CN114507611B - α-酮戊二酸生产用耐高温酵母及发酵方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种α‑酮戊二酸生产用耐高温酵母及发酵方法。该酵母是库德里阿兹氏毕赤酵母TLF108，即Pichia kudriavzevii TLF108，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2021年12月27日，保藏编号为CCTCC NO：M20211680。本发明提供的菌株Pichia kudriavzevii TLF108发酵温度高、发酵速度快，将该菌株应用于发酵时，通过温度调控及添加物的适时使用，在45℃下能够快速生长并高产α‑酮戊二酸，发酵温度远高于现有技术，对于夏天在南方地区的α‑酮戊二酸的生产可以大量节约冷却水，具有特殊的应用价值。

Description

α-酮戊二酸生产用耐高温酵母及发酵方法
技术领域
本发明属于发酵工程技术领域，具体涉及一种α-酮戊二酸生产用耐高温酵母及利用该酵母进行α-酮戊二酸发酵的发酵方法。
背景技术
α-酮戊二酸在食品、医药、化工、化妆品等领域有着广泛的应用。目前α- 酮戊二酸的工业化生产方法是化学合成法。该方法具有较高的效率，但由于生产过程涉及到一些有毒的化学品，因此其在食品中的使用受到限制。微生物发酵法可以有效克服上述困难因此受到人们的重视。
目前国内外研究者采用解脂亚罗酵母、谷氨酸棒杆菌等作为菌种进行α- 酮戊二酸的发酵，取得了一定的进展。由于受到菌种的限制，上述发酵的温度均在30℃左右。有机酸发酵是一个需氧的高耗能过程，发酵过程大量产热，因此需要用冷却水对发酵罐进行降温。在炎热的夏天，我国南方地区外界水温一般都接近30℃，因此降温有很大的困难，往往需要使用冷冻水，由于发酵过程冷冻水的用量很大，而且制备过程需要消耗大量的能量，因此既不利于节能减排，也不利于降低生产成本，因此很多南方企业在夏季需要停产相当长的时间。
针对上述问题，有必要进行α-酮戊二酸的耐高温工艺研发。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种在45℃下快速生长并高产α-酮戊二酸的耐高温酵母及利用该酵母进行α-酮戊二酸发酵的发酵方法。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：前期发酵温度为45℃，后期发酵温度为49℃，发酵所使用的菌种是一种耐高温酵母；该酵母是库德里阿兹氏毕赤酵母TLF108，即Pichia kudriavzevii TLF108，简称TLF108，已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉，保藏日期为2021年12月27日，保藏编号为CCTCC NO：M20211680。
耐高温酵母TLF108的获得方法如下：
(1)耐高温酵母的自然界筛选：首先在7月份，在新疆吐鲁番等地大量采集葡萄园等地散落的葡萄，终点采集出现少量腐烂的葡萄，带回实验室将葡萄上腐烂组织或破碎处组织分离培养涂布在YPD培养基上，在50℃进行培养。培养时间控制在48小时，收集平板上形成的菌落，进一步显微镜观察判断为酵母的菌落，则进行分离纯化，再进一步按上述方法共计获得能够在50℃生长的酵母5000多株。
(2)产α-酮戊二酸菌种的筛选：配制摇瓶发酵培养基，甘油100g/L，尿素4g/L，磷酸二氢钾3g/L，NaCl 4g/L，玉米浆干粉5g/L；用盐酸或氢氧化钠调整pH至5.5左右；121℃灭菌15min，再加入已经在130℃干热灭菌 1小时的碳酸钙30g/L；一般使用500mL三角瓶，装液量为100mL；接上一步骤获得的酵母单菌落于上述培养基中，45℃，摇瓶发酵72小时，检测发酵液中α-酮戊二酸的量。检测方法同文献(房俊,周景文,曾伟主.高产α-酮戊二酸解脂亚洛酵母的选育及其发酵过程优化.食品与发酵工业,2021,47(2): 137-144.)。结果显示其中有136株酵母发酵液中α-酮戊二酸的量在1％以上。
(3)酵母生长曲线的确定：将上述136株酵母分别接种摇瓶发酵培养基，摇瓶至24小时后，每隔12小时取样检测细胞量，检测方法同文献(房俊,周景文,曾伟主.高产α-酮戊二酸解脂亚洛酵母的选育及其发酵过程优化.食品与发酵工业,2021,47(2):137-144.)，分别绘制上述酵母的生长曲线。
(4)摇瓶发酵条件的建立：根据酵母生长曲线，分别在酵母细胞量大约达到最高量1/3、1/2、2/3的时候采用改变温度、添加不同浓度的醋酸钠和各种盐离子的方法改编发酵条件，根据细胞量的变化，在达到细胞量最高值后再发酵24小时，检测发酵液中的α-酮戊二酸，结果显示其中一株编号为TLF108 的菌株，在特定发酵条件下其发酵液中α-酮戊二酸积累量达到30g/L。具体条件为：当细胞量达到最高量的1/2时，将温度提升到49℃，加入醋酸钠至3g/L，硫酸镁至5g/L。
(5)发酵罐发酵条件：根据上述结果建立发酵罐发酵条件如下：培养基同摇瓶发酵培养基，但做如下改变：碳酸钙的量改为3g/L。首先制作种子培养基，种子培养基是将酵母单菌落接种至YPD液体培养基中，45℃摇瓶培养 48小时；按10％的接种量接种上述发酵罐发酵培养基。45℃发酵，通风量一般控制在1vvm，主要以搅拌转速控制溶氧量在20～30％，用氢氧化钠或盐酸控制pH在5.0～6.0之间。在发酵至菌体量为最高值的1/2左右时，一般是发酵至22小时的时候，将温度提升到49℃，加入醋酸钠至3g/L，硫酸镁至5g/L，甘油至50g/L。按上述方法，发酵48小时，发酵液中α-酮戊二酸的量大约可以达到70g/L。进一步将硫酸镁的量改为10g/L后，α-酮戊二酸的产量可以达到 83g/L。
(6)生物材料的保藏：上述筛选得到的菌种酵母TLF108已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2021年12月27日，保藏编号为CCTCC NO： M20211680。
(7)菌种的鉴定：菌种采用ITS序列法进行鉴定，染色体提取方法同文献(周小玲,沈微,饶志明,王正祥,诸葛健.一种快速提取真菌染色体DNA的方法[J].微生物学通报,2004,31(4):89-92)；染色体提取后，进一步进行ITS 基因扩增及序列分析的方法同文献(陈源源,沈微,石贵阳,王正祥.两种分子标识在酵母分子鉴定中的比较[J].食品工业科技,2011,32(2):175-177)中有关 ITS基因鉴定的方法。序列比对显示，TLF108的ITS序列与美国国家生物技术信息中心(www.NCBI.nlm.nih.gov)核苷酸序列库中收录的登录号为：KJ527043的序列同源性最高达到99.8％，该菌株为Pichia kudriavzevii strain Y281-I，据此本方法获得的菌种TLF108命名为：Pichia kudriavzevii TLF108，简称TLF108。
利用以上所述的Pichia kudriavzevii TLF108进行α-酮戊二酸发酵的方法，前期发酵温度控制在44.5～45.5℃，在发酵至菌体量为最高值的1/2时，将发酵温度提升到48.5～49.5℃，并加入醋酸钠至2～4g/L，硫酸镁至5～10g/L，维持发酵至终点。
具体包括如下步骤：
S1、制备种子培养液：
取酵母Pichia kudriavzevii TLF108单菌落于YPD液体培养基中，摇瓶培养获得种子培养液；
S2、制备发酵罐发酵培养基：
发酵罐发酵培养基优选采用以下方法制备：在发酵罐中准备发酵培养基：甘油90～110g/L，尿素3～5g/L，磷酸二氢钾2～4g/L，NaCl 3～5g/L，玉米浆干粉3～7g/L；调整pH至5～6，灭菌15min，再加入干热灭菌的碳酸钙 2～4g/L，获得发酵罐发酵培养基；
S3、按8～12％的接种量接种种子培养液到发酵罐发酵培养基中；前期发酵温度控制在44.5～45.5℃，控制溶氧量在20～30％，pH在5.0～6.0之间；在发酵至菌体量为最高值的1/2时，将发酵温度提升到48.5～49.5℃，并加入醋酸钠至2～4g/L，硫酸镁至5～10g/L，维持发酵至终点。
步骤S3中，发酵后期优选向发酵液内按50g/L补加甘油，以保证碳源充足。
本发明具有至少以下有益效果：
(1)本发明提供的菌株Pichia kudriavzevii TLF108的最大优势是发酵温度高，发酵速度快，将该菌株应用于发酵时，通过温度调控及添加物的适时使用，在45℃下能够快速生长并高产α-酮戊二酸，可以大幅度提高α-酮戊二酸的产量。
(2)本发明提供的菌株Pichia kudriavzevii TLF108及发酵方法所达到的发酵水平虽略低于现有技术公开的产α-酮戊二酸菌株，但发酵温度远高于现有技术，发酵速度也显著高于现有技术的同类型菌株，在夏季的南方可以大量节约冷却水，在我国炎热的南方具有应用于实际生产的特殊价值。
具体实施方式
下面结合实施例，进一步阐述本发明。在下面的详细描述中，只通过说明的方式描述了本发明的某些示范性实施例。毋庸置疑，本领域的普通技术人员可以认识到，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以用各种不同的方式对所描述的实施例进行修正。因此，以下描述在本质上是说明性的，而不是用于限制权利要求的保护范围。
实施例1
取平板上划线分离得到的菌种Pichia kudriavzevii TLF108单菌落1个于 YPD液体培养基中，45℃摇瓶培养48小时，获得种子培养液。
在5L发酵罐中准备发酵培养基如下：甘油100g/L，尿素4g/L，磷酸二氢钾3g/L，NaCl 4g/L，玉米浆干粉5g/L；用盐酸或氢氧化钠调整pH至5.5 左右，121℃灭菌15min，再加入已经在130℃干热灭菌1h的碳酸钙3g/L，制得发酵罐发酵培养基。
按10％的接种量接种已经培养48小时的种子培养液到上述发酵罐发酵培养基中。45℃发酵，通风量控制在1vvm，主要以搅拌转速控制溶氧量在 20～30％，用氢氧化钠或盐酸控制pH在5.0～6.0之间。在发酵至菌体量为最高值的1/2左右时(发酵至22小时)，将温度提升到49℃，加入醋酸钠至3g/L，硫酸镁至5g/L，甘油至50g/L(指新添加的甘油量相当于每升发酵液新加入甘油50g)。再发酵48小时至终点，发酵液中α-酮戊二酸的量为70g/L。
实施例2
取平板上划线分离得到的菌种Pichia kudriavzevii TLF108单菌落1个于 YPD液体培养基中，45℃摇瓶培养48小时，获得种子培养液。
在5L发酵罐中准备发酵培养基如下：甘油100g/L，尿素4g/L，磷酸二氢钾3g/L，NaCl 4g/L，玉米浆干粉5g/L；用盐酸或氢氧化钠调整pH至5.5 左右，121℃灭菌15min，再加入已经在130℃干热灭菌1h的碳酸钙3g/L，制得发酵罐发酵培养基。
按10％的接种量接种已经培养48小时的种子培养液到上述发酵罐发酵培养基中。45℃发酵，通风量控制在1vvm，主要以搅拌转速控制溶氧量在 20～30％，用氢氧化钠或盐酸控制pH在5.0～6.0之间。在发酵至菌体量为最高值的1/2左右时(发酵至22小时)，将温度提升到49℃，加入醋酸钠至3g/L，硫酸镁至8g/L，甘油至50g/L(指新添加的甘油量相当于每升发酵液新加入甘油50g)。再发酵48小时至终点，发酵液中α-酮戊二酸的量为75g/L。
实施例3
取平板上划线分离得到的菌种Pichia kudriavzevii TLF108单菌落1个于 YPD液体培养基中，45℃摇瓶培养48小时，获得种子培养液。
在5L发酵罐中准备发酵培养基如下：甘油100g/L，尿素4g/L，磷酸二氢钾3g/L，NaCl 4g/L，玉米浆干粉5g/L；用盐酸或氢氧化钠调整pH至5.5 左右，121℃灭菌15min，再加入已经在130℃干热灭菌1h的碳酸钙3g/L，制得发酵罐发酵培养基。
按10％的接种量接种已经培养48小时的种子培养液到上述发酵罐发酵培养基中。45℃发酵，通风量控制在1vvm，主要以搅拌转速控制溶氧量在 20～30％，用氢氧化钠或盐酸控制pH在5.0～6.0之间。在发酵至菌体量为最高值的1/2左右时(发酵至22小时)，将温度提升到49℃，加入醋酸钠至3g/L，硫酸镁至10g/L，甘油至50g/L(指新添加的甘油量相当于每升发酵液新加入甘油50g)。再发酵48小时至终点，发酵液中α-酮戊二酸的量为83g/L。
比较例4
取平板上划线分离得到的菌种Pichia kudriavzevii TLF108单菌落1个于 YPD液体培养基中，45℃摇瓶培养48小时，获得种子培养液。
在5L发酵罐中准备发酵培养基如下：甘油100g/L，尿素4g/L，磷酸二氢钾3g/L，NaCl 4g/L，玉米浆干粉5g/L；用盐酸或氢氧化钠调整pH至5.5 左右，121℃灭菌15min，再加入已经在130℃干热灭菌1h的碳酸钙3g/L，制得发酵罐发酵培养基。
按10％的接种量接种已经培养48小时的种子培养液到上述发酵罐发酵培养基中。45℃发酵，通风量控制在1vvm，主要以搅拌转速控制溶氧量在 20～30％，用氢氧化钠或盐酸控制pH在5.0～6.0之间。在发酵至菌体量为最高值的1/2左右时(发酵至22小时)，将温度提升到49℃，加入醋酸钠至3g/L，甘油至50g/L(指新添加的甘油量相当于每升发酵液新加入甘油50g)，再发酵 48小时至终点，发酵液中α-酮戊二酸的量为3g/L。
比较例5
取平板上划线分离得到的菌种Pichia kudriavzevii TLF108单菌落1个于 YPD液体培养基中，45℃摇瓶培养48小时，获得种子培养液。
在5L发酵罐中准备发酵培养基如下：甘油100g/L，尿素4g/L，磷酸二氢钾3g/L，NaCl 4g/L，玉米浆干粉5g/L；用盐酸或氢氧化钠调整pH至5.5 左右，121℃灭菌15min，再加入已经在130℃干热灭菌1h的碳酸钙3g/L，制得发酵罐发酵培养基。
按10％的接种量接种已经培养48小时的种子培养液到上述发酵罐发酵培养基中。45℃发酵，通风量控制在1vvm，主要以搅拌转速控制溶氧量在 20～30％，用氢氧化钠或盐酸控制pH在5.0～6.0之间。在发酵至菌体量为最高值的1/2左右时(发酵至22小时)，将温度提升到49℃，加入硫酸镁至5g/L，甘油至50g/L(指新添加的甘油量相当于每升发酵液新加入甘油50g)。再发酵 48小时至终点，发酵液中α-酮戊二酸的量为2.8g/L。
比较例6
取平板上划线分离得到的菌种Pichia kudriavzevii TLF108单菌落1个于 YPD液体培养基中，45℃摇瓶培养48小时，获得种子培养液。
在5L发酵罐中准备发酵培养基如下：甘油100g/L，尿素4g/L，磷酸二氢钾3g/L，NaCl 4g/L，玉米浆干粉5g/L；用盐酸或氢氧化钠调整pH至5.5 左右，121℃灭菌15min，再加入已经在130℃干热灭菌1h的碳酸钙3g/L，制得发酵罐发酵培养基。
按10％的接种量接种已经培养48小时的种子培养液到上述发酵罐发酵培养基中。前期直接49℃发酵，加入醋酸钠至3g/L，硫酸镁至5g/L，通风量控制在1vvm，主要以搅拌转速控制溶氧量在20～30％，用氢氧化钠或盐酸控制pH在5.0～6.0之间，发酵70小时至终点，发酵液中α-酮戊二酸的量为1.8 g/L。
通过实施例1-3及比较例4-6可以看出，采用本发明中方法进行发酵时，发酵后期升温并同时加入醋酸钠和硫酸镁是发酵成果的关键，只加入其中一种、或其中一种的浓度不足、或者没有同时进行温度的调节，都会导致发酵水平大幅度下降，α-酮戊二酸均在4g/L以下。如发酵前期就将温度提升到49℃，则α-酮戊二酸产量不足2g/L。在后期补加甘油，只是为了保证碳源充足，也可以采用流加的方法。
另外，在本发明菌种的筛选过程中，初始的摇瓶发酵条件下，TLF108并不是发酵水平最高的菌种，但采用如上所述特有的方法后，其产量显著超过其他菌种，其他菌种采用上述方法得到的α-酮戊二酸的产量均在4g/L，因此，本发酵方法是专门针对TLF108的有效方法。
综上所述，本发明采用的菌种和方法进行α-酮戊二酸发酵的最大优势是发酵温度高，对于夏天在南方地区的α-酮戊二酸的生产可以大量节约冷却水，有利于节能减排，具有特殊的应用价值。
以上所述仅为本发明示意性的具体实施方式，并非用以限定本发明的范围。任何本领域的技术人员，在不脱离本发明的构思和原则的前提下所作出的等同变化与修改，均应属于本发明保护的范围。

Claims (3)

1.α-酮戊二酸生产用耐高温酵母，其特征在于：该酵母是库德里阿兹氏毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)TLF108，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2021年12月27日，保藏编号为CCTCC NO：M20211680。
2.α-酮戊二酸的耐高温发酵方法，其特征在于：以权利要求1中所述的Pichiakudriavzevii TLF108作为发酵菌种，前期发酵温度控制在44.5～45.5℃，在发酵至菌体量为最高值的1/2时，将发酵温度提升到48.5～49.5℃，并加入醋酸钠至2～4g/L，硫酸镁至5～10g/L，维持发酵至终点；包括如下步骤：
S1、制备种子培养液：
取酵母Pichia kudriavzevii TLF108单菌落于YPD液体培养基中，摇瓶培养获得种子培养液；
S2、制备发酵罐发酵培养基；发酵罐发酵培养基采用如下方法制备：
在发酵罐中准备发酵培养基：甘油90～110g/L，尿素3～5g/L，磷酸二氢钾2～4g/L，NaCl 3～5g/L，玉米浆干粉3～7g/L；调整pH至5～6，灭菌15min，再加入干热灭菌的碳酸钙2～4g/L，获得发酵罐发酵培养基；
S3、按8～12％的接种量接种种子培养液到发酵罐发酵培养基中；前期发酵温度控制在44.5～45.5℃，控制溶氧量在20～30％，pH在5.0～6.0之间；在发酵至菌体量为最高值的1/2时，将发酵温度提升到48.5～49.5℃，并加入醋酸钠至2～4g/L，硫酸镁至5～10g/L，维持发酵至终点。
3.如权利要求2所述的α-酮戊二酸的耐高温发酵方法，其特征在于：步骤S3中，发酵后期向发酵液内按50g/L补加甘油。
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