KR20160043498A

KR20160043498A - D-자일로스로부터 1，2，4-부탄트리올을 생산하는 재조합 대장균, 이의 제조방법 및 이를 이용하여 1，2，4-부탄트리올을 생산하는 방법

Info

Publication number: KR20160043498A
Application number: KR1020150045928A
Authority: KR
Inventors: 정욱진; 발데후에사 크리스; 류 훠메이; 라모스 크리스틴; 니소라 그레이스; 이원근
Original assignee: 명지대학교 산학협력단
Priority date: 2014-10-13
Filing date: 2015-04-01
Publication date: 2016-04-21

Abstract

본 발명은 D-자일로스로부터 1，2，4-부탄트리올을 생산하는 능력을 가지는 재조합 대장균, 이의 제조방법 및 이를 이용하여 1，2，4-부탄트리올을 생산하는 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 야생의 대장균 내 D-자일로스와 D-자일로네이트 대사에 관여하는 유전자를 파괴하고, 여기에 필요한 유전자를 도입하여 형질전환함으로써 제조한 재조합 대장균, 이의 제조방법 및 이를 이용하여 D-자일로스로부터 1，2，4-부탄트리올을 생산하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 재조합 대장균을 이용하면 D-자일로스로부터 1，2，4-부탄트리올을 높은 수율로 생산할 수 있다.

Description

D-자일로스로부터 1，2，4-부탄트리올을 생산하는 재조합 대장균, 이의 제조방법 및 이를 이용하여 1，2，4-부탄트리올을 생산하는 방법{ENGINEERED ESCHERICHIA COLI PRODUCING 1，2，4-BUTANETRIOL FROM ＤXYLOSE, METHOD FOR MANUFACTURING THE SAME AND METHOD FOR 1，2，4-BUTANETRIOL PRODUCTION USING THE SAME}

본 발명은 D-자일로스로부터 1，2，4-부탄트리올을 생산하는 능력을 가지는 재조합 대장균, 이의 제조방법 및 이를 이용하여 1，2，4-부탄트리올을 생산하는 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 야생의 대장균 내 D-자일로스와 D-자일로네이트 대사에 관여하는 유전자를 파괴하고, 여기에 필요한 유전자를 도입하여 형질전환함으로써 제조한 재조합 대장균, 이의 제조방법 및 이를 이용하여 D-자일로스로부터 1，2，4-부탄트리올을 생산하는 방법에 관한 것이다.

글로벌 환경에 대한 인식은 재생 가능한 바이오매스의 미생물 발효를 통한 화학 물질 생산에 관한 과학적 연구에 동기를 부여하는 주요한 원인이다. 이러한 미생물 형질 전환 공정은 대사공학적으로 조작된 미생물을 이용하여 C5 및 C6 당류 유래의 바이오매스를 연료, 플랫폼 화합물 및 바이오폴리머 등으로 컨버젼하는 것을 포함한다. 3-하이드록시프로피오닉산(3-hydroxypropionic acid)，에틸렌 글리콜(ethylene glycol)，5-아미노발레르에이트(5-aminovalerate) 및 폴리하이드록시알카노에이트(polyhydroxyalkanoates)의 생산 등이 그 예이다(Valdehuesa KNG，Liu H，Nisola GM，Chung W-J，Lee SH，Park SJ. Recent advances in the metabolic engineering for the production of 3-hydroxypropionic acid as C3 platform chemica1. Appl Microbiol BiotechnoI2013;97:3309-3321.; Liu H，Ramos KRM，Valdehuesa KNG，Nisola GM，Lee W-K，Chung W-J. Biosynthesis of ethylene glycol in Escherichㅽa coli.Appl Microbiol Biotechno 12013;97:3409-3417.; Park SJ，Kim TW，Kim MK，Lee SY，Lim SC. Advanced bacterial polyhydroxyalkanoates: towards a versatile and sustainable platform for unnatural tailor-made polyesters. Biotechnol Adv 2012;30:1196-1206.; Park SJ，Kim EY，Noh W，Park HM，Oh YH，Lee SH，Song BK，Jegal J，Lee SY. Metabolic engineering of Escherichia coli for the production of 5-aminovalerate and glutarate as C5 platform chemicals. Metab Eng 2013;16:42-47.) 이러한 높은 가치의 화학 물질은 바이오매스의 주요한 구성요소인 D-글루코스 또는 D-자일로스에서 생산된다. D-글루코스 뿐만아니라, 바이오 기초 화학 물질 생산을 위한 기질로서 D-자일로스는 헤미셀룰로오스 내에 매우 풍부하기 때문에 D-글루코스와 동등하게 관심을 받고 있다.

3개의 하이드록시기를 갖는 폴리 알코올 BT(1，2 4-butanetriol)는 글리세롤(C3)과 유사한 구조를 갖는 C4 화합물이다. 이는 니트로글리세린 대체제로 사용되는 에너제틱한 가소제(energetic plasticizer)인, 1,2,4-부탄트리올 트리니트레이트(1，2，4-butanetriol trinitrate) 생산을 위한 전구체로 알려 있다. BT는 또한, 개선된 탄성 특성과 천연 섬유와 유사한 압축-굽힘 특성을 갖는 폴리우레탄 폼 (polyurethane foams) 생산을 위한 원료로 사용된다. 의료 분야에서 BT는 약물전달을 위한 양이온성 지질의 합성을 위한 잠재적 전구체일 수 있다; 또한 탈수반응에 의해 HIV 약물 Amprenavir을 위한 주요한 구성 성분인 3-하이드록시테트라하이드로퓨란(3-hydroxytetrahydrofuran)으로 사용될 수 있다. BT의 전통적인 합성은 고압, 고온에서의 NaBH₄에 의한 D ,L-말릭산(D,L-malic acid)의 수소화 반응에 의해 혼합물을 생성하는 방법으로 구성된다. 이 방법에서 출발물질 약 25%는 전형적으로 부산물 형성에 소비되는데, 이는 BT의 수율을 제한하고 BT의 정제를 복잡하게 문제가 있다. 한편 BT의 생합성과 같은 대안적 방법은 거의 보고된 바 없다.

Niu W, Molefe MN, Frost JW.Microbial synthesis of the energetic material precursor 1,2,4-butanetriol. J Am ChemSoc2003125:12998-12999.

본 발명의 목적은 D-자일로스로부터 1，2，4-부탄트리올을 생산하는 능력을 가지는 재조합 대장균을 제조하고 및 이를 이용하여 1，2，4-부탄트리올을 생산하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명은, 수탁번호 KCTC 12722BP로 기탁된, D-자일로스로부터 1，2，4-부탄트리올(BT)을 생산하는 능력을 가진 재조합 대장균 EWBT304를 제공한다.

상기 재조합 대장균 EWBT304는, 자일로스 이성화효소(isomerase)를 인코딩하는 xylA 유전자, 자일루로스 키나아제(xylulose kinase)를 인코딩하는 xylB 유전자, 2-케토-3-데옥시-D-자일로네이트 알돌라아제(2-keto-3-deoxy-D-xylonate aldolase)를 인코딩하는 yjhH 유전자 및 yagE 유전자가 파괴되고, 자일로스 탈수소효소를 인코딩하는 xdh 유전자를 클로닝함으로써 제조된 플라스미드 pKMX 및 벤조일포메이트 탈탄산효소(benzoylformate decarboxylase)를 인코딩하는 mdlC 유전자를 클로닝함으로써 제조된 플라스미드 pTRM이 도입된 것일 수 있다.

상기 자일로스 이성화효소(isomerase)를 인코딩하는 xylA 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 구성될 수 있다.

상기 자일루로스 키나아제(xylulose kinase)를 인코딩하는 xylB 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 구성될 수 있다.

상기 알돌라아제를 인코딩하는 yjhH 유전자는 서열번호 3의 염기서열로 구성될 수 있다.

상기 알돌라아제를 인코딩하는 yagE 유전자는 서열번호 4의 염기서열로 구성될 수 있다.

상기 xdh 유전자는 서열번호 5의 염기서열로 구성될 수 있다.

상기 mdlC 유전자는 서열번호 6의 염기서열로 구성될 수 있다.

또한 본 발명은, 대장균에서 자일로스 이성화효소(isomerase)를 인코딩하는 xylA 유전자, 자일루로스 키나아제(xylulose kinase)를 인코딩하는 xylB 유전자 및 2-케토-3-데옥시-D-자일로네이트 알돌라아제(2-keto-3-deoxy-D-xylonate aldolase)를 인코딩하는 yjhH 유전자 및 yagE 유전자를 파괴하는 단계(단계 a); 및 자일로스 탈수소효소를 인코딩하는 xdh 유전자 및 벤조일포메이트 탈탄산효소(benzoylformate decarboxylase)를 인코딩하는 mdlC 유전자를 상기 단계 a의 대장균 내에 도입하는 단계(단계 b)를 포함하는 재조합 대장균 EWBT304 제조방법을 제공한다.

상기 단계 b에서 자일로스 탈수소효소를 인코딩하는 xdh 유전자를 도입하는 단계는, 자일로스 탈수소효소를 인코딩하는 xdh 유전자를 클로닝하여 플라스미드 pKMX를 제조하고 이를 대장균 내에 도입하는 방법으로 수행될 수 있다.

상기 단계 b에서 벤조일포메이트 탈탄산효소(benzoylformate decarboxylase)를 인코딩하는 mdlC 유전자를 도입하는 단계는, 벤조일포메이트 탈탄산효소(benzoylformate decarboxylase)를 인코딩하는 유전자 mdlC를 클로닝하여 플라스미드 pTRM를 제조하고 이를 대장균 내에 도입하는 방법으로 수행될 있다.

상기 xdh 유전자는 카울로박터 크레센투스(Caulobacter crescentus)에서 유래될 수 있다.

상기 mdlC 유전자는 슈도모나스 퓨티다(Pseudomonas putida)에서 유래될 수 있다.

상기 자일로스 탈수소효소를 인코딩하는 xdh 유전자 및 벤조일포메이트 탈탄산효소(benzoylformate decarboxylase)를 인코딩하는 mdlC 유전자의도입은 전기천공법으로 수행할 수 있다.

또한 본 발명은, D-자일로스가 포함된 배지에 재조합 대장균 EWBT304를 첨가하여 배양액을 제조하는 단계; 및 상기 배양액으로부터 1，2，4-부탄트리올을 회수하는 단계를 포함하는 1，2，4-부탄트리올의 생산방법을 제공한다.

상기 배양은 진탕 배양법으로 수행할 수 있다.

상기 배양은 27 ~ 45 ℃에서 수행할 수 있고 더욱 바람직하게는 37 ℃에서 수행할 수 있다. 또한 상기 배양은 36 ~ 72 시간 동안 수행할 수 있다.

또한 본 발명은, D-자일로스가 포함된 배지에 재조합 대장균 EWBT304를 첨가하여 제조된 배양액에서 회수된 1，2，4-부탄트리올을 이용하여 1,2,4-부탄트리올 트리니트레이트를 생산하는 방법을 제공할 수 있다.

또한 본 발명은, D-자일로스가 포함된 배지에 재조합 대장균 EWBT304를 첨가하여 제조된 배양액에서 회수된 1，2，4-부탄트리올을 이용하여 양물전달용 양이온성 지질을 생산하는 방법을 제공할 수 있다.

본 발명에 따른 재조합 대장균을 이용하면 D-자일로스로부터 1，2，4-부탄트리올을 높은 수율로 생산할 수 있다.

도 1은 D-자일로스에서 1,2,4-부탄트리올로 컨버전되는 생합성 경로를 나타내는 것이다; xdh - 자일로스 탈수소효소 코딩 유전자 (xylose dehydrogenase coding gene from Caulobacter crescentus); yjhG/yagF - D-자일로닉 산 탈수효소(D-xylonic acid dehydratase genes from E. coli); mdlC - 벤조일포메이트 탈탄산효소 코딩 유전자 (benzoylformate decarboxylase coding gene from Pseudomonas putida); adh - 알코올 탈수소효소 유전자 (any alcohol dehydrogenase gene from E. coli). X는 유전자 파괴를 나타낸다. 유전자 파괴(Gene disruptions): xylAB - 자일로스 이성화효소 및 자일루로키나아제 (xylose isomerase and xylulokinase in E. coli); yjhH/yagE - 2-케토-3-데옥시-D-자일로네이트 알돌라아제 (2-keto-3-deoxy-D-xylonate aldolase in E. coli)
도 2는 D-자일로스에서 1,2,4-부탄트리올로 컨버전되는 반응의 깁스 자유 에너지 변화(Gibbs free energy change, Δ_rG°)를 나타내는 것이다. 막대(bar) 그래프는 각 반응 단계의 개별 자유 에너지 변화(the individual free energy change)이고 선(line) 그래프는 전체 경로의 누적 자유 에너지 변화(cumulative free energy change)를 나타내는 것이다.
도 3은 (a) 다양한 농도의 BT 내에서의 E. coli W3110 (DE3)의 성장 곡선, (b) 다양한 농도의 BT 내에서의 균주의 비성장속도(Specific growth rate, μ [h^-1])를 나타내는 것이다. 모든 실험은 2회 반복하여 중복으로 수행하였다.
도 4는 SDS-PAGE 겔 분석으로 E. coli W3110 (DE3) 내의 Bfd (~56 kDa) 및 Xdh (~30 kDa)를 분석한 결과이다. 조 효소(Crude enzyme) 추출물을 사용하여 분석하였다; (A) 0.1 mM IPTG 첨가군, (B) 0.1 mM IPTG 무첨가군 및 (C) 야생형 E. coli W3110 (DE3)
도 5는 (a) Bfd 효소 분석 결과를 나타내는 HPLC 크로마토그램(chromatogram), (b) fd 효소 분석 결과를 나타내는 GC-MSD 이온 크로마토그램, (c) GC-MSD 이온 크로마토 그램에서의 3.28 분에서 피크의 질량 스펙트럼, (d) GC-MSD 피크의 매스 스펙트라 라이브러리 서치 매치(Mass spectra Library search match)를 나타내는 그래프이다.
도 6은 BT 새산 균즈를 진탕 배양한 결과를 나타내는 그래프이다. 데이터는 2회 반복실험으로 얻은 것이다.
도 7은 EWBT304의 BT의 누적 속도에 대한 세포 내 산화 환원 상태의 상관관계를 나타내는 것이다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 본 발명의 목적은, 특징, 장점은 이하의 실시예를 통하여 쉽게 이해될 수 있다. 여기서 소개되는 실시예는 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위하여 제공되는 것이다. 따라서 이하의 실시예에 의하여 본 발명의 권리범위가 제한되어서는 안 된다.

본 발명에 따르면, 재조합된 단일 균주를 이용하여 D-자일로스부터 BT(1，2 4-butanetriol)를 생산할 수 있다(도 1 참조). 경로는 4단계로 구성된다. 우선 D-자일로스의 D-자일로닉 산으로의 컨버젼을 위해 카울로박터 크레센투스 (Caulobacter crescentus)로부터, NAD⁺-의존성 자일로스 탈수소효소(Xdh)를 인코딩하는 유전자(xdh)를 도입한다. 이어서, D-자일로네이트(D-xylonate)로부터 KDX(2-keto-3-deoxy-D-xylonate)를 생산하는데, 이는 본래의 자일로네이트 탈수효소(xylonate dehydratase, XylD)에 의해 촉진(촉매화)될 수 있다(Liu H, Ramos KRM, Valdehuesa KNG, Nisola GM, Lee W-K, Chung W-J. Biosynthesis of ethylene glycol in Escherichia coli. Appl Microbiol Biotechnol 2013;97:3409-3417.). 세 번째 단계에서 탈카르복실화 반응(decarboxylation, 탈탄산반응)에 의해 KDX로부터 DHB(D-3,4-dihydroxybutanal)가 생산된다. 이는 벤조일포메이트 탈탄산효소(benzoylformate decarboxylase, Bfd)를 인코딩하는 mdlC 유전자에 의해 촉진(촉매화)된다. 상기 mdlC 유전자는 슈도모나스 퓨티다(Pseudomonas putida)에서 유래된다. 마지막 단계에서, 숙주 균주 내생의 알코올 탈수소효소(endogenous alcohol dehydrogenases, Adh)에 의해 DHB의 알데하이드 기능기(aldehyde functional group)가 하이드록실기(hydroxyl group)로 변환되어 BT를 생성한다.

균주 및 플라스미드 합성

본 발명에서 사용되는 모든 플라스미드 및 박테리아 균주는 표 1에 나타내었다. E. coli DH5α (Solgent, Daejon, Republic of Korea 305-348)는 일반적 복제 실험과 프라스미드 보수(plasmid maintenance)를 위해 사용되었다. American Type Culture Collection (Manassas, VA 20108; ATCC No. 27325)으로부터 구매한 와일드 타입 E. coil W3110은 효소 발현 실험과 유전자 파괴에 사용되었다. 발현 벡터 pTrcHis2A는 Invitrogen (Invitrogen™ 5791 Van Allen Way Carlsbad, CA 92008)으로부터 구매하였고, P. putida.로부터 얻은 mdlC gen을 위한 발현 벡터로 사용하였다.

[표 1]

본 발명에서 사용된 플라스미드 및 균주

^aInvitrogen™ 5791 Van Allen Way Carlsbad, CA 92008

^bKorean Collection for Type Cultures, Daejon, Republic of Korea 305-806

^cSolgent Competent Cells, Daejon, Republic of Korea 305-348

^dAmerican Type Culture Collection, Manassas, VA 20108

[1] Kovach ME, Elzer PH, Hill DS, Robertson GT, Farris MA, Roop II RM, Peterson KM. Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS, carrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene 1995;166:175-176.

[2] Park SJ, Lee TW, Lim S-C, Kim TW, Lee H, Kim MK, Lee SH, Song BK, Lee SY. Biosynthesis of polyhydroxyalkanoates containing 2-hydroxybutyrate from unrelated carbon source by metabolically engineered Escherichia coli. Appl Microbiol Biotech 2012;93:273-283.

[3] Lee SH, Park SJ, Lee SY, Hong SH. Biosynthesis of enantiopure (S)-3-hydroxybutyric acid in metabolically engineered Escherichia coli. Appl Microbiol Biotechnol 2008;79:633-641.

[4] Liu H, Ramos KRM, Valdehuesa KNG, Nisola GM, Lee W-K, Chung W-J. Biosynthesis of ethylene glycol in Escherichia coli. Appl Microbiol Biotechnol 2013;97:3409-3417.

[5] Liu H, Valdehuesa KNG, Nisola GM, Ramos KRM, Chung W-J. High yield production of D-xylonic acid from D-xylose using engineered Escherichia coli. Bioresour Technol 2012;115:244-248.

상기 ΔxylA, ΔxylB, ΔyjhH, ΔyagE는 각각 xylA, xylB, yjhH, yagE 유전자가 파괴된 것을 나타낸다.

상기 플라스미드 pKMX는 Thermo Scientific 등에서, pTRM은 Invitrogen 등에서 구매하여 사용할 수 있다.

플라스미드 pXdh는 본 발명에서 xdh를 위한 소스로 사용하였다. 플라스미드 pKE12-MCS는 프로모터를 포함하는 발현 벡터이고, pTacLacI은 tac 프로포터를 포함하는 발현 벡터이다. pTacLacI로부터 얻은 tac 프로포터는 프라이머 Tac-F 및 Tac-R를 이용하여 증폭시켰다. 증폭된 단편은 플라스미드 pKE112-MCS를 제조하기 위하여, tXhoI/EcoRI 사이트의 pKE12-MCS 내에서 P_L1acO-1프로모터를 대체하기 위하여 사용되었다. tac 프로모터, 멀티-클로닝 사이트(MCS) 및 pKE112-MCS로부터 얻은 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha) 전사 종결자(transcription terminator)를 포함하는 DNA 단편은 프라이머 TacMCS-F 및 TacMCS-R를 이용하여 증폭시켰고 pKM212-MCS를 생산하기 위하여 SspI-digested pBBR1MCS2로 클로닝하였다.

표준 절차 후 DNA 조작을 하였다(Sambrook J, Russell DW. Molecular cloning-a laboratory manual. 3^rdedn. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001.). 본 발명에서 사용된 모든 프라이머(표 2)는 Bionics (Seoul, Republic of Korea)에서 합성되었다. FastDigestㄾ 효소는 Thermo Scientific (Waltham, MA, USA)에서 구매하였고 KOD DNA 중합효소는 Toyobo (Osaka, Japan)에서 구매하였다. PCR (Polymerase chain reactions)은 T100™ Thermal Cycler (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 이용하여 수행하였다. mdlC gene의 DNA 시퀀스 (1,587 bp, GenBank accession no. AY143338.1, NT 2860-4446)는 OPTIMIZER를 이용하여 코돈 최적화 되었고(Puigb P, Guzmn E, Romeu A, Garcia-Vallv S. OPTIMIZER: A web server for optimizing the codon usage of DNA sequences. Nucleic Acids Research 2007;35:W126-W131.), pUC 타입 벡터에서 유전자 인서트로 Bioneer(Daejon, Republic of Korea 306-220)에 의해 합성되었다. pTRM을 제조하기 위해, mdlC 유전자를 적절한 프라이머를 이용하여 증폭시켰다(표 2). PCR 증폭된 DNA 단편 및 pTrcHis2A를 NcoI 및 EcoRI 제한효소로 절단, E. coli DH5α에 리게이션 및 형질전환시켰다. 성공적인 형질 전환체를 확인, pTRM을 DH5α에서 추출하여 GenePulser (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 이용한 전기천공법에 의해 원하는 숙주 균주에 도입하여 형질전환시켰다. 플라스미드 pKMX는 프라이머 Xdh-F와 Xdh-R을 사용하여 pXdh에서 증폭되고 플라스미드 pKM212-MCS의 EcoRI 및 BamHI로 제한 자리(restriction sites)에서 연결(ligate)된 xdh 유전자를 클로닝함으로써 제조되었다.

[표 2]

본 발명에서 사용된 프라이머

^a볼드체는 제한효소 자리,

^bBioneer Corp., Daejon, Republic of Korea 306-220,

^c이탤릭체로 기재된 시퀀스는 각 유전자 타겟과 상응하는 상동 시퀀스(homologous sequences)이다.

유전자 조작

본 연구에 사용된 E. coli W3110 xylAB 돌연변이 및 yjhH yagE 돌연변이 균주의 조작은 Valdehuesa KNG, Liu H, Nisola GM, Chung W-J, Lee SH, Park SJ. Recent advances in the metabolic engineering for the production of 3-hydroxypropionic acid as C3 platform chemical. Appl Microbiol Biotechnol 2013;97:3309-3321 및 Liu H, Valdehuesa KNG, Nisola GM, Ramos KRM, Chung W-J. High yield production of D-xylonic acid from D-xylose using engineered Escherichia coli. Bioresour Technol 2012;115:244-248.에서 설명되었다. 이전에 보고된 원-스텝 유전자 불활성법을 유전자 파괴 실험에 이용하였다(Cherepanov PP, Wackernagel W. Gene disruption in Escherichia coli: TcR and KmR cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant. Gene 1995;15:9-14). 플라스미드 pKD46를 Red 재조합효소 발현벡터(Red recombinase expression vector)로서 사용하였다; pKD3 및 pKD4는 유전자 파괴 카세트의 PCR 증폭을 위한 템플릿으로 사용되었다; pCP20은 플라스미드를 제거하는 내성 유전자(resistance gene)로 사용되었다. 돌연변이 균주 E. coli WXHE는 E. coli WHE에서 xylAB 유전자를 파괴함으로써 제조하였다. xylAB 파괴 카세트(disruption cassette)는 템플릿으로서 pKD4를 갖는 프라이머 xylAB-kF 및 xylAB-kR을 이용하여 PCR 증폭시켰다. 그 다음 카나마이신 내성 유전자를 운반하는 PCR 단편(PCR fragment)을, pKD46이 잠복하는 E. coli WHE.로 형질전환시켰다. 카나마이신에 대한 내성을 갖는 형질전환체을 스크리닝한 다음 pCP20 플라스미드를 이용한 처리를 통해 선택된 내성 유전자를 제거하였다. 유전자 파괴는 프라이머 ylAB-vF 및 xylAB-vR를 이용하여 확인하였고, 또한 이전에 보고된 확인 프라이머를 이용한 yjhH 및 yagE 의 유전자 파괴의 리텐션(retention)을 이용하여 확인하였다(Liu H, Ramos KRM, Valdehuesa KNG, Nisola GM, Lee W-K, Chung W-J. Biosynthesis of ethylene glycol in Escherichia coli. Appl Microbiol Biotechnol 2013;97:3409-3417.).

단백질 활성 및 효소 활성 분석

E. coli 내의 Xdh 및 Bfd의 단백질 발현 레벨은 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)을 이용하여 테스트하였다. Xdh 활성은 이전에 보고된 방법에 따라 조 세포(crude cell) 추출물로부터 측정하였다(Liu H, Valdehuesa KNG, Nisola GM, Ramos KRM, Chung W-J. High yield production of D-xylonic acid from D-xylose using engineered Escherichia coli. Bioresour Technol 2012;115:244-248.; Berghㅴll S, Hilditch S, Penttilㅴ M, Richard P. Identification in the mould Hypocrea jecorina of a gene encoding an NADP(+): D-xylose dehydrogenase. FEMS Microbiol Lett 2007;277:249-53.) 단백질 농도는 Bradford에 의해 개발된 분석법에 기초하여, 바이오-래드(Bio-Rad) 단백질 키트를 사용하여 측정하였다(Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 1976;72:248-254.) D-자일로스 탈수소효소 활성의 1 단위는 분당 1 ㅅmol D-자일로스를 D-자일로닉 산으로 변환하는 효소의 양으로 정의된다. BFD 활성 분석은 기질 KDX의 비가용성 때문에 제한되었다. BFD 활성을 증명하기 위하여, Niu et al.(Niu W, Molefe MN, Frost JW. Microbial synthesis of the energetic material precursor 1,2,4-butanetriol. J Am ChemSoc 2003;125:12998-12999.) 및 Meijnen et al.(Meijnen J-P, de Winde JH, Ruijssenaars HJ. Establishment of oxidative D-xylose metabolism in Pseudomonas putida S12. Appl Envi Microbiol 2009;75:2784-2791.)에 의해 개발된 연속적인 분석 기법에 약간의 수정을 가하였다. 이 분석은 BT 경로의 "다운스트림(downstream)"컨버젼 단계의 활성을 결정한다(즉, D-자이로네이트에서 2 효소 단계를 포함하는 DHB로의 변환). 이 활성은 DHB에서 BT로 컨버전될 때의 이콰인 탈수소효소(equine dehydrogenase, Sigma, Korea)에 의한 NADH 소비를 감지함으로써 측정하였다. 효소 용액은 50 mM 포타슘 포스페이트(potassium phosphate, pH 6.5), 10 mM D-자일로네이트(D-xylonate), 10 mM 마그네슘 클로라이드(magnesium chloride), 0.15 mM 티아민 피로포스페이트(thiamine pyrophosphate), 0.2 mM NADH, 10 U 이콰인 탈수소효소(equine dehydrogenase) 및 100 ㎕의 조효소 용균액(crude enzyme lysate)를 포함한다. 이콰인 탈수소효소는 이 분석에서 최종 효소이기 때문에, 이콰인 탈수소효소의 활성은 XylD 및 BFD의 전체 활성을 나타낼 수 있다. 분석은 BFD 분석 용액을 추가로 24 시간 동안 37 ℃에서 배양하고 HPLC와 GC-MSD로 수행하였다.

미디어(media) 및 배양 조건

100 mL Luria Bertani (LB) broth (L3022, Sigma), 10 g L^-1D-자일로스, 1.0mM MgSO₄, 및 1.0 mgL^-1티아민 하이드로클로라이드(thiamine hydrochloride)를 포함하는 300 mL Erlenmeyer에서 진탕 플라스크 배양을 수행하였다. 하룻밤동안 배양된 접종제 일부(aliquot, 1 mL)를 첨가하고, 항생제(카나마이신 및 암피실린)를 발효 초기에 첨가하여 180 rpm으로 교반하면서 37 ℃에서 배양하였다. 균주 성장에 대한 BT 농도의 효과는 Bioscreen C(Growth Curves USA, Piscataway, NJ)를 이용하여 측정하였다.

각 허니컴 웰(honeycomb well)에 하룻밤 동안 배양된 1.0 μL의 접종제(overnight inoculant) 및 다양한 BT 농도(0, 5, 10, 50, 100, 200, 300 g L^-1)의 LB 배지 100 μL를 로딩하였다. 각 배양물에 대한 비성장속도(specific growth rates)를 계산하였다.

바이오매스, 대사산물, 생산물 및 NAD ⁺ /NADH 분석

세포 성장은 세포 건조 중량으로 측정하였다. 세포 성장은 세포 건조 중량으로 측정 하였다. 배양 샘플을 2 mL 원심분리튜브(pre-dried and pre-weighed centrifuge tubes)에 옮기고 8,000 g에서 10분 동안 펠릿화화였다. 그 다음 증류수로 2회 세척하고 105 ℃에서 건조시켰다. 600 nm (OD₆₀₀)에서 옵티컬 밀도(optical density)와 상관된 건조 세포 중량의 스탠다드 커브를 생성하였다; 하나의 OD₆₀₀유닛(unit)은 세포 건조 중량의 0.32 g L^-1에 해당한다.

D-자일로스, D-자일로닉 산(D-xylonic acid), 아세트산(acetic acid), 글리콜릭 산(glycolic acid), 에틸렌 글리콜(ethylene glycol) 및 BT 세포외 대사는 Bio-Rad Aminex HPX-87H 컬럼 (300 x 7.8 mm)이 장착된 HPLC를 이용하여 분석하였다(용리액 5 mM H₂SO₄, flow rate 0.4 mL min^-1). 컬럼 온도는 55 ℃로 유지하였고 Waters 2414 리프렉티브 인덴그 디텍터(refractive index detector)를 이용하여 피크를 감지하였다. D-자일로스는 D-자일로닉 산 존재 하에서 HPLC에 의해 정확하게 감지할 수 없었다. 따라서, D-자일로닉 산 농도를 Lien이 고안한 hydroxamate 법을 이용하여 측정하였다(Lien OG. Determination of gluconolactone, galactonolactone, and their free acids by hydroxamate method. Anal Chem1959;31:1363-1366.) 5개 샘플을 0.7 M HCl로 희석하고, 500 μl의 희석된 샘플을 1 mL의 하이드록실아민 시약(hydroxylamine reagent, 2 M hydroxylamine HCl in 2 M NaOH))에 첨가하기 전에 100 ℃에서 15분 동안 가열하여 D-자일로닉 산을 xylono-γ-lactone으로 컨버전시켰다. HCl (650 μl, 3.2 M) 같은 다른 시약들을 첨가한 후, 500 μl 의 FeCl₃(100 gl^-1in 0.1M HCl)을 첨가하였다. 흡광도는 8453 Agilent UV-VIS 분광광도계를 이용하여, D-자일로닉 산의 부량(quantification)을 위해 550nm에서 측정하였다.

BT 누적 농도는 GC-MSD 분석으로 확인하였다. 500 μL의 시료 분취액을 마이크로 원심 튜브에 옮기고, 80 % 황산을 첨가함으로써 산성화시켰다. 산성화된 용액은 -50 ℃ 및 133 mbar에서 Labconco Freeze 건조기를 이용하여 탈수하였다. 잔류물을 250 μL의 피리딘에 용해시켰다. 250 μL의 N, O-비스(트리메틸실릴)트리플루오로아세트아미드 (N,O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide, BSFTA)를 첨가하기 전에, 용해되지 않은 잔류물을 원심 분리에 의해 제거하였다.

GC-MSD (HP 6890 GC / HP5973 Mass selective detector) 분석을 하기 전에, 이 용액을 2-3시간 동안 60 ℃에서 배양하였다. GC-MSD 오븐 온도 조건은 처음 2 분 동안 130 ℃로 설정, 25 ℃ h^-1에서 2 분 동안 220 ℃로 램핑(ramping), 다시 40℃h^-1에서 2 분 동안 280 ℃로 램핑하였다. He 캐리어 가스를 유속 2.0 mL min^-1 으로 공급하고, 샘플을 분할비율 50:1로 하여 1.0 μL 주입하였다. MSD 트랜스퍼 라인(transfer line)은 280 ℃로 유지하였다(solvent delay 1.75 분 및 EM voltage 1400). 세포의 NAD⁺/NADH 비율은 NAD+/NADH Quantification Colorimetric Kit를 이용하여 측정하였다. 사용자 프로토콜을 따랐고 100-웰 플레이트 허니컴 플레이트를 Bioscreen C (Growth Curves USA, Piscataway, NJ)를 사용하여 450 nm에서 판독하였다.

경로 설계 및 열역학

모든 대사 연구 및 공학적 노력(metabolic research 및 engineering effort)에서 일반적인 매개 변수는 열역학적 제약을 고려하는 것이다. 이는 생화학적 반응 가능성 및 자연에서 발견되는 몇몇의 대사 경로에 큰 영향을 미친다(Bar-Even A, Flamholz A, Noor E, Milo R. Rethinking glycolysis: on the biochemical logic of metabolic pathways. Nat ChemBiol 2012;8:509-517.) 이러한 접근법의 신규 대사 경로 디자인으로의 활용은 1,4-부탄디올, 4-하이드록시 부티레이트와 3-하이드록시 프로피온산과 같은 상업적으로 유용한 화합물을 합성하는 루트를 발견하는 과정에서 성공적으로 입증되어 왔다.

본 발명에서, 실험적 구현 전에 설계된 BT 합성 경로의 열역학적 가능성도 평가하였다(도 1 및 도 2). D-자일로닉 산을 형성하기 위하여 D-자일로스의 카르보닐기가 카르복실기로 변환되는 첫 번째 반응에서, NAD⁺는 공동인자로 사용되고 -36.7 kJ mol^-1의 깁스 자유 에너지 (Δ_rG^o)를 갖는다(eQuilibrato 온라인 프로그램을 사용하여 계산됨, Mavrovouniotis ML. Group contributions for estimating standard Gibbs energies of formation of biochemical compounds in aqueous solution. Biotechnol Bioeng 1990;36:1070-1082.). 두 번째 단계(2)에 의해서도 네거티브 Δ_rG^o를 갖는 덜 환원된 상태의 KDX가 형성된다(도 2 참조). 세 번째 단계(3)의 Δ_rG^o도 네거티브이다; 덜 환원된 상태 및 더 짧은 탄소-체인 길이의 이산화탄소를 포함하는 화합물 및 DHB가 방출된다. 마지막 단계(4)는 DHB의 BT로의 변환을 위하여 환원 당량의 NADH 또는 NADPH의 참여를 수반한다. 이 단계 또한 네거티브 Δ_rG^o를 나타낸다. 이는 이 반응이 정방향을 선호한다는 것을 나타낸다. 전반적으로, 전체 BT 합성 경로는 네 단계 모두 네거티브 자유 에너지 변화를 가지고 있다는 사실 때문에 열역학적으로 바람직하다고 할 것이다(도 2).

1,2,4 - 부탄트리올(BT) 독성(1,2,4-Butanetriol toxicity)

미생물 활성은 일반적으로 지방산 및 유기 용매의 존재에 의해 영향을 받는다. 따라서, E. coli에서 BT 경로 구축 이전에, E. coli에 대한 BT의 독성 시험을 수행하였다. 유기 용매의 대수 옥탄올/물 분배 계수 (Logarithmic octanol/water partition coefficient, log P_ow)는 세균에 대한 독성에 관한 파라미터를 나타내는데 바람직할 수 있다. 1 ~ 5 범위의 log P _ow값을 갖는 화합물은 일반적으로 생체적합성이 좋지 않다(Isken S, de Bont JAM. Bacteria tolerant to organic solvents. Extremophiles 1998;2:229-238.). BT에 대한 계산된 log P_ow 값은 -1.32이었고 이는 높은 극성 및 낮은 독성을 나타내는 것이다. 이러한 거동 특성은 BT를 함유하는 배양 성장 실험(culture growth test)에서 확인되었다(도 3a). 50 g L^-1BT 이하를 포함하는 배양물은 대조군(0 g L^-1BT)과 비교할 때 성장 패턴의 차이가 없었다(도 3a). 그러나 BT 농도> 50 g L^-1는 성장 곡선 및 배양 속도에 상당한 영향을 미친다는 것이 확인되었다. 완전한 성장 억제는 200 g L^-1BT에서 관찰되었다.

BT 농도가 각각 50 g L^-1 및 100 g L^-1일 때, 비성장속도(Specific growth rates)가 11% 및 37%까지 감소되었다. 또한 대조군(control)과 비교할 때, 100 g L^-1BT를 함유하는 배양물의 유도기(lag phase)가 3시간 더 길었다. 이러한 결과는 최근에 보고된 내용과 일치한다. 이에 따르면 BT 농도 >10 % (v/v)인 E. coli 배양물은 눈에 띄게 성장 억제가 관찰되었고, BT= 20 % (v/v) (238 g L^-1)일 때 완전한 성장 억제가 관찰되었다. BT의 낮은 독성은 BT의 낮은 log P_ow 값에서 기인할 수 있는데, 이는 결과적 E. coli 세포막에 결합(통합)이 잘 안된다는 것을 의미할 수 있다. 따라서 본 발명에서, BT의 성장 저해 효과는 E. coli에 의한 생성물에 영향을 미치지 않는다고 할 것이다.

Xdh 및 Bfd 단백질 발현 및 효소 분석

xdh를 pKM212-MCS에 클로닝하여 플라스미드 pKMX를 제조하였고, mdlC를 pTrcHis2A에 클로닝하여 플라스미드 pTRM를 제조하였다. 이러한 두가지 플라스미드를 E. coli 숙주로 트랜스폼(transform)시키고 Xdh 및 Bfd의 발현을 SDS-PAGE 분석을 이용하여 테스트하였다. Xdh 및 Bfd 발현 모두 0.1mM IPTG(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid) 첨가군 또는 무첨가군에서 뚜렷한 차이를 나타내지는 않았다(도 4). 따라서 BT 생산을 위한 추가 실험에서 IPTG는 첨가하지 않았다.

Xdh 및 BFD의 기능 발현은 효소 분석을 통해 시험하였다. 대조 균주에서 두 효소 모두 기저 활성(Basal activities)활동이 감지되지 않았다(표 3). 한편 테스트 균주에서는 Xdh 및 BFD의 기능 발현이 관찰되었는데, 대조 균주보다 상당히 높은 활성에 의해 입증되었다.

[표 3]

효소 활성

^aKDX의 DHB로의 컨버전을 촉진(촉매화)하는 Bfd에 대한 결합 효소 반응 분석(Coupled enzymatic reaction assay for the Bfd which catalyzes the conversion of KDX to DHB)

^b대조군 균주(Control strain): 야생형 E. coli W3110 (DE3)

BT 생산에서 Bfd 기능을 추가로 확인하기 위해, "다운스트림(downstream)" 변환 단계 (즉 D-자일로닉 산을 BT로 변환)를 위한 효소 분석 용액을 24 시간 동안 배양한 후, 샘플을 HPLC 및 GC-MSD로 분석하였다. BT의 형성은 두 가지 방법으로 확인하였다(도 5a 및 5b); 본격적인 BT 제품은 GC-MSD 를 통해 검출되었다(도 5c 및 5d).

BT 생산을 위한 E. coli host의 대사공학

플라스미드 pKMX 및 pTRM를 야생형 E. coli W3110 (DE3)로 트랜스폼(transform)하였다. BT 생산을 위해, 생산된 균주('EWBT001'라 한다)를 진탕 플라스크 배양을 이용하여 테스트하였다(도 6a). 72시간 후, 관찰된 BT 양은 HPLC의 최소 검출 한계보다 낮았다(도 6a). 그러나, GC-MSD에 의해 37 mg L^-1의 농도로 감지되었다. 본래의 D-자일로스 대사 경로(pentose phosphate pathway) 때문에 EWBT001에서 BT 생산량이 낮게 나타났다. 이는 BT 합성 경로에서, D-자일로네이트(D-xylonate)의 컨버전을 통하여 기질을 채널링(channeling)하는 대신, 세포 성장을 위한 D-자일로스 기질 및 다른 대사물질로 변환되었기 때문이다(도 6a). 72시간 후 D-자일로네이트(D-xylonate)는 단지 1.3 g L^-1까지 누적되었다. 그러나, 배양물에서 아세트산은 3.5 g L^-1이상 누적되었다. 이러한 친유성 유기산은 용이하게 세포막으로 투과할 수 있다고 알려져 있고, 결과적으로 세포의 양성자 구배를 파괴(방해)할 수 있다. 이러한 파괴(방해)는 기질 흡수 및 세포 성장 저해와 같은 바람직하지 상태를 야기할 수 있다. 이는 EWBT001 배양에 있어서 명백하게 확인된다. 12시간 이내에 pH가 4.8까지 감소하였는데, 이는 결과적으로 세포 성장을 막고 기질 소비를 감소시키는 결과를 가져오게 된다.

본 발명에서는 D-자일로네이트(D-xylonate)를 통해 BT 경로 쪽으로 탄소 흐름을 용이하게 하기 위하여, 각각 자일로스 이소머라아제(xylose isomerase) 및 자일루로스 키나아제(xylulose kinase)를 인코딩하는 유전자 xylA 및 xylB를 파괴함으로써 E. coli에서 본래의 D-자일로스 대사를 차단하였다. 돌연변이 균주 ΔxylAB는 D-자일로스 대사 기능을 잃게 된다. 두 번째 BT 생산 균주 EWBT103를 제조하기 위하여, 플라스미드 pKMX 및 pTRM 모두 이 돌연변이 균주에 트랜스폼(transform)시켰다. 상기와 같은 조건으로 EWBT103를 진탕 플라스크 배양하여 72시간 후에 0.12 g L^-1BT를 생산하였다(도 6b). 아세트산은 36시간 경과 후 최대 농도인 1.1 g L^-1를 나타내었다. 아세트산 및 D-자일로닉 산 농도가 최대치에 이르렀을 때, 배양물 pH는 동일 시간 동안 5.7까지 감소하였다. pH가 거의 중성으로 되돌아가는 나머지 배양 기간 동안, 상기 두 가지 산은 소비되었다. EWBT001와 달리, EWBT103은 모든 D-자일로스 및 3.0 g L^-1까지 누적된 바이오매스를 소비하였다. EWBT103의 향상된 성장은 아세트산 누적량이 저하된 것으로 설명될 수 있다. 이러한 균주에서, 아세트산은 Dahm's Pathway에서 유래된 피루베이트(pyruvate)로부터 형성된다. 또한 아세트산은 이후 세포 성장을 위해 더 많은 탄소를 공급하는 배양에서 동화된다. 클리콜릭 산 및 에틸렌 글리콜 또한 각각 역가(titers) 0.30 및 0.50 g L^-1을 나타내었다. 전체적으로, EWBT001와 비교할 때, EWBT103은 BT 생산과 D-자일로스 컨버전에 있어서 약간의 개선을 나타내었는데, 이는 E. coli.에서 BT 합성 경로 쪽으로 D-자일로스 채널링(channeling)을 위하여 본래의 D-자일로스 대사의 차단(blockage)이 필요하다는 것을 나타낸다.

본래의 D-자일로스 대사에 더하여, E. coli.는 대사물을 형성을 위하여 또 다른 경로를 갖는데, 이는 BT의 합성 경로와 경쟁하게 된다. E. coli.는 Dahms pathway를 통하여 D-자일로네이트(D-xylonate)를 대사할 수 있다(Liu H, Ramos KRM, Valdehuesa KNG, Nisola GM, Lee W-K, Chung W-J. Biosynthesis of ethylene glycol in Escherichia coli. Appl Microbiol Biotechnol 2013;97:3409-3417.; Park SJ, Kim TW, Kim MK, Lee SY, Lim SC. Advanced bacterial polyhydroxyalkanoates: towards a versatile and sustainable platform for unnatural tailor-made polyesters. Biotechnol Adv 2012;30:1196-1206.; Dahms AS. 3-deoxy-D-pentulosonic acid aldolase and its role in a new D-xylose degradation. Biochem Biophys Res Comm 1974;60:1433-1439.) D-자일로네이트(D-xylonate)는 KDX로 전환되고 알돌라아제(aldolases)에 의해 분해되어 피루베이트(pyruvate) 및 글리콜알데하이드(glycoaldehyde)를 방출한다(도 1 참조). 이러한 두 가지 중간체는 세포 성장을 위해 활용되거나 글리콜릭 산 또는 에틸렌 글리콜과 같은 다른 대사물을 형성할 수 있는데, 이는 EWBT103의 배양에서 감지되었다(도 6b). 따라서, BT 합성 쪽으로 탄소 흐름을 증가시키기 위하여 E. coli host에서 Dahms pathway의 차단이 필요할 수 있다. 이는 KDX에서 활성화되는 것으로 알려진 알돌라아제를 파괴하는 방법으로 수행될 수 있다. 이러한 효소는 yjhH 및 yagE 에 의해 인코딩된다. 이에 따라 ΔxylAB 돌연변이 균주로부터 yjhH 및 yagE를 추가로 파괴하여 삼중 돌연변이 균주 ΔxylABΔyjhHΔyagE를 제조하였다. 그 다음 플라스미드 pKMX 및 pTRM를 상기 삼중 돌연변이 균주에 도입하여 세 번째 BT 생산 균주 EWBT304를 제조하였다. 이 균주를 상기 조건과 동일하게 진탕 플라스크 배양하여 그 결과 고농도의 BT를 누적하였다(0.88 g L^-1, 도 6c, 몰수율 12.82%, 표 4). 도 6c에서 나타내는 바와 같이, 48시간 후 D-자일로스는 완전히 소비되었고 pH는 점진적으로 감소하였다(최종 pH.6). 이는 배양물에서 감지된 D-xylonate (8.8 g L^-1), 단일 유기산 때문일 수 있다. yjhH 및 yagE 유전자의 파괴 때문에, 이 균주에서는 아세트산, 글리콜릭 산 및 에틸렌 글리콜은 관찰되지 않았다. 하기 표 4에서 48시간 동안 진탕 플라스크 배양 후의 EWBT304에서의 BT 생산을 위한 대사물과 탄소 분포에 대해 나타내었다. 표 4에서의 탄소 균형(carbon balance)은, 95.09%의 탄소가 초기의 D-자일로스에서 회수되는 것을 나타낸다. 여기서 82.28%는 D-자일로네이트로 변환되었고, 10.25%는 BT로 전환되었다. 손실된 탄소는 BT 합성 경로에서 중간체에 대하여 낮은 활성을 갖는 알려지지 않은 효소들에 의하여 다른 대사물질로 변환되었을 수 있다. 또한 상기 탄소 균형은 D-자일로스가 BT 합성 경로로 유도되는 동안 오로지 LB 배지가 EWBT304의 성장을 지지한다는 것을 암시한다.

[표 4]

EWBT304에서 BT 생산에 있어서 대사 산물과 탄소 분배 분석

(EWBT304는 48 시간 동한 진탕 플라스크 배양함)

^a(C-mmol) x 100 / total carbon in D-xylose로 계산됨.

^b생성된 CO₂몰수는 동일하다고 누적된 BT 몰수와 동일하다고 가정함.

균주 EWBT 304의 NAD ⁺ /NADH 비율

환원 당량(Reducing equivalents)은 BT 경로 특히 첫 번째 및 마지막 단계와 직접적으로 관련된다. 육안검사(visual inspection)로, 도 1의 경로는, 첫 번째 단계에서 NAD⁺ 이 요구되고 NAD⁺이 재생성되는 마지막 단계에서 사용될 수 있는 NADH의 방출(release)이 이루어지므로 산화환원평형(redox balance)인 것처럼 보인다. 세포내 NAD⁺/NADH 비율에 의한 산화환원평형은 EWBT304를 이용하여 분석하였다(도 7). 처음 12시간 동안은 NAD⁺/NADH 비율이 >10을 나타내었고 이는 E. coli. 의 호기성 배양에서 전형적인 것이다. 24시간 경과 후, 빠른 속도로 D-자일로닉 산이 형성되면서 BT의 생성률이 가장 높았을 때, 비율은 4.5까지 감소하였다. 이 때, 세포 내의 토탈 프리 NAD+ 은 감소하였는데, 이는 D-자일로스가 D-자일로네이트로 컨버전하는 동안 공동인자(co-factor)로서 사용되는 것으로 추정된다. 결과적으로 이 반응 동안에 방출된 NADH는 상기 경로의 마지막 단계에서 BT를 형성하는 과정에 공동인자로서 사용되었을 수 있다. 이는 24시간 경과 시 BT 생성율이 0.046 g L^-1h^-1로 증가된 결과에 의해 지지될 수 있다. 공동인자 재활용 효과(co-factor recycling effect)는, NAD⁺값이 감소됨에도 불구하고 NADH 레벨이 일관되게 나타나는 것으로 설명될 수 있다(도 7). 이러한 결과는 BT 합성 경로의 마지막 단계를 촉진하는(촉매화하는) 활성 알코올 탈수소효소(active alcohol dehydrogenase)가 NADH에 의존할 가능성이 가장 높다는 것을 암시하는 것일 수 있다. E. coli의 세포 내에는 NADH가 NADPH가 더 풍부하고, 대부분의 알코올 탈수소효소(alcohol dehydrogenases, e.g. adhP, fucO, eutG, adhE, yjgB, 및 yiaY)는 NADH-의존성이 있으므로 BT 합성경로의 마지막 단계를 촉진(촉매화)하는 특정 알코올 탈수소효소에 대한 연구가 더 필요할 수 있다.

한국생명공학연구원

KCTC12722BP

20141113

<110> MYONGJI UNIVERSITY INDUSTRY AND ACADEMIA COOPERATION FOUNDATION <120> ENGINEERED ESCHERICHIA COLI PRODUCING 1,2,4-BUTANETRIOL FROM D-XYLOSE, METHOD FOR MANUFACTURING THE SAME AND METHOD FOR 1,2,4-BUTANETRIOL PRODUCTION USING THE SAME <130> P15-0126/MJU <160> 18 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1323 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 1 atgcaagcct attttgacca gctcgatcgc gttcgttatg aaggctcaaa atcctcaaac 60 ccgttagcat tccgtcacta caatcccgac gaactggtgt tgggtaagcg tatggaagag 120 cacttgcgtt ttgccgcctg ctactggcac accttctgct ggaacggggc ggatatgttt 180 ggtgtggggg cgtttaatcg tccgtggcag cagcctggtg aggcactggc gttggcgaag 240 cgtaaagcag atgtcgcatt tgagtttttc cacaagttac atgtgccatt ttattgcttc 300 cacgatgtgg atgtttcccc tgagggcgcg tcgttaaaag agtacatcaa taattttgcg 360 caaatggttg atgtcctggc aggcaagcaa gaagagagcg gcgtgaagct gctgtgggga 420 acggccaact gctttacaaa ccctcgctac ggcgcgggtg cggcgacgaa cccagatcct 480 gaagtcttca gctgggcggc aacgcaagtt gttacagcga tggaagcaac ccataaattg 540 ggcggtgaaa actatgtcct 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ggcgtaaaag ttattttgct caacgagcag 60 ggtgaggtgg ttgctgcgca aacggaaaag ctgaccgttt cgcgcccgca tccactctgg 120 tcggaacaag acccggaaca gtggtggcag gcaactgatc gcgcaatgaa agctctgggc 180 gatcagcatt ctctgcagga cgttaaagca ttgggtattg ccggccagat gcacggagca 240 accttgctgg atgctcagca acgggtgtta cgccctgcca ttttgtggaa cgacgggcgc 300 tgtgcgcaag agtgcacttt gctggaagcg cgagttccgc aatcgcgggt gattaccggc 360 aacctgatga tgcccggatt tactgcgcct aaattgctat gggttcagcg gcatgagccg 420 gagatattcc gtcaaatcga caaagtatta ttaccgaaag attacttgcg tctgcgtatg 480 acgggggagt ttgccagcga tatgtctgac gcagctggca ccatgtggct ggatgtcgca 540 aagcgtgact ggagtgacgt catgctgcag gcttgcgact tatctcgtga ccagatgccc 600 gcattatacg aaggcagcga aattactggt gctttgttac ctgaagttgc gaaagcgtgg 660 ggtatggcga cggtgccagt tgtcgcaggc ggtggcgaca atgcagctgg tgcagttggt 720 gtgggaatgg ttgatgctaa tcaggcaatg ttatcgctgg ggacgtcggg ggtctatttt 780 gctgtcagcg aagggttctt aagcaagcca gaaagcgccg tacatagctt ttgccatgcg 840 ctaccgcaac gttggcattt aatgtctgtg atgctgagtg cagcgtcgtg 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gacgatctga tcaaagcagg cgttgacggc ctgttcttcc tgggcagcgg tggcgagttc 180 tcccagctcg gcgccgaaga gcgtaaagcc attgcccgct ttgctatcga tcatgtcgat 240 cgtcgcgtgc cggtgctgat cggcaccggc ggcaccaacg cccgggaaac catcgaactc 300 agccagcacg cgcagcaggc gggcgcggac ggcatcgtgg tgatcaaccc ctactactgg 360 aaagtgtcgg aagcgaacct gatccgctat ttcgagcagg tggccgacag cgtcacgctg 420 ccggtgatgc tctataactt cccggcgctg accgggcagg atctgactcc ggcgctggtg 480 aaaaccctcg ccgactcgcg cagcaatatt atcggcatca aagacaccat cgactccgtc 540 gcccacctgc gcagcatgat ccataccgtc aaaggtgccc atccgcactt caccgtgctc 600 tgcggctacg acgatcatct gttcaatacc ctgctgctcg gcggcgacgg ggcgatatcg 660 gcgagcggca actttgcccc gcaggtgtcg gtgaatcttc tgaaagcctg gcgcgacggg 720 gacgtggcga aagcggccgg gtatcatcag accttgctgc aaattccgca gatgtatcag 780 ctggatacgc cgtttgtgaa cgtgattaaa gaggcgatcg tgctctgcgg tcgtcctgtc 840 tccacgcacg tgctgccgcc cgcctcgccg ctggacgagc cgcgcaaggc gcagctgaaa 900 accctgctgc aacagctcaa gctttgctga 930 <210> 5 <211> 747 <212> DNA <213> Caulobacter crescentus <400> 5 atgtcctcag ccatctatcc cagcctgaag ggcaagcgcg tcgtcatcac cggcggcggc 60 tcgggcatcg gggccggcct caccgccggc ttcgcccgtc agggcgcgga ggtgatcttc 120 ctcgacatcg ccgacgagga ctccagggct cttgaggccg agctggccgg ctcgccgatc 180 ccgccggtct acaagcgctg cgacctgatg aacctcgagg cgatcaaggc ggtcttcgcc 240 gagatcggcg acgtcgacgt gctggtcaac aacgccggca atgacgaccg ccacaagctg 300 gccgacgtga ccggcgccta ttgggacgag cggatcaacg tcaacctgcg ccacatgctg 360 ttctgcaccc aggccgtcgc gccgggcatg aagaagcgtg gcggcggggc ggtgatcaac 420 ttcggttcga tcagctggca cctggggctt gaggacctcg tcctctacga aaccgccaag 480 gccggcatcg aaggcatgac ccgcgcgctg gcccgggagc tgggtcccga cgacatccgc 540 gtcacctgcg tggtgccggg caacgtcaag accaagcgcc aggagaagtg gtacacgccc 600 gaaggcgagg cccagatcgt ggcggcccaa tgcctgaagg gccgcatcgt cccggagaac 660 gtcgccgcgc tggtgctgtt cctggcctcg gatgacgcgt cgctctgcac cggccacgaa 720 tactggatcg acgccggctg gcgttga 747 <210> 6 <211> 1587 <212> DNA <213> Pseudomonas putida <400> 6 atggcctccg ttcacggtac cacttacgag ctgctgcgtc 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Sequence <220> <223> xylAB-kR Primer <400> 16 cggctcatgc cgctgaaccc atagcaattt aggcgcagta gtgtaggctg gagctgcttc 60 g 61 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> xylAB-vF Primer <400> 17 cggcaacgca agttgttac 19 <210> 18 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> xylAB-vR Primer <400> 18 cgtcagacat atcgctggc 19

Claims

수탁번호 KCTC 12722BP로 기탁된,
D-자일로스로부터 1，2，4-부탄트리올을 생산하는 능력을 가진 재조합 대장균 EWBT304.
청구항 1에 있어서,
상기 재조합 대장균 EWBT304는,
자일로스 이성화효소(isomerase)를 인코딩하는 xylA 유전자, 자일루로스 키나아제(xylulose kinase)를 인코딩하는 xylB 유전자, 2-케토-3-데옥시-D-자일로네이트 알돌라아제(2-keto-3-deoxy-D-xylonate aldolase)를 인코딩하는 yjhH 유전자 및 yagE 유전자가 파괴되고, 자일로스 탈수소효소를 인코딩하는 xdh 유전자를 클로닝함으로써 제조된 플라스미드 pKMX 및 벤조일포메이트 탈탄산효소(benzoylformate decarboxylase)를 인코딩하는 mdlC 유전자를 클로닝함으로써 제조된 플라스미드 pTRM이 도입된 것을 특징으로 하는 재조합 대장균 EWBT304.
청구항 2에 있어서,
상기 자일로스 이성화효소(isomerase)를 인코딩하는 xylA 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 재조합 대장균 EWBT304.
청구항 2에 있어서,
상기 자일루로스 키나아제(xylulose kinase)를 인코딩하는 xylB 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 재조합 대장균 EWBT304.
청구항 2에 있어서,
상기 알돌라아제를 인코딩하는 yjhH 유전자는 서열번호 3의 염기서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 재조합 대장균 EWBT304.
청구항 2에 있어서,
상기 알돌라아제를 인코딩하는 yagE 유전자는 서열번호 4의 염기서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 재조합 대장균 EWBT304.
청구항 2에 있어서,
상기 xdh 유전자는 서열번호 5의 염기서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 재조합 대장균 EWBT304.
청구항 2에 있어서,
상기 mdlC 유전자는 서열번호 6의 염기서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 재조합 대장균 EWBT304.
대장균에서 자일로스 이성화효소(isomerase)를 인코딩하는 xylA 유전자, 자일루로스 키나아제(xylulose kinase)를 인코딩하는 xylB 유전자 및 2-케토-3-데옥시-D-자일로네이트 알돌라아제(2-keto-3-deoxy-D-xylonate aldolase)를 인코딩하는 yjhH 유전자 및 yagE 유전자를 파괴하는 단계(단계 a); 및
자일로스 탈수소효소를 인코딩하는 xdh 유전자 및 벤조일포메이트 탈탄산효소(benzoylformate decarboxylase)를 인코딩하는 mdlC 유전자를 상기 단계 a의 대장균 내에 도입하는 단계(단계 b)를 포함하는 재조합 대장균 EWBT304 제조방법.
청구항 9에 있어서,
상기 단계 b에서 자일로스 탈수소효소를 인코딩하는 xdh 유전자를 도입하는 단계는, 자일로스 탈수소효소를 인코딩하는 xdh 유전자를 클로닝하여 플라스미드 pKMX를 제조하고 이를 대장균 내에 도입하는 것을 특징으로 하는 재조합 대장균 EWBT304 제조방법.
청구항 9에 있어서,
상기 단계 b에서 벤조일포메이트 탈탄산효소(benzoylformate decarboxylase)를 인코딩하는 mdlC 유전자를 도입하는 단계는, 벤조일포메이트 탈탄산효소(benzoylformate decarboxylase)를 인코딩하는 유전자 mdlC를 클로닝하여 플라스미드 pTRM를 제조하고 이를 대장균 내에 도입하는 것을 특징으로 하는 재조합 대장균 EWBT304 제조방법.
청구항 9에 있어서,
상기 xdh 유전자는 카울로박터 크레센투스(Caulobacter crescentus)에서 유래되는 것을 특징으로 하는 재조합 대장균 EWBT304 제조방법.
청구항 9에 있어서,
상기 mdlC 유전자는 슈도모나스 퓨티다(Pseudomonas putida)에서 유래되는 것을 특징으로 하는 재조합 대장균 EWBT304 제조방법.
청구항 9에 있어서,
상기 자일로스 탈수소효소를 인코딩하는 xdh 유전자 및 벤조일포메이트 탈탄산효소(benzoylformate decarboxylase)를 인코딩하는 mdlC 유전자의도입은 전기천공법으로 수행하는 것을 특징으로 하는 재조합 대장균 EWBT304 제조방법.
D-자일로스가 포함된 배지에 청구항 1의 균주를 첨가하여 배양액을 제조하는 단계; 및
상기 배양액으로부터 1，2，4-부탄트리올을 회수하는 단계를 포함하는 1，2，4-부탄트리올의 생산방법.
청구항 15에 있어서,
상기 배양은 진탕 배양법으로 수행되는 것을 특징으로 하는 1，2，4-부탄트리올의 생산방법.
청구항 15에 있어서,
상기 배양은 27 ~ 45 ℃에서 수행하는 것을 특징으로 하는 1，2，4-부탄트리올의 생산방법.
D-자일로스가 포함된 배지에 청구항 1의 균주를 첨가하여 제조된 배양액에서 회수된 1，2，4-부탄트리올을 이용하여 1,2,4-부탄트리올 트리니트레이트를 생산하는 방법.
D-자일로스가 포함된 배지에 청구항 1의 균주를 첨가하여 제조된 배양액에서 회수된 1，2，4-부탄트리올을 이용하여 양물전달용 양이온성 지질을 생산하는 방법.