CN105829524A - D(-)型2,3-丁二醇的生产率得到增强的重组微生物及利用其的d(-)型2,3-丁二醇的生产方法 - Google Patents

D(-)型2,3-丁二醇的生产率得到增强的重组微生物及利用其的d(-)型2,3-丁二醇的生产方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及具有使乙偶姻转化为2,3?丁二醇的途径的微生物，并且涉及导入对使乙偶姻转化为D(?)型2,3?丁二醇的酶进行编码的基因的D(?)型2,3?丁二醇生产用重组微生物。并且，本发明涉及利用上述重组微生物生产D(?)型2,3?丁二醇的方法。

Description

D(-)型2,3-丁二醇的生产率得到增强的重组微生物及利用其的D(-) 型2,3-丁二醇的生产方法
技术领域
本发明涉及2,3-丁二醇的生产率得到增强的重组微生物及利用其的2,3-丁二醇的生产方法。
背景技术
作为具有4个碳和2个羟基(-OH)的醇的一种(CH3CHOHCHOHCH3)的2,3-丁二醇，可化学性地催化转化为作为合成橡胶制备工序的原料物质的1,3-丁二烯(1,3-Butadiene)和用于燃料添加剂及溶剂的甲基乙基甲酮(Methyl ethylketone，MEK)。并且，2,3-丁二醇与汽油(Gasoline)相混合可适用于辛烷值增进剂(octane booster)，来是在产业上极其重要的中间体。
2,3-丁二醇可通过化学合成工序和微生物发酵工序进行生产。然而，通过上述工序的2,3-丁二醇的生产成本非常高，因此还未实现商业规模的2,3-丁二醇的生产。另一方面，近来，与通过微生物发酵工序的2,3-丁二醇生产技术的飞跃发展一同，随着化石燃料物质的价格的急剧上涨和国际性的对环境污染的限制，对于通过微生物发酵的生物基2,3-丁二醇的生产的关心和研究开发的重要性逐渐增大。
2,3-丁二醇分子中包含两处的立体中心(stereo center)，从而能够以3种立体异构体(stereo isomer)的形式存在，即，D(-)型(左旋体(levo form)、2R，3R–丁二醇(2R，3R-BDO))，L(+)型(右旋体(dextro form)、2S，3S-丁二醇(2S，3S-BDO))，内消旋型(meso)(2R，3S-丁二醇2R，3S-BDO)。除了上述提及的2,3-丁二醇的一般用途之外，具有光学活性的2,3-丁二醇能够以特殊用途使用。例如，D(-)型的2,3-丁二醇具有很低的冰点，来可用作抗冻剂(anti-freeze agent)，并且可用作医药品和农业用化学物的中间体。然而，通过化学合成工序来生产光学上纯的D(-)型2,3-丁二醇的方法，由于在合成及分离/精制方面耗费多而不优选，通过微生物发酵工序来生产光学上纯的D(-)型2,3-丁二醇的方法，在经济上有利(Zeng et al.，Curr.Opin.Biotechnol.，22:1，2011)。
可实现通过微生物发酵工序的生物基2,3-丁二醇的生产的微生物非常多样，具有代表性的为肠杆菌(Enterobacter)属、克雷伯氏菌(Klebsiella)属、芽孢杆菌(Bacillus)属、沙雷氏菌(Serratia)属等。存在于自然界中的野生型微生物存在如下问题：主要生产无光学活性的内消旋型2,3-丁二醇，或即使生产具有光学活性的2,3-丁二醇异构体，也以混合物的型进行生产。
另一方面，多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)能够以高纯度生产D(-)型2,3-丁二醇。然而，多粘类芽孢杆菌具有对高营养成分的要求非常高、且生产率及产量低，从而具有难以直接适用于当前的商业工序的问题。
对此，本发明人以可适用于商业工序的水平来研究用于生产具有光学活性的D(-)型2,3-丁二醇的重组微生物中，确认了在特定基因的缺失/取代的重组微生物的情况下，以高生产率和产量来生产高纯度的D(-)型2,3-丁二醇，并完成了本发明。
发明内容
本发明要解决的技术问题
本发明的目的在于，提供D(-)型2,3-丁二醇的生产率得到增强的重组微生物及利用其的D(-)型2,3-丁二醇的生产方法。
技术方案
为了实现上述目的，本发明提供D(-)型2,3-丁二醇生产用重组微生物，具有将乙偶姻转化为2,3-丁二醇的途径，导入有用于对将乙偶姻转化为D(-)型2,3-丁二醇的酶进行编码的基因。
并且，本发明提供D(-)型2,3-丁二醇的制备方法，包括：对本发明的重组微生物进行接种的步骤；以及对上述D(-)型2,3-丁二醇生产用重组微生物进行培养的步骤。
有益效果
本发明的重组微生物不仅D(-)型2,3-丁二醇的生产率高，而且通过调节导入的基因及抑制的基因，从而可调节所生产的2,3-丁二醇内的多个异构体的比率。
附图说明
图1表示在2,3-丁二醇生成菌株中各2,3-丁二醇异构体的生物合成途径。
图2为对存在于作为基本菌株的产酸克雷伯氏菌内的与2,3-丁二醇的合成相关的基因操纵子进行图式化的图。
图3为对存在于重组产酸克雷伯氏菌内的与2,3-丁二醇的合成相关的基因操纵子进行图式化的图。
图4为当对多个重组克雷伯氏菌株进行分批发酵时，所生产的2,3-丁二醇异构体的气相色谱法(GC)分析结果。
图5为当对重组克雷伯氏菌株(KoΔLB3)进行补料分批发酵时，各2,3-丁二醇异构体的生产结果。
图6示出当对重组克雷伯氏菌株(KoΔLB3)进行补料分批发酵时，2,3-丁二醇异构体的纯度。
具体实施方式
本发明涉及D(-)型2,3-丁二醇生产用重组微生物，具有将乙偶姻转化为2,3-丁二醇的途径，导入有用于对将乙偶姻转化为D(-)型2,3-丁二醇的酶进行编码的基因。
并且，本发明涉及D(-)型2,3-丁二醇的生产方法，包括：对本发明的重组微生物进行接种的步骤；以及对上述D(-)型2,3-丁二醇生产用重组微生物进行培养的步骤。
以下，详细地说明本发明。
本发明的重组微生物
本发明的重组微生物为D(-)型2,3-丁二醇生产用重组微生物，上述D(-)型2,3-丁二醇生产用重组微生物具有将乙偶姻转化为2,3-丁二醇的途径，导入有用于对乙偶姻转化为D(-)型2,3-丁二醇的酶进行编码的基因。
并且，可抑制用于对使将乙偶姻转化为内消旋型2,3-丁二醇的酶进行编码的一种以上基因。
本发明的重组微生物可抑制用于将丙酮酸转化为乳酸的途径。
优选地，本发明的重组微生物为由用于对将乙偶姻转化为内消旋型2,3-丁二醇的酶进行编码的基因被用于对将乙偶姻转化为D(-)型2,3-丁二醇的酶进行编码的基因取代而成。更优选地，本发明的重组微生物为如下重组微生物：用于对将乙偶姻转化为内消旋型2,3-丁二醇的酶(即，具有可将(R)-乙偶姻转化为内消旋型2,3-丁二醇的活性的酶)进行编码的基因被用于对将乙偶姻转化为D(-)型2,3-丁二醇的酶(即，具有用于将(R)-乙偶姻转化为D(-)型2,3-丁二醇的活性的酶)进行编码的基因取代，并且抑制用于将丙酮酸转化为乳酸的途径。
上述具有用于将乙偶姻转化为2,3-丁二醇的途径的微生物可以为野生型微生物或重组微生物，并且可以为肠杆菌属、克雷伯氏菌属、芽孢杆菌属、沙雷氏菌属微生物等，优选为克雷伯氏菌属微生物，更优选为产酸克雷伯氏菌。
优选地，本发明的重组微生物通过在基因水平上有效地去除存在于野生型产酸克雷伯氏菌的、作为2,3-丁二醇转化酶(乙偶姻还原酶)的AR1(BudCKo)和/或AR2(DarKo)，并且将对转化为D(-)型2,3-丁二醇的活性高的酶进行编码的基因向基因体插入，从而能够以高纯度生产如下D(-)型2,3-丁二醇：保持原来的以往产酸克雷伯氏菌株的2,3-丁二醇的生产性能，即，菌株稳定性、生产率、生产浓度及生产量，并利用度更高。
导入用于对将乙偶姻转化为D(-)型2,3-丁二醇的酶进行编码的基因
用于对将上述乙偶姻转化为D(-)型2,3-丁二醇的酶进行编码的基因可以为bdhPp且可以为包含SEQ ID NO.21的碱基序列的基因或与其具有90％以上的同源性的基因、对具有SEQ ID NO.20的氨基酸序列的蛋白质进行编码的基因、对与上述SEQ ID NO.20的氨基酸序列具有90％以上的同源性的氨基酸序列的蛋白质进行编码的基因、对BdhPp蛋白质进行编码的基因，或对与BdhPp酶活性90％以上相同的蛋白质进行编码的基因等。
上述基因的导入可通过与对象菌株基因体上的特定基因之间的代替或向特定位的插入来实现。例如，用于对上述蛋白质进行编码的基因，例如，bdhPp基因、SEQ ID NO.21的基因，或使与其具有90％以上的同源性的基因等，从对象菌体基因体上缺失的基因，例如，与budCKo或darKo基因，或与其具有90％以上的同源性的基因等在基因体上正确地进行代替，或在基因体上插入于可实现基因表达的特定的新的位置等，本发明所属技术领域的普通技术人员可选择适当的方法来全新导入上述蛋白质的活性。
抑制用于对将乙偶姻转化为内消旋型2,3-丁二醇的酶进行编码的基因
本发明的重组微生物可以为抑制用于对将乙偶姻转化为内消旋型2,3-丁二醇的酶进行编码的一种以上基因。上述基因可以为budCKo、darKo、具有SEQ IDNO.10或SEQ ID NO.12的碱基序列的基因、或与SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.12的碱基序列具有90％以上的同源性的基因、对具有SEQ ID NO.9或SEQ IDNO.11的氨基酸序列的蛋白质进行编码的基因、或对与SEQ ID NO.9或SEQ IDNO.11的氨基酸序列具有90％以上的同源性的氨基酸序列的蛋白质进行编码的基因、对AR1或AR2蛋白质进行编码的基因等。
上述基因的抑制不仅为上述基因本身的抑制，还包括上述基因进行编码的蛋白质的活性抑制等。上述蛋白质的活性抑制可借助上述蛋白质的表达抑制、酶活性抑制等进行。例如，本发明的对将乙偶姻转化为内消旋型2,3-丁二醇的酶进行编码的基因的抑制，可通过使上述基因缺失或在上述基因中导入基因突变(使一部分碱基突变、取代或删除，或导入一部分碱基来抑制正常的基因的表达等基因突变)，或转录过程或翻译过程中的基因表达调节等方法来实现，本发明所属技术领域的普通技术人员可选择适当的方法。
在对用于将上述乙偶姻转化为内消旋型2,3-丁二醇的酶进行编码的基因不进行抑制，而导入用于将上述乙偶姻转化为D(-)型2,3-丁二醇的酶进行编码的基因的情况下，内消旋型2,3-丁二醇和(D)型的2,3-丁二醇均以相当的比率生产。因此，可生产以相当比率包含内消旋型2,3-丁二醇和(D)型2,3-丁二醇的2,3-丁二醇。
当用于将乙偶姻转化为内消旋型2,3-丁二醇的酶进行编码的基因被用于将乙偶姻转化为D(-)型2,3-丁二醇的酶进行编码的基因取代时，导入对用于转化为D(-)型2,3-丁二醇的酶进行编码的基因的同时，还可实现抑制对用于转化为内消旋型2,3-丁二醇的酶进行编码的基因的效果，因此从改善D(-)型2,3-丁二醇的生产率的侧面上，可呈现出优选的效果。
抑制将丙酮酸转化为乳酸的途径
本发明的重组微生物可抑制用于将丙酮酸转化为乳酸的途径。乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase)用于调节乳酸向丙酮酸的转化。通过抑制上述乳酸脱氢酶，可抑制用于将丙酮酸转化为乳酸的途径。上述乳酸脱氢酶的抑制可通过乳酸脱氢酶的表达抑制、乳酸脱氢酶的酶活性抑制等来实现。例如，作为用于对乳酸脱氢酶进行编码的基因的ldhA缺失，或在上述基因中引起基因突变(使一部分碱基突变、取代或删除，或导入一部分碱基来抑制正常的基因的表达等的基因突变)，转录过程或翻译过程中的基因表达调节等，本发明所属技术领域的普通技术人员可选择适当的方法来抑制乳酸脱氢酶。
利用本发明的重组微生物的D(-)型2,3-丁二醇的生物学上的生产
本发明的重组微生物为如下所述的重组微生物：如图1所示，具有(R)-乙偶姻生物合成途径，在(R)-乙偶姻中追加导入具有D(-)型2,3-丁二醇转化活性的酶来全新生成D(-)型2,3-丁二醇生产途径，并且抑制以往存在的(R)-乙偶姻转化为内消旋型2,3-丁二醇的途径。
如图1所示，用于生产本发明的2,3-丁二醇的微生物具有α-乙酰乳酸合成酶(ALS，α-acetolactate synthase)，α-乙酰乳酸脱羧酶(ALDC，α-acetolactatedecarboxylase)，乙偶姻还原酶(AR，acetoin reductase)等的一系列转化酶组。如图2所示，对与2,3-丁二醇合成相关的基因操纵子进行图式化。另一方面，如途径1所示，野生型的产酸克雷伯氏菌株借助乙酰乳酸合成酶使丙酮酸转化为α-乙酰乳酸，借助乙酰乳酸脱羧酶，α-乙酰乳酸转化为(R)-乙偶姻，借助乙偶姻还原酶，(R)-乙偶姻转化为内消旋型2,3-丁二醇。上述提及的AR1(BudCKo)和AR2(DarKo)均参与从(R)-乙偶姻向内消旋型2,3-丁二醇的相互转化反应。
<途径1>
丙酮酸→α-乙酰乳酸(α-acetolactate)→(R)-乙偶姻(acetoin)→内消旋型2,3-丁二醇
本发明中的D(-)型2,3-丁二醇的生产因新导入用于催化途径2的反应的酶而可实现，并且上述酶为位点特异性不同于以往的作为乙偶姻还原酶的AR1(BudCKo)和AR2(DarKo)的乙偶姻还原酶家族的酶。
<途径2>
(R)-乙偶姻(acetoin)→D(-)型2,3-丁二醇(左旋体(levo form)，2R，3R-丁二醇)
D(-)型2,3-丁二醇的制备方法
本发明涉及D(-)型2,3-丁二醇的制备方法，包括：对本发明的重组微生物进行接种的步骤，以及对上述重组微生物的进行培养的步骤。上述D(-)型2,3-丁二醇的生产方法还可包括回收已生产的D(-)型2,3-丁二醇的步骤。
2,3-丁二醇的制备方法
本发明涉及利用本发明的重组微生物来生产所需的具有2,3-丁二醇异构体的组成的2,3-丁二醇的方法，即，在不抑制用于对将乙偶姻转化为内消旋型2,3-丁二醇的酶进行编码的基因来导入用于对将乙偶姻转化为D(-)型2,3-丁二醇的酶进行编码的基因的情况下，生产出以相当的比率包含内消旋型2,3-丁二醇和(D)型2,3-丁二醇的2,3-丁二醇。并且，在抑制AR1而导入用于对将乙偶姻转化为D(-)型2,3-丁二醇的酶进行编码的基因的情况下和在抑制AR2而导入用于对将乙偶姻转化为D(-)型2,3-丁二醇的酶进行编码的基因的情况下所生产的2,3-丁二醇内的内消旋型和(D)型的2,3-丁二醇有可能互不相同。相同地，在均对AR1及AR2进行抑制而导入用于对将乙偶姻转化为D(-)型2,3-丁二醇的酶进行编码的基因的情况下，内消旋型2,3-丁二醇的生产量减少至极少，而D(-)型2,3-丁二醇的比率提高很多。
培养
本发明的重组微生物在好氧条件下进行培养，优选地，在微好氧条件(microaerobic condition)下进行。例如，当进行培养时，上述培养一边供给氧，即，供给空气来进行，作为具体例，上述培养可通过搅拌来完成，但不局限于此。本发明的重组微生物可在复合培养基中进行培养，复合培养基的种类不受特别限制，通常本发明所属技术领域的普通技术人员可适当地选择在市场中销售、所使用的复合培养基来使用是显而易见的。
具体实施例
通过参照详细叙述的实施例，可明确本发明的优点及特征、及用于实现它们的方法。然而，本发明不局限于以下公开的实施例，而是以其他多种方式来实现，本实施例仅用于使本发明的公开完整，并且为了使本发明所属技术领域的普通技术人员完全地理解发明的范畴而提供，本发明仅由发明要求保护范围的范畴来进行定义。
材料及方法
准备产酸克雷伯氏菌KCTC12133BP△ldhA(KO△L)菌株
缺失乳酸脱氢酶(乳酸脱氢酶，LdhA)的产酸克雷伯氏菌KCTC12133BP△ldhA(KO△L)菌株由以下方法进行了制备。首先，为了克隆产酸克雷伯氏菌的乳酸脱氢酶，利用SEQ ID NO.3及SEQ ID NO.4的引物，对作为靶基因的ldhA(SEQ ID NO.1)的同源区域1(SEQ ID NO.2)进行了聚合酶链式反应(PCR)扩增。并且，利用SEQ ID NO.6及SEQ ID NO.7的引物，对同源区域2(SEQ ID NO.5)进行了聚合酶链式反应扩增。之后，将同源区域1和同源区域2同时作为模板来进行聚合酶链式反应扩增，来完成了同源区域1与同源区域2相接合的脱氧核糖核酸(DNA)片段(SEQ ID NO.8)。为了提高靶基因的重组概率，上述完成的脱氧核糖核酸片段可包含抗生素耐性基因等，为了去除染色体内重组的抗生素耐性基因，可包含对果聚糖蔗糖酶进行编码的sacB基因(表1)。
上述制备的氧核糖核酸片段利用电穿孔法(electroporation，25uF、200Ω、18kV/cm)，向产酸克雷伯氏菌的野生型进行了传递，利用微生物自身具有的同源重组机制，去除靶基因。
表1
2,3-丁二醇转化酶及其基因的确认
基于产酸克雷伯氏菌KCTC12133BP的基因体信息，利用KEGG database(http://www.genome.jp/kegg/)和NCBI database(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)搜索了2,3-丁二醇的合成及与消耗途径相关的酶。其结果，确认到众所周知基因体信息的所有产酸克雷伯氏菌具有至少两种2,3-丁二醇转化酶(AR1及AR2)。
在SEQ ID NO.9中记载上述AR1的氨基酸序列，作为对其进行编码的基因的budCKo的碱基序列为SEQ ID NO.10。另一方面，在SEQ ID NO.11中记载AR2的氨基酸序列，作为对其进行编码的基因的darKo的碱基序列为SEQ ID NO.12(表2)。
表2
准备产酸克雷伯氏菌KCTC 12133BP△ldhA △darKo菌株
为了缺失AR2，利用SEQ ID NO.14及SEQ ID NO.15的引物，对作为靶基因的darKo(SEQ ID NO.12)的同源区域1(SEQ ID NO.13)进行聚合酶链式反应扩增，利用SEQ ID NO.17及SEQ ID NO.18的引物，对同源区域2(SEQ IDNO.16)进行了聚合酶链式反应扩增。之后，将同源区域1(SEQ ID NO.13)和2(SEQ ID NO.16)同时作为模板进行聚合酶链式反应扩增，来完成了同源区域1与同源区域2相接合的脱氧核糖核酸片段(SEQ ID NO.19)(表3)。
表3
准备了上述制备的缺失乳酸脱氢酶(LdhA)的产酸克雷伯氏菌KCTC12133BP△ldhA(KO△L)。并且，利用电穿孔法(electroporation，25uF，200Ω，18kV/cm)向产酸克雷伯氏菌(KO△L)导入了上述SEQ ID NO.19的脱氧核糖核酸片段。因此，制备出了从KO△ldhA中去除了AR2(DarKO)的重组菌株(产酸克雷伯氏菌KCTC12133BP△ldhA△darKo)。
实验例1：制备重组微生物
产酸克雷伯氏菌KCTC12133BP△ldhAbudC Ko::bdhPp (Ko△LB1)菌株
来源于多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)的作为乙偶姻还原酶的BdhPp为属于中链脱氢酶还原酶(medium-chain dehydrogenase/reductase)酶。重组产酸克雷伯氏菌利用作为将其进行编码的基因的bdhPp，来取代作为产酸克雷伯氏菌KCTC12133BP的内源性乙偶姻还原酶之一的budCKo，上述重组产酸克雷伯氏菌利用以下方法制备。具体地，基于产酸克雷伯氏菌KCTC12133BP△ldhA(Ko△L)，利用下述方法进行了制备，上述菌株的基因组图式如图3所示。来源于上述多粘类芽孢杆菌KCTC1663的BdhPp的氨基酸序列记载于SEQ ID NO.20中，作为对其进行编码的基因的bdhPp的碱基序列为SEQID NO.21(表4)。
表4
首先，为了将作为产酸克雷伯氏菌KCTC12133BP的内源性乙偶姻还原酶基因的budCKo(SEQ ID NO.10)框内取代为上述作为靶基因的bdhPp(SEQ IDNO.21)，利用SEQ ID NO.23及SEQ ID NO.24的引物，对budCKo的同源区域1(SEQ ID NO.22)进行了聚合酶链式反应扩增。并且，bdhPp(SEQ ID NO.21)利用SEQ ID NO.25及SEQ ID NO.26的引物，进行了聚合酶链式反应扩增，budCKo的同源区域2(SEQ ID NO.27)利用SEQ ID NO.28及SEQ ID NO.29的引物进行了聚合酶链式反应扩增，之后，将同源区域1(SEQ ID NO.22)、bdhPp(SEQ ID NO.21)及同源区域2(SEQ ID NO.27)同时作为模板进行聚合酶链式反应扩增来完成了同源区域1、bdhPp及同源区域2相接合的脱氧核糖核酸片段(SEQ ID NO.30)(表5)。
此时，为了提高靶基因的重组概率，上述完成的脱氧核糖核酸片段可包含抗生素耐性基因等，为了去除在染色体内重组的抗生素耐性基因，可包含对果聚糖蔗糖酶进行编码的sacB基因。
表5
产酸克雷伯氏菌KCTC12133BP△ldhAdar Ko::bdhPp (Ko△LB2)菌株
利用上述作为靶基因的bdhPp来取代产酸克雷伯氏菌KCTC12133BP的内源性乙偶姻还原酶之一的darKo的、作为重组产酸克雷伯氏菌的产酸克雷伯氏菌KCTC12133BP△ldhA darKo::bdhPp(Ko△LB2)菌株由如下所述的方法来进行了制备。具体地，基于产酸克雷伯氏菌KCTC12133BP△ldhA(Ko△ldhA)，利用如下所述的方法进行了制备，上述菌株的基因组图式如图3所示。
首先，为了利用上述作为靶基因的bdhPp(SEQ ID NO.21)，对作为产酸克雷伯氏菌KCTC12133BP的内源性乙偶姻还原酶基因的darKo(SEQ ID NO.12)进行框内取代，利用SEQ ID NO.32及SEQ ID NO.33的引物，对darKo的同源区域1(SEQ ID NO.31)进行聚合酶链式反应扩增，并且，bdhPp(SEQ ID NO.21)利用SEQ ID NO.34及SEQ ID NO.35的引物，来进行聚合酶链式反应扩增，darKo的同源区域2(SEQ ID NO.36)利用SEQ ID NO.37及SEQ ID NO.38的引物，来进行聚合酶链式反应扩增，之后，同时将同源区域1(SEQ ID NO.31)、bdhPp(SEQ ID NO.21)及同源区域2(SEQ ID NO.36)作为模板进行聚合酶链式反应扩增来完成了同源区域1、bdhPp及同源区域2相接合的脱氧核糖核酸片段(SEQ ID NO.39)(表6)。
此时，为了提高靶基因的重组概率，上述完成的脱氧核糖核酸片段可包含抗生素耐性基因等，为了去除在染色体内重组的抗生素耐性基因，可包含对果聚糖蔗糖酶进行编码的sacB基因。
表6
产酸克雷伯氏菌KCTC12133BP△ldhA△dar KobudCKo::bdhPp (Ko△LB3)菌株
基于在上述制备的产酸克雷伯氏菌KCTC12133BP△ldhA△darKo，制备了产酸克雷氏菌KCTC12133BP△ldhA△darKobudCKo::bdhPp(Ko△LB3)菌株。将存在于上述基本菌株内的内源性乙偶姻还原酶中之一的budCKo(SEQ ID NO.10)框内取代为作为靶基因的bdhPp(SEQ ID NO.21)的方法，与制备上述“产酸克雷伯氏菌KCTC12133BP△ldhAbudCKo::bdhPp(Ko△LB1)菌株”的方法相同(图3)。
上述为了本发明而制备的重组产酸克雷伯氏菌KCTC12133BP的基因型如下列表7所示。
表7
实验例2：通过分批发酵的2,3-丁二醇的生产
培养在上述实验例1中制备的重组菌株来生产了2,3-丁二醇。此时，作为比较例，使用了产酸克雷伯氏菌KCTC12133BP△ldhA(Ko△L)菌株。
将各重组菌株接种于包含9g/L的葡萄糖(50mM，glucose)的250ml的复合培养基，并且在37℃温度下进行16小时的培养之后，将上述培养液接种于3L的复合培养基，来进行了发酵。此时，发酵条件为微好氧条件(micro-aerobiccondition，通气率：1vvm、搅拌速度：400rpm)，且初始葡萄糖浓度设定为90g/L、pH6.8、培养温度为37℃。发酵当中为了调节pH，使用了5N的NaOH。对上述重组克雷伯氏菌属采集了发酵中的样品，并且测定采取的试样的光密度值OD600(optical density)来测定了生长速度，在13000rpm条件下，对采取的试样进行离心分离10分钟之后，利用高效液相色谱分析法(HPLC)分析了上层液的代谢产物及2,3-丁二醇浓度。并且，利用气相色谱法(GC)分析了生产的2,3-丁二醇异构体成分分析。
其结果，在实验例1中制备的重组菌株均呈现出与作为比较菌株的Ko△L相似的生长及生产量，在D(-)型2,3-丁二醇的生产侧面，Ko△LB3呈现了最优秀的性能。即，存在于产酸克雷伯氏菌KCTC12133BP内的两种乙偶姻还原酶之中，budCKo取代为bdhPp，并且在缺失其他作为乙偶姻还原酶的darKo的菌株的情况下，2,3-丁二醇的生产率、生产浓度及生产量的侧面上与比较菌株相似，且以97％以上的纯度，即，比率生产出了D(-)型2,3-丁二醇(图4、表8)。
表8
a2,3-丁二醇异构体比率
实验例3：通过补料分批发酵的2,3-丁二醇的生产
将在实验例2中确认的D(-)型2,3-丁二醇的生产率的菌株之中，呈现了最优秀的性能的Ko△LB3(产酸克雷伯氏菌KCTC12133BP△ldhA△darKobudCKo::bdhPp)作为对象，通过如下所述的补料分批发酵方法追加地确认了其生产率。
将Ko△LB3接种于包含9g/L的葡萄糖(50mM，glucose)的250ml的复合培养基，并且在37℃温度下进行16小时的培养之后，将上述培养液接种于3L的复合培养基中，并进行了发酵。此时，发酵条件为微好氧条件(micro-aerobiccondition，通气率：1vvm、搅拌速度：400rpm)，且初始葡萄糖浓度设定为90g/L、pH6.8、培养温度为37℃。发酵当中为了调节pH，使用了5N的NaOH。在发酵中，当葡萄糖浓度降低至小于10g/L时，通过供给(feeding)大于700g/L的葡萄糖溶液来追加提供碳源。对上述重组克雷伯氏菌属采取了发酵中的样品，并且测定采集的试样的光密度值OD600来测定了生长速度，在13000rpm条件下，对采取的试样进行离心分离10分钟之后，利用高效液相色谱分析法分析了上层液的代谢产物及2,3-丁二醇浓度。并且，利用气相色谱法分析了生产出的2,3-丁二醇异构体成分分析。
其结果，在整个发酵工序中，D(-)型2,3-丁二醇异构体的纯度维持了96.4％以上，并且确认到了44％的生产量、2.0g/L/小时的生产率及98g/L的D(-)型2,3-丁二醇最终浓度(图5及图6)。
工业实用性
本发明涉及具有将乙偶姻转化为2,3-丁二醇的途径的微生物，导入用于对将乙偶姻转化为D(-)型2,3-丁二醇的酶进行编码的基因的D(-)型2,3-丁二醇生产用重组微生物。并且，本发明涉及利用上述重组微生物来生产D(-)型2,3-丁二醇的生产方法。
序列表自由内容(Free Text)
SEQ ID NO.1为ldhA的基因碱基序列。SEQ ID NO.2为ldhA的同源区域1，SEQ ID NO.3及SEQ ID NO.4为用于其的聚合酶链式反应扩增的引物。SEQ IDNO.5为ldhA的同源区域2，SEQ ID NO.6及SEQ ID NO.7为用于它的聚合酶链式反应扩增的引物。SEQ ID NO.8为ldhA的上述同源区域1及同源区域2相接合的脱氧核糖核酸片段。
SEQ ID NO.9为AR1的氨基酸序列，SEQ ID NO.10为作为对其进行编码的基因的budCKo的碱基序列。
SEQ ID NO.11为AR2的氨基酸序列，SEQ ID NO.12为作为对其进行编码的基因的darKo的碱基序列。
SEQ ID NO.13为作为靶基因的darKo的同源区域1，SEQ ID NO.14及SEQ IDNO.15为用于其的聚合酶链式反应扩增的引物。
SEQ ID NO.16为作为靶基因的darKo的同源区域2，SEQ ID NO.17及SEQ IDNO.18为用于其的聚合酶链式反应扩增的引物。
SEQ ID NO.19为darKo的同源区域1(SEQ ID NO.13)与同源区域2(SEQ IDNO.16)相接合的脱氧核糖核酸片段。
SEQ ID NO.20为源自多粘类芽孢杆菌KCTC1663的BdhPp的氨基酸序列，SEQ ID NO.21为作为对其进行编码的基因的bdhPp的碱基序列。
SEQ ID NO.22为budCKo的同源区域1，SEQ ID NO.23及SEQ ID NO.24为用于其的聚合酶链式反应扩增的引物。
SEQ ID NO.25及SEQ ID NO.26为用于bdhPp(SEQ ID NO.21)的聚合酶链式反应扩增的引物。
SEQ ID NO.27为budCKo的同源区域2，SEQ ID NO.28及SEQ ID NO.29为用于其的聚合酶链式反应扩增的引物。
SEQ ID NO.30为budCKo的同源区域1(SEQ ID NO.22)、bdhPp(SEQ IDNO.21)及budCKo的同源区域2(SEQ ID NO.27)相接合的脱氧核糖核酸片段。
SEQ ID NO.31为darKo的同源区域1，SEQ ID NO.32及SEQ ID NO.33为用于其的聚合酶链式反应扩增的引物。
SEQ ID NO.34及SEQ ID NO.35为用于bdhPp(SEQ ID NO.21)的聚合酶链式反应扩增的引物。
SEQ ID NO.36为darKo的同源区域2，SEQ ID NO.37及SEQ ID NO.38为用于其的聚合酶链式反应扩增的引物。
SEQ ID NO.39为darKo的同源区域1(SEQ ID NO.31)、bdhPp(SEQ ID NO.21)及darKo的同源区域2(SEQ ID NO.36)相接合的脱氧核糖核酸片段。

Claims (21)

1.一种D(-)型2,3-丁二醇生产用重组微生物，具有将乙偶姻转化为2,3-丁二醇的途径，其特征在于，导入有用于对将乙偶姻转化为D(-)型2,3-丁二醇的酶进行编码的基因。
2.根据权利要求1所述的D(-)型2,3-丁二醇生产用重组微生物，其特征在于，所述用于对将乙偶姻转化为D(-)型2,3-丁二醇的酶进行编码的基因为bdhPp。
3.根据权利要求1所述的D(-)型2,3-丁二醇生产用重组微生物，其特征在于，所述用于对将乙偶姻转化为D(-)型2,3-丁二醇的酶进行编码的基因包含SEQ ID NO.21的碱基序列。
4.根据权利要求1所述的D(-)型2,3-丁二醇生产用重组微生物，其特征在于，所述用于对将乙偶姻转化为D(-)型2,3-丁二醇的酶进行编码的基因为对具有SEQ ID NO.20的氨基酸序列的蛋白质进行编码的基因。
5.根据权利要求1所述的D(-)型2,3-丁二醇生产用重组微生物，其特征在于，抑制用于对将乙偶姻转化为内消旋型2,3-丁二醇的酶进行编码的一种以上的基因。
6.根据权利要求5所述的D(-)型2,3-丁二醇生产用重组微生物，其特征在于，抑制budCKo或darKo。
7.根据权利要求5所述的D(-)型2,3-丁二醇生产用重组微生物，其特征在于，抑制对具有SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.11的氨基酸序列的蛋白质进行编码的基因。
8.根据权利要求5所述的D(-)型2,3-丁二醇生产用重组微生物，其特征在于，抑制具有SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.12的碱基序列的基因。
9.根据权利要求1所述的D(-)型2,3-丁二醇生产用重组微生物，其特征在于，所述微生物为克雷伯氏菌属。
10.根据权利要求1所述的D(-)型2,3-丁二醇生产用重组微生物，其特征在于，抑制用于将丙酮酸转化为乳酸的途径。
11.一种D(-)型2,3-丁二醇的生产方法，其特征在于，包括：
对权利要求1至10中任一项所述的D(-)型2,3-丁二醇生产用重组微生物进行接种的步骤；以及
对所述D(-)型2,3-丁二醇生产用重组微生物进行培养的步骤。
12.一种D(-)型2,3-丁二醇生产用重组微生物，其特征在于，用于对将乙偶姻转化为内消旋型2,3-丁二醇的酶进行编码的基因被用于对将乙偶姻转化为D(-)型2,3-丁二醇的酶进行编码的基因取代。
13.根据权利要求12所述的D(-)型2,3-丁二醇生产用重组微生物，其特征在于，所述用于对将乙偶姻转化为D(-)型2,3-丁二醇的酶进行编码的基因为bdhPp。
14.根据权利要求12所述的D(-)型2,3-丁二醇生产用重组微生物，其特征在于，所述用于对将乙偶姻转化为D(-)型2,3-丁二醇的酶进行编码的基因包含SEQ ID NO.21的碱基序列。
15.根据权利要求12所述的D(-)型2,3-丁二醇生产用重组微生物，其特征在于，所述用于对将乙偶姻转化为D(-)型2,3-丁二醇的酶进行编码的基因为对具有SEQ ID NO.20的氨基酸序列的蛋白质进行编码的基因。
16.根据权利要求12所述的D(-)型2,3-丁二醇生产用重组微生物，其特征在于，所述用于对将乙偶姻转化为内消旋型2,3-丁二醇的酶进行编码的基因为budCKo或darKo。
17.根据权利要求12所述的D(-)型2,3-丁二醇生产用重组微生物，其特征在于，所述用于对将乙偶姻转化为内消旋型2,3-丁二醇的酶进行编码的基因为对具有SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.11的氨基酸序列的蛋白质进行编码的基因。
18.根据权利要求12所述的D(-)型2,3-丁二醇生产用重组微生物，其特征在于，所述用于对将乙偶姻转化为内消旋型2,3-丁二醇的酶进行编码的基因为具有SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.12的碱基序列的基因。
19.根据权利要求12所述的D(-)型2,3-丁二醇生产用重组微生物，其特征在于，所述微生物为克雷伯氏菌属。
20.根据权利要求12所述的D(-)型2,3-丁二醇生产用重组微生物，其特征在于，抑制用于将丙酮酸转化为乳酸的途径。
21.一种D(-)型2,3-丁二醇的生产方法，其特征在于，包括：
将权利要求12至20中任一项所述的D(-)型2,3-丁二醇生产用重组微生物进行接种的步骤；以及
对所述D(-)型2,3-丁二醇生产用重组微生物进行培养的步骤。
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