 화학적 탈수 단계를 통해 알파-치환된 아크릴산으로 변환되며, 예를 들어, 여기서 도 19에서 단계 K는 화학적 탈수 단계를 지칭한다.
당해 분야의 통상의 기술자 중 하나는, 효소들(본원에서 사용되는 바와 같이, 효소들은 활성을 갖는 폴리펩타이드들로서 상호교환적으로 지칭됨)은 도면들에서 식별되며, 본원에는 예시적인 효소들이 있으며, 이들의 활성들 및 기질 특이성이 용이하게 시험되고 변경될 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 동일한 활성들을 갖는 새로운 효소들은 미래에 식별되며, 그러한 미래에 발견된 효소들은 기재된 경로들에서 사용될 수 있다.
일부 실시양태들에서, 폴리펩타이드들의 기질 특이성 및/또는 활성이 개질되도록 허용하는 하나 이상의 점 돌연변이를 갖는 폴리펩타이드들은 중간체들 및 생성물들을 제조하는 데 사용된다.
도 3과 관련된 명확성을 위해, 하나 이상의 작용화된 알파 치환된 다이카복실산들 및 알파 치환된 3HP 분자들을 생기게 할 수 있는 다수의 경로들이 제시된다. 이들 경로는 특정 원하는 생성물에 따라 달라진다. 명확성을 위해, 도 9 및 도 10은 특정 생성물들을 생성하기 위한 경로들의 사용을 예시하는 구조체들 및 효소들을 제공한다.
도 9는, 세린, 3-포스포하이드록시피루베이트 또는 이타콘산부터 출발하여 알파 (하이드록시메틸) 다이카복실산들을 제조하는 데 사용될 수 있는 경로를 제시한다. 또한 도 9는, 알파 (하이드록시메틸) 말레산으로부터 알파 작용기에 탄소를 첨가하여 알파 (하이드록시에틸) 말레산 또는 알파 (하이드록시에틸) 푸마르산을 생성시키기 위하여 어떻게 스페이서 경로(도 3 참조)가 사용될 수 있는 지에 대한 예를 제공한다.
유사하게는, 도 10은, 호모트레오닌, 추가의 스페이서 경로 단계들을 통한 트레오닌, 또는 피루브산으로부터 출발하여, 알파 (2-하이드록시프로필) 다이카복실산들 및 알파 (2-하이드록시프로필) 3HP를 생성하는 데 사용될 수 있는 경로를 나타낸다.
당해 분야의 통상의 기술자 중 하나는, 작용화된 알파 치환된 다이카복실산과 3HP의 혼합물이 재조합 미생물에 의해 생성될 수 있고, 상기 혼합물이 작용화된 알파 치환된 아크릴레이트로 화학적으로 변환될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 그 다음, 도 3, 9 및 10에서 제시된 바와 같이, 작용화된 알파 치환된 아크릴레이트는 후속적으로 에스테르 또는 락톤으로 화학적으로 또는 효소적으로 변환될 수 있다. 이들 변환을 책임지는 효소들은 도 4의 H열 및 G열에 제시되어 있다.
다양한 여러 탄소 소오스들은, 본원에서 기재된 재조합 미생물을 제조하기 위해 선택되는 균주에 의존하여 원하는 생성물을 제조하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 유기산들, 당 알코올들 및/또는 셀룰로오스들을 자연적으로 이용할 수 있는 호스트 균주는 원하는 경로의 도입에 따라 생성물이 특정 탄소 소오스으로부터 생성되도록 사용될 수 있다. 사용할 수 있는 다양한 여러 탄소 소오스은 도 3에 표시된 다수의 적층된 화살표들에 의해 표시되어 있다. 당해 분야의 통상의 기술자 중 하나는, 다양한 여러 효소 활성들이 재조합 미생물에 의해 이용될 필요가 있고, 필요로 하는 특정 활성들이 사용된 탄수화물의 소오스에 의존하는 것을 화살표들이 표시하는 것을 이해할 것이다. 또한, 재조합 미생물은 재조합 미생물 내에 공지된 효소 활성들 조작함으로써 특정 탄소 소오스을 이용하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 자일로스로부터 생성물을 생성하고자 하는 경우, WO2014164410에서 기재된 효소 활성들은 재조합 미생물 내에 도입될 수 있다. 유사하게, 메테인, 메탄올, 글루코스, 아세트산, 뿐만 아니라 다른 유기 분자들은 특정 트랜스포터 및 다른 효소 활성들의 도입을 통한 재조합 미생물에 의해 사용될 수 있다.
본원에서 기재된 생합성 경로들은, 경로에서 중간체로 자연적으로 중간체를 과생성하는 호스트 생명체로 조작될 수 있거나, 또는 미리 조작되었다. 피루베이트, 이타콘산 또는 아미노산을 고농도로 미리 생성시킨 호스트 세포는, 원하는 작용화된 알파 치환된 다이카복실산 및 작용화된 알파 치환된 3HP을 생성하도록 하나 이상의 재조합 핵산 서열들이 포함되는 재조합 호스트 세포로서 사용하기 위해 선택될 수 있다. 예를 들어, 하기 역가의 아미노산들은 다양한 발효들을 통해 미리 얻어지고 있다.
[표 B] 아미노산 발효의 최고 역가*
Figure pct00015
* 표 B는, 본원에 참고로 인용되고 있는 Adrio 및 Demain의 문헌 [Bioengineered Bugs 116-131, March April 2010]에서 표 2로부터 재생성된다.
당해 분야의 통상의 기술자 중 하나는, 재조합 미생물의 성장을 지원하기 위해 발효 브로쓰에 사용되는 탄소 소오스(들)과 관계없이, 생성물 생성을 위해 탄소 소오스(들)로부터 탄소 이용을 극대화하고자 하는 욕망이 경제적 현실에 존재한다는 것을 이해할 것이다. 일반적으로, 이것은 야생형 호스트 균주에서 달리 네이티브인 원하지 않는 생합성 경로들을 감쇠함으로써 또는 완전하게 방해함으로써 수행된다. 원하는 경로는 탄소 유동을 전환하기 위해 조작될 것이며, 이는 조작된 경로가 호스트 세포에서 정상적으로 발견되는 기질에 대한 증가된 수준의 효소 활성을 가질 것이기 때문이다. 예를 들어, 재조합 미생물은 알파 케토글루타레이트에 대해, 또는 대안적으로 아미노산에 대해 증가된 활성을 표시할 수 있다. 당해 분야의 통상의 기술자 중 하나는, 조작된 경로에 대한 분지 지점에 대해 업스트림에서 또는 이전에, 어떤 경로들이 중앙 대사로부터의 탄소의 전환(diversion)을 초래하는 지를 검토할 수 있다. 그 다음, 이러한 전환 경로들은 원하는 생성물을 더욱 많은 탄소가 수렴 이동되도록(funnel) 감쇠 또는 녹아웃될 수 있다(knock out). 감쇠 또는 녹아웃될 수 있는 경로들의 예들로는 에탄올, 아세테이트, 글리세롤 등과 같은 생성물들에 대한 경로들을 포함한다(WO2008116853에서의 예들을 참조). 감쇠될 수 있는 활성들의 더욱 구체적인 예들은, 다음 효소들과 연관된 것들을 포함한다: 피루베이트 옥시다제(poxB), 피루베이트-포르메이트 리아제(pflB), 포스포트랜스아세틸라제(pta), 아세테이트 키나제(ackA), 알데하이드 디하이드로게나제(aldB), 알코올 디하이드로게나제(adhE), 알코올 디하이드로게나제(adhP), 메틸글리옥살 신타제(mgsA) 및 락테이트 디하이드로게나제(ldhA). 이들 효소의 감쇠, 뿐만 아니라 작용화된 알파 치환된 다이카복실산 및 작용화된 3-하이드록시프로피온산의 생성을 증가시키는 데 사용될 수 있는 기타 방법들은 WO2013163292에 기재되어 있다. 또한 Man Kit Lau에 대한 WO2013163292는, 케토산, 알파 케토 아디페이트를 알파 케토 피말레이트로 신장시키는, 도 3에서 제시된 스페이서 경로의 사용을 기재하고 있다. 이 동일한 경로는 작용화된 알파 치환된 다이카복실산을 신장시키는 데 사용될 수 있다(WO2013163292은 본원에 참고로 포함됨).
상업적으로 실행 가능한 생합성 경로의 설계는, 소모된 탄소 소오스과 비교되는 생성물의 충분한 수율을 가져야 하고, 또한 균형잡힌 방식으로 생성물을 제조할 수 있어야 한다. 재조합 미생물에 의해 소모된 및 생성된 전체 생성물 및 공동 인자들은, 세포에게 생성물을 생성하는 능력을 호스트 세포 능력에 대해 부담되는 순수 흑자 또는 적자가 발생할 것을 의미한다. 예를 들어, 전체 경로가 아세틸-CoA를 소모하면, 경로로 설계되는 데 아세틸 CoA의 추가 소오스이 필요할 수 있다. 대안적으로, 특정 부산물, 예컨대 H2O2이 과도하게 생성되는 경우, 부산물을 수송하거나 또는 부산물을 소모하는 적절한 메커니즘이 경로에 포함되어야 한다.
II. 화학 촉매
하기 실시예들은 발명을 예시하기 위해 제공되지만, 이의 범위를 제한하는 것은 아니다. 달리 표시되지 않는 한, 모든 부 및 백분율은 중량 기준이다.
본원에 제공된 방법들은 작용화된 알파 치환된 유기산들의 작용화된 아크릴산 및 유도체들로의 작용화된 알파 치환된 C4 다이카복실산의 변환에 관한 것이다(상기 표 A 참조). 예를 들어, 작용화된 아크릴산의 제조는 반응식 1에서 제시된 바와 같을 수 있다.
Figure pct00016
여기서, 상기 각각의 화합물들은 이의 염 또는 에스테르로서 존재할 수 있다.
따라서, 작용화된 아크릴산, 또는 이의 염 또는 에스테르를 제조하는 방법들이 본원에 제공되며, 상기 방법은 작용화된 알파 치환된 C4 산, 또는 이의 염, 에스테르 또는 락톤을 금속 촉매와 접촉하는 것을 포함한다.
일부 실시양태들에서, 화학식 I의 화합물 또는 이의 염을 제조하는 방법:
화학식 I
Figure pct00017
상기 식에서,
각각의 R1은 (메틸보다 긴) 알킬, 하이드록시, 하이드록시알킬, 분지된 하이드록시알킬, 알콕시, 분지된 알킬, 아미노, 분지된 아미노 알킬, 페닐, 알킬 치환된 페닐, -S-, -SH,, -SeH, -Se-, 하이드록시방향족, 아미노방향족, 폼일, 카바모일, 인돌릴, 구아니디닐, 및 n>1 경우의 카복실레이트로부터 선택되고, R2는 개별적으로 H 및 보호기로부터 선택되고, n은 1 이상이다.
방법은 화학식 II, III 또는 IV의 화합물 또는 이의 염을 포함하는 조성물과 금속 촉매를 접촉시키는 단계를 포함한다:
화학식 II, III 및 IV
Figure pct00018
상기 식에서,
각각의 R1은 (메틸보다 긴) 알킬, 하이드록시, 하이드록시알킬, 분지된 하이드록시알킬, 알콕시, 분지된 알킬, 아미노, 분지된 아미노 알킬, 페닐, 알킬 치환된 페닐, -S-, -SH, -SeH, -Se-, 하이드록시방향족, 아미노방향족, 폼일, 카바모일, 인돌릴, 구아니디닐, 및 n>1 경우의 카복실레이트, 및 이의 보호기들로부터 선택되고, R2, R3 및 R4는 개별적으로 H 및 보호기로부터 선택되고, n은 1 이상이다.
반응식 1에 나타낸 바와 같이, 화학식 I의 화합물 또는 이의 염은 일부 실시양태들에서 화학식 I의 화합물 또는 이의 염을 제조하기 위해 화학식 II, III 또는 IV의 화합물의 베타 카복실레이트의 선택적 탈카복실화를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다.
또한 이 개시내용은, 작용화된 알파 치환된 C4 다이카복실산을 금속 촉매와 접촉시키는 단계를 포함하는, 작용화된 아크릴산, 또는 이의 염 또는 에스테르를 제조하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태들에서, 화학식 I의 화합물 또는 이의 염을 제조하는 방법은 화학식 II, III, IV의 화합물, 또는 이의 염을 포함하는 조성물과 금속 촉매를 접촉시키는 단계를 포함한다. 예를 들어, 화학식 I의 화합물 또는 이의 염을 제조하는 방법은, 화학식 I의 화합물 또는 이의 염을 제조하기 위해, 화학식 II, III, IV의 화합물, 또는 이의 염의 선택적 탈카복실화를 포함할 수 있다. 일부 실시양태들에서, 이러한 방법은 금속 촉매의 존재 하에 단일 반응 포트에서 수행된다.
또한, 상기 표 A에서 제시된 화합물들, 또는 이의 염 또는 에스테르의 제조방법들이 본원이 제공된다. 방법들은 작용화된 알파 치환된 C4 다이카복실산, 또는 이의 염, 에스테르 또는 락톤을 금속 촉매와 접촉하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태들에서, 하기 것들으로부터 선택된 화합물 또는 이의 염을 제조하는 방법:
Figure pct00019
상기 식에서,
각각의 R1은 (메틸보다 긴) 알킬, 하이드록시, 하이드록시알킬, 분지된 하이드록시알킬, 알콕시, 분지된 알킬, 아미노, 분지된 아미노 알킬, 페닐, 알킬 치환된 페닐, -S-, -SH, , -SeH, -Se-, 하이드록시방향족, 아미노방향족, 폼일, 카바모일, 인돌릴, 구아니디닐, 및 n>1 경우의 카복실레이트 및 이의 보호기들로부터 선택되고, R2는 개별적으로 H 및 보호기로부터 선택되고, n은 1 이상이다.
일부 실시양태들에서, 상기 표 A에서 제시된 화합물 또는 이의 염을 제조하는 방법은, 화학식 I의 화합물 또는 이의 염을 제조하기 위해, 화학식 II, III, IV의 화합물 또는 이의 염의 선택적 탈카복실화를 포함할 수 있다.
추가 실시양태에서, 하기 식의 알파-치환된 아크릴산, 또는 이의 염 또는 에스테르를 제조하는 방법으로서:
Figure pct00020
상기 식에서,
각각의 R1은 (메틸보다 긴) 알킬, 하이드록시, 하이드록시알킬, 분지된 하이드록시알킬, 알콕시, 분지된 알킬, 아미노, 분지된 아미노 알킬, 페닐, 알킬 치환된 페닐, -S-, -SH,, -SeH, -Se-, 하이드록시방향족, 아미노방향족, 폼일, 카바모일, 인돌릴, 구아니디닐, 및 n>1 경우의 카복실레이트로부터 선택되고, R2는 개별적으로 H 및 보호기로부터 선택되고, n은 1 이상이다.
상기 방법은 알파-치환된 아크릴산을 생성하기 위해 알파-치환된 3-하이드록시프로피온산을 탈수시키는 것을 포함하며, 여기서 알파-치환된 3-하이드록시프로피온산은 하기 식의 것 또는 이의 염이다:
Figure pct00021
상기 식에서,
각각의 R1은 (메틸보다 긴) 알킬, 하이드록시, 하이드록시알킬, 분지된 하이드록시알킬, 알콕시, 분지된 알킬, 아미노, 분지된 아미노 알킬, 페닐, 알킬 치환된 페닐, -S-, -SH,, -SeH, -Se-, 하이드록시방향족, 아미노방향족, 폼일, 카바모일, 인돌릴, 구아니디닐, 및 n>1 경우의 카복실레이트로부터 선택되고, R2는 개별적으로 H 및 보호기로부터 선택되고, n은 1 이상이다.
예를 들어, 3-하이드록시프로피온산은, 본원에서 정의된 재조합 미생물을 탄수화물의 존재 하에서 배양하는 단계; 및 작용화된 알파 치환된 3-하이드록시프로피온산 또는 이의 염을 분리하는 단계를 포함하는 방법에 의해 생성된다.
본원에 제공된 방법들은 본원에서 기재된 하나 이상의 화합물을 제조하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에서 기재된 방법들은 표 A에 표시된 화합물들 또는 이의 염 또는 에스테르로 이루어진 군으로부터 선택된 2개 이상의 화합물들을 포함하는 조성물을 제조하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태들에서, 방법은 작용화된 알파 치환된 C4 다이카복실산, 또는 이의 염, 에스테르 또는 락톤을 금속 촉매와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 표 A에 표시된 화합물들 또는 이의 염으로 이루어진 군으로부터 선택된 2개 이상의 화합물들을 포함하는 조성물을 제조하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 화학식 II, III, IV, 또는 이의 염을 화합물을 포함하는 조성물과 금속 촉매를 접촉시키는 단계를 포함한다. 당해 분야의 통상의 기술자는 일부 작용기들이 촉매 첨가에 민감할 수 있음을 알고 있을 것이다. 보호기들의 도입은 예컨대 R1의 경우 필요할 수 있다: 여기서, 각각의 R1은 (메틸보다 긴) 알킬, 하이드록시, 하이드록시알킬, 분지된 하이드록시알킬, 알콕시, 분지된 알킬, 아미노, 분지된 아미노 알킬, 페닐, 알킬 치환된 페닐, -S-, -SH,, -SeH, -Se-, 하이드록시방향족, 아미노방향족, 폼일, 카바모일, 인돌릴, 구아니디닐, 및 n>1 경우의 카복실레이트로부터 선택되고, R2는 개별적으로 H 및 보호기로부터 선택되고, n은 1 이상이다.
일부 실시양태들에서, 화학식 I의 화합물 및 표 A에 표시된 하나 이상의 화합물들 또는 이의 염을 포함하는 조성물의 제조방법은, 화학식 II, III 또는 IV의 화합물의 베타 카복실레이트의 선택적 탈카복실화를 포함할 수 있다.
전술된 화합물들(즉, 화학식 I, II, III, IV의 화합물들)에서, 보호기를 참조한다. 일부 실시양태들에서, 카복실기는 보호될 수 있다(R1, R2 및 R3의 경우). 이 목적을 위해, R2, R3 및 R4는, 에스테르들, 아미드들, 또는 하이드라진 보호기들을 포함하지만 이에 국한되지 않는 임의의 적합한 카복실 보호기를 포함할 수 있다. 보호기의 각각의 경우는 동일하거나 상이할 수 있다.
특히, 에스테르 보호기는 메틸, 메톡시 메틸(MOM), 벤질옥시메틸(BOM), 메톡시에톡시메틸(MEM), 2-(트라이메틸실릴)에톡시메틸(SEM), 메틸싸이오메틸(MTM), 페닐싸이오메틸(PTM), 아지도메틸, 사이아노메틸, 2,2-다이클로로-1,1-다이플루오로에틸, 2-클로로에틸, 2-브로모에틸, 테트라하이드로피라닐(THP), 1-에톡시에틸(EE), 펜아실, 4-브로모펜아실, 사이클로프로필메틸, 알릴, 프로파길, 아이소프로필, 사이클로헥실, t-뷰틸, 벤질, 2,6-다이메틸벤질, 4-메톡시벤질(MPM-OAr), o-나이트로벤질, 2,6-다이클로로벤질, 3,4-다이클로로벤질, 4-(다이메틸아미노)카보닐벤질, 4-메틸설피닐벤질(Msib), 9-안트릴메틸, 4-피콜릴, 헵타플루오로-p-톨릴, 테트라플루오로-4-피리딜, 트라이메틸실릴(TMS), t-뷰틸다이메틸실릴(TBDMS), t-뷰틸다이페닐실릴(TBDPS) 및 트라이아이소프로필실릴(TIPS) 보호기들을 포함할 수 있다.
아미드 및 하이드라진 보호기들은 N,N-다이메틸아미드, N-7-나이트로인돌릴아미드, 하이드라자이드, N-페닐하이드라자이드, 및 N,N'-다이아이소프로필하이드라자이드를 포함할 수 있다.
일부 실시양태들에서, 하이드록실 기는 보호될 수 있다(R1 또는 R4의 경우). 이 목적을 위해, R4는, 에테로, 에스테르, 카보네이트 또는 설포네이트 보호기들을 포함하지만 이에 국한되지 않는 임의의 적합한 하이드록실 보호기를 포함할 수 있다. 보호기의 각각의 경우는 동일하거나 상이할 수 있다.
특히, 에테르 보호기는 메틸, 메톡시 메틸(MOM), 벤질옥시메틸(BOM), 메톡시에톡시메틸(MEM), 2-(트라이메틸실릴)에톡시메틸(SEM), 메틸싸이오메틸(MTM), 페닐싸이오메틸(PTM), 아지도메틸, 사이아노메틸, 2,2-다이클로로-1,1-다이플루오로에틸, 2-클로로에틸, 2-브로모에틸, 테트라하이드로피라닐(THP), 1-에톡시에틸(EE), 펜아실, 4-브로모펜아실, 사이클로프로필메틸, 알릴, 프로파길, 아이소프로필, 사이클로헥실, t-뷰틸, 벤질, 2,6-다이메틸벤질, 4-메톡시벤질(MPM-OAr), o-나이트로벤질, 2,6-다이클로로벤질, 3,4-다이클로로벤질, 4-(다이메틸아미노)카보닐벤질, 4-메틸설피닐벤질(Msib), 9-안트릴메틸, 4-피콜릴, 헵타플루오로-p-톨릴, 테트라플루오로-4-피리딜, 트라이메틸실릴(TMS), t-뷰틸다이메틸실릴(TBDMS), t-뷰틸다이페닐실릴(TBDPS) 및 트라이아이소프로필실릴(TIPS) 보호기들을 포함할 수 있다.
에스테르 보호기는 아세톡시(OAc), 아릴 포르메이트, 아릴 아세테이트, 아릴 레불리네이트, 아릴 피발로에이트, 아릴 벤조에이트 및 아릴 9-플루오로엔카복실레이트를 포함할 수 있다. 일 실시양태에서, 에스터 보호기는 아세톡시 기이다.
카보네이트 보호기는 아릴 메틸 카보네이트, 1-아다만틸 카보네이트(Adoc-OAr), t-뷰틸 카보네이트(BOC-OAr), 4-메틸설피닐벤질 카보네이트(Msz-OAr), 2,4-다이메틸펜트-3-일(Doc-OAr), 아릴 2,2,2-트라이클로로에틸 카보네이트, 아릴 바이닐 카보네이트, 아릴 벤질 카보네이트 및 아릴 카바메이트를 포함할 수 있다.
설포네이트 보호기들은 아릴 메테인설포네이트, 아릴 톨루엔설포네이트, 및 아릴 2-폼일벤젠설포네이트를 포함할 수 있다.
본원에서 기재된 바와 같은 화합물들의 제조는 다양한 화학 기들의 보호 및 탈보호를 포함할 수 있다. 보호 및 탈보호에 대한 필요성 및 적절한 보호기의 선택은 당해 분야의 통상의 기술자 중 하나에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 보호기들의 화학은 예컨대 문헌 [Protecting Group Chemistry, 1st Ed., Oxford University Press, 2000]; 문헌 [March's Advanced Organic chemistry: 반응, 메커니즘 및 구조(Reactions, Mechanisms, and Structure), 5th Ed., Wiley-Interscience Publication, 2001]; 및 Peturssion, S. 등의 문헌 ["탄수화물 화학에서의 보호기(Protecting Groups in Carbohydrate Chemistry)," J. Chem. Educ., 74(11), 1297(1997)]에서 찾을 수 있다(각각이 본원에 참고로 인용됨).
전술된 방법에서, 작용화된 알파 치환된 C4 다이카복실산, 또는 이의 염, 에스테르 또는 락톤은 당해 분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법들에 의해 수득될 수 있다. 예를 들어, 작용화된 알파 치환된 C4 다이카복실산, 또는 이의 염, 에스테르 또는 락톤은 상업적으로 얻어거나, 또는 합성적으로 제조될 수 있다. 일부 실시양태들에서, 작용화된 알파 치환된 C4 다이카복실산, 또는 이의 염, 에스테르 또는 락톤은, 전체적으로 본원에 참고로 인용되고 있는, BioAmber Inc.에 양도된 WO 2014/043182에서 기재된 바와 같은 발효 방법들을 사용하여 제조될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 금속 촉매는 임의의 적합한 금속 촉매를 포함할 수 있다. 예를 들어, 적절한 금속 촉매는 하나 이상의 작용화된 아크릴산들, 이의 염들, 에스테르들 또는 락톤들로의 작용화된 알파 치환된 C4 다이카복실산, 또는 이의 염, 에스테르 또는 락톤의 변환을 촉진시킬 수 있는 것이다.
일부 실시양태들에서, 본 방법들에 적합한 금속 촉매는 불균일계(heterogenous)(또는 고체) 촉매이다. 금속 촉매(예컨대, 불균일계 촉매)는 (본원에서 "지지된 금속 촉매"로서 지칭되는) 적어도 하나의 촉매 지지체 상에 지지될 수 있다. 사용되는 경우, 금속 촉매를 위한 적어도 하나의 지지체는, 산화물들, 예컨대 실리카, 알루미나 및 티타니아, 이의 화합물들 또는 이의 조합들; 바륨 설페이트; 지르코니아; 탄소(예컨대, 산 세척된 탄소); 및 이들의 조합들을 포함하지만 이에 국한되지 않는 반응 조건들 하에서 불활성인 임의의 고체 물질일 수 있다. 산 세척된 탄소는, 불순물을 제거하기 위해, 질산, 황산 또는 아세트산과 같은 산으로 세척된 탄소이다. 지지체는 분말, 과립, 펠릿 등의 형태로 존재할 수 있다. 지지된 금속 촉매는, 당해 분야의 통상의 기술자에게 임의 수의 공지된 방법들, 예컨대 분무, 침지 또는 물리적 혼합, 이어서 건조, 하소, 및 뿐만 아니라 임의의 수에 의해 지지체 상에 금속 촉매를 증착하여 제조하고, 필요하다면 가열, 환원 및/또는 산화와 같은 방법들을 통한 활성화에 의해 지지체 상에 금속 촉매를 침적시킴으로써 제조될 수 있다. 일부 실시양태들에서, 촉매의 활성화는 수소 기체의 존재 하에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 활성화는 수소 유동 또는 압력(예컨대, 약 200 psi의 수소 압력) 하에서 수행될 수 있다. 일부 실시양태들에서, 금속 촉매는 약 100 ℃ 내지 약 500 ℃의 온도에서 활성화된다(예컨대, 약 100 ℃ 내지 약 500 ℃).
일부 실시양태들에서, 적어도 하나의 지지체 상에 적어도 하나의 금속 촉매의 적재는 적어도 하나의 산 촉매 + 적어도 하나의 지지체의 조합된 중량을 기반으로 약 0.1 중량% 내지 약 20 중량%이다. 예를 들어, 적어도 하나의 지지체 상에 하나 이상의 금속 촉매의 적재는 약 5 중량%일 수 있다.
금속 촉매는 니켈, 팔라듐, 백금, 구리, 아연, 로듐, 루테늄, 비스무스, 철, 코발트, 오스뮴, 이리듐, 바나듐으로부터 선택된 금속, 및 이들 중 2개 이상의 조합을 포함할 수 있다. 일부 실시양태들에서, 금속 촉매는 구리 또는 백금을 포함한다. 예를 들어, 금속 촉매는 백금을 포함할 수 있다.
화학적 프로모터는 촉매의 활성을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 프로모터는 촉매 성분의 화학적 처리에서의 임의의 단계 도중 촉매 내에 혼입될 수 있다. 화학적 프로모터는 일반적으로 촉매 제제의 물리적 또는 화학적 기능을 향상시킬 뿐만 아니라, 바람직하지 않은 부반응들을 지연하기 위해 첨가될 수 있다. 적합한 프로모터들은 예컨대 황(예컨대, 설파이드) 및 인(예컨대, 포스페이트)을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 프로모터는 황을 포함한다.
본원에서 기재된 바와 같이, 적합한 금속 촉매의 비제한적 예들은 표 C에 제공된다.
[표 C]
Figure pct00022
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
온도, 용매, 촉매, 반응기 배열구성(configuration), 압력 및 혼합 비율은 본원에서 기재된 변환들에 영향을 미칠 수 있는 모든 파라미터들이다. 이러한 파라미터들 사이의 관계들은 공정의 반응에서 원하는 변환, 반응 속도 및 선택성을 수행하도록 조정될 수 있다.
일부 실시양태들에서, 본원에 제공된 방법들은 약 25 ℃ 내지 약 350 ℃의 온도에서 수행된다. 예를 들어, 방법들은 적어도 약 100 ℃의 온도에서 수행될 수 있다. 일부 실시양태들에서, 본원에 제공된 방법은 약 100 ℃ 내지 약 200 ℃의 온도에서 수행된다. 예를 들어, 방법은 약 150 ℃ 내지 약 180 ℃의 온도에서 수행될 수 있다.
본원에서 기재된 방법들은 순수하게, 수중에서 또는 유기 용매의 존재 하에서 수행될 수 있다. 일부 실시양태들에서, 반응 용매는 물을 포함한다. 유기 용매들의 예로는 탄화수소들, 에테르들 및 알코올들을 포함한다. 일부 실시양태들에서, 알코올들은 예컨대 저급 알칸올, 예컨대 메탄올 및 에탄올이 사용될 수 있다. 반응 용매는 2개 이상의 용매들의 혼합물일 수 있다. 예를 들어, 용매는 물과 알코올의 혼합물일 수 있다.
본원에 제공된 방법들은 불활성 분위기 하에서 수행될 수 있다(예컨대, N2 및 Ar). 일부 실시양태들에서, 본원에 제공된 방법들은 질소 하에서 수행된다. 예를 들어, 방법들은 약 20 psi 내지 약 1000 psi의 질소 압력 하에서 수행될 수 있다. 일부 실시양태들에서, 본원에서 기재된 방법은 약 200 psi의 질소 압력 하에서 수행된다.
일부 실시양태들에서, 추가의 시약들은 본원에서 기재된 방법들에 첨가될 수 있다. 예를 들어, NaOH와 같은 염기는 반응에 첨가될 수 있다.
반응들은 당해 분야에 공지된 임의의 적합한 방법에 따라 모니터될 수 있다. 예를 들어, 생성물 형성은 분광 수단, 예컨대 핵 자기 공명 분광법(예컨대, 1H 또는 13C), 적외선 분광법, 분광광도법(예컨대, UV-가시광선), 질량 분석법 또는 크로마토그래피 방법들, 예컨대 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 액체 크로마토그래피-질량 스펙트럼(LCMS) 또는 박층 크로마토그래피(TLC)에 의해 모니터링될 수 있다. 화합물들은 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)(전체적으로 본원에 참고로 인용되고 있는, 문헌 ["제조용 LC-MS 정제: 개선된 화합물 특이적 방법 최적화(Preparative LC-MS Purification: Improved Compound Specific Method Optimization)" K.F. Blom, 등, J. Combi. Chem. 6(6)(2004)])를 포함하는 다양한 방법들에 의해 당해 분야의 통상의 기술자에 의해 정제될 수 있다.
실시예
실시예 1 - 중간체에 대해 내성인 세포
도 2에서 제시된 바와 같이, 작용화된 알파 치환된 C4 다이카복실산들에 대한 톨러런스를 결정함으로써 알파 치환된 C4 다이카복실산들로의 기재된 경로에 대한 잠재적인 호스트들이 식별되었다. 박테리아 및 진핵 호스트들의 톨러런스를 평가하기 위해, 특정 작용화된 알파 치환된 C4 다이카복실산 화합물이 선택되었다.
2개의 진핵 균주들, 아이 오리엔탈리스(I. orientalis) 및 에스 세레비시아에(S. cerevisiae)는 pH 3 및 pH 5에서 시험되었다. 3개의 박테리아 균주들은 개별적인 최적의 조건들을 사용하여 시험되었다. 이 콜라이(E coli) 및 씨 글루타미쿰(C. glutamicum)은 pH 8 및 30 ℃에서 시험되고, 비 피르무스(B. firmus)는 pH 9 및 37 ℃에서 시험되었다. 아이 오리엔탈리스(I. orientalis)는 황산 암모늄 5 g/L, 황산 마그네슘 헵타하이드레이트 0.5 g/L, 인산 칼륨 모노베이식(monobasic) 3 g/L, 덱스트로스 10 g/L, 10 % 글리세롤 스톡 1 mL/L, 1000x 트레이스 1 mL/L로 이루어진 한정된 효모 배지에서 성장되었다. 1000x 트레이스 스톡 용액은 ZnSO4.7H2O 4 g/L, FeSO4.7H2O 2 g/L, MnSO4.H2O 1 g/L, CuSO4.5H2O 0.2 g/L, 및 H2SO4 0.8 mL/L를 함유한다. 에스 세레비시아에(S. cerevisiae)는 덱스트로스 50 g/L, 효모 추출물 5 g/L 및 25x DM 염들 40 mL/L로 이루어진 완충된 한정된 덱스트로스 배지에서 성장되었다. 25x DM 염 스톡 용액은 황산 암모늄 125 g/L, 황산 마그네슘 헵타하이드레이트 12.5 g/L, 인산 칼륨 모노베이식 75 g/L 및 물 787.5 g/L를 함유한다. 박테리아 균주들은, 글루코스 20 g/L에 더하여, 박토-트립톤 10 g/L, 효모 추출물 5 g/L, NaCl 10 g/L 및 덱스트로스 20 g/L로 이루어진 표준 LB 배지에서 성장되었다.
시간 지점들은, 성장의 속도를 계산하는 데 적어도 8 h 내지 24 h의 기간에 걸쳐 취하였다. 특정 성장 속도는 시간에 대한 세포 수의 자연 로그를 플롯팅함으로써 결정되었다. 화합물의 부재와 비교되는, 톨러런스는 화합물의 존재 하에서 세포의 성장 속도에 의해 결정되었다. 채점 방법은 표 D에 표시된다. 톨러런스 시험의 결과들은 표 E 및 F에서 제시된다. 왼쪽으로부터의 제 2 칼럼은, 성장이 검출되는 표시된 화합물의 최대 농도를 나타내었다. 결과들에서는, 에스 세레비시아에(S. cerevisiae)가 이 연구에서 시험된 임의의 작용화된 알파 치환된 C4 이산(diacid) 화합물을 생성하는 데 적합한 호스트인 것을 시사한다. 아이 오리엔탈리스(I. orientalis)는 또한 화합물들의 대부분에 대해 적합한 호스트이다. 결과들에서는, 시험된 조건들 하에서, 이 콜라이(이 콜라이)가 호모시트레이트 락톤을 생성하는 데 적합한 호스트이고, 씨 글루타미쿰(C. glutamicum)은 호모시트레이트을 생성하는 데 적합한 호스트인 것을 시사한다.
[표 D] 세포 성장 속도에 대해 특정 화학물질의 영향을 채점하는 데 사용된 주관적 시스템.
Figure pct00027
[표 E] 잠재적인 효모 호스트의 톨러런스.
Figure pct00028
[표 F] 잠재적인 박테리아 호스트의 톨러런스
Figure pct00029
실시예 2 - 세린 과생성 미생물을 이용하여 알파 ( 하이드록시메틸 ) 말산의 생성을 위한 재조합 미생물의 구성.
알파 (하이드록시메틸) 말산의 생성에 사용되는 미생물은 효모 및 사상균(filamentous fungi), 뿐만 아니라 박테리아를 포함하는 진균으로부터 선택될 수 있다. Pharkya 등에서 기재된 미생물은, 박테리아 생성이 요구되는 경우들에서, 후속적인 유전 조작 단계들을 위한 출발 세린 과생성 균주로서 사용될 수 있다. 유사하게, Stolz 등 및 US006037154A에서 기재된 미생물은, 진핵 생성이 요구되는 경우들에서, 후속적인 유전 조작 단계들을 위한 출발 균주로서 사용될 수 있다.
Pharkya, Burgard 및 Maranas의 문헌 [바이레벨 최적화 프레임워크 옵녹을 사용하는 아미노산의 과생성의 탐색(Exploring the overproduction of amino acids using the bilevel optimization framework optknock ). Wiley Intersciences . 24 Nov 2003]
Stolz 등의 문헌 [코리네박테리움 글루타미쿰에 의한 L-세린 생성에 대한 해결책으로서 환원된 폴레이트 공급(Reduced folate supply as key to enhanced L-serine production by Corynebacterium glutamicum). Appliced and Environ. Microbio. Feb 2007, p. 750-755]
DNA 단편 인코딩 트랜스아미나제(도 4, A열) 및 신타제(도 4, B열)는 발현 벡터 내로 클로닝된다. 유전자 후보들 및 그들 서열은 도 4, 오른쪽 칼럼에서 제시된다. 트랜스아미나제 및 신타제 활성은, 적절한 프로모터들 및 터미네이터들의 제어 하에서 식별된 핵산 서열을 인코딩하는 재조합 핵산 서열들의 도입에 의해 재조합 미생물에서 증가된다. 구체적으로는, 트랜스아미나제 유전자는 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)로부터의 세린-글리옥실레이트이고(EC 2.6.1.45), 신타제는 쉬조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)로부터의 호모시트레이트 신타제이다(2.3.3.14). 모든 경로 유전자들을 성공적으로 전사하는 생성된 플라스미드는 세린 과생성 미생물로 형질전환된다.
또한, 알파 (하이드록시메틸) 말산 트랜스포터를 인코딩하는 DNA 단편의 발현은 알파 (하이드록시메틸) 말산의 생성을 개선시킨다. 구체적으로, 트랜스포터 유전자는 말산 트랜스 유전자들로부터 선택되고, tehA는 이 콜라이로부터 선택되고(UNIPROT E0IVN4), mae1는 에스 폼베(S. pombe)로부터 선택되고(Saayman 등, 2000), ykxJ는 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis)로부터 선택되고(Krom 등, 2001), 또는 이의 유사체들로부터 선택된다.
Krom, Aardema, 및 Lolkema의 문헌 [바실루스 서브틸리스 YxkJ는 L-말레이트 및 시트레이트를 수송하는 2- 하이드록시카복실레이트 트랜스포터 패밀리의 제 2 트랜스포터이다 (Bacillus subtilis YxkJ is a secondary transporter of the 2- hydroxycarboxylate transporter family that transports L-malate and citrate). J Bacteriol, 2001 Oct; 183(20):5862-9.]
Saayman, van Vuuren, van Zyl, 및 Viljoen-Bloom의 문헌 [칸디다 유틸리스 및 쉬조사카라오미세스 폼베에 의한 푸마레이트의 상이한 흡수(Differential uptake of fumarate by Candida utilis and Schizosaccharaomyces pombe ). Appl Microbiol Biotechnol, 2000. 54: 792-798.]
트랜스아미나제 활성 검정
당해 분야의 통상의 기술자 중 하나는, 많은 트랜스아미나제 효소들의 활성이 특성화되었고, 트랜스아미나제 활성을 검출하기 위한 당해 분야에 공지된 임의의 방법이 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 특히, 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) 효소의 발현에 따라, Kendziorek 및 Paszkowski에 의해 기재된 검정을 사용하여 활성이 특성화될 수 있다. 아미노기 공여체로서 글리신을 사용하는 반응의 양은, NADH 및 락테이트 디하이드로게나제를 사용하는 분광광도 방법에 의해 결정되는, 반응이 정지된 후, 잔여 2-옥소산 기질을 결정함으로써 예측된다.
Kendziorek 및 Paszkowski의 문헌 [아라비돕시스 탈리아나 잎으로부터 정제된 세린:글리옥실레이트 아미노트랜스퍼라제의 성질(Properties of serine:glyoxylate aminotransferase purified from Arabidopsis thaliana leaves). Acta Biochim Biophys Sin, 2008, 40(2): 102-110.]
신타제 활성 검정
신타제들을 인코딩하는 이 콜라이 최적화된 유전자들은 합성되고 pTrcHisA 내로 클로닝되었다(Life Technologies(이전 Invitrogen)). 시험된 신타제 유전자들은 표 G에서 존재한다. 최적화된 신타제 유전자들을 함유하는 플라스미드들은 BL21 이 콜라이 세포들로 형질전환된다. 빈 플라스미드 pTrcHisA는 또한 음성 대조군으로서 형질전환되었다. 발현 및 특성화 실험들에서, 40 mL TB를 함유한 진탕 플라스크들은 밤샘(overnight) 배양들로부터 5 %에서 접종되었다. 플라스크들은 2 시간 동안 250 rpm으로 진탕하면서 30 ℃에서 항온처리된 후, 0.2 mM IPTG로 유도되고, 진탕하면서 30 ℃에서 4 h 더 항온처리되었다. 세포들은 원심분리에 의해 수확되고, 펠렛들은 -80 ℃에서 저장되었다.
신타제 후보들의 활성은 지표로서 DTNB를 사용하는 시험관 내 검정으로 평가되었다(5,5'-다이싸이오비스(2-나이트로벤조산)). 효소 활성은 기질 없이 또는 기질으로서 하이드록시피루베이트를 사용하여 시험되었다. DTNB는 존재하는 기질 및 아세틸-CoA의 축합에 의해 생성된 자유 싸이오(thio)와 상호작용한다. 별도의 규정이 없는 한, 모든 화학물질들은 Sigma-Aldrich Chemical Company, St. Louis, MO에서 구입하였다.
세포들은 제조업자의 지침들에 따라 BeadBeater(상표명)(BopSpec products, Bartlesville, OK)를 사용하는 기계적 파괴를 사용하여 용해시켰다. 세포 용해물은 원심분리에 의해 부분적으로 밝혀졌다(5 분 동안 14,000G). 밝혀진 생성된 용해물의 단백질 농도들은 제조업자의 지침들을 사용하는 BioRad total Protein 검정을 통해 측정되었다. 용해물은 100 mM 트리스 완충액에서 단백질 농도에 의해 정규화되었다. 정규화된 용해물들은 100 mM 트리스 완충액에서 1 내지 7로 희석되었다. 20 μL 용해물은 96-웰 플레이트 검정을 위해 각각의 웰에 첨가되었다. 각 조건은 3중으로 수행되었다.
반응 혼합물은 100 mM Tris pH 7.4, 5 mM MgSO4, 0.2 mM 아세틸-CoA, 0.5 mM DTNB, 0.5 mM 기질, 하이드록시피루베이트를 함유한다. 반응을 시작하기 위해, 180 μL 반응 혼합물은 각각 20 μL 용해물을 함유하는 웰에 첨가되었다. 이러한 마이크로플레이트들에서의 반응들은 412 nm에서 모니터링되었다. 판독들은 10 분동안 매 9 초마다 취하고, 데이터는 각각의 효소의 활성들을 계산하는 데 사용되었다. 결과들은 도 20(a)에서 제시된다. 빈 벡터를 함유하는 세포들과 비교되는, 하이드록시피루베이트가 기질일 때, 신타제 활성이 관찰되었다(도 20(a), 표 G). 기질이 없는 동일한 반응에 의해 측정된 바와 같이, 백그라운드 흡광도(Background absorbance)가 감산되었다(subtracted). 그래프에서의 오차 바아(error bar)들은 3중으로 수행된 각 조건에 대한 평균들에 대해 계산된 표준 편차들을 반영하고 있다. 특정 돌연변이들은 시험된 효소들의 활성을 변화시킨다(도 20(b), 표 H). 또한, 효소 조작은 원하는 효소 반응의 특이성 및 활성을 개선시킬 것이다.
[표 G] 후보 신타제 및 하이드록시피루베이트와의 활성의 목록.
Figure pct00030
[표 H] 돌연변이 후보 신타제 및 하이드록시피루베이트와의 활성 및 야생형 신타제와 비교의 목록.
Figure pct00031
경로 효소들을 인코딩하는 핵산 서열을 함유하는 플라스미드로 이 콜라이의 형질전환
플라스미드 DNA 분자들은 화학적 변형 또는 전기천공에 의해 실시예 2에서 기재된 참조된 경로로 조작된 표적 이 콜라이 세포 내로 도입된다. 화학적 형질전환을 위해, 세포들은, 600 nm에서의 광학 밀도에 의해 결정되는 바와 같이, 중간 로그 성장 단계로 성장한다(0.5-0.8). 세포들을 수확하여 세척하고, 최종적으로 CaCl2를 처리한다. 이 이 콜라이 세포들을 화학적으로 형질전환시키기 위해, 정제된 플라스미드 DNA를 얼음 상의 마이크로원심분리 관에서 세포 현탁액과 혼합시키도록 허용한다. 열 충격(heat shock)은 혼합물에 적용한 후, 풍부한 배양 배지에서 30-60분 회수 항온처리로 이어진다. 전기천공을 위해, 중간-로그 성장 단계로 성장한 이 콜라이 세포들을 물로 여러 번 세척하고, 최종적으로 10 % 글리세롤 용액에 재현탁한다. 이들 세포 내에 DNA를 전기천공하기 위해(electroporate), 전극을 포함하는 일회용 플라스틱 큐벳으로 세포들과 DNA의 혼합물을 피펫팅한다. 그 다음, 짧은 전기 펄스가 세포에 가해지며, 여기서 DNA가 유입될 수 있는 막에 작은 구멍들이 형성된다. 그 다음, 세포 현탁액은 풍부한 액체 배지와 함께 항온처리한 후, 고체 한천 플레이트에 도막한다. 자세한 프로토콜은 분자 클로닝을 얻을 수 있다: 문헌 [A Laboratory Manual, Third Edition, Sambrook and Russell, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd Edition].
BL21 균주의 이 콜라이 세포들은 기재된 플라스미드 또는 플라스미드들로 형질전환된다. BL21은 유전자형을 갖는 이 콜라이 균주이다: B F- dcm ompT hsdS(rB - mB -) gal [malB+]K-12(λS).
모든 용액들은 증류되고 탈이온화된 물로 제조된다. LB 배지(1 L)는 Bacto 트립톤(즉, 카세인의 효소 소화)(10 g), Bacto 효모 추출물(즉, 자가분해된 효모 세포의 수용성 부분)(5 g) 및 NaCl(10 g)을 함유하였다. LB 글루코오스 배지는 LB 배지 1 L 중에 글루코스(10 g), MgSO4(0.12 g) 및 티아민 하이드로클로라이드(0.001 g)를 함유하였다. LB-동결 완충액은 LB 배지 1 L 중에 K2HPO4(6.3 g), KH2PO4(1.8 g), MgSO4(1.0 g), (NH4)2SO4(0.9 g), 소듐 시트레이트 디하이드레이트(0.5 g) 및 글리세롤(44 mL)을 함유한다. M9 염들(1 L)은 Na2HPO4(6 g), KH2PO4(3 g), NH4Cl(1 g), 및 NaCl(0.5 g)을 함유한다. M9 최소 배지는 M9 염 1 L 중에 D-글루코오스(10 g), MgSO4(0.12 g) 및 티아민 하이드로클로라이드(0.001 g)을 함유한다. 항생제들을 하기 최종 농도에 따라 적절하게 첨가한다: 암피실린(Ap), 50 μg/mL; 클로람페니콜(Cm), 20 μg/mL; 카나마이신(Kan), 50μg/㎖; 테트라사이클린(Tc), 12.5 μg/mL. 항생제들의 스톡 용액들은, 95 % 에탄올에서 제조된 클로람페니콜 및 50 % 수성 에탄올에서 제조된 테트라사이클린을 제외하고는, 물에서 제조된다. 아이소프로필-B-D-싸이오갈락토피라노사이드(IPTG)의 수성 스톡 용액들을 다양한 농도로 제조한다.
표준 발효 배지(1 L)는 K2HPO4(7.5 g), 암모늄 철(III) 시트레이트(0.3 g), 시트르산 모노하이드레이트(2.1 g) 및 농축된 H2SO4(1.2 mL)를 함유한다. 발효 배지는 오토클레이빙 전에 농축된 NH4OH를 첨가하여 pH를 7.0으로 조정한다. 다음의 보충제들은 발효의 개시 직전에 첨가된다: D-글루코오스, MgSO4(0.24 g), 칼륨 및 미량 미네랄, 예컨대 (NH4)6(Mo7O24).4H2O(0.0037 g), ZnSO4.7H2O(0.0029 g), H3BO3(0.0247 g), CuSO4.5H2O(0.0025 g), 및 MnCl2.4H2O(0.0158 g). 표시된 최종 농도까지 IPTG 스톡 용액을 필요에 따라(예컨대, 600 nm에서의 광학 밀도가 15-20일 때) 첨가한다. 글루코오스 공급 용액 및 MgSO4(1 M) 용액을 개별적으로 오토클레이빙한다. 글루코스 300 g과 H2O 280 mL를 혼합하여 글루코스 공급 용액(650g/L)을 제조한다. 미량 미네랄과 IPTG의 용액을 0.22-μm 막을 통해 멸균한다. 안티폼(antifoam)(Sigma 204)을 필요에 따라 발효 브로쓰에 첨가한다.
씨드 접종물은 LB 한천 플레이트로부터 선택된 단일 콜로니를 50 mL TB 배지(1.2 % w/v Bacto 트립톤, 2.4 % w/v Bacto 효모 추출물, 0.4 % v/v 글리세롤, 0.017 M KH2PO4, 0.072 M K2HPO4) 내에 도입함으로써 시작된다. 배양은 이들이 혼탁해질 때까지 250 rpm에서 교반하면서 37 ℃에서 밤새도록 재배한다. 모든 배양 조건들은, 생합성 경로 유전자들을 함유하는 플라스미드가 호스트 세포에서 유지되고 발현되도록 하기 위한 적절한 선택 압력을 포함한다. 이어서, 이 배양의 2.5 mL 분취량을 50 mL의 신선한 TB 배지에 옮긴다. 추가로 3 시간 동안 37 ℃ 및 250 rpm으로 배양한 후, IPTG는 0.2 mM의 최종 농도로 첨가된다. 생성된 배양은 4 시간 동안 30 ℃로 성장시킨다. 세포를 수확하고, PBS 배지로 2 회 세척하고, 글루코스(2 g/L)가 보충된 0.5 원래 부피의 M9 배지에 재현탁한다. 그 다음, 전체 세포 현탁액을 30 ℃에서 48 시간 동안 배양 한다. 샘플들을 취하고, GC/MS 및 1H-NMR로 분석한다.
실시예 3 - 하이드록시피루베이트부터 출발하는 알파 ( 하이드록시메틸 ) 말산의 생성을 이한 재조합 미생물의 구성.
실시예 2에 열거된 DNA 단편들에 더하여, 포스파타제를 인코딩하는 DNA 단편이 포함된다. 포스파타제 유전자는 이 콜라이로부터의 yeaB 유전자 또는 에스 세레비시아에(S. cerevisiae)(US2011294178A1, WO2010076324A1)로부터의 GPP2로부터 선택되는 포스포하이드록시피루베이트 포스파타제이다. 생성된 플라스미드는 하이드록시피루베이트로부터 출발하여 알파 (하이드록시메틸) 말산의 생성을 위한 모든 경로 유전자들을 성공적으로 전사한다.
알파 (하이드록시메틸) 말산의 생성에 사용된 미생물은, 박테리아뿐만 아니라, 효모 및 사상균들을 포함하는 진균으로부터 선택될 수 있다. 하이드록시피루베이트를 과생성하는 미생물을 구성하기 위해, 포스포세린 아미노트랜스퍼라제를 코딩하는 serC(Uniprot P23721) 유전자는 결실된다. serC 결실은 3-포스포 하이드록시피루베이트의 과생성하게 되며, 이는 yeaB 또는 GPP2에 의해 하이드록시피루베이트로 변환된다. 이 유전 전략은, 박테리아 또는 진핵생물 생성이 요구되는 경우들에서, 유전 조작 단계들에 대한 출발 균주를 구성하는 데 사용된다. 본원에서 기재된 하이드록시피루베이트의 과생성 생명체는 실시예 2에서 기재된 세린 과생성 생명체에 대한 대안으로서 사용될 수 있다.
포스파타제 활성은 당해 분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 검출할 수 있다. 예를 들어, Ho 등에서 기재된 검정은 포스파타제 활성을 결정하는 데 사용될 수 있다. 또한, 통상적으로 포스파타제 활성을 측정하는 데 사용되는 몇 가지 상업적으로 이용 가능한 키트들이 있다.
Ho, Noji 및 Saito의 문헌 [아라비돕시스 탈리아나로부터의 3-포스포세린 포스파타제의 세린 생합성, 분자 클로닝 및 발현의 플라스티딕 경로(Plastidic pathway of serine biosynthesis. Molecular cloning and expression of 3-phosphoserine phosphatase from Arabidopsis thaliana). J Biol chem. 1999 Apr 16; 274(16):11007-12.]
실시예 4 - 이타타르타르산 및/또는 하이드록시파라콘산의 생성을 위한 재조합 미생물의 구성.
이타타르타르산로도 칭하는 알파 알파 (하이드록시메틸) 말산을 과생성하는 균주들은 배양된다. 이타콘산 및 이타타르타르산을 과생성하는 균주 및 배양 조건들은 문헌 [Jakubowska 등, 1974; Guevarra and Tabuchi, 1990 a and b; and Geiser 등, 2014]에 기재되어 있다. 또 다른 반복에서, 이타코닉 옥시다제를 인코딩하는 DNA 단편은 과생성된다. 이타코닉 옥시다제 유전자를 아스페르길루스(Aspergillus) 또는 우스틸라고(Ustilago)(문헌 [Jakubowska 등, 1974; Guevarra and Tabuchi, 1990 a and b; Geiser 등, 2014])로부터이다. 생성된 플라스미드는 이타타르타르산으로도 불리는 알파 (하이드록시메틸) 말산의 생성을 위해 모든 경로 유전자들을 성공적으로 전사한다. 이타코닉 옥시다제 유전자의 돌연변이 형태는 증가된 활성을 표시한다(문헌 [Aprai, 1958; Aprai, 1959; Jakubowska 등., 1967]). 락톤 형태의 하이드록시파라콘산도 또한 생성된다.
이타타르타르산으로의 이타코닉 변환에 필요한 유전자들을 발현하는 플라스미드는 이타코닉 과생성 호스트로 형질전환된다. 예를 들어, 아스페르길루스(Aspergillus) 및 우스틸라고(Ustilago) 균주들, 구체적으로는 아스페르길루스 테레우스(Aspergillus terreus), 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger), 우스틸라고 시노돈티스(Ustilago Cynodontis) 또는 우스틸라고 메이디스(Ustilago maydis)는 호스트로서 사용된다. 이타코닉 옥시다제 활성은 야생형 효소로부터 자연적으로, 야생형 유전자의 과발현으로부터, 또는 돌연변이 이타코닉 옥시다제 유전자의 발현으로부터 발생한다. Vuoristo 등 2014에서 기재된 바와 같이, 이타콘산을 과생성하는 조작된 이 콜라이는 이타코닉 옥시다제 유전자로 형질전환되어 이타타르타르산을 생성할 수 있다.
이타콘산 옥시다제 활성은 당해 분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 검출할 수 있다. 예를 들어, Geiser 등.에서 기재된 검정은 HPLC 검정을 통해 생성물 이타타르타르산을 검출함으로써 이타코닉 옥시다제 활성을 결정하는 데 사용될 수 있다.
우스틸라고 메이디스(Ustilago maydis) 및 아스페르길루스 테레우스(Aspergillus terreus)는 30 ℃에서 9일까지 동안 한정된 배지에서 성장시켰다. 성장 배지는 표시된 pH로 조정된 1 L 당 120 g 글루코스, 1 g 유레아, 0.2 g KH2PO4, 1 g MgSO4*7H2O, 1 g 효모 추출물 및 1000x 미량 금속 용액 1 mL로 이루어졌다. 1000x 미량 금속 용액은 0.125 g ZnSO4 및 1.25 g FeSO4*7H2O를 물 250 mL에 첨가하여 제조하였다. 유 메이디스(U. maydis)는 pH 3, pH 5 및 pH 7 배지에서 성장시키는 한편, 에이 테레우스(A. terreus)는 pH 3 배지에서 성장시켰다. 시간 지점을 대략 매 24 h마다 취하고, 상청액을 HPLC를 통해 분석하였다. 이타타르타르산은 이의 락톤 형태, 하이드록시파라콘산(HP)으로 우세하게 존재하는 것으로 관찰되었다. HP 생성물의 수준들은 합성된 ITT/HP 표준의 여러 양들과 비교하여 예측되었다. 우스틸라고 메이디스(Ustilago maydis) 및 아스페르길루스 테레우스(Aspergillus terreus) 둘다는 HP를 생성시켰다(도 21(a) 및 (b)).
Aprai의 문헌 [이타코닉 옥시다제: 아스페르길루스 테레우스의 자외선-유도된 돌연변이체로부터의 효소(Itaconic oxidase: an enzyme from an ultraviolet-induced mutant of Aspergillus terreus). Nature, 1958, 182, 661-662.]
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Guevarra 및 Tabuchi의 문헌 [우스틸라고 속의 균주에 의한 이타콘산, 2-하이드록시파라콘산, 이타타르타르산 및 말산의 축적(Accumulation of Itaconic, 2-hydroxyparaconic, itatartaric, and malic acids by strains of the genus Ustilago). Agric. Biol. Chem. 1990, 54 (9), 2353-2358.]
Guevarra 및 Tabuchi의 문헌 [우스틸라고 시노돈티스에 의한 2-하이드록시파라콘산 및 이타타르타르산의 생성, 및 산의 단순한 회수 공정(Production of 2-hydroxyparaconic and itatartaric acids by Ustilago Cynodontis and simple recovery process of the acids). Agric. Biol. Chem., 1990, 54 (9), 2359-2365.]
Jakubowska 및 Metodiewa의 문헌 [아스페르길루스 테레우스에 의한 이타타르타르산 형성을 위한 대사 경로에 대한 연구, 세포-부재 추출물에 의한 (-)-시트라말레이트, 시트라네이트 및 이타코네이트의 용도(Studies on the metabolic pathway for itatartaric acid formation by Aspergillus terreus II. Use of (-)-citramalate, citraconate and itaconate by cell-free extracts). Acta Microbiologica Polonica Ser. B 1974, Vol. 6 (23), No. 2, 51-61.]
Jakubowska, Oberman, Makiedonska 및 Florianowicz의 문헌 [아스페르길루스 테레우스 NRRL 1960의 uv- 및 감마-조사된 격리물에 의한 이타콘산 및 이타타르타르산 형성(The itatonic and itatartaric acid formation by uv- and gamma-irradiated isolates of Aspergillus terreus NRRL 1960). 1967, 16(1), 53-68.]
Vuuoristo 등의 문헌 [대장균에서 이타코네이트 생성의 대사 조작(Metabolic engineering of itaconate production in Escherichia coli). Appl Microbiol Biotechnol, July 2014.]
실시예 5 - 알파 ( 하이드록시메틸 ) 말산으로부터 출발하여 알파 ( 하이드록시메틸 ) 말레산의 생성을 위한 재조합 미생물의 구성.
실시예 2 및 3에 열거된 DNA 단편에 더하여, 디하이드라타제를 인코딩하는 DNA 단편(도 4, C열)이 포함된다. 도 3 그리고 더욱 특히는 도 9 단계 C에서 제시된 바와 같이, 재조합 핵산 서열들의 도입을 통해 재조합 미생물에서 디하이드라타제 활성이 증가된다. 구체적으로, 디하이드라타제 유전자는 이 콜라이 유래의 아코니테이트 하이드라타제이다(EC 4.2.1.3). 알파 (하이드록실 메틸) 말산으로부터 출발하여 알파 (하이드록실 메틸) 말레산의 생성을 위한 모든 경로 유전자들을 성공적으로 전사하는 생성된 플라스미드는 실시예 2, 3 및 4에서 기재된 생명체로 형질전환된다.
디하이드라타제 검정
디하이드라타제들을 인코딩하는 이 콜라이에 최적화된 유전자를 합성하고 pTrcHisA(Life Technologies(이전의 Invitrogen))에 클로닝하였다. 디하이드라타제 후보들이 표 I에 있다. 최적화된 신타제 유전자들을 함유하는 플라스미드는 BL21 이 콜라이 세포들로 형질전환된다. 빈 플라스미드 pTrcHisA는 또한 음성 대조군으로서 형질전환된다. 발현 및 특성화 실험을 위해, 40 ML TB를 포함하는 쉐이크 플라스크들은 밤새도록 배양액들에서 5 %에서 접종된다. 플라스크들을 2 시간 동안 250 rpm 진탕으로 30 ℃에서 배양한 다음, 단백질 생성을 0.2 mM IPTG로 유도하고 30 ℃에서 4 시간 동안 진탕하면서 배양한다. 세포들을 원심분리하여 수확하고, 펠렛들을 -80 ℃에서 저장된다.
[표 I] 디하이드라타제 후보
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디하이드라타제 후보들의 활성은, UV-분광기로 235 nm에서 측정한 알파 치환된 말레익 생성물에서의 이중 결합으로의 알파 치환된 말릭 기질에서의 단일 결합의 변환을 사용하는 시험관내 검정으로 평가한다. 효소 활성은 기질 없이 또는 기질로서 알파 치환된 말릭을 사용하여 시험한다. 이중 결합의 형성은 235 nm에서의 흡수를 증가시킨다. 반응은 또한 반대 방향, 이중 결합으로부터 단일 결합까지 시험될 수 있으며, 이는 235 nm에서의 흡수를 감소시킨다. 순방향 또는 역방향 중 어느 하나는 원하는 반응에 대한 디하이드라타제 후보의 활성을 계산할 수 있는 정보를 제공할 것이다. 달리 특정화되지 않는 한, 모든 화학물질은 Sigma-Aldrich Chemical Company, St. Louis, MO에서 구입한다.
세포는 제조업자의 지침들을 사용하여 BeadBeater(BopSpec 제품들, Bartlesville, OK)를 사용하는 기계적 파괴를 사용하여 용해시킨다. 세포 용해물은 원심분리(14,000G에서 5 분간)에 의해 부분적으로 정화된다. 생성된 정화된 용해물의 단백질 농도를 BioRad total Protein assay를 통해 제조업자의 지침들을 사용하여 측정한다. 용해물들은 100 mM TAPS 완충액 중 단백질 농도에 의해 표준화된다. 표준화된 용해물을 100 mM TAPS 완충액에서 1로부터 10까지 희석한다. 10 μl의 용해물을 96-웰 플레이트 분석을 위해 각 웰에 첨가하였다. 각 조건은 3중으로 수행되었다.
반응 혼합물은 100 mM TAPS 완충액 pH 6.8, 100 mM KCl, 100 mM 기질 알파 (하이드록시메틸) 말레산을 함유한다. 디하이드라타제 용해물을 1 mM 암모늄 철 황산염 및 5 mM DTT의 존재 하에 항온처리하여 30 분 동안 효소의 철-황 클러스터(cluster)를 재구성한다. 반응을 시작하기 위해 90 μl의 반응 혼합물을 이미 10 μl 용해물이 들어있는 각 웰에 첨가한다. 이 마이크로플레이트에서의 반응은 235 nm에서 모니터링된다. 판독들은 매 9 초마다 10 분 동안 취해지며, 데이터는 각 효소의 활동을 계산하는 데 사용된다. 백그라운드 흡광도는 존재하는 기질이 없는 동일한 반응에 의해 측정된다.
동일한 반응들을 30 ℃에서 밤새도록 항온처리하도록 허용하였다. 샘플들을 100 ℃에서 5 분간 끓여 단백질을 변성시킨다. 샘플을 원심분리하여 단백질 파편(debris)을 제거하고, 생성된 상청액을 HPLC로 분석하여 원하는 생성물의 형성을 측정한다.
용해물들은 밤새도록 30 ℃에서 공지된 양의 합성된 ITT를 사용하여 또는 사용하지 않고서 항온처리한 후, 샘플들을 HPLC로 분석하였다. 이 콜라이 세포들이 ITT의 존재 하에서 항온처리될 때, 피크가 현저하게 증가하는 것으로 관찰되었다(도 22(a)). NMR 분석을 위해 샘플을 제출하였다. 결과들에서는, ITT 기질이 첨가된 용해물들에서만 생성물이 형성되었음을 나타낸다. 호모시트레이트 및 이의 탈수된 형태 호모아코니테이트, 뿐만 아니라 시트르산과 시스-아코니테이트, 시트라말릭으로부터 시트라코닉까지 등과 같은 구조적 유사체와의 비교는 탈수 생성물의 피크 특성의 존재를 확인하였다(도 22(b)). 결과들에서는, 내인성 이 콜라이 디하이드라타제가 빈 벡터 제어 세포들에서 탈수 생성물의 존재에 의해 표시되는 바와 같이, ITT 탈수 반응을 촉매할 수 있음을 시사한다. 녹아웃(knockout) 이 콜라이 균주들에 대한 연구는 이 콜라이 아코니타제 acnA는 관찰된 탈수 생성물을 생성할 수 있다(도 23).
도 23에서, 빈 벡터(ptrc) 또는 내인성 이 콜라이 디하이드라타제, acnA 또는 acnB를 발현하는 플라스미드를 발현하는, acnA 또는 acnB가 결실된 이 콜라이 세포들에서의 기질 없는 대조군과 비교되는 디하이드라타제 생성물의 수준들을 나타낸다. 표시된 용해물은 30 ℃에서 밤새도록 존재하는 이타타르타르산(ITT)을 사용하여 또는 사용하지 않고서 항온처리하였다. 샘플들은 HPLC에 의해 분석하였다
실시예 6 - 알파 ( 하이드록시메틸 ) 말레산으로부터 출발하는 알파 ( 하이드록시메틸 ) 푸마르산의 생성을 위한 재조합 미생물의 구성.
실시예 5에 열거된 DNA 단편에 더하여, 아이소머라제(도 4, F열)를 인코딩하는 DNA 단편이 포함된다. 도 3 및 더욱 구체적으로는 도 9의 단계 F에서 제시된 바와 같이, 아이소머라제 활성은 재조합 핵산 서열의 도입을 통해 재조합 미생물에서 증가된다. 구체적으로, 아이소머라제 유전자는 슈도모나스 푸티 다(Pseudomonas putida)(EC 5.2.1.1)로부터의 시스-트랜스 아이소머라제 및 쉬웨넬라 오네이덴시스(Shewenella oneidensis)로부터의 prpF로부터 선택된다(Grimek 등, 2003). 제 3 후보는 우스틸라고 메이디스(Ustilago maydis)로부터의 Adi1(UMAG_11777)이다(Geiser 등, 2016). 알파 (하이드록시메틸) 말레산으로부터 출발하여 알파 (하이드록시메틸) 푸마르산의 생성을 위한 모든 경로 유전자들을 성공적으로 전사하는 생성된 플라스미드는 실시예 5에서 기재된 생명체로 형질전환시킨다.
다른 반복에 있어서, 메타노사에타 터모필레(Methanosaeta thermophile) 또는 메타노사에타 잔나쉬이(Methanococcus jannashii)로부터, 트랜스-호모아코니테이트 신타제를 인코딩하는 DNA 단편, aksA가 포함되어 있다. aksA의 발현은 하이드록시피루베이트로부터 알파 (하이드록시메틸) 푸마르산을 생성한다(Howell 등, 1998).
알파 (하이드록시메틸) 푸마르산 트랜스포터를 인코딩하는 DNA 단편의 첨가는 알파 (하이드록시메틸) 푸마르산의 생성을 증가시킨다. 구체적으로, 트랜스포터 유전자는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtillis)로부터의 푸마릭 트랜스포터 유전자, ydbH이다(Asai 등, 2000).
Asai , Baik , Kasahara , Moriya , 및 Ogasawara의 문헌 [바실러스 서브틸리스에서 C4-다이카복실산의 수송 시스템의 조절(Regulation of the transport system of C4- dicarboxylic acids in Bacillus subtilis) . Microbiology, 2000. 143, 263-271.]
Geiser , Przybilla , Friedrich , Buckel , Wierckx , Blank, 및 Bolker의 문헌 [우스틸라고 메이디스는 비통상적인 중간체 트랜스-아코니테이트를 통해 이타콘산을 생성시킨다(Ustilago maydis produces itaconic acid via the unusual intermediate trans-aconitate). Microbiology Biotechnology, 2016. 9,116-129.]
Grimek 및 Escalante - Semerena의 문헌 [쉬웨넬라 오네이덴시스의 acnD 유전자는 생체 내 prpF 기능을 요구하는 새로운 Fe/S-의존성 2-메틸시트레이트 디하이드라타제 효소를 인코딩한다(The acnD genes of Shewenella oneidensis and Vibrio cholera encode a new Fe/S -dependent 2- methylcitrate dehydratase enzyme that requires prpF function in vivo) . Journal of bacteriology, Jan. 2004, p. 454-462.]
Howell, Harich , Xu , 및 White의 문헌 [메탄생성 고생물에서 조효소 B (7-머캅토헵타노일 트레오닌 포스페이트)의 생합성에 관여된 A-케토산 쇄 연장 반응(A- Keto acid chain elongation reactions involved in the biosynthesis of coenzyme B (7- mercaptoheptanoyl threonine phosphate) in methanogenic archea) . Biochemistry, 1998. 37, 10108-10117.]
실시예 7 - 세린 과생성 미생물에서 스페이서 경로를 이용하는 알파 (하이드록시에틸) 말산의 생성을 위한 재조합 미생물의 구성.
세린 생성 생명체는 실시예 2에 기재되어 있다. 실시예 2, 3, 4 및 5에 열거된 DNA 단편들에 더하여, 하이드라타제(도 4, D열), 디하이드로게나제(도 4, E열), 신타제(도 4, B열), 디하이드라타제(도 4, C열)가 포함된다. 도 3, 및 더욱 구체적으로는 도 9의 단계 B, C, D 및 E에서 제시된 바와 같이, 하이드라타제, 디하이드로게나제, 신타제 및 디하이드라타제 활성은 재조합 핵산 서열들의 도입을 통해 재조합 미생물에서 증가된다. 구체적으로, 하이드라타제는 쉬조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)로부터의 호모아코니테이트 하이드라타제이고(EC 4.2.1.36), 디하이드로게나제는 메타노사에타 잔나쉬이(Methanococcus jannashii)로부터의 호모아이소시트레이트 디하이드로게나제이고(EC 1.1.1.87), 신타제는 쉬조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)로부터의 호모시트레이트 디하이드로게나제이고(2.3.3.14), 디하이드라타제는 이 콜라이로부터의 아코니테이트 하이드라타제(4.2.1.3)이다. 이들 효소의 조작된 돌연변이체들은 스페이서 경로의 중간체들에 대한 특이성을 증가시키도록 구성된다.
세린 과생성 미생물에서 '스페이서 경로'를 이용하는 알파 (하이드록시에틸) 말산의 생성을 위한 모든 경로 유전자들을 성공적으로 전사하는 생성된 플라스미드는 실시예 2, 3, 4 및 5에서 기재된 생명체들로 형질전환된다.
또한, 알파 (하이드록시에틸) 말산 트랜스포터를 인코딩하는 DNA 단편의 발현은 알파 (하이드록시에틸) 말산의 생성을 개선시킨다. 구체적으로, 트랜스포터 유전자는 말산 트랜스포트 유전자들, 이 콜라이로부터의 tehA(UNIPROT E0IVN4), 에스 폼베(S. pombe)로부터의 mae1(Saayman 등, 2000), 및 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)로부터의 ykxJ(Krom 등, 2001), 또는 이의 유사체들로부터 선택된다.
Krom , Aardema , 및 Lolkema의 문헌 [바실러스 서브틸리스 YxkJ는 L-말레이트 및 시트레이트를 수송하는 2-하이드록시카복실레이트 트랜스포터 패밀리의 제 2 트랜스포터이다(Bacillus subtilis YxkJ is a secondary transporter of the 2- hydroxycarboxylate transporter family that transports L-malate and citrate). J Bacteriol , 2001 Oct; 183(20):5862-9.]
Saayman , van Vuuren , van Zyl , 및 Viljoen -Bloom의 문헌 [칸디다 유틸리스 및 쉬조사카라오미세스 폼베에 의한 푸마레이트의 상이한 흡수(Differential uptake of fumarate by Candida utilis and Schizosaccharaomyces pombe ). Appl Microbiol Biotechnol , 2000. 54: 792 -798.]
실시예 8 - 알파 (2- 하이드록시프로필 ) 말산의 생성을 위한 재조합 미생물의 구성.
알파 (2-하이드록시프로필) 말산의 생성에 사용된 미생물은, 박테리아뿐만 아니라, 효모 및 사상균을 포함하는 진균으로부터 선택할 수 있다. 호모트레오닌 은, 트레오닌 과생성 미생물을 이용하는, 실시예 7에서 기재된 스페이서 경로를 사용하여 생성될 수 있다. 다른 반복에서, ilvA, leuA, leuCD 및 leuB의 발현은 중간체 4-하이드록시-2-옥소-펜타노산의 생성을 초래한다(Shen 및 Liao). 이 반복은, Adrio 및 Demain에 의한 검토에서 기재한 바와 같이, 트레오닌 과생성 균주에서 이용된다. 예를 들어, 박테리아 생성이 요구되는 경우, 이 콜라이 또는 세라티아 마르센센스(Serratia marcencens)는 후속적인 유전자 조작 단계들의 출발 균주로서 사용될 수 있다. 유사하게, Ramos 및 Calderon에서 기재된 미생물은, 진핵생물 생성이 요구되는 경우, 후속적인 유전 조작 단계들을 위한 출발 균주로서 사용될 수 있다.
호모트레오닌 과발현 세포의 상기 실시예에 더하여, 중간체 4-하이드록시-2-옥소-펜타노산은 여러 가지 대안적인 방법들을 통해 생성된다. 하나의 반복에서, 피루베이트 알돌라제(EC 4.1.3.39)의 발현은 중간체 4-하이드록시-2-옥소-펜타노산을 생성한다(Manjasetty 등).
호모트레오닌 과발현 균주에서, 트랜스아미나제(도 4, A열) 및 신타제(도 4, B열)를 인코딩하는 DNA 단편들은 발현 벡터에 클로닝된다. 유전자 후보들 및 그들의 서열은 도 4, 맨 오른쪽 칼럼에서 식별된다. 도 3 및 더욱 구체적으로 도 10 단계 A 및 B에 나타낸 바와 같이, 트랜스아미나제 및 신타제 활성은 재조합 핵산 서열들의 도입을 통해 재조합 미생물에서 증가된다. 구체적으로, 트랜스아미나제 유전자는 쉬조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)로부터의 분지된-쇄-아미노산 트랜스아미나제이고(EC 2.6.1.42), 신타제는 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)로부터의 2-아이소프로필말레이트 신타제이다(2.3.3.13). 생성된 플라스미드는 모든 경로 유전자들을 성공적으로 전사한다.
또한, 알파 (2-하이드록시프로필) 말산 트랜스포터를 인코딩하는 DNA 단편의 발현은 알파 (2-하이드록시프로필) 말산의 생성을 개선시킨다. 구체적으로, 트랜스포터 유전자는 에스 세레비시아에(S. cerevisiae)로부터의 아이소프로필말산 트랜스포터 유전자, Oac1P(Marobbio 등, 2008) 또는 이의 유사체들로부터 선택된다.
Adrio 및 Demian의 문헌 [상업용 생성의 제조를 위한 재조합 생명체(Recombinant organisms for production of indrustrial production). Bioengineered Bugs, March/April 2010, 1:2, 116-131.]
Manjasetty , Powlowski , 및 Vrielink의 문헌 [2작용성 알돌라제-디하이드로게나제의 결정 구조: 반응성 및 휘발성 중간체의 격리(Crystal structure of a bifunctional aldolase - dehydrogenase : sequestering a reactive and volatile intermediate). PNAS , 2002, vol. 100, no. 12.]
Marobbio , Giannuzzi , Paradies , Pierri , 및 Palmieri의 문헌 [a- 아이소프로필말레이트 , 효모에서의 류신 생합성 중간체는 미토콘드리아 옥살로아세테이트 캐리어에 의해 수송된다(a-Isopropylmalate, a leucine biosynthesis intermediate in yeast, is transported by the mitochondrial oxaloacetate carrier). J Biol Chem .2008. 283(42): 28445 -28453.]
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Shen 및 Liao의 문헌 [케토산 경로를 통한 1-뷰탄올 및 1-프로판올 생성을 위한 대장균의 대사 조작(Metabolic engineering of Escherichia coli for 1-butanol and 1- propanol production via the keto -acid pathways. Metabolic Engineering, 2008, 10: 312 -320.]
실시예 9 - 알파 치환된 3- 하이드록시프로피온산의 생성을 위한 재조합 미생물의 구성.
실시예 2, 3 및 4에 열거된 DNA 단편들에 더하여, 디하이드라타제(도 6, A열), 하이드라타제(도 6, B열), 리덕타제(도 6, C열), 디카복실라제(도 6, D열) 및 알데하이드 리덕타제(도 6, E열)를 인코딩하는 DNA 단편들은 발현 벡터에 클로닝된다. 유전자 후보들 및 그들의 서열은 도 6의 맨 오른쪽 칼럼에 표시되어 있다. 구체적으로는, 디하이드라타제 유전자는 이 콜라이로부터의 아코니테이트 하이드라타제이고(EC4.2.1.3), 하이드라타제 유전자는 에스 폼베(S. pombe)로부터의 호모아코니테이트 하이드라타제이고(EC 4.2.1.36), 리덕타제 유전자는 에스 세레비시아에(S. cerevisiae)로부터의 말레이트 디하이드로게나제이고(EC1.1.1.37), 디카복실라제 유전자는 에스 세레비시아에(S. cerevisiae)로부터의 분지된 쇄 2-옥소산 디카복실라제이고(EC 4.1.1.72), 알데하이드 리덕타제 유전자는 에스 세레비시아에(S. cerevisiae)로부터의 알데하이드 리덕타제이다(EC 1.1.1.21). 모든 경로 유전자들을 성공적으로 전사하는 생성된 플라스미드는, 실시예 2, 3 또는 4에서 기재된 바와 같이, 호스트 생명체로 형질전환된다.
단계 A, B 및 C의 특정 실시예들은 알파 치환된 말산이 2-아이소프로필 말산인 류신 합성 경로에서 설명된다. 효소 3-아이소프로필말레이트 디하이드라타제는 수화(hydration) 및 디하이드라타제 단계들 둘다를 수행하여 3-아이소프로필말레이트를 생성한다. 효소 3-아이소프로필 말레이트 디하이드로게나제는 단계 C에서 예시된 리덕타제 작용을 제공한다. 이들 효소는 효모를 포함하는 많은 종에 존재한다(Hsu 및 Kohlhaw). 단계 D의 실시예를 위해, 디카복실라제, 효소는 2-케토산 디카복실라제일 수 있다. 다수의 2-옥소산 디카복실라제는 자연에서 존재하며, 활용될 수 있는 상이한 특이성들을 가진 단일 생명체 내에 존재한다(Romagnoli 등). 특이성을 변화시키기 위한 2-케토산 디카복실라제들의 조작은 예컨대 Zhang 등에 의해 입증되어 왔다. 리덕타제의 일례(단계 E)는 알코올 디하이드로게나제, adh일 수 있다. 알데하이드 리덕타제/알코올 디하이드로게나제 유전자들은 예컨대 Atsumi 등에 의해 이 콜라이에서 광범위한 특이성을 갖는 것으로 입증되고 있다.
Atsumi , 등의 문헌 [3개의 알데하이드 리덕타제/알코올 디하이드로게나제 유전자의 비교에 의한 대장균에서의 아이소뷰탄올 생합성 경로의 조작(Engineering the isobutanol biosynthetic pathway in Escherichia coli by comparison of three aldehyde reductase /alcohol dehydrogenase genes). Appl Microbiol Biotechnol 2010, 85:651-657.]
Hsu 및 Kohlhaw의 문헌 [사카로미세스 세레비시아에에서의 류신 생합성 (Leucine biosynthesis in Saccharomyces cerevisiae). JBC 1979, Vol 255, No. 15, pp. 7255-7260.]
Romagnoli 등의 문헌 [사카로미세스 세레비시아에에서 티아민 피로포스페이트-의존성 2-옥소산 디카복실라제의 기질 특이성(Substrate specificity of thiamine pyrophosphate-dependent 2- oxo acid decarboxylases in Saccharomyces cerevisiae). Appl Environ Mircobiol 2012, 78(21):7538.]
Zhang 등의 문헌 [비-자연적 알코올의 생합성을 위한 대사의 확대(Expanding metabolism for biosynthesis of non-natural alcohols). PNAS , Dec 2008, vol. 105, no. 52, 20653-20658.
실시예 10 - 발효
공급된-배치 발효는 2 L 작업 용량 발효기에서 수행된다. 온도, pH 및 용존 산소는 PID 제어 루프(loop)들에 의해 제어된다. 온도는 성장 단계에서 발효기 용기 주위를 감싸고 있는 재킷을 통해 온도 조절된 물 유동에 의해 37 ℃로 유지되고, 나중에 생성 단계가 시작될 때 27 ℃로 조정된다. pH는 5 N KOH 및 3 H3PO4의 첨가에 의해 목적하는 수준으로 유지된다. 용존 산소(Dissolved oxygen)(DO) 수준은 교반 속도뿐만 아니라 공기 공급을 조정함으로써 공기 포화도의 20 %로 유지된다.
접종물은 LB 한천 플레이트로부터 추출한 단일 콜로니를 TB 배지 50 mL에 도입함으로써 시작된다. 배양액은 배지가 혼탁해질 때까지 37 ℃에서 250 rpm으로 교반하면서 성장된다. 후속적으로, 100 mL 씨드 배양액을 신선한 M9 글루코스 배지로 옮긴다. 추가로 10 시간 동안 37 ℃ 및 250 rpm에서 배양한 후, 접종물(OD600 = 6-8)의 분액(aliquot)(50 mL)을 발효 용기로 옮기고, 배치식 발효를 개시하였다. 발효 배지에서의 초기 글루코스 농도는 약 40 g/L이다.
발효-제어된 조건 하에서의 배양은 2 단계로 나누어진다. 제 1 단계에서, 기류(air flow)는 300 ccm으로 유지되고, 임펠러(impeller) 속도는 100 %에서 1000 rpm으로 증가되어 DO를 20 %로 유지한다. 임펠러 속도가 1000 rpm에서 이의 미리 설정된 최대 값에 도달하면, 질량 유량 컨트롤러는 순수 O2의 0로부터 100 %까지 산소 보충에 의해 DO를 유지하기 시작한다.
글루코스의 초기 배치는 약 12 시간 후에 고갈되고, 글루코스 공급물(650 g/L)은 용기 내 글루코오스 농도를 5-20 g/L로 유지하기 시작한다. OD600 = 20-25에서, IPTG 스톡 용액을 배양 배지에 최종 농도 0.2 mM까지 첨가한다. 온도 설정은 37 ℃로부터 27 ℃까지 감소되고, 생성 단계(즉, 제 2 단계)가 시작된다. 생성 단계 발효를 48 시간 동안 실행하고, 샘플을 제거하여 세포 밀도를 결정하고 대사산물을 정량화한다. 특정 제품의 생성은 GS/MS에 의해 측정된다.
실시예 11 - 분리
실시예 2, 3 및 4에서 기재된 바와 같이, 세포 배양액들로부터 제조된 알파 (하이드록시메틸) 말산 또는 이타타르타르산을 함유하는 발효 브로쓰는, Guevarra 및 Tabuchi 등, 1990에서 기재된 절차를 사용하여 처리하여 원하는 생성물을 분리한다. 발효 브로쓰를 여과하여 세포들을 제거한 다음, 시럽으로 농축한다. 생성된 시럽은 순환된 형태, 하이드록시파라코닉(hydroxyparaconic)(HP)으로, 알파 (하이드록시메틸) 말산 또는 이타타르타르산의 락톤화를 촉매하도록 감압 하에 6 시간 동안 70 ℃까지 가열된다. 고체 덩어리는 격렬한 교반 하에 가열된 에틸 아세테이트 중에 용해된 것으로 나타난다. 용매 층을 분리한 후, 결정질 덩어리가 형성될 때까지 농축 및 건조시켰다. HP의 추가 정제는 에틸 아세테이트 및 클로로포름으로 결정화하여 수행한다. 최종 생성물의 순도는 HPLC를 통해 분석된다. 이타타르타르산 소듐 염은, 차가운 H2O에 용해시키고, 0.05N NaOH로 적정함으로써 재결정된 HP로부터 제조된다. 이 용액을 비등 수조에서 10 분 후, 감압 하에 농축하고, 최종적으로 O를 105 ℃ 오븐에서 건조시켜 가열한다. 최종 생성물의 순도는 HPLC를 통해 분석된다.
호모시트레이트를 포함하는 다른 알파 치환된 말산 중간체들은 다양한 카복실산에 대해 개발된 방법을 사용하여 분리된다. 그러한 방법들로는, Kumar 및 Babu 2008에서 검토된 바와 같이, 음이온 교환, 한외 여과, 증류, 전기 투석, 역삼투압 및 다양한 추출 방법들을 사용한 분리가 포함된다.
Guevarra 및 Tabuchi의 문헌 [우스틸라고 시노돈티스에 의한 2-하이드록시파라콘산 및 이타타르타르산의 생성, 및 산의 단순한 회수 공정(Production of 2- hydroxyparaconic and itatartaric acids by Ustilago cynodontis and simple recovery process of the acids). Agric . Biol . Chem ., 1990, 54 (9), 2359-2365.]
Kumar 및 Babu의 문헌 [반응성 추출을 사용하여 발효로부터 카복실산의 분리를 위한 강화 방법(Process intensification for separation of carboxylic acids from fermentation broths using reactive extraction). Journal on Future Engineering & Technology, Vol. 3(3), pp 19.26.]
실시예 12 - 2-메틸렌 글루타르산으로의 호모시트르산의 변환
작용화된 알파 치환된 아크릴산으로의 작용화된 알파 치환된 C4 다이카복실산의 변환은 2-메틸렌 글루타르산을 생성시키기 위해 Pt계 촉매를 소듐 호모시트르산과 접촉시킴으로써 실시하였다.
재료 및 방법
실험은 5 %의 Pt/Al2O3을 사용하고, 0.1N NaOH 베이스를 첨가하여 수행되었다. 촉매 적재는 2.5 몰%이고(Pt 금속의 건조한 분말에 기초하여 계산됨), 사용된 용매는 0.1N NaOH이었다. 반응 시간은 180 ℃의 온도에서 N2의 450 psi 하에 16시간이었다. 다른 반응은 H2 기체 하에 sod. 호모시트레이트 염을 사용하여 오토클레이브에서 Cu계 촉매(Cu 금속에 기초하여 50 몰%)로 순수(pure water)에서 수행하였다.
반응 생성물은 GC/MS(Agilent, 5975B, 불활성, XL, EI/CI)를 사용하여 분석하였다. 촉매의 평가는 GC/MS 데이터의 정성적 결과들에 기초하였다. 시험된 다른 촉매들은 5% Pd/CaCO3, 5% Pd/BaSO4, Cu-0860(사전-환원된) BASF, Cu-0860(비-환원된) BASF, Cu/Zn/Al(사전-환원된)를 포함한다. Pt 및 Pd 지지된 촉매 모두에서, 금속 적재는 2.5 몰%이되, 이 세트의 반응을 위한 건조한 금속에 기초하여 50 중량%를 사용하는 Cu계 촉매들은 제외된다. 상업용 촉매들은 사용하기 직전에 활성화되었다. 촉매 활성화는 하기 프로토콜에 의해 Symyx 고처리 반응기(high throughput reactor)를 사용하는 CCRI 고처리(High-Throughput) 시설에서 수행되었다:
a. 2 시간 동안 N2의 400 psi 하에 180 ℃에서 어닐링
b. 2 시간 동안 H2의 200 psi 하에 180 ℃에서 어닐링
반응들은 Symyx 고처리 모듈(High Throughput Module)(Symyx Discovery Tools)을 사용하여 수행되었다. 전형적인 실험에서, 소듐 호모시트레이트(0.12 밀리몰, 0.032 g)를 자기 교반 바가 장착된 유리 바이알에서 1 mL의 0.1N NaOH에 첨가하였다. 기질을 실온에서 교반함으로써 수성의 0.1N NaOH에 용해시켰다. 그 다음, 생성된 용액은 24 웰 플레이트 상에 배치되고 코어 모듈 상에 적재된 바이알에서 사전-활성화된 촉매(2.5 첨가 몰% Pt 또는 Pd 또는 50 중량%의 Cu 건조한 금속 기초)에 첨가하였다. 반응 혼합물은 450 Psi N2 기체로 가압되고, 16 시간 동안 연속 교반하면서 180 ℃ 온도로 가열되었다. 반응 후, 반응 바이알로부터의 상청액 200 μL을 오븐 건조 바이알로 옮기고, 동결 건조기에서 완전히 건조시켰다.
건조된 샘플은 GC-MS 분석을 시작하기 위해 유도체화에 사용되었다.
메탄올 500 μL 및 1 소적의 황산을 완전히 건조된 샘플(반응 바이알로부터의 상청액 200 μL)에 첨가한 후, 밀봉하고, 교반하고, 90 분 동안 70 ℃에서 샘플들을 가열하였다. 냉각 후, 고체 중탄산 나트륨의 약 30 내지 40 mg은 mg-스쿱(mg-scoop)을 사용하여 수동으로 샘플들에 첨가하고, 5 내지 10 분 교반하였다. 염수 300 μL 및 물 300 μL을 첨가하고, 생성된 혼합물을 5 분 더 교반하였다. ACS-등급의 에틸 아세테이트 600 μL를 첨가한 후, 샘플들은 2개의 상들의 완전한 접촉을 보장하도록 잘 혼합하고, 구획 평형을 구성하였다(5-10 분 동안 씨팅한(sit) 후, 충분히 분리된 상들). 최종적으로, 200 μL를 최상부 유기 상으로부터 제거하고, GC-MS 분석을 위해 1000 μL로 희석시켰다(MeOH).
결과 및 토론
호모시트르산 트라이소듐 염은 알파 치환된 아크릴산, 특히 2-메틸렌 글루타르산으로의 변환을 촉진하기 위해 다양한 금속 촉매들과 접촉시켰다. 소듐 호모시트레이트이 5 % Pt/Al2O3과 접촉한 실험의 결과들은 도 24의 크로마토그램으로 나타내었다. 공지된 피크들은 출발 물질, 호모시트레이트 에스테르, 원하는 아크릴레이트 생성물의 수소화된 형태, 2-메틸글루타르산을 포함한다. 기타 식별된 생성물들은, 체류 시간 10.044 mins에서의 메틸에스테르의 유도화 후, 출발 호모시트레이트와 함께, 9.6 mins에서의 1,2,4-뷰테인트라이카복실산 및 9.834 mins에서의 락톤 에스테르를 포함한다. 이들 피크 중 일부에 대한 질량 스펙트럼 결과들은 도 25(a), 도 25(b) 및 도 26에서 제시된다.
500 psi H2 기체 하에서 소듐 호모시트레이트 염을 사용하는 오토클레이브에서 Cu계 촉매(Cu 금속에 기초하여 50 몰%)로 순수에서 반응이 수행될 때, GC-MS 크로마토그램에서는 주된 피크로서 2-메틸렌 글루타르산의 형성을 제시하였다. 글루을 메인 피크로서 수득 하였다. 도 27(a)는, 500 psi H2 기체 압력 하에서 수중에서 소듐 호모시트레이트와 Cu계 촉매를 사용하는 오토클레이브(5 mL)의 GC-MS 크로마토그램을 제시하며, 도 27(b)/(c)는 생성된 2-메틸렌 글루타르산의 질량 스펙트럼을 나타낸다.
실시예 13 - 알파- 아이소프로필 아크릴산으로의 2- 아이소프로필말산의 변환
작용화된 알파 치환된 아크릴산으로의 작용화된 알파 치환된 C4 다이카복실산의 변환은 알파-아이소프로필 아크릴산을 생성시키기 위해 Cu계 촉매를 2-아이소프로필말산과 접촉시킴으로써 성공적으로 실시하였다.
재료 및 방법
실험은 H2 또는 N2 하에서 Cu 촉매를 사용하여 수행되었다. 촉매 적재는 50 중량%이고(건조한 분말에 기초하여 계산됨), 사용된 용매는 H2O이었다. 반응 시간은 180 ℃의 온도에서 H2 또는 N2의 450 psi 하에 16시간이었다. 반응 생성물은 GC/MS(Agilent, 5975B, 불활성, XL, EI/CI)를 사용하여 분석하였다. 촉매들의 평가는 GC/MS 데이터의 정성적 결과들에 기초하였다.
상업용 CuO 촉매들은 사용하기 직전에 활성화되었다. 촉매 활성화는 하기 프로토콜에 의해 Symyx 고처리 반응기를 사용하는 CCRI 고처리 시설에서 수행되었다:
a. 2 시간 동안 N2의 400 psi 하에 180 ℃에서 어닐링
b. 2 시간 동안 H2의 200 psi 하에 180 ℃에서 어닐링
반응들은 Symyx 고처리 모듈(Symyx Discovery Tools)을 사용하여 수행되었다. 전형적인 실험에서, 2-아이소프로필말산(0.12 밀리몰, 0.0213 g)을 자기 교반 바가 장착된 유리 바이알에서 1 mL의 H2O에 첨가하였다. 기질을 실온에서 교반함으로써 수중에 용해시켰다. 그 다음, 생성된 용액은 24 웰 플레이트 상에 배치되고 코어 모듈 상에 적재된 바이알에서 사전-활성화된 촉매(50 중량%, 0.01065 g)에 첨가하였다. 반응 혼합물은 450 Psi H2 또는 N2 기체로 가압되고, 16 시간 동안 연속 교반하면서 180 ℃ 온도로 가열되었다. 반응 후, 반응 바이알로부터의 상청액 200 μL을 오븐 건조 바이알로 옮기고, 동결 건조기에서 완전히 건조시켰다.
건조된 샘플은 GC-MS 분석을 시작하기 위해 유도체화에 사용되었다. 메탄올 500 μL 및 1 소적의 황산을 완전히 건조된 샘플(반응 바이알로부터의 상청액 200 μL)에 첨가한 후, 밀봉하고, 교반하고, 90 분 동안 70 ℃에서 샘플들을 가열하였다. 냉각 후, 고체 중탄산 나트륨의 약 30 내지 40 mg은 mg-스쿱을 사용하여 수동으로 샘플들에 첨가하고, 5 내지 10 분 교반하였다. 염수 300 μL 및 물 300 μL을 첨가하고, 생성된 혼합물을 5 분 더 교반하였다. ACS-등급의 에틸 아세테이트 600 μL를 첨가한 후, 샘플들은 2개의 상들의 완전한 접촉을 보장하도록 잘 혼합하고, 구획 평형을 구성하였다(5-10 분 동안 씨팅한 후, 충분히 분리된 상들). 최종적으로, 200 μL를 최상부 유기 상으로부터 제거하고, GC-MS 분석을 위해 1000 μL로 희석시켰다(MeOH).
결과 및 토론
출발 물질, 2-아이소프로필말산은 알파 치환된 아크릴산, 알파-아이소프로필 아크릴산으로의 변환을 촉진하기 위해 Cu계 촉매와 접촉시켰다. 2-아이소프로필말산이 H2 하에서 Cu계 촉매와 접촉한 실험의 결과들은 도 28(a)의 크로마토그램으로 나타내었다. 공지된 피크들은 뷰타노산 2,3-다이메틸, 메틸 에스테르- 원하는 아크릴레이트 생성물의 수소화된 형태를 포함한다. 뷰타노산 2,3-다이메틸, 메틸 에스테르의 질량 스펙트럼은 도 28(b)/(c)의 질량 스펙트럼에서 제시된다. 또 다른 피크는 2-아이소프로필말산의 수소화된 유도체, 다이메틸 에스테르(1-메틸에틸)-뷰테인다이오산으로 탈수되는 것으로 결정되었다. 7.435 분에서의 피크는 특정된 반응 조건들 하에서 미반응된 출발 물질, 2-아이소프로필말산이다(주석: 7.435 분의 반응 시간은 도 30(a)에서 7.329 분에서의 진짜 샘플과 약간 다른 데, 이는 샘플이 GC-칼럼의 유지 전에 분석되었기 때문이다).
원하는 알파 치환된 아크릴산의 메틸렌 기의 수소화를 방지하기 위해, 반응은 H2 대신에 N2 하에서 반복하였다. 다른 모든 조건들은 동일하였다. 반응은 원하는 생성물, 아이소프로필 아크릴산의 생성으로 나타났다(도 29(a)의 크로마토그램). 아이소프로필 아크릴산의 질량 스펙트럼은 도 29(b)/(c)에서 제시된다. 출발 물질, 2-아이소프로필 말산의 스펙트럼은 도 30(a)/(b)에서 제시된다. 다른 피크들은 4-메틸-2-펜테노산 및 2-(1-메틸에틸)-2-뷰텐다이오산으로서 식별되었다(도 31(a) /(b) 및 도 32(c)).
실시예 14 - 하이드록시알킬 알파 치환된 아크릴산으로의 하이드록시알킬 알파 치환된 C4 이산의 변환
작용화된 알파 치환된 아크릴산으로의 작용화된 알파 치환된 C4 다이카복실산의 변환은 하이드록시알킬 알파 치환된 아크릴산을 생성시키기 위해 Cu계 또는 Pt계 촉매를 하이드록시알킬 알파 치환된 C4 이산과 접촉시킴으로써 실시하였다. 특히, 하이드록시알킬 알파 치환된 C4 이산은 알파 (하이드록시메틸)말산이며, 생성물은 알파 (하이드록시메틸) 아크릴산이다.
재료 및 방법
실험은 N2 또는 H2 하에서 Cu 또는 Pt 촉매를 사용하여 수행된다. 촉매가 Cu인 경우, 촉매 적재는 50 중량%이고(건조한 분말에 기초하여 계산됨), 사용된 용매는 H2O이다. 촉매가 5% Pt/Al2O3인 경우, 촉매 적재는 2.5 몰%이고(건조한 분말에 기초하여 계산됨), 사용된 용매는 0.1N NaOH이다. 촉매 조건을 위하여, 반응 시간은 180 ℃의 온도에서 N2 또는 H2의 450 psi 하에 16시간이었다. 반응은 실시예 12 및 13에서 기재된 바와 같이 수행된다. 반응 생성물들은 GC/MS(Agilent, 5975B, 불활성, XL, EI/CI)를 사용하여 분석하였다. 촉매들의 평가는 GC/MS 데이터의 정성적 결과들에 기초하였다. 분석은 실시예 12 및 13에서 기재된 바와 같이 수행된다.
결과 및 토론
하이드록시알킬 알파 치환된 C4 이산은, 하이드록시알킬 알파 치환된 아크릴산으로의 변환을 촉진하기 위해 Cu계 또는 Pt계 촉매와 접촉시켰다. 특히, 하이드록시알킬 알파 치환된 C4 이산은 알파 (하이드록시메틸) 말산이고, 생성물은 알파 (하이드록시메틸) 아크릴산이다.
실시예 15 - 툴리팔린으로의 알파 (2-하이드록시에틸) 말산의 변환
작용화된 알파 치환된 아크릴산, 알파 하이드록시에틸 아크릴산으로의 실시예 7의 생성물, 알파 하이드록시에틸 말산의 변환은, 하이드록시알킬 알파 치환된 아크릴산, 알파 (2-하이드록시에틸) 아크릴산을 생성시키기 위해, Cu계 또는 Pt계 촉매를 하이드록시알킬 알파 치환된 C4 이산과 접촉시킴으로써 실시하였다. 하이드록시알킬 알파 치환된 아크릴산 생성물, 알파 (2-하이드록시에틸) 아크릴산은 락톤화되어 툴리팔린을 생성한다. 당해 분야에 익숙한 바와 같이, 락톤화는 임의의 강산, 예컨대 황산, 염산 등을 사용하여 실시된다.
재료 및 방법
실험은 N2 또는 H2 하에서 Cu 또는 Pt 촉매를 사용하여 수행된다. 촉매가 Cu인 경우, 촉매 적재는 50 중량%이고(건조한 분말에 기초하여 계산됨), 사용된 용매는 H2O이다. 촉매가 5% Pt/Al2O3인 경우, 촉매 적재는 2.5 몰%이고(건조한 분말에 기초하여 계산됨), 사용된 용매는 0.1N NaOH이다. 촉매 조건을 위하여, 반응 시간은 180 ℃의 온도에서 N2 또는 H2의 450 psi 하에 16시간이었다. 반응은 실시예 12 및 13에서 기재된 바와 같이 수행된다. 반응 생성물들은 GC/MS(Agilent, 5975B, 불활성, XL, EI/CI)를 사용하여 분석하였다. 촉매들의 평가는 GC/MS 데이터의 정성적 결과들에 기초하였다. 분석은 실시예 12 및 13에서 기재된 바와 같이 수행된다.
결과 및 토론
알파 (2-하이드록시에틸) C4 이산은, 알파-(2-하이드록시에틸) 아크릴산으로의 변환을 촉진하기 위해 Cu계 또는 Pt계 촉매와 접촉시켰다. 알파 (2-하이드록시에틸) 아크릴산 생성물은 락톤화되어 툴리팔린을 생성한다.
실시예 16 - MeMBL로의 알파 (2- 하이드록시프로필 ) 말산의 변환
작용화된 알파 치환된 아크릴산, 알파 (2-하이드록시프로필) 아크릴산으로의 실시예 8의 생성물, 알파 (2-하이드록시프로필) 말산의 변환은, 알파 치환된 아크릴산, 알파 (2-하이드록시프로필) 아크릴산을 생성시키기 위해, Cu계 또는 Pt계 촉매를 알파 치환된 C4 이산, 알파 (2-하이드록시프로필) 말산과 접촉시킴으로써 실시하였다. 알파 치환된 아크릴산 생성물, 알파 (2-하이드록시프로필) 아크릴산은 락톤화되어 MeMBL을 생성한다. 당해 분야에 익숙한 바와 같이, 락톤화는 임의의 강산, 예컨대 황산, 염산 등을 사용하여 실시된다.
재료 및 방법
실험은 N2 또는 H2 하에서 Cu 또는 Pt 촉매를 사용하여 수행된다. 촉매가 Cu인 경우, 촉매 적재는 50 중량%이고(건조한 분말에 기초하여 계산됨), 사용된 용매는 H2O이다. 촉매가 5% Pt/Al2O3인 경우, 촉매 적재는 2.5 몰%이고(건조한 분말에 기초하여 계산됨), 사용된 용매는 0.1N NaOH이다. 촉매 조건을 위하여, 반응 시간은 180 ℃의 온도에서 N2 또는 H2의 450 psi 하에 16시간이었다. 반응은 실시예 12 및 13에서 기재된 바와 같이 수행된다. 반응 생성물들은 GC/MS(Agilent, 5975B, 불활성, XL, EI/CI)를 사용하여 분석하였다. 촉매들의 평가는 GC/MS 데이터의 정성적 결과들에 기초하였다. 분석은 실시예 12 및 13에서 기재된 바와 같이 수행된다.
결과 및 토론
알파 (2-하이드록시프로필) 말산은, 알파 (2-하이드록시프로필) 아크릴산으로의 변환을 촉진하기 위해 Cu계 또는 Pt계 촉매와 접촉시켰다. 알파 (2-하이드록시프로필) 아크릴산 생성물은 락톤화되어 MeMBL을 생성한다.
실시예 17 - 작용화된 알파 치환된 아크릴산을 조작하기 위한 호스트의 선택
알파 치환된 아크릴산에 대한 기재된 경로들을 위한 잠재적인 호스트들은, 도 1 및 3에 총괄적으로 제시되고, 도 9 및 10에서 더욱 구체적으로 제시된 바와 같이, 작용화된 알파 치환된 아크릴산 최종-생성물들에 대한 톨러런스를 결정함으로써 식별되었다. 표시된 작용화된 알파 치환된 아크릴산들, 작용화된 알파 치환된 아크릴산 에스테르들, 및 작용화된 알파 치환된 아크릴산 락톤들은 박테리아 및 진핵생물 호스트의 톨러런스를 평가하기 위해 선택되었다(표 K 및 L).
2개의 진핵 균주들, 아이 오리엔탈리스(I. orientalis) 및 에스 세레비시아에(S. cerevisiae)는 pH 3 및 pH 5에서 선택된 화합물들에 대한 톨러런스에 대해 시험되었다. 박테리아 균주들은 이들의 개별적인 최적의 조건들에서, 이 콜라이(E coli) 및 씨 글루타미쿰(C. glutamicum)은 pH 8 및 30 ℃에서 시험되고, 비 피르무스(B. firmus)는 pH 9 및 37 ℃에서 성장되었다. 아이 오리엔탈리스(I. orientalis)는 황산 암모늄 5 g/L, 황산 마그네슘 헵타하이드레이트 0.5 g/L, 인산 칼륨 모노베이식(monobasic) 3 g/L, 덱스트로스 10 g/L, 10 % 글리세롤 스톡 1 mL/L, 1000x 트레이스 1 mL/L로 이루어진 한정된 효모 배지에서 성장되었다. 1000x 트레이스 스톡 용액은 ZnSO4.7H2O 4 g/L, FeSO4.7H2O 2 g/L, MnSO4.H2O 1 g/L, CuSO4.5H2O 0.2 g/L, 및 H2SO4 0.8 mL/L를 함유한다. 에스 세레비시아에(S. cerevisiae)는 덱스트로스 50 g/L, 효모 추출물 5 g/L 및 25x DM 염들 40 mL/L로 이루어진 완충된 한정된 덱스트로스 배지에서 성장되었다. 25x DM 염 스톡 용액은 황산 암모늄 125 g/L, 황산 마그네슘 헵타하이드레이트 12.5 g/L, 인산 칼륨 모노베이식 75 g/L 및 물 787.5 g/L를 함유한다. 박테리아 균주들은, 글루코스 20 g/L에 더하여, 박토-트립톤 10 g/L, 효모 추출물 5 g/L, NaCl 10 g/L 및 덱스트로스 20 g/L로 이루어진 표준 LB 배지에서 성장되었다.
시간 지점들은, 성장의 속도를 계산하는 데 적어도 8 h 내지 24 h의 기간에 걸쳐 취하였다. 특정 성장 속도는 시간에 대한 세포 수의 자연 로그를 플롯팅함으로써 결정되었다. 화합물의 부재와 비교되는, 톨러런스는 화합물의 존재 하에서 세포의 성장 속도에 의해 결정되었다. 채점 방법은 표 J에 표시된다. 톨러런스 시험의 결과들은 표 K 및 L에서 제시된다. 왼쪽으로부터의 제 2 칼럼은, 성장이 검출되는 표시된 화합물의 최대 농도를 나타내었다. 결과들에서는, 선택된 박테리아 호스트들은 알파 치환된 아크릴레이트의 생성을 위해 적합한 호스트들이며, 특히 이 콜라이는 하이드록시메틸 아크릴레이트에 대해, 그리고 씨 글루타미쿰(C. glutamicum) 및 비 피르무스(B. firmus)는 하이드록시에틸 아크릴레이트 및 메틸 하이드록시에틸 아크릴레이트에 대해 적합한 호스트들이다.
[표 J] 세포 성장 속도에 대한 특정 화학물질의 영향을 채점하는 데 사용된 주관적 시스템.
Figure pct00033
[표 K] 잠재적인 효모 호스트의 톨러런스.
Figure pct00034
[표 L] 잠재적인 박테리아 호스트의 톨러런스
Figure pct00035
일 실시양태에서, 알파 치환된 3-하이드록시프로피온산은 호스트 생명체에 의해 생성된다. 특정 실시양태에서, 알파 하이드록시메틸 3-하이드록시프로피온산은 호스트 생명체에 의해 생성된다. 호스트 생명체들을 평가하기 위해, 앞서 기재된 프로토콜이 사용되었다. 30 ℃에서 24 시간 동안 항온처리의 말단에서의 상대적인 OD는, 다른 양의 하이드록시메틸-3HP의 존재에서 클루이베로미세스 마륵시아누스(Kluyveromyces marxianus), 에스 세레비시아에(S. cerevisiae) 및 이 콜라이에 대해 비교되었다(도 33(a)). 3개의 생명체 모두는 알파-하이드록시메틸 3-하이드록시프로피온산에 대해 적어도 60 g/L까지 견딜 수 있었다(tolerate). 케이 마륵시아누스(K. marxianus)는 이 화합물에 대해 시험된 생명체들의 가장 우수한 톨러런스를 제시하였다.
일단 호스트 생명체가 선택되면, 합성 유전자들에 사용된 코돈은 호스트 세포들의 것에 맞춰지게 되는 것으로 이해된다.
실시예 18 - 알파 ( 하이드록시메틸 ) 아크릴산 및 상응하는 에스테르으로의 알파 ( 하이드록시메틸 ) C4 다이카복실산의 변환을 위한 재조합 미생물의 구성.
실시예 5에 열거된 DNA 단편에 더하여, 디카복실라제를 인코딩하는 DNA 단편(도 12, I열)은 발현 벡터 내에 클로닝된다. 유전자 후보들 및 그들의 서열들은 도 12, 오른쪽 칼럼에서 제시된다. 구체적으로, 디카복실라제 유전자는 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger)로부터의 시스-아코니타제 디카복실라제, cadA이다(EC 4.1.1.6). 모든 경로 유전자들을 성공적으로 전사하는 생성된 플라스미드는, 실시예 5에서 기재된 바와 같이 알파 (하이드록시메틸) 아크릴산을 초래하도록 알파 (하이드록시메틸) 말레산을 생성하는 재조합 미생물로 형질전환된다. 디카복실라제 플라스미드는 또한 실시예 6에서 기재된 바와 같이 알파 (하이드록시메틸) 아크릴산을 초래하도록 알파 (하이드록시메틸) 푸마르산을 생성하는 세포들에서 발현된다.
또한, 알파 (하이드록시메틸) 아크릴산 트랜스포터를 인코딩하는 DNA 단편의 발현은, 알파 (하이드록시메틸) 아크릴산의 생성을 개선시킨다. 특히, 트랜스포터 유전자는 아스페르길루스 테레우스(Aspergillus terreus)로부터의 추정적인 메이저 퍼실리테이터 슈퍼패밀리(putative Major Facilitator Superfamily) 단백질을 인코딩하는 msfA이다(UNIPROT Q0C8L2).
디카복실라제 활성 검정
디카복실라제들을 인코딩하는 이 콜라이 최적화된 유전자들은 합성되고 pTrcHisA 내로 클로닝되었다(Life Technologies(이전 Invitrogen)). 디카복실라제 후보들은 표 M에서 존재한다. 최적화된 신타제 유전자들을 함유하는 플라스미드들은 BL21 이 콜라이 세포들로 형질전환된다. 빈 플라스미드 pTrcHisA는 또한 음성 대조군으로서 형질전환되었다. 발현 및 특성화 실험들에서, 40 mL TB를 함유한 진탕 플라스크들은 밤샘 배양들로부터 5 %에서 접종되었다. 플라스크들은 2 시간 동안 250 rpm으로 진탕하면서 30 ℃에서 항온처리된 후, 0.2 mM IPTG로 유도되고, 진탕하면서 30 ℃에서 4 h 더 항온처리되었다. 세포들은 원심분리에 의해 수확되고, 펠렛들은 -80 ℃에서 저장되었다.
디카복실라제 후보들의 활성은 시험관 내 용해물 검정으로 평가되는 한편, 아크릴레이트 생성물은 HPLC를 사용하여 검출되었다. 효소 활성은 기질 없이 또는 기질으로서 알파 치환된 말레익을 사용하여 시험되었다. 아크릴레이트 생성물은 벤손(Benson) 유기산 칼럼(300 x 7.8 mm, Part #2000-0 BP-OA)을 사용하여 검출되고, 직렬식의 2개의 벤손 칼럼들, 4% 아세토나이트릴 + 0.025 N 황산 이동상을 사용하여 진행된다. 별도의 규정이 없는 한, 모든 화학물질들은 Sigma-Aldrich Chemical Company, St. Louis, MO에서 구입하였다.
세포들은 제조업자의 지침들에 따라 BeadBeater(상표명)(BopSpec products, Bartlesville, OK)를 사용하는 기계적 파괴를 사용하여 용해시켰다. 세포 용해물은(5 분 동안 14,000 g) 원심분리에 의해 부분적으로 밝혀졌다. 밝혀진 생성된 용해물의 단백질 농도들은 제조업자의 지침들을 사용하는 BioRad total Protein 검정을 통해 측정되었다. 용해물은 100 mM 인산 나트륨 완충액 pH 6.3에서 단백질 농도에 의해 정규화되었다.
반응 혼합물은 100 mM 인산 나트륨 완충액 pH 6.3, 1 μl DTT, 및 10 mM 기질 알파 (치환된) 말레산을 함유한다. 반응은 30 ℃에서 밤새도록 항온처리하도록 허용된다. 샘플들은 100 ℃에서 5 분 동안 비등시켜 단백질을 변성시킨다. 샘플들은 단백질 파편을 제거하기 위해 원심분리되고, 생성된 상층액은 원하는 생성물의 형성을 측정하기 위해 HPLC에 의해 분석된다. 빈 벡터를 함유하는 세포들과 비교되는, 기질을 사용하여 디카복실라제 활성이 관찰된다.
대안적으로, 디카복실라제 후보는 기질로서 알파 치환된 푸마르산, 예컨대 하이드록시메틸 푸마르산을 취할 수 있다. 예를 들어, 이 후보는 우스틸라고 메이디스(Ustilago maydis)(UMAG_05076)로부터의 tad1 (UMAG_05076)일 수 있다(Geiser 등., 2016).
[표 M] 예시적 디카복실라제 서열의 목록
Figure pct00036
알파 ( 하이드록시메틸 ) 아크릴산으로부터 출발하는 알파 ( 하이드록시메틸 ) 아크릴산 에스테르의 생성을 위한 재조합 미생물의 구성.
이 실시예에서 앞서 열거된 DNA 단편들에 더하여, 에스테라제를 인코딩하는 DNA 단편(도 12, H열)이 포함된다. 특히, 에스테라제는 이 콜라이로부터의 카복실에스테라제이다(EC 3.1.1.1). 알파 (하이드록시메틸) 아크릴산으로부터 출발하는 알파 (하이드록시메틸) 아크릴산 에스테르의 생성을 위한 모든 경로 유전자들을 성공적으로 전사하는 생성된 플라스미드는, 앞서 기재된 바와 같이, 알파 (하이드록시메틸) 아크릴산을 생성하는 생명체로 형질전환된다.
또한, 알파 (하이드록시메틸) 아크릴산 트랜스포터를 인코딩하는 DNA 단편의 발현은, 알파 (하이드록시메틸) 아크릴산의 생성을 개선시킨다. 특히, 트랜스포터 유전자는 아스페르길루스 테레우스(Aspergillus terreus)로부터의 추정적인 메이저 퍼실리테이터 슈퍼패밀리 단백질을 인코딩하는 msfA이다(UNIPROT Q0C8L2).
Geiser , Przybilla , Friedrich , Buckel , Wierckx , Blank, 및 Bolker의 문헌 [우스틸라고 메이디스는 비통상적인 중간체 트랜스-아코니테이트를 통해 이타콘산을 생성시킨다(Ustilago maydis produces itaconic acid via the unusual intermediate trans-aconitate). Microbiology Biotechnology, 2016. 9,116-129.]
실시예 19 - 알파 ( 하이드록시메틸 ) 3HP로부터 출발하는 알파 ( 하이드록시메틸 ) 아크릴산의 생성을 위한 재조합 미생물의 구성.
실시예 9에 열거된 DNA 단편들에 더하여, coA 트랜스퍼라제(도 14, F열), 3HP-CoA 디하이드라타제(도 14, G열) 및 CoA 트랜스퍼라제(도 14, F열)를 인코딩하는 DNA 단편들이 포함된다. 특히, CoA 트랜스퍼라제는 클로로플렉수스 아우란티아쿠스(Chloroflexus aurantiacus)로부터의 석시닐-CoA-D-시트라말레이트 CoA-트랜스퍼라제(EC 2.8.3.20)이고, 3HP-CoA 디하이드라타제는 메탈로스파에라 세둘라(Metallosphaera sedula)로부터의 3-하이드록시프리오닐-CoA 디하이드라타제(EC 4.2.1.116)이고, CoA 트랜스퍼라제는 라투스 노르베기쿠스(Rattus norvegicus)로부터의 석시네이트-하이드록시메틸글루타레이트 CoA-트랜스퍼라제(2.8.3.13)이다. 생성된 플라스미드는 알파 (하이드록시메틸) 3-하이드록시프로피온산으로부터 출발하는 알파 (하이드록시메틸) 아크릴산의 생성을 위한 모든 경로 유전자들을 성공적으로 전사한다.
유전자들은 Teufel 등에서 기재된 바와 같이 엠 세둘라(M. sedula)로부터 선택될 수 있다. 이들 유전자는 Lucas 등에서 기재된 바와 같이 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)로부터 선택된다. Lucas 등에서 기재된 바와 같이, 메틸말로네이트 세미알데하이드 디하이드로게나제를 인코딩하는 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) 유전자는 CoA 트랜스퍼라제 활성에 적합하고(도 14, F열), 아실-CoA 디하이드로게나제/옥시다제 및 아이소발레릴-CoA 디하이드로게나제는 3HP 디하이드라타제 활성에 적합할 것이다(도 14, G열).
또한, 알파 (하이드록시메틸) 아크릴산 트랜스포터를 인코딩하는 DNA 단편의 발현은, 알파 (하이드록시메틸) 아크릴산의 생성을 개선시킨다. 특히, 트랜스포터 유전자는 아스페르길루스 테레우스(Aspergillus terreus)로부터의 추정적인 메이저 퍼실리테이터 슈퍼패밀리 단백질을 인코딩하는 msfA이다(UNIPROT Q0C8L2).
Lucas, 등.의 문헌 [식물에서 프로피온산 및 아이소뷰티르산의 퍼 옥시좀 대사(Peroxisomal metabolism of propionic acid and isobutyric acid in plants). JBC 2007. Vol 282, No 34, pp 24980-24989.]
Teufel 등.의 문헌 [3-하이드록시프로피오닐-조효소 A 디하이드라타제 및 아크릴로일-조효소 A 리덕타제, 설폴로발레스에서 오토트로픽 3-하이드록시프로피오네이트/4-하이드록시뷰티레이트 사이클의 효소(3- Hydroxypropionyl -coenzyme A dehydratase and acryloyl-coenzyme A reductase , enzymes of the autotrophic 3-hydroxypropionate/4-hydroxybutyrate cycle in the sulfolobales) . J Bacteriol 2009 Jul ; 191(14): 4572 -4581.]
실시예 20 - 알파 (하이드록시에틸) 아크릴산 및 상응하는 락톤으로의 알파 (하이드록시에틸) C4 다이카복실산의 변환을 위한 재조합 미생물의 구성.
디카복실라제를 인코딩하는 DNA 단편(도 12, I열)은 발현 벡터 내에 클로닝된다. 유전자 후보들 및 그들의 서열들은 도 12, 오른쪽 칼럼에서 제시된다. 구체적으로, 디카복실라제 유전자는 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger)로부터의 시스-아코니타제 디카복실라제, cadA이다(EC 4.1.1.6). 모든 경로 유전자들을 성공적으로 전사하는 생성된 플라스미드는, 실시예 5에서 기재된 바와 같이 알파 (하이드록시에틸) 말산, 알파 (하이드록시에틸) 말레산 또는 알파 (하이드록시에틸) 푸마르산을 생성하는 재조합 미생물로 형질전환된다.
또한, 알파 (하이드록시에틸) 아크릴산 트랜스포터를 인코딩하는 DNA 단편의 발현은, 알파 (하이드록시에틸) 아크릴산의 생성을 개선시킨다. 특히, 트랜스포터 유전자는 아스페르길루스 테레우스(Aspergillus terreus)로부터의 추정적인 메이저 퍼실리테이터 슈퍼패밀리 단백질을 인코딩하는 msfA이다(UNIPROT Q0C8L2).
알파 (하이드록시에틸) 아크릴산으로부터 출발하는 툴리팔린의 생성을 위한 재조합 미생물의 구성.
이 실시예에서 앞서 열거된 DNA 단편들에 더하여, 락토나제를 인코딩하는 DNA 단편(도 12, G열)이 포함된다. 특히, 에스테라제는 호모 사피엔스(Homo sapiens)로부터의 1,4-락토나제이다(EC 3.1.1.25). 알파 (하이드록시에틸) 아크릴산으로부터 출발하는 툴리팔린의 생성을 위한 모든 경로 유전자들을 성공적으로 전사하는 생성된 플라스미드는, 앞서 기재된 바와 같이, 알파 (하이드록시에틸) 아크릴산을 생성하는 생명체로 형질전환된다.
실시예 21 - 알파-치환된 아세트산으로부터 알파-치환된 아크릴산의 생성을 위한 재조합 생명체의 구성.
미생물은 알파-치환된 아세트산을 알파-치환된 아크릴산으로 변환하기 위해 필요한 모든 효소들을 발현한다. 일 실시양태에서, 3- 하이드록시프로피온산은 알파-하이드록시메틸 3-하이드록시프로피온산으로 변환된다. CoA 트랜스퍼라제(도 16, A열), CoA 카복실라제(도 16, B열), 옥시-리덕타제(도 16, I열), 리덕타제(도 16, J열), CoA 트랜스퍼라제(도 16, L열), 3HP CoA-디하이드라타제(도 16, E열) 및 CoA 트랜스퍼라제(도 16, F열)를 인코딩하는 DNA 단편들은 발현 벡터 내에 클로닝된다. 유전자 후보들 및 이들의 서열은 도 16, 오른쪽 칼럼에서 제시된다.
특정 효소들 및 참고문헌(reference)들은 하기 표(표 N)에 제시되며 하기 첨부된 문장에서 기재되어 있다. 특히, CoA 트랜스퍼라제(단계 A)는 메탈로스파에라 세둘라(Metallosphaera sedula)로부터의 3-하이드록시프로피닐-CoA 신타제이고, CoA 카복실라제(단계 B)는 루게리아 포메로이이(Rugeria pomeroyi)로부터의 프로피오닐-CoA 카복실라제이고, 옥시-리덕타제(단계 I) 및 말로닐-CoA 리덕타제/석시닐-CoA 리덕타제(단계 J)는 클로로플렉수스 아우란티아쿠스(Chloroflexus aurantiacus)로부터의 이작용성 말로닐-CoA 리덕타제이고, CoA 트랜스퍼라제(단계 L)는 메탈로스파에라 세둘라(Metallosphaera sedula)로부터의 3-하이드록시프로피닐-CoA 신타제이고, 3HP CoA-디하이드라타제(단계 E)는 메탈로스파에라 세둘라(Metallosphaera sedula)로부터이고, CoA 트랜스퍼라제(단계 F)는 클로로플렉수스 아우란티아쿠스(Chloroflexus aurantiacus)로부터의 석시닐-CoA-L-말레이트 CoA-트랜스퍼라제이다. 모든 경로 유전자들을 성공적으로 전사하는 생성된 플라스미드는 3-하이드록시프로피온산을 과생성하는 미생물로 형질전환된다. 3-하이드록시프로피온산을 과생성하는 미생물은 WO 2015017721 A1, WP 0242418 A2를 포함하는 수많은 특허들에 기재되어 있고, Tokuyama 등., 2014에서 검토된다. 미생물은 박테리아 또는 진핵생물일 수 있다. 호스트들에는 이 콜라이, 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumonia), 슈도모나스 덴트리피칸스(Pseudomonas dentrificans), 및 에스 세레비시아에(S. cerevisiae)를 포함하는 효모 균주들을 포함한다.
[표 N] 알파 치환된 말로닐 CoA 경로에 대한 효소 및 참고문헌.
Figure pct00037
단계 A: 메탈로스파에라 세둘라(Metallosphaera sedula)로부터의 3HP CoA-신테타제는 Alber 등. 2008 J. Bacteriol에 의해 특성화되어 있다. 효소는 이 생명체의 3-하이드록시프로피오네이트 오토트로픽 CO2 고정 경로의 일부이다. 클로로플렉수스 아우란티아쿠스(Chloroflexus aurantiacus)에서, 이 단계는, 동일한 기능을 수행하도록 독립적으로 진화한 것으로 보이는 3작용성 단백질의 도메인에 의해 수행된다(Alber and Fuchs, JBC 2002). 3HP CoA 신테타제 활성을 함유하는 도메인은 격리 및 발현되거나, 또는 대안적으로, 3HP CoA 신테타제 활성을 갖지 않는 2개의 도메인들은 이들의 활성을 억제하기 위해 돌연변이될 수 있다.
단계 B: 박테리아 프로피오닐-CoA 카복실라제의 결정 구조가 해결되었다(Huang 등 2010 Nature). 구조로부터, 카복실라제 트랜스퍼라제 활성 부위는 큰 캐뇬(large canyon)인 것으로 관찰된다. 구조는 약간 더 큰 기질을 수용할 수 있음을 시사한다. 밝혀진 구조는 종결 하이드록시 기를 수용할 수 있는 효소를 조작하기 위해 표적화하는 아미노산들을 선택할 수 있게 허용한다. 예를 들어, 부위-특이적 변이(site-directed mutagenesis)는 이러한 활성적인 부위의 부분이 친수성하게 하도록 사용될 것이다.
단계 C: Alber 등 2008에서 기재된 3HP CoA 신테타제의 특이성은, 다른 잠재적인 기질들을 사용하는 표준 결합 검정에서 3-하이드록시프로피오네이트를 교체함으로써 결정되었다. 엠 세둘라(M. sedula)로부터의 3HP CoA 신테타제는 프로피오네이트, 아크릴레이트, 아세테이트 및 뷰티레이트를 포함하는 다양한 기질들과의 활성을 나타냈다. 에스 토코다이이(S. tokodaii)로부터의 3-HP CoA 신테타제는 프로피오네이트, 아크릴레이트, 아세테이트, 뷰티레이트, 3-머캅토프로피오네이트 및 3-클로로프로피오네이트와의 활성을 갖는 것으로 특성화되고 보고되었다. 이들 효소에 대한 다양한 기질들은 효소가 그의 특이성에서 불규칙한 것(promiscuous)을 시사한다. 이 명백한 불규칙성(promiscuity)은 효소가 이미 우리의 관심 기질과의 충분한 CoA 트랜스퍼라제 활성을 소유할 수 있음을 시사한다. 또 다른 후보 CoA 트랜스퍼라제는 단계 F에서 설명되어 있다.
단계 D: 3-하이드록시뷰티릴-CoA 디하이드로게나제, 엠 세둘라(M. sedula)로부터의 3HP/4HB 사이클에 관여하는 효소는, Hawkins, Adams, and Kelly, 2014에 의해 보고된 바와 같이 정제되고 특성화된다. 효소 패밀리의 더욱 넓은 전망에서, 하이드록시아실 조효소 A 디하이드로게나제는, 1950년대 초기 공개된 논문들, 예컨대 Wakil 등., 1954에 의해 입증된 바와 같이 수십 년 동안 다수의 그룹들에 의해 연구되었다. 디하이드로게나제는 4 내지 12개의 탄소들을 함유하는 기질들을 촉매할 수 있는 넓은 특이성을 갖는다. 이 효소에 의해 촉매된 반응은 가역적이다. 분야에서 이 효소의 광범위한 지식은 이 효소에 대해 특이성을 증가시키도록 조작하기 위한 유망한 표적으로 만든다.
단계 E: 메탈로스파에라 세둘라(Metallosphaera sedula)로부터의 3HP CoA 디하이드로게나제는 Teufel 등.2009 J. Bacteriol에 의해 특성화되었다. 효소는 이 생명체의 3-하이드록시프로피오네이트 오토트로픽 CO2 고정 경로의 일부이다. 클로로플렉수스 아우란티아쿠스(Chloroflexus aurantiacus)에서, 이 단계는, 동일한 기능을 수행하도록 독립적으로 진화한 것으로 보이는 3작용성 단백질의 도메인에 의해 수행된다(Alber and Fuchs, JBC 2002). 자연 반응은 3-하이드록시프로피오닐-CoA로부터 물을 제거하여서 아크릴로일-CoA를 형성한다. 효소는 또한 크로토닐-CoA로의 3-하이드록시뷰티릴-CoA의 변환을 촉매할 수 있으며, 이는 여러 크기의 기질을 수용할 수 있음을 시사하는 것이다.
단계 F: Friedmann 등은, 클로로플렉수스 아우란티아쿠스(Chloroflexus aurantiacus)로부터의 석시닐-CoA-L-말레이트 조효소 A 트랜스퍼라제가 CoA 공여체로서 석시닐-CoA의 그의 사용에 대해 특이적이지만, 자연적으로는 하나 초과의 CoA 수용체, 말레이트 또는 시트라말레이트를 이용한다. 효소의 자연 이중 작용은, 포켓이 여러 크기의 기질들을 수용하기에 충분하게 가용성임을 시사한다. 또한, 이 반응을 수행하기 위한 가능한 후보들인 가역적 CoA 트랜스퍼라제 반응들 묘사하는 단계 A, C, H 및 I에 대한 설명을 참조한다.
단계 G: 효소 2-옥소글루타레이트 카복실라제는 Aoshima 등, 2004에 의해 식별되고, 하이드로게노박터 써모필루스(Hydrogenobacter thermophilus)에서 Aoshima and Igarashi, 2006에 의해 추가로 특성화된다. 이 효소에 의해 촉매된 반응은, 오토트로픽 생명체들에 의해 사용되는 환원 TCA 사이클에서 중요하며, ATP를 필요로 한다. 이 반응을 모니터링하는 가장 직접적인 방법은 생성물을 크로마토그래피를 통해 검출하는 것이다. Aoshima and Igarashi 2006에서 기재된 바와 같이, 실시간 분광기 검정도 또한 사용될 수 있다. 2-옥소글루타레이트 카복실라제는, 피루베이트 카복실라제와 구조적으로 유사하며 통상적인 단백질로부터 진화되기 쉬운 것으로 보고되어 있다. 피루베이트 카복실라제의 결정 구조는 해결되었으며, 구조적으로 유사한 2-옥소글루타레이트 카복실라제의 관심 기질에 대한 증가된 특이성을 조작하는 데 사용될 수 있다(Jitrapakdee 등., 2008).
단계 H: 단계 C 및 F에 대한 설명을 참조한다.
단계 I: 클로로플렉수스 아우란티아쿠스(Chloroflexus aurantiacus)로부터의 말로닐-CoA 리덕타제는 이작용성이며, CoA-활성화된 카복실산 카복실산의 환원 및 세미알데하이드의 환원을 촉매할 수 있다(Alber 등., 2006). 대조적으로, 엠 세둘라(M. sedula)로부터의 말로닉 세미알데하이드 리덕타제는 오직 CoA 카복실산으로부터 세미알데하이드까지의 환원, 예컨대 석시닐-CoA로부터 석시닉 세미알데하이드까지의 환원을 촉매한다(Kockelkorn and Fuchs, 2009). 기질로서 석시닐-CoA를 사용하는 것에 더하여, 이 효소는 또한 말로닐-CoA 리덕타제 활성을 소유한다. 효소의 추가 특성화에서는, NADH-의존성 효소가 이의 선택성에서 불규칙적이며, 잘 연구된 아스파테이트 리덕타제 디하이드로게나제와 관련되어 있다.
단계 J: 단계 I에 첨부된 설명에서 전술한 바와 같이, 클로로플렉수스 아우란티아쿠스(Chloroflexus aurantiacus)로부터의 말로닐-CoA 리덕타제는 이작용성이며, CoA-활성화된 카복실산 카복실산의 환원 및 세미알데하이드의 환원을 촉매할 수 있다(Alber 등., 2006). 메탈로스파에라 세둘라(Metallosphaera sedula)에서, 이 단계는 말로닉 세미알데하이드 리덕타제에 의해 실시된다(Kockelkorn and Fuchs, 2009). 촉매 메커니즘은 보존된 시스테인 및 히스티딘을 사용하는 Alber 등에 의해 제안된다(Alber 등, 2006). 다른 알데하이드 디하이드로게나제와의 효소의 이러한 정보와 유사성은, 우리의 관심 중간체를 수용하도록 이 효소를 조작하는 데 사용될 것이라는 통찰력(insight)들을 제공한다. 대안적으로, 이 콜라이는 이 반응에서 활성에 대해 스크리닝될 수 있는 여러 알데하이드 리덕타제들을 발현한다. 예를 들어, 이 콜라이로부터의 알데하이드 리덕타제, YqhD는, 광범위한 기질을 가지며, 생명 공학 적용들에서 사용되는 것으로 입증되었다(Atsumi 등, 2010). 유사하게는, 에스 세레비시아에(S. cerevisiae)로부터의 adh2는 이 반응을 촉매하는 데 사용될 수 있다.
단계 K: 이 콜라이로부터의 효소 prpD는 2-메틸아코니테이트로의 메틸시트레이트의 탈수를 촉매할 수 있다(Brock 등, 2002). 이 효소는 프로피오네이트를 피루베이트로 산화시키는 내인성 경로에서 사용되며, 이 콜라이가 프로피오네이트 상에서 성장될 때 독점적적으로 존재한다. Brock 등은, 이 콜라이 prpD가 아코니테이트와의 일부 활성을 갖는 것으로 나타났다. 소량의 활성은 또한 시트레이트 및 아이소시트레이트로 관찰되었으며, 이는 효소가 여러 기질들을 사용하는 잠재력을 갖는 것으로 시사한다.
살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica)로부터의 prpD의 결정 구조는 해결되었다(Gulick 등, 2002). 이 구조는, 하이드록시 아크릴산으로의 경로에 대해 요구되는 바와 같이, 2-(하이드록시메틸)-3-하이드록시프로피오네이트에 대한 이 단계의 특이성을 개질시키는 데 유용할 것이다.
단계 L: 단계 C 및 F에 대한 설명을 참조한다.
대안적인 반복들은, 3-하이드록시프로피온산으로부터 알파 (하이드록시메틸) 아크릴산을 생성하도록 구성된다. 하나의 경로는 단계 A, B, I, C, D, E 및 F에서 기재된 효소들을 포함한다. 다른 경로는 단계 A, B, I, J 및 K에서 기재된 효소들을 포함한다. 다른 경로는 단계 G, H, I, C, D, E 및 F에서 기재된 효소들을 포함한다. 다른 경로는 단계 G, H, I, J, L, E 및 F에서 기재된 효소들을 포함한다. 다른 경로는 단계 G, H, I, J 및 K에서 기재된 효소들을 포함한다. 다른 경로는 단계 A, B, I, J, L, E 및 F에서 기재된 효소들을 포함한다.
또한, 알파 (하이드록시메틸) 아크릴산 트랜스포터를 인코딩하는 DNA 단편의 발현은 알파 (하이드록시메틸) 아크릴산을 개선한다. 특히, 트랜스포터 유전자는 아스페르길루스 테레우스(Aspergillus terreus)로부터의 추정적인 메이저 퍼실리테이터 슈퍼패밀리 단백질을 인코딩하는 msfA이다(UNIPROT Q0C8L2).
카복실라제 검정
하이드록시메틸말로닐-CoA로 변환된 3HP-CoA의 양은 피루베이트 축적을 초래하는 커플링된 반응을 사용하여 측정되었다. 이 콜라이 세포들은 빈 벡터(ptrc) 또는 RpPCC로 형질전환되었다. 세포들은, 제조업자의 지침들을 사용하는, BeadBeater(상표명)(BopSpec products, Bartlesville, OK)를 사용하는 기계적 파괴를 사용하여 용해시켰다. 세포 용해물은 원심분리에 의해 부분적으로 밝혀졌다(5 분 동안 14,000G). 밝혀진 생성된 용해물의 단백질 농도들은 제조업자의 지침들을 사용하는 BioRad total Protein 검정을 통해 측정되었다. 용해물들은 100 mM 인산 칼륨 완충액, pH 7.6에서 단백질 농도에 의해 정규화되었다. 피루베이트-커플링된 카복실라제 반응 검정들은, 100 mM 인산 칼륨 완충액(pH 7.6), 피루베이트 키나제 5 μl(2.5 유닛/μl), 5 mM 포스포에놀피루베이트 0.3 mg/mL BSA, 5 mM MsCl2, 50 mM NaHCO3, 5 mM ATP, 및 5 mM 3HP-CoA 기질을 함유하였다. 반응은 100 μL의 총 부피에 도달하도록 반응 혼합물에 첨가된 용해물 25 μl로 시작하였다. 피루베이트의 축적은 HPLC를 통해 평가되었다. RpPCC를 발현하는 용해물은 시간에 걸쳐 피루베이트를 축적하였으며, 이는 3HP-CoA의 카복실라제가 하이드록시메틸 말로닐-CoA를 초래하는 것을 나타냈다(도 33(b)).
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실시예 22 - 알파-치환된 3- 하이드록시프로피온산을 알파-치환된 아크릴산으로 변환하는 방법.
실시예 9 및 21에서와 같이, 알파-치환된 3-하이드록시메틸 산을 생성하는 미생물의 경우에서, 이 화합물은 알파-치환된 아크릴산으로 탈수된다. 일 실시양태에서, 알파-하이드록시메틸 3-하이드록시프로피온산(HM3HP)은 알파-하이드록시메틸 아크릴산(HMA)으로 탈수된다. 공지된 양의 HM3HP는 완충된 용액 중에 용해시켰다. 용액은 pH 3, pH 5 또는 pH 7으로 조정된 3개의 분취량으로 분할하였다. 샘플들을 밤새도록 -20 ℃, 30 ℃ 또는 70 ℃에서 항온처리하였다. NMR 분석은 HMA로 탈수된 HM3HP의 양을 측정하는 데 사용되었다. HMA에 대한 대부분의 변환은 pH 10에서 관찰되었다(표 O). 결과에서는, 더욱 염기성인 pH가 HMA로의 HM3HP의 변환을 유인하는 것으로 나타낸다. 용액의 pH는 온도에서 변화한 것보다 HMA로의 변환에 대해 더욱 많은 효과를 가졌다.
[표 O] 상이한 온도 및 pH에서 알파-하이드록시메틸 3-하이드록시프로피온산으로부터 변환된 하이드록시메틸 아크릴산(HMA)의 비교
Figure pct00038
실시예 23 - 이타콘산으로부터 출발하는 알파 (하이드록시에틸) 아크릴산의 생성을 위한 재조합 미생물의 구성.
이타콘산으로부터의 알파 (하이드록시에틸) 말산의 생성을 위해 사용된 미생물은, 실시예 4에서 기재된 바와 같이, 박테리아뿐만 아니라, 효모 및 사상균들을 포함하는, 이타콘산을 생성하는 호스트들로부터 선택될 수 있다. 이러한 생명체들은 에스 세레비시아에(S. cerevisiae), 이 콜라이, 뿐만 아니라 진균 균주, 예컨대 아스페르길루스(Aspergillus) 및 우스틸라고(Ustilago) 균주들을 포함한다. 특정 진균 균주들은 에이 니게르(A. niger), 에이 테레우스(A. terreus) 및 우스틸라고 메이디스(Ustilago maydis)를 포함한다. 이타콘산 생성은 생명체에 대해 자연적인 것이거나, 또는 시트레이트 신타제, 아코니타제 및 시스-아코니테이트 디카복실라제를 포함하는 내인성 및/또는 외인성인 관련 유전자들의 발현 및/또는 과발현에 의해 생성된다(Bonnarme 등, 1995; Huang 등, 2014; Vuoristo 등, 2014).
옥시-리덕타제(도 18, A열) 및 리덕타제(도 18, B열)를 인코딩하는 DNA 단편은 발현 벡터 내에 클로닝된다. 구체적으로, 옥시-리덕타제는 이 콜라이로부터의 석시네이트-세미알데하이드 디하이드로게나제이고, 리덕타제는 이 콜라이 또는 에스 세레비시아에(S. cerevisiae)로부터의 알데하이드 리덕타제이다. 리덕타제 활성은 Kockelkom and Fuchs, 2009에서 기재된 바와 같이 검정될 수 있다. 도 17에서 예시된 바와 같이, 알파 (하이드록시에틸) 아크릴산으로의 이타콘산의 변환을 위한 활성을 인코딩하는 플라스미드는, 전술된 호스트 생명체로 형질전환된다. 또한, 알파 (하이드록시에틸) 아크릴산 트랜스포터를 인코딩하는 DNA 단편의 발현은, 알파 (하이드록시 메틸) 아크릴산의 생성을 개선시킨다. 특히, 트랜스포터 유전자는 아스페르길루스 테레우스(Aspergillus terreus)로부터의 추정적인 메이저 퍼실리테이터 슈퍼패밀리 단백질을 인코딩하는 msfA이다(UNIPROT Q0C8L2).
이 실시예에서 앞서 열거된 DNA 단편들에 더하여, 락토나제를 인코딩하는 DNA 단편(도 18, C열)이 포함된다. 특히, 락토나제는 호모 사피엔스(Homo sapiens)로부터의 1,4-락토나제이다(EC 3.1.1.25). 이타콘산으로부터 출발하는 툴리팔린의 생성을 위한 모든 경로 유전자들을 성공적으로 전사하는 생성된 플라스미드는, 앞서 기재된 바와 같이, 이타콘산을 생성하는 생명체로 형질전환된다.
Bonnarme , Gillet , Sepulchre, Role, Beloeil 및 Ducrocq의 문헌 [아스페르길루스 테레우스에서의 이타코네이트 생합성( Itaconate biosynthesis in Aspergillus terreus). J Bacterio , 1995. 177(12): 3573 .]
Huang , Lu , Li , Li , 및 Li .의 문헌 [아스페르길루스 테레우스 균주의 유전자 조작을 통한 이타콘산 생성의 개선(Improving itaconic acid production through genetic engineering of an industrial Aspergillus terreus strain). Microbial Cell Factories 2014, 13:1 19.]
Kockelkorn 및 Fuchs의 문헌 [메탈로스파에라 세둘라로부터의 말로닉 세미알데하이드 리덕타제, 석시닉 세미알데하이드 리덕타제 및 석시닐 조효소 A 리덕타제: 설폴로발레스에서 오토트로픽 3-하이드록시프로피오네이트/4-하이드록시뷰티레이트 사이클의 효소( Malonic semialdehyde reductase , succinic semialdehyde reductase , and succinyl -coenzyme A reductase from Metallosphaera sedula: Enzymes of the autotrophic 3- hydroxypropionate /4- hydroxybutyrate cycle in Sulfolobales) . J of Bacteriology, Oct 2009, p. 6352-6362.]
Vuoristo , Mars, Sangra , Springer, Eggink , Sanders, 및 Weusthuis의 문헌 [대장균에서 이타코네이트 생성의 대사 조작(Metabolic engineering of itaconate production in Escherichia coli .) Appl Microbiol Biotechnol , 2014.]
실시예 24 - 작용화된 알파 치환된 아크릴산을 발효 및 분리하는 방법
작용화된 알파 치환된 아크릴산들의 생성을 위한 발효 방법들은 실시예 10에서 기재된 바와 같이 수행된다. 작용화된 알파 치환된 아크릴산들의 분리는 음이온 교환, 역삼투, 결정화 및 막 추출과 같이 발효 브로쓰로부터 이타콘산을 분리하는 데 사용된 것과 유사한 방법들을 통해 수행된다(US 3544455A, CN 102940992A, CN 101643404B). 더욱 구체적으로, 하이드록시알킬 아크릴산들을 제조하는 방법들은 참고문헌 JP10218835A 및 JP10218834A에 기재되어 있다.

Claims (115)

  1. 작용성 알파 치환이 (메틸보다 긴) 알킬, 하이드록시, 하이드록시알킬, 분지된 하이드록시알킬, 알콕시, 분지된 알킬, 아미노, 분지된 아미노 알킬, 페닐, 알킬 치환된 페닐, -S-, -SH, , -SeH, -Se-, 하이드록시방향족(hydroxyaromatic), 아미노방향족(aminoaromatic), 폼일, 카바모일, 인돌릴, 구아니디닐, 및 n>2 경우의 카복실레이트로부터 선택되는 작용화된 알파 치환된 C4 다이카복실산; 및 트랜스아미나제(도 4, A열), 신타제(도 4, B열), 디하이드라타제(도 4, C열), 하이드라타제(도 4, D열), 디하이드로게나제(도 4, E열), 시스-트랜스 아이소머라제(도 4, F열), 사이클라제, 락토나제, 락타마제(도 4, G열), 에스테라제(도 4, H열), 리덕타제(도 6, C열), 디카복실라제(도 6, D열), 및 알데하이드 리덕타제(도 6, E열)로부터 선택되는 적어도 하나의 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 재조합 핵산 서열을 포함하는 재조합 미생물.
  2. 제1항에 있어서,
    작용화된 알파 치환된 C4 다이카복실산은 알파-(하이드록시메틸) 말산, 알파-(2-하이드록시프로필) 말산, 알파-(1-하이드록시에틸) 말산 및 알파-(2-하이드록시에틸) 말산으로부터 선택되는 재조합 미생물.
  3. 제1항에 있어서,
    작용화된 알파 치환된 C4 다이카복실산을 추가로 포함하며,
    상기 작용화된 알파 치환은 2개의 수소 원자와 연관된 하나 이상의 탄소 원자를 포함하는 스페이서(spacer)를 추가로 포함하는 재조합 미생물.
  4. 제3항에 있어서,
    스페이서는 -(CH2)2-, -(CH2)3- 또는 -(CH2)4-로부터 선택되는 재조합 미생물.
  5. 제1항에 있어서,
    작용화된 알파 치환된 C4 다이카복실산은 아미노산 측쇄로부터 선택된 작용기를 포함하는 재조합 미생물.
  6. 제1항에 있어서,
    작용화된 알파 치환된 C4 다이카복실산은 작용화된 알파 치환된 말산, 작용화된 알파 치환된 말레산 및 작용화된 알파 치환된 푸마르산으로부터 선택되는 재조합 미생물.
  7. 제1항에 있어서,
    재조합 미생물은, 작용화된 알파 치환된 말산, 작용화된 알파 치환된 말레산 및 작용화된 알파 치환된 푸마르산으로부터 선택된 적어도 2개의 작용화된 알파 치환된 C4 다이카복실산을 포함하는 재조합 미생물.
  8. 제1항에 있어서,
    재조합 미생물은, 작용화된 알파 치환된 말산, 작용화된 알파 치환된 말레산 및 작용화된 알파 치환된 푸마르산으로부터 선택된 적어도 3개의 작용화된 알파 치환된 C4 다이카복실산을 포함하는 재조합 미생물.
  9. 제5항에 있어서,
    적어도 2개의 작용화된 알파 치환된 C4 다이카복실산은 동일한 작용성 치환기를 포함하는 재조합 미생물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    베타 작용화된 알파 케토산을 추가로 포함하는 재조합 미생물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    작용화된 알파 치환된 3-하이드록시프로피온산을 추가로 포함하는 재조합 미생물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    재조합 미생물은 적어도 하나의 아미노산을 선택적으로 과생성하는(overproduce) 재조합 미생물.
  13. 제12항에 있어서,
    재조합 미생물은 히스티딘, 아르기닌, 아스파라긴, 리신, 메티오닌, 시스테인, 페닐알라닌, 트레오닌, 글루타메이트, 글루타민, 트립토판, 셀레노시스테인, 세린, 호모세린, 호모트레오닌, 티로신, 발린, 류신 및 이소류신으로부터 선택된 아미노산을 적어도 0.1 g/L/hr 생성하는 재조합 미생물.
  14. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    재조합 미생물은 작용화된 알파 치환된 C4 다이카복실산을 선택적으로 과생성하는 재조합 미생물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    재조합 미생물은 작용화된 알파 치환된 C4 다이카복실산을 적어도 0.1 g/L/hr 생성하는 재조합 미생물.
  16. 제10항에 있어서,
    재조합 미생물은 작용화된 베타 치환된 알파 케토산을 적어도 0.1 g/L/hr 생성하는 재조합 미생물.
  17. 제8항에 있어서,
    재조합 미생물은 작용화된 알파 치환된 푸마르산을 적어도 0.1 g/L/hr 생성하는 재조합 미생물.
  18. 제8항에 있어서,
    재조합 미생물은 작용화된 알파 치환된 말레산을 적어도 0.1 g/L/hr 생성하는 재조합 미생물.
  19. 제8항에 있어서,
    재조합 미생물은 작용화된 알파 치환된 말산을 적어도 0.1 g/L/hr 생성하는 재조합 미생물.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    유기산 트랜스포터(transporter)를 인코딩하는 재조합 핵산 서열을 추가로 포함하는 재조합 미생물.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    재조합 미생물은 원핵생물인 재조합 미생물.
  22. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    재조합 미생물은 진핵생물인 재조합 미생물.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 재조합 미생물을 탄수화물의 존재 하에서 배양하는 단계; 및 작용화된 알파 치환된 말산 또는 이의 염을 분리하는 단계를 포함하는 작용화된 알파 치환된 말산의 제조방법.
  24. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 재조합 미생물을 탄수화물의 존재 하에서 배양하는 단계; 및 작용화된 치환된 말레산 또는 이의 염을 분리하는 단계를 포함하는 작용화된 치환된 말레산의 제조방법.
  25. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 재조합 미생물을 탄수화물의 존재 하에서 배양하는 단계; 및 작용화된 베타 치환된 케토산 또는 이의 염을 분리하는 단계를 포함하는 작용화된 베타 치환된 케토산의 제조방법.
  26. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 재조합 미생물을 탄수화물의 존재 하에서 배양하는 단계; 및 작용화된 알파 치환된 3-하이드록시프로피온산 또는 이의 염을 분리하는 단계를 포함하는 알파 치환된 3-하이드록시프로피온산의 제조방법.
  27. 작용화된 알파 치환된 아크릴레이트, 또는 이의 염 또는 에스테르를 제조하는 방법으로서,
    작용화된 알파 치환된 C4 다이카복실산 또는 작용화된 알파 치환된 3-하이드록시프로피온산, 또는 이의 염, 에스테르 또는 락톤을 금속 촉매와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
  28. 화학식 I을 갖는 화합물 또는 이의 염을 제조하는 방법으로서,
    화학식 I
    Figure pct00039

    상기 식에서,
    각각의 R1은 (메틸보다 긴) 알킬, 하이드록시, 하이드록시알킬, 분지된 하이드록시알킬, 알콕시, 분지된 알킬, 아미노, 분지된 아미노 알킬, 페닐, 알킬 치환된 페닐, -S-, -SH, , -SeH, -Se-, 하이드록시방향족, 아미노방향족, 폼일, 카바모일, 인돌릴, 구아니디닐, 및 n>1 경우의 카복실레이트로부터 선택되고, R2는 개별적으로 H 및 보호기로부터 선택되고, n은 1 이상이며,
    화학식 II, III 또는 IV의 화합물 또는 이의 염을 포함하는 조성물과 금속 촉매를 접촉시키는 단계를 포함하는 방법:
    화학식 II, III 및 IV
    Figure pct00040

    상기 식에서,
    각각의 R1은 (메틸보다 긴) 알킬, 하이드록시, 하이드록시알킬, 분지된 하이드록시알킬, 알콕시, 분지된 알킬, 아미노, 분지된 아미노 알킬, 페닐, 알킬 치환된 페닐, -S-, -SH, , -SeH, -Se-, 하이드록시방향족, 아미노방향족, 폼일, 카바모일, 인돌릴, 구아니디닐, 및 n>1 경우의 카복실레이트, 및 이의 보호기들로부터 선택되고, R2, R3 및 R4는 개별적으로 H 및 보호기로부터 선택되고, n은 1 이상이다.
  29. 화학식 V의 화합물 또는 이의 염을 제조하는 방법으로서,
    화학식 V
    Figure pct00041

    상기 식에서,
    각각의 R1은 H 또는 CH3으로부터 선택되고, R2 및 R3은 H 또는 보호기로부터 선택되고, n은 1 이상이며,
    화학식 VI, VII 또는 VIII의 화합물 또는 이의 염을 포함하는 조성물과 금속 촉매를 접촉시키는 단계를 포함하는 방법:
    화학식 VI, VII 및 VIII
    Figure pct00042

    상기 식에서,
    각각의 R1은 H 또는 CH3으로부터 선택되고, R2, R3 및 R4는 개별적으로 H 또는 보호기로부터 선택되고, n은 1 이상이다.
  30. 작용화된 알파 치환된 C4 다이카복실산의 유도체 및 화학식 I을 갖는 화합물을 제조하는 방법으로서,
    화학식 II, III 및 IV로부터 선택된 화합물, 또는 이의 염, 에스테르 또는 락톤을 금속 촉매와 접촉시키는 단계를 포함하며,
    상기 작용화된 알파 치환된 C4 다이카복실산의 유도체는 하기 식들로부터 선택되는 방법:
    Figure pct00043

    상기 식에서,
    각각의 R1은 (메틸보다 긴) 알킬, 하이드록시, 하이드록시알킬, 분지된 하이드록시알킬, 알콕시, 분지된 알킬, 아미노, 분지된 아미노 알킬, 페닐, 알킬 치환된 페닐, -S-, -SH, , -SeH, -Se-, 하이드록시방향족, 아미노방향족, 폼일, 카바모일, 인돌릴, 구아니디닐, 및 n>1 경우의 카복실레이트로부터 선택되고, R2는 개별적으로 H 및 보호기로부터 선택되고, R2는 개별적으로 H 및 보호기로부터 선택되고, n은 1 이상이다.
  31. 화학식 I을 갖는 화합물 또는 이의 염, 및 작용화된 알파 치환된 C4 다이카복실산의 적어도 하나의 유도체를 포함하는 조성물을 제조하는 방법으로서,
    화학식 I
    Figure pct00044

    상기 식에서,
    각각의 R1은 (메틸보다 긴) 알킬, 하이드록시, 하이드록시알킬, 분지된 하이드록시알킬, 알콕시, 분지된 알킬, 아미노, 분지된 아미노 알킬, 페닐, 알킬 치환된 페닐, -S-, -SH, , -SeH, -Se-, 하이드록시방향족, 아미노방향족, 폼일, 카바모일, 인돌릴, 구아니디닐, 및 이의 보호기들로부터 선택되고, R2는 개별적으로 H 및 보호기로부터 선택되고, n은 1 이상이고, n이 1 초과인 경우, R1은 카복실레이트 또는 메틸로부터 선택될 수 있으며,
    화학식 II, III 또는 IV의 화합물 또는 이의 염을 포함하는 조성물과 금속 촉매를 접촉시키는 단계를 포함하는 방법:
    화학식 II, III 및 IV
    Figure pct00045

    상기 식에서,
    각각의 R1은 (메틸보다 긴) 알킬, 하이드록시, 하이드록시알킬, 분지된 하이드록시알킬, 알콕시, 분지된 알킬, 아미노, 분지된 아미노 알킬, 페닐, 알킬 치환된 페닐, -S-, -SH, -SeH, -Se-, 하이드록시방향족, 아미노방향족, 폼일, 카바모일, 인돌릴, 구아니디닐, 및 n>1 경우의 카복실레이트, 및 이의 보호기들로부터 선택되고, R2, R3 및 R4는 개별적으로 H 및 보호기로부터 선택되고, n은 1 이상이다.
  32. 제31항에 있어서,
    적어도 하나의 화합물은 작용화된 알파 치환된 C4 다이카복실산의 적어도 2개의 유도체를 포함하는 방법.
  33. 화학식 I을 갖는 화합물 또는 이의 염을 제조하는 방법으로서,
    화학식 II, III 또는 IV로부터 선택된 작용화된 알파 치환된 다이카복실산, 또는 이의 염 또는 에스테르와 금속 촉매를 접촉시키는 단계를 포함하며,
    작용화된 알파 치환된 다이카복실산의 베타 카복실레이트는 선택적으로 디카복실레이트화되는 방법:
    화학식 I
    Figure pct00046

    상기 식에서,
    각각의 R1은 (메틸보다 긴) 알킬, 하이드록시, 하이드록시알킬, 분지된 하이드록시알킬, 알콕시, 분지된 알킬, 아미노, 분지된 아미노 알킬, 페닐, 알킬 치환된 페닐, -S-, -SH, , -SeH, -Se-, 하이드록시방향족, 아미노방향족, 폼일, 카바모일, 인돌릴, 구아니디닐, 카복실레이트, 및 이의 보호기들로부터 선택되고, R2는 개별적으로 H 및 보호기로부터 선택되고, n은 1 이상이다.
  34. 하이드록시알킬 알파 치환된 아크릴산, 또는 이의 염, 락톤 또는 에스테르를 제조하는 방법으로서,
    하이드록시알킬 알파 치환된 C4 다이카복실산, 또는 이의 염, 에스테르 또는 락톤을 금속 촉매와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
  35. 화학식 I을 갖는 화합물 또는 이의 염을 제조하는 방법으로서,
    작용화된 알파 치환된 말산, 작용화된 알파 치환된 말레산, 작용화된 알파 치환된 푸마르산, 또는 이의 염, 에스테르 또는 락톤을 포함하는 조성물과 금속 촉매를 접촉시키는 단계를 포함하는 방법:
    화학식 I
    Figure pct00047

    상기 식에서,
    각각의 R1은 (메틸보다 긴) 알킬, 하이드록시, 하이드록시알킬, 분지된 하이드록시알킬, 알콕시, 분지된 알킬, 아미노, 분지된 아미노 알킬, 페닐, 알킬 치환된 페닐, -S-, -SH, -SeH, -Se-, 하이드록시방향족, 아미노방향족, 폼일, 카바모일, 인돌릴, 구아니디닐, 및 n>1 경우의 카복실레이트 및 이의 보호기들로부터 선택되고, R2는 개별적으로 H 및 보호기로부터 선택되고, n은 1 이상이다.
  36. 제27항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
    금속 촉매는 불균일계(heterogenous) 촉매인 방법.
  37. 제27항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
    금속 촉매는 Ni, Pd, Pt, Cu, Zn, Rh, Ru, Bi, Fe, Co, Os, Ir, V, 및 이의 2개 이상의 혼합물들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 금속을 포함하는 방법.
  38. 제27항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
    금속 촉매는 Cu 또는 Pt로 이루어진 군으로부터 선택된 금속을 포함하는 방법.
  39. 제38항에 있어서,
    금속 촉매는 Cu를 포함하는 방법.
  40. 제38항에 있어서,
    금속 촉매는 Pt를 포함하는 방법.
  41. 제27항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
    금속 촉매는 지지된 촉매인 방법.
  42. 제27항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
    금속 촉매는 프로모터(promoter)를 포함하는 방법.
  43. 제42항에 있어서,
    프로모터는 황을 포함하는 방법.
  44. 제27항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서,
    방법은 적어도 약 100 ℃의 온도에서 수행되는 방법.
  45. 제27항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서,
    방법은 약 100 ℃ 내지 약 250 ℃의 온도에서 수행되는 방법.
  46. 제27항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서,
    방법은 약 150 ℃ 내지 약 200 ℃의 온도에서 수행되는 방법.
  47. 제27항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서,
    금속 촉매는 접촉 전에 활성화되는 방법.
  48. 제47항에 있어서,
    금속 촉매는 수소 기체 하에서 활성화되는 방법.
  49. 제27항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서,
    금속 촉매에는 수소가 실질적으로 없는 방법.
  50. 제47항 또는 제48항에 있어서,
    금속 촉매는 약 100 ℃ 내지 약 200 ℃의 온도에서 활성화되는 방법.
  51. 작용화된 알파 치환된 아크릴산, 또는 이의 염, 에스테르 또는 락톤, 및 알파-(하이드록시메틸) 말산, 알파-(2-하이드록시프로필) 말산, 알파-(1-하이드록시에틸) 말산 및 알파-(2-하이드록시에틸) 말산, 또는 이의 염 또는 에스테르로부터 선택된 하나 이상의 화합물을 포함하는 조성물.
  52. 제51항에 있어서,
    작용화된 알파 치환된 C4 카복실산의 하나 이상의 유도체를 추가로 포함하는 조성물.
  53. 화학식 I의 화합물 또는 이의 염을 제조하는 방법으로서,
    작용화된 알파 치환된 3HP를 가열하여서 작용화된 알파 치환된 3HP를 탈수하고 화학식 I을 갖는 화합물을 생성시키는 단계를 포함하는 방법:
    화학식 I
    Figure pct00048

    상기 식에서,
    각각의 R1은 (메틸보다 긴) 알킬, 하이드록시, 하이드록시알킬, 분지된 하이드록시알킬, 알콕시, 분지된 알킬, 아미노, 분지된 아미노 알킬, 페닐, 알킬 치환된 페닐, -S-, -SH, , -SeH, -Se-, 하이드록시방향족, 아미노방향족, 폼일, 카바모일, 인돌릴, 구아니디닐, 및 n>1 경우의 카복실레이트로부터 선택되고, R2는 개별적으로 H 및 보호기로부터 선택되고, n은 1 이상이다.
  54. 작용성 알파 치환이 (메틸보다 긴) 알킬, 하이드록시, 하이드록시알킬, 분지된 하이드록시알킬, 알콕시, 분지된 알킬, 아미노, 분지된 아미노 알킬, 페닐, 알킬 치환된 페닐, -S-, -SH, , -SeH, -Se-, 하이드록시방향족, 아미노방향족, 폼일, 카바모일, 인돌릴, 구아니디닐, 및 n>2 경우의 카복실레이트로부터 선택되는 작용화된 알파 치환된 아크릴산; 및 트랜스아미나제(도 12, A열), 신타제(도 12, B열), 디하이드라타제(도 12, C열), 하이드라타제(도 12, D열), 디하이드로게나제(도 12, E열), 시스-트랜스 아이소머라제(도 12, F열), 사이클라제, 락토나제, 락타마제(도 12, G열), 에스테라제(도 12, H열), 디카복실라제(도 12, I열), 리덕타제(도 14, C열), 디카복실라제(도 14, D열), 리덕타제(도 14, E열), CoA 트랜스퍼라제(도 14, F열) 및 3HP-CoA 디하이드라타제(도 14, G열)로부터 선택된 적어도 하나의 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 재조합 핵산 서열을 포함하는 재조합 미생물.
  55. 제54항에 있어서,
    작용화된 알파 치환된 C4 다이카복실산을 추가로 포함하며,
    작용화된 알파 치환된 C4 다이카복실산은 알파-(하이드록시메틸) 말산, 알파-(2-하이드록시프로필) 말산, 알파-(1-하이드록시에틸) 말산 및 알파-(2-하이드록시에틸) 말산으로부터 선택되는 재조합 미생물.
  56. 제55항에 있어서,
    작용화된 알파 치환은 2개의 수소 원자와 연관된 하나 이상의 탄소 원자를 포함하는 스페이서를 추가로 포함하는 재조합 미생물.
  57. 제56항에 있어서,
    스페이서는 -(CH2)2-, -(CH2)3- 또는 -(CH2)4-로부터 선택되는 재조합 미생물.
  58. 제54항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서,
    작용화된 알파 치환된 아크릴산은 아미노산 측쇄로부터 선택된 작용기를 포함하는 재조합 미생물.
  59. 제54항에 있어서,
    작용화된 알파 치환된 C4 다이카복실산을 추가로 포함하며,
    작용화된 알파 치환된 C4 다이카복실산은 작용화된 알파 치환된 말산, 작용화된 알파 치환된 말레산 및 작용화된 알파 치환된 푸마르산으로부터 선택되는 재조합 미생물.
  60. 제59항에 있어서,
    재조합 미생물은, 작용화된 알파 치환된 말산, 작용화된 알파 치환된 말레산 및 작용화된 알파 치환된 푸마르산으로부터 선택된 적어도 2개의 작용화된 알파 치환된 C4 다이카복실산을 포함하는 재조합 미생물.
  61. 제59항에 있어서,
    재조합 미생물은, 작용화된 알파 치환된 말산, 작용화된 알파 치환된 말레산 및 작용화된 알파 치환된 푸마르산으로부터 선택된 적어도 3개의 작용화된 알파 치환된 C4 다이카복실산을 포함하는 재조합 미생물.
  62. 제60항에 있어서,
    적어도 2개의 작용화된 알파 치환된 C4 다이카복실산은 동일한 작용성 치환기를 포함하는 재조합 미생물.
  63. 제54항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서,
    베타 작용화된 알파 케토산을 추가로 포함하는 재조합 미생물.
  64. 제54항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서,
    작용화된 알파 치환된 3-하이드록시프로피온산을 추가로 포함하는 재조합 미생물.
  65. 제54항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서,
    재조합 미생물은 적어도 하나의 아미노산을 선택적으로 과생성하는 재조합 미생물.
  66. 제65항에 있어서,
    재조합 미생물은 히스티딘, 아르기닌, 아스파라긴, 리신, 메티오닌, 시스테인, 페닐알라닌, 트레오닌, 글루타메이트, 글루타민, 트립토판, 셀레노시스테인, 세린, 호모세린, 호모트레오닌, 티로신, 발린, 류신 및 이소류신으로부터 선택된 아미노산을 적어도 0.1 g/L/hr 생성하는 재조합 미생물.
  67. 제59항에 있어서,
    재조합 미생물은 작용화된 알파 치환된 C4 다이카복실산을 선택적으로 과생성하는 재조합 미생물.
  68. 제59항에 있어서,
    재조합 미생물은 작용화된 알파 치환된 C4 다이카복실산을 적어도 0.1 g/L/hr 생성하는 재조합 미생물.
  69. 제59항에 있어서,
    재조합 미생물은 작용화된 베타 치환된 알파 케토산을 적어도 0.1 g/L/hr 생성하는 재조합 미생물.
  70. 제59항에 있어서,
    재조합 미생물은 작용화된 알파 치환된 푸마르산을 적어도 0.1 g/L/hr 생성하는 재조합 미생물.
  71. 제59항에 있어서,
    재조합 미생물은 작용화된 알파 치환된 말레산을 적어도 0.1 g/L/hr 생성하는 재조합 미생물.
  72. 제59항에 있어서,
    재조합 미생물은 작용화된 알파 치환된 말산을 적어도 0.1 g/L/hr 생성하는 재조합 미생물.
  73. 제54항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서,
    유기산 트랜스포터를 인코딩하는 재조합 핵산 서열을 추가로 포함하는 재조합 미생물.
  74. 제54항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서,
    재조합 미생물은 원핵생물인 재조합 미생물.
  75. 제54항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서,
    재조합 미생물은 진핵생물인 재조합 미생물.
  76. 제54항 내지 제75항 중 어느 한 항의 재조합 미생물을 탄수화물의 존재 하에서 배양하는 단계; 및 작용화된 알파 치환된 아크릴산 또는 이의 염을 분리하는 단계를 포함하는 작용화된 알파 치환된 아크릴산의 제조방법.
  77. 하이드록시메틸 말로닐-CoA, 및 CoA 트랜스퍼라제(도 16, A열), CoA 카복실라제(도 16, B열), CoA 트랜스퍼라제(도 16, C열), 리덕타제(도 16, D열), 디하이드로게나제(도 16, D열), 3HP CoA-디하이드라타제(도 16, E열), CoA 트랜스퍼라제(도 16, F열), 카복실라제(도 16, G열), CoA 트랜스퍼라제(도 16, H열), 옥시-리덕타제(도 16, I열), 리덕타제(도 16, J열), 디하이드라타제(도 16, K열) 및 CoA 트랜스퍼라제(도 16, L열)로부터 선택된 효소를 인코딩하는 재조합 핵산 서열을 포함하는 재조합 미생물.
  78. 하이드록시메틸 말로닐-CoA, 및 CoA 트랜스퍼라제(도 16, A열), CoA 카복실라제(도 16, B열), CoA 트랜스퍼라제(도 16, C열), 리덕타제(도 16, D열), 디하이드로게나제(도 16, D열), 3HP CoA-디하이드라타제(도 16, E열), CoA 트랜스퍼라제(도 16, F열), 카복실라제(도 16, G열), CoA 트랜스퍼라제(도 16, H열), 옥시-리덕타제(도 16, I열), 리덕타제(도 16, J열) 및 CoA 트랜스퍼라제(도 16, L열)로부터 선택된 효소를 인코딩하는 재조합 핵산 서열을 포함하는 재조합 미생물.
  79. 제77항 또는 제78항에 있어서,
    3-하이드록시프로피온산을 추가로 포함하는 재조합 미생물.
  80. 제77항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서,
    트랜스퍼라제를 인코딩하는 재조합 핵산 서열을 추가로 포함하는 재조합 미생물.
  81. 제77항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서,
    미생물은 3-하이드록시프로피오닐-CoA 또는 하이드록시메틸 말론산을 0.1 g/L/hr 초과의 속도로 추가로 생성하는 재조합 미생물.
  82. 제77항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서,
    미생물은 3 하이드록시프로피오산을 0.1 g/L/hr 초과의 속도로 추가로 생성하는 재조합 미생물.
  83. 제77항에 있어서,
    하이드록시메틸 아크릴레이트를 추가로 포함하는 재조합 미생물.
  84. 제77항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서,
    미생물은 원핵생물인 재조합 미생물.
  85. 제77항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서,
    미생물은 대장균(Escherichia coli)(이 콜라이(E. coli)), 엔테로박터(Enterobacter), 아조토박터(Azotobacter), 에르위니아(Erwinia), 바실루스(Bacillus), 슈도모나스(Pseudomonas), 클렙시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 살모넬라(Salmonella), 세라티아(Serratia), 쉬겔라(Shigella), 리조비아(Rhizobia), 비트레오실라(Vitreoscilla) 및 파라코쿠스(Paracoccus)로부터 선택되는 재조합 미생물.
  86. 제77항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서,
    미생물은 진핵생물인 재조합 미생물.
  87. 제77항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서,
    미생물은 칸디다(Candida), 피치아(Pichia), 사카로미세스(Saccharomyces), 쉬조사카로미세스(Schizosaccharomyces), 지고사카로미세스(Zygosaccharomyces), 클루이베로미세스(Kluyveromyces), 데바리오미세스(Debaryomyces), 피치아(Pichia), 이사트첸키아(Issatchenkia), 야로위아(Yarrowia) 및 한센눌라(Hansenula); 특정 호스트 효모 세포, 예컨대 씨 소노렌시스(C. sonorensis), 케이 마륵시아누스(K. marxianus), 케이 테르모톨레란스(K. thermotolerans), 씨 메타네소르보사(C. methanesorbosa), 사카로미세스 불데리(Saccharomyces bulderi)(에스 불데리(S. bulderi)), 아이 오리엔탈리스(I. orientalis), 씨 람비카(C. lambica), 씨 소르복실로사(C. sorboxylosa), 씨 젬플리니나(C. zemplinina), 씨 게오차레스(C. geochares), 피 멤브라니파시엔스(P. membranifaciens), 지 콤부차엔시스(Z. kombuchaensis), 씨 소르보시보란스(C. sorbosivorans), 씨 반데르왈티이(C. vanderwaltii), 씨 소르보필라(C. sorbophila), 지 비스포루스(Z. bisporus), 지 렌투스(Z. lentus), 사카로미세스 바이야누스(Saccharomyces bayanus)(에스 바이야누스(S. bayanus)), 디 카스텔리이(D. castellii), 씨 보이디니이(C, boidinii), 씨 에트첼시이(C. etchellsii), 케이 락티스(K. lactis), 피 자디니이(P. jadinii), 피 아노말라(P. anomala), 사카로미세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae)(에스 세레비시아에(S. cerevisiae)), 피치아 갈레이포르미스(Pichia galeiformis), 피치아 종(Pichia sp.) YB-4149(NRRL 명칭), 칸디다 에찬톨리카(Candida ethanolica), 피 데세르티콜라(P. deserticola), 피 멤브라니파시엔스(P. membranifaciens), 피 페르멘탄스(P. fermentans) 및 사카로미콥시스 크라타에겐시스(Saccharomycopsis crataegensis)(에스 크라타에겐시스(S. crataegensis))로부터 선택되는 재조합 미생물.
  88. 제77항에 따른 재조합 미생물을 탄수화물의 존재 하에 배양하는 단계 및 알파 하이드록시메틸 아크릴레이트를 분리하는 단계를 포함하는 알파 하이드록시메틸 아크릴레이트를 제조하는 방법.
  89. 2-메틸렌-석시닐 세미알데하이드, 알파-하이드록시에틸 아크릴레이트 및 툴리팔린 A로부터 선택된 화합물, 및 옥시-리덕타제(도 18, 표 7, A열), 리덕타제(도 18, 표 7, B열), 사이클라제(도 18, 표 7, C열), 락토나제(도 18, 표 7, C열), 락타마제(도 18, 표 7, C열) 및 이들의 조합으로부터 선택된 효소를 인코딩하는 재조합 핵산 서열을 포함하는 재조합 미생물.
  90. 제89항에 있어서,
    재조합 미생물은 2-메틸렌-석시닐 세미알데하이드, 알파-하이드록시에틸 아크릴레이트 및 툴리팔린 A로부터 선택되는 화합물 적어도 10g/L의 존재 하에서 생존 가능하게 잔존하는(remain viable) 재조합 미생물.
  91. 제89항 또는 제90항에 있어서,
    재조합 미생물은 이타콘산을 적어도 0.1 g/L/hr로 생성하는 재조합 미생물.
  92. 제89항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서,
    재조합 미생물은 2-메틸렌-석시닐 세미알데하이드를 적어도 0.1 g/L/hr로 생성하는 재조합 미생물.
  93. 제89항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서,
    재조합 미생물은 알파-하이드록시에틸 아크릴레이트를 적어도 0.1 g/L/hr로 생성하는 재조합 미생물.
  94. 제89항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서,
    재조합 미생물은 툴리팔린 A를 적어도 0.1 g/L/hr로 생성하는 재조합 미생물.
  95. 2-메틸렌-석시닐 세미알데하이드, 알파-하이드록시에틸 아크릴레이트 및 툴리팔린 A로부터 선택된 화합물을 제조하는 방법으로서,
    탄소 소오스로 제89항 내지 제94항 중 어느 한 항에 따른 재조합 미생물을 배양하는 단계, 및 발효 브로스(fermentation broth)로부터 화합물을 분리하는 단계를 포함하는 방법.
  96. 알파 치환된 3-하이드록시프로피온산, 및 CoA 트랜스퍼라제(도 16, A열), CoA 카복실라제(도 16, B열), CoA 트랜스퍼라제(도 16, C열), 리덕타제(도 16, D열), 디하이드로게나제(도 16, D열), 카복실라제(도 16, G열), CoA 트랜스퍼라제(도 16, H열), 옥시-리덕타제(도 16, I열) 및 리덕타제(도 16, J열)로부터 선택되는 효소를 인코딩하는 재조합 핵산 서열을 포함하는 재조합 미생물.
  97. 알파-치환된 말로닐-CoA; 및 CoA 트랜스퍼라제(도 16, A열), CoA 카복실라제(도 16, B열), CoA 트랜스퍼라제(도 16, C열), 리덕타제(도 16, D열), 디하이드로게나제(도 16, D열), 카복실라제(도 16, G열), CoA 트랜스퍼라제(도 16, H열), 옥시-리덕타제(도 16, I열) 및 리덕타제(도 16, J열)로부터 선택된 효소를 인코딩하는 재조합 핵산 서열을 포함하는 재조합 미생물.
  98. 알파-치환된 말로닉 세미알데하이드; 및 CoA 트랜스퍼라제(도 16, A열), CoA 카복실라제(도 16, B열), CoA 트랜스퍼라제(도 16, C열), 리덕타제(도 16, D열), 디하이드로게나제(도 16, D열), 카복실라제(도 16, G열), CoA 트랜스퍼라제(도 16, H열), 옥시-리덕타제(도 16, I열) 및 리덕타제(도 16, J열)로부터 선택된 효소를 인코딩하는 재조합 핵산 서열을 포함하는 재조합 미생물.
  99. 제96항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서,
    알파-치환된 아세트산을 추가로 포함하는 재조합 미생물.
  100. 제96항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서,
    트랜스퍼라제를 인코딩하는 재조합 핵산 서열을 추가로 포함하는 재조합 미생물.
  101. 제96항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서,
    미생물은 알파-치환된 아세틸-CoA 또는 알파-치환된 말론산을 0.1 g/L/hr 초과의 속도로 추가로 생성하는 재조합 미생물.
  102. 제96항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서,
    미생물은 알파-치환된 아세트산을 0.1 g/L/hr 초과의 속도로 추가로 생성하는 재조합 미생물.
  103. 제96항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서,
    미생물은 원핵생물인 재조합 미생물.
  104. 제96항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서,
    미생물은 대장균(Escherichia coli)(이 콜라이(E. coli)), 엔테로박터(Enterobacter), 아조토박터(Azotobacter), 에르위니아(Erwinia), 바실루스(Bacillus), 슈도모나스(Pseudomonas), 클렙시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 살모넬라(Salmonella), 세라티아(Serratia), 쉬겔라(Shigella), 리조비아(Rhizobia), 비트레오실라(Vitreoscilla) 및 파라코쿠스(Paracoccus)로부터 선택되는 재조합 미생물.
  105. 제96항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서,
    미생물은 진핵생물인 재조합 미생물.
  106. 제96항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서,
    미생물은 칸디다(Candida), 피치아(Pichia), 사카로미세스(Saccharomyces), 쉬조사카로미세스(Schizosaccharomyces), 지고사카로미세스(Zygosaccharomyces), 클루이베로미세스(Kluyveromyces), 데바리오미세스(Debaryomyces), 피치아(Pichia), 이사트첸키아(Issatchenkia), 야로위아(Yarrowia) 및 한센눌라(Hansenula), 특정 호스트 효모 세포, 예컨대 씨 소노렌시스(C. sonorensis), 케이 마륵시아누스(K. marxianus), 케이 테르모톨레란스(K. thermotolerans), 씨 메타네소르보사(C. methanesorbosa), 사카로미세스 불데리(Saccharomyces bulderi)(에스 불데리(S. bulderi)), 아이 오리엔탈리스(I. orientalis), 씨 람비카(C. lambica), 씨 소르복실로사(C. sorboxylosa), 씨 젬플리니나(C. zemplinina), 씨 게오차레스(C. geochares), 피 멤브라니파시엔스(P. membranifaciens), 지 콤부차엔시스(Z. kombuchaensis), 씨 소르보시보란스(C. sorbosivorans), 씨 반데르왈티이(C. vanderwaltii), 씨 소르보필라(C. sorbophila), 지 비스포루스(Z. bisporus), 지 렌투스(Z. lentus), 사카로미세스 바이야누스(Saccharomyces bayanus)(에스 바이야누스(S. bayanus)), 디 카스텔리이(D. castellii), 씨 보이디니이(C, boidinii), 씨 에트첼시이(C. etchellsii), 케이 락티스(K. lactis), 피 자디니이(P. jadinii), 피 아노말라(P. anomala), 사카로미세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae)(에스 세레비시아에(S. cerevisiae)), 피치아 갈레이포르미스(Pichia galeiformis), 피치아 종(Pichia sp.) YB-4149(NRRL 명칭), 칸디다 에찬톨리카(Candida ethanolica), 피 데세르티콜라(P. deserticola), 피 멤브라니파시엔스(P. membranifaciens), 피 페르멘탄스(P. fermentans) 및 사카로미콥시스 크라타에겐시스(Saccharomycopsis crataegensis)(에스 크라타에겐시스(S. crataegensis))로부터 선택되는 재조합 미생물.
  107. 하기 식의 알파-치환된 3-하이드록시프로피온산 또는 이의 염을 제조하는 방법으로서,
    제96항 내지 제106항 중 어느 한 항에서 정의된 재조합 미생물을 탄수화물의 존재 하에서 배양하는 단계; 및 알파-치환된 3-하이드록시프로피온산 또는 이의 염을 분리하는 단계를 포함하는 방법:
    Figure pct00049

    상기 식에서,
    각각의 R1은 (메틸보다 긴) 알킬, 하이드록시, 하이드록시알킬, 분지된 하이드록시알킬, 알콕시, 분지된 알킬, 아미노, 분지된 아미노 알킬, 페닐, 알킬 치환된 페닐, -S-, -SH, , -SeH, -Se-, 하이드록시방향족, 아미노방향족, 폼일, 카바모일, 인돌릴, 구아니디닐, 및 n>1 경우의 카복실레이트로부터 선택되고, n은 1 이상이다.
  108. 하기 식의 알파-치환된 아크릴산 또는 이의 염을 제조하는 방법으로서,
    알파-치환된 아크릴산을 제조하기 위해 알파 치환된 3-하이드록시프로피온산을 탈수하는 단계를 포함하는 방법:
    Figure pct00050

    상기 식에서,
    각각의 R1은 (메틸보다 긴) 알킬, 하이드록시, 하이드록시알킬, 분지된 하이드록시알킬, 알콕시, 분지된 알킬, 아미노, 분지된 아미노 알킬, 페닐, 알킬 치환된 페닐, -S-, -SH, , -SeH, -Se-, 하이드록시방향족, 아미노방향족, 폼일, 카바모일, 인돌릴, 구아니디닐, 및 n>1 경우의 카복실레이트로부터 선택되고, n은 1 이상이다.
  109. 제108항에 있어서,
    제107항에 따른 방법에 의해 알파-치환된 3-하이드록시프로피온산을 생성하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  110. 하기 식의 화합물 또는 이의 염:
    Figure pct00051

    상기 식에서,
    각각의 R1은 (메틸보다 긴) 알킬, 하이드록시, 하이드록시알킬, 분지된 하이드록시알킬, 알콕시, 분지된 알킬, 아미노, 분지된 아미노 알킬, 페닐, 알킬 치환된 페닐, -S-, -SH, , -SeH, -Se-, 하이드록시방향족, 아미노방향족, 폼일, 카바모일, 인돌릴, 구아니디닐, 및 n>1 경우의 카복실레이트로부터 선택되고, n은 1 이상이다.
  111. 하기 식의 화합물 또는 이의 염:
    Figure pct00052

    상기 식에서,
    각각의 R1은 (메틸보다 긴) 알킬, 하이드록시, 하이드록시알킬, 분지된 하이드록시알킬, 알콕시, 분지된 알킬, 아미노, 분지된 아미노 알킬, 페닐, 알킬 치환된 페닐, -S-, -SH, , -SeH, -Se-, 하이드록시방향족, 아미노방향족, 폼일, 카바모일, 인돌릴, 구아니디닐, 및 n>1 경우의 카복실레이트로부터 선택되고, n은 1 이상이다.
  112. 제110항 또는 제111항에 있어서,
    R1은 하이드록시인 화합물.
  113. 제110항 내지 제112항 중 어느 한 항에 있어서,
    n은 1 또는 2인 화합물.
  114. 제110항 또는 제111항에 있어서,
    R1은 하이드록시이고, n은 1인 화합물.
  115. 제110항 또는 제111항에 있어서,
    R1은 하이드록시이고, n은 2인 화합물.
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