CN103361296A - 生产高纯度手性d-(-)-2,3-丁二醇的枯草芽孢杆菌菌株及构建及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生产高纯度手性D-(-)-2，3-丁二醇的枯草芽孢杆菌菌株及构建方法及应用，构建方法为：在枯草芽孢杆菌中敲除2，3-丁二醇的直接底物乙偶姻的降解途径中acoA基因、敲除乙偶姻还原酶编码基因bdhA、敲除副产物乙酸生成途径pta基因和敲除副产物乳酸生成途径ldh基因，使用P43强启动子过表达合成支路alsSD操纵子、使用P43强启动子过表达D-(-)-2，3-丁二醇脱氢酶编码基因bdhA和使用P43强启动子过表达还原力平衡过程转氢酶编码基因udhA。本发明所构建的菌安全无害，可以利用葡萄糖为底物生产手性纯度大于99％的D-(-)-2，3-丁二醇。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术与应用领域，具体地涉及一种生产高纯度手性丁二醇的枯草芽孢杆菌菌株及构建及应用。
背景技术
2，3-丁二醇(2，3-Butanediol)分子中含有2个手性碳原子，存在3种旋光异构体，分别为D-(-)-2，3-丁二醇、L-(+)-2，3-丁二醇和meso-2，3-丁二醇。作为一种重要的化工原料和液体燃料，2，3-丁二醇广泛应用于化工、食品等领域。2，3-丁二醇的燃烧值为27.2kJ/g，与甲醇(22.1kJ/g)和乙醇(29.0kJ/g)相当，它具有较高的辛烷值，是一种潜在价值很高的燃料添加剂。2，3-丁二醇及其衍生物还有众多潜在的应用，如生产油墨、香水、熏剂、氨纶、增湿剂、软化剂、塑化剂以及药物载体等。2，3-丁二醇可转化为1，3-丁二烯而用于合成橡胶的生产，其衍生的化学品也可用于塑料及溶剂的生产。脱水产物2-丁酮(燃烧热略高于乙醇)是一种重要的燃料添加剂和有机溶剂。脱氢产物双乙酰和3-羟基丁酮可作为风味物质和防腐剂用于食品和香料行业。特别提到的是，手性2，3-丁二醇在不对称合成方面有着巨大的潜在优势，同时可以用于高附加值的药物中间体和液晶材料等精细化学品。手性2，3-丁二醇虽然目前市场需求不大，但附加值比仅用作燃料的2，3-丁二醇的混合物附加值高很多，有着潜在的发展空间。而在三种手性异构体中，D-(-)-2，3-丁二醇的凝固点很低(-60℃)，可用作具有潜在价值的工业防冻剂。
与传统化学合成法相比，2，3-丁二醇的微生物发酵法对环境友好，工艺简单，技术上较为成熟，符合绿色化工的要求。但值得注意的是，目前2，3-丁二醇的高产菌种大都是病原菌，如肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、以及阴沟肠杆菌溶解亚种(Enterobacter cloacae subsp.dissolvens)等微生物，而大规模工业化生产的安全性原则在很大程度上限制了这些生产菌株的应用，因此迫切需要开发出2，3-丁二醇的产量、得率、生产效率以及光学纯度高并且安全可靠的代谢工程菌株。另外很多生产菌种生产的是两种2，3-丁二醇旋光异构体的混合物，这也为后续高纯度异构体的分离带来了困难。利用代谢工程或合成生物学方法对模式菌株的代谢途径进行重新设计和合理改造是一种较好的策略，虽然有人对大肠杆菌(Escherichia coli)生产手性2，3-丁二醇的研究已经较为深入，但2，3-丁二醇的得率、产量、产率等方面并不理想。
枯草芽孢杆菌作为生产菌株具有以下几点优势：1.它是一种安全的非病原微生物(ClassI，Generally Regard As Safe)。2.枯草芽孢杆菌对木糖、阿拉伯糖、甘油等底物的利用能力较强，很适合以半纤维素和纤维素水解液或重要工业副产物甘油为原料进行化学品的生产，有利于降低大规模生产的成本。3.作为革兰氏阳性菌，它对酸、醇类、高温、高浓度糖及高浓度盐的耐受性要强于革兰氏阴性菌。4.作为一种重要的模式菌株，对其生理生化特性及遗传背景已经有了比较深入的了解，相关的分子生物学方法和基因操作技术都比较成熟，有利于通过代谢工程及合成生物学的合理设计来改进菌种。
经检索，目前未见有使用代谢工程改造枯草芽孢杆菌并利用其生产手性D-(-)-2，3-丁二醇的报道。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种能高效率地生产高纯度手性D-(-)-2，3-丁二醇的枯草芽孢杆菌菌株。
本发明的第二个目的是提供一种生产高纯度手性D-(-)-2，3-丁二醇的枯草芽孢杆菌菌株的构建方法。
本发明的第三个目的是提供一种生产高纯度手性D-(-)-2，3-丁二醇的枯草芽孢杆菌菌株的应用。
本发明的技术方案概述如下：
一种生产高纯度手性D-(-)-2，3-丁二醇的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株构建方法，其特征是包括如下步骤：在枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168中敲除2，3-丁二醇的直接底物乙偶姻的降解途径中acoA基因、敲除乙偶姻还原酶编码基因bdhA、敲除副产物乙酸生成途径pta基因和敲除副产物乳酸生成途径ldh基因，使用P43强启动子过表达合成支路alsSD操纵子、使用P43强启动子过表达D-(-)-2，3-丁二醇脱氢酶编码基因bdhA和使用P43强启动子过表达还原力平衡过程转氢酶编码基因udhA。
上述方法构建的生产高纯度手性D-(-)-2，3-丁二醇的枯草芽孢杆菌菌株。
上述生产高纯度手性D-(-)-2，3-丁二醇的枯草芽孢杆菌菌株生产高纯度手性D-(-)-2，3-丁二醇的用途。
有益效果
本发明所构建的枯草芽孢杆菌工程菌安全无害，克服了目前生物法制备2，3-丁二醇的高产发酵菌株多为条件致病菌的缺点，可以利用葡萄糖为底物生产手性纯度大于99％的D-(-)-2，3-丁二醇，且在摇瓶的发酵结果为48g/L以上，这为后续发酵罐连续补料提高D-(-)-2，3-丁二醇的产量和产率奠定了基础。
附图说明
图1为基因操作靶点。
图2为手性2，3-丁二醇的气相色谱检测。
图3为pCU-acoA-FB质粒的构建过程。
图4为pCU-bdhA-FB质粒载体的图谱。
图5为pCU-pta-FB敲除载体的图谱。
图6为pCU-ldh-FB敲除载体的图谱。
图7为pPSDAUE整合载体图谱。
图8为pCU-bdhA-FB-PSD整合载体的图谱。
图9为电泳验证图谱。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，下述实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但对本发明不作任何限制。
本发明所用到的原始菌株B.subtilis 168来源为BGSC(Bacillus Genetic Stock Center，http://www.bgsc.org/)。
原始质粒pC194和pHP13来源为BGSC(Bacillus Genetic Stock Center，http://www.bgsc.org/)。
所用2，3-丁二醇标准品从sigma公司(http://www.sigmaaldrich.com/sigma-aldrich)购买。
所用限制性内切酶、去磷酸化酶、DNA连接酶等分子生物学试剂从thermo公司购买(http://www.thermoscientificbio.com/fermentas)。
所用其他生化试剂从生工生物工程(上海)股份有限公司购买(http://www.sangon.com/)。
实施例1无抗生素标记筛选枯草芽孢杆菌系统出发菌株的构建和基础操作质粒pCU的构建
(1)无抗生素标记筛选枯草芽孢杆菌系统出发菌株的构建
以在枯草芽孢杆菌B.subtilis168中敲除upp基因而获得的菌株为无抗生素标记筛选枯草芽孢杆菌系统出发菌株，命名为BSF1。
无抗生素标记筛选枯草芽孢杆菌系统出发菌株的构建步骤如下：
使用含有upp基因上下游同源臂和neo抗性标记的质粒通过Spizizen转化到枯草芽孢杆菌B.subtilis 168中，在含有5ug/mL的卡那霉素的LB平板上筛选出转化子，经菌落PCR验证，得到upp基因敲除的出发菌株BSF1。本发明对该菌株的构建方法不做限定，也可以用其它的方法进行构建，参考文献1中公开了相关方法。
(2)基础操作质粒pCU的构建
利用PCR反应以pC194质粒为模版使用上下游引物Kit-Fsn-catU和Kit-Fsn-catL获取cat基因、以B.subtilis 168基因组为模版使用上下游引物Kit-fsn-uppU和Kit-fsn-uppL获取upp基因，再以上面的两个片段为模版，利用融合PCR反应使用上下游引物Kit-fsn-U和Kit-fsn-L获取重组片段cat-upp。将该重组片段与pUC18(通用载体)质粒经酶切、酶连、转化、验证等操作后，得到基础操作质粒pCU。本发明对该基础操作质粒pCU的构建方法以及抗性基因的选择不做限定，参考文献1中公开了相关方法。
实施例2：2，3-丁二醇的直接底物乙偶姻的降解途径中acoA基因的敲除
敲除乙偶姻(2，3-丁二醇的直接底物)降解途径acoA基因的具体操作如下：
利用D-acoA-FU、D-acoA-FL和D-acoA-BU、D-acoA-BL两对引物，以B.subtilis 168为模版，使用KOD-plus高保真DNA聚合酶扩增分别得到大小为1143bp和1208bp的上下游同源臂acoA-F和acoA-B。经切胶回收后利用引物D-acoA-FsnU、D-acoA-FsnL，同样使用KOD-plus高保真DNA聚合酶进行融合PCR扩增，得到上下游同源臂的2073bp的拼接产物acoA-FB。然后将融合产物acoA-FB和pCU质粒使用Thermo Fast digest SalI和KpnI双酶切，经连接、转化后得到acoA基因敲除载体pCU-acoA-FB(见图3)。将测序结果正确的质粒通过Spizizen转化导入枯草芽孢杆BSF1中，用含氯霉素LB固体培养基中筛选重组成功的阳性克隆，并用菌落PCR验证。挑出的转化子接种于5ml LB液体培养基中，200rpm震荡培养6h(OD约为2)，并在五氟尿嘧啶基本培养基上挑出菌落，使用引物D-acoA-FU、D-acoA-BL进行PCR验证，得到acoA基因敲除菌株BSF2，验证见图9A，其中M为1kb DNA ladder(条带从下到上依次为250、500、750、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、5000、6000、8000、10000bp，下同)，1泳道为以B.subtilis 168为模版扩增所得片段，2泳道为以BSF2为模版扩增所得片段。
其中，LB液体培养基配方为：10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L NaCl，调节pH至7.5。0.1Mpa压力下灭菌20min。
LB固体培养基配方为：在LB液体培养基中加入琼脂粉(终浓度15g/L)，0.1Mpa压力下灭菌20min。
实施例3：乙偶姻还原酶编码基因bdhA基因的敲除
利用D-bdhA-FU、D-bdhA-FL和D-bdhA-BU、D-bdhA-BL两对引物，以B.subtilis 168为模版，使用KOD-plus高保真DNA聚合酶扩增分别得到大小为1096和973bp的上下游同源臂bdhA-F和bdhA-B。切胶回收后利用引物D-bdhA-FsnU、D-bdhA-FsnL，同样使用KOD-plus高保真DNA聚合酶进行融合PCR扩增，得到上下游同源臂的1796bp的拼接产物bdhA-FB。然后将融合产物bdhAFB和pCU质粒使用Thermo Fast digest SphI和KpnI双酶切，经连接、转化后得到bdhA基因敲除载体pCU-bdhA-FB(见图4)。将测序结果正确的质粒通过Spizizen转化导入枯草芽孢杆BSF2中，用氯霉素筛选重组成功的阳性克隆，并用菌落PCR验证。挑出的转化子接种于5ml卡那抗性培养液中，200rpm震荡培养6h(OD约为2)，并在5-氟尿嘧啶基本培养基上挑出菌落，使用引物D-bdhA-FU、D-bdhA-BL进行PCR验证，得到bdhA基因敲除菌株BSF3，验证见图9B，其中M为1kb DNA ladder，1泳道为以B.subtilis 168为模版扩增所得片段，2泳道为以BSF3为模版扩增所得片段。
实施例4：副产物乙酸生成途径pta基因与副产物乳酸生产途径ldh基因的敲除
敲除乙酸生成途径pta基因具体操作如下：
利用D-pta-FU、D-pta-FL和D-pta-BU、D-pta-BL两对引物，以B.subtilis 168为模版，使用KOD-plus高保真DNA聚合酶扩增分别得到大小为908bp和948bp的上下游同源臂pta-F和pta-B。经切胶回收后利用引物D-pta-FsnU、D-pta-FsnL，同样使用KOD-plus高保真DNA聚合酶进行融合PCR扩增，得到上下游同源臂的1728bp的拼接产物pta-FB。然后将融合产物ptaFB和pCU质粒使用Thermo Fast digest SphI和KpnI双酶切，经连接、转化后得到pta基因敲除载体pCU-pta-FB(见图5)。将测序结果正确的质粒通过Spizizen转化导入枯草芽孢杆BSF3中，用氯霉素筛选重组成功的阳性克隆，并用菌落PCR验证。挑出的转化子接种于5ml卡那抗性培养液中，200rpm震荡培养6h(OD约为2)，并在5-氟尿嘧啶基本培养基上挑出菌落，使用引物D-pta-FU、D-pta-BL进行PCR验证，得到pta基因敲除菌株BSF4，验证见图9C，其中M为1kb DNA ladder，1泳道为以B.subtilis 168为模版扩增所得片段，2泳道为以BSF4为模版扩增所得片段。
敲除乳酸生成途径ldh基因具体操作如下：
利用D-ldh-FU、D-ldh-FL和D-ldh-BU、D-ldh-BL两对引物，以B.subtilis 168为模版，使用KOD-plus高保真DNA聚合酶扩增分别得到大小为1067和1134bp的上下游同源臂ldh-F和ldh-B。经切胶回收后利用引物D-ldh-FsnU、D-ldh-FsnL，同样使用KOD-plus高保真DNA聚合酶进行融合PCR扩增，得到上下游同源臂的2090bp的拼接产物ldh-FB。然后将融合产物ldhFB和pCU质粒使用Thermo Fast digest AatII双酶切，经连接、转化后得到ldh基因敲除载体pCU-ldh-FB(见图6)。将测序结果正确的质粒通过Spizizen转化导入枯草芽孢杆BSF2中，用氯霉素筛选重组成功的阳性克隆，并用菌落PCR验证。挑出的转化子接种于5ml卡那抗性培养液中，200rpm震荡培养6h(OD约为2)，并在五氟尿嘧啶基本培养基上挑出菌落，使用引物D-ldh-FU、D-ldh-BL进行PCR验证，得到ldh基因敲除菌株BSF5，验证见图9C，其中M为1kb DNA ladder，3泳道为以B.subtilis 168为模版扩增所得片段，4泳道为以BSF5为模版扩增所得片段。
实施例5：使用P43强启动子过表达合成支路alsSD操纵子、D-(-)-2，3-丁二醇脱氢酶编码基因bdhA和还原力平衡过程转氢酶编码基因udhA
使用引物0-P43-U、0-P43-L以B.subtilis168基因组为模版扩增所得的片段和pUC18质粒分别经EcoRI和BamHI双酶切后，连接、转化、验证得到质粒pP；将使用引物0-udhA-U、0-udhA-L以E.coli基因组为模版扩增所得的扩增片段和pP质粒分别经XbaI和SalI双酶切后同理构建出质粒pPU；将使用引物0-alsSD-U、0-alsSD-L以B.subtilis168基因组为模版扩增所得的扩增片段和pPU质粒分别经SmaI和BamHI双酶切、纯化和酶连，构建出质粒pPSDU；后者与使用引物0-bdhA-U、0-bdhA-L以B.subtilis168基因组为模版扩增所得的片段使用BamHI单酶切并去磷酸化，连接、转化、验证得到质粒pPSDAU；将使用引物0-EM-U、0-EM-L以质粒pHP13为模版扩增所得含有红霉素抗性基因erm的片段和pPSDBU质粒经AatII单酶切后纯化和酶连，构建出pPSDAUE质粒(见图7)。最后，将pPSDAUE质粒通过Spizizen转化导入BSF6中，通过终浓度0.6ug/mL的红霉素筛选出过表达alsS，alsD，bdhA，udhA基因的BSF30，验证见图9C，其中M为1kb DNA ladder，5泳道为以BSF30为模版，0-P43-U和0-udhA-L为引物扩增所得片段。
构建BSF6的具体操作过程如下：以pPSDAUE质粒为模版，使用引物Operon-U-P43和Operon-L-alsSD扩增得到P43过表达alsSD两个基因的3005bp的操纵子片段。所得PCR产物两端为AflII和XhoI酶切位点，将其与pCU-bdhA-FB经Fast digest AflII和XhoI双酶切，纯化和酶连后得到大小为8.9kp的过表达载体pCU-bdhA-FB-PSD(见图8)。在BSF5中通过上述正负筛选，得到在B.subtilis基因组bdhA基因内部插入P43过表达的alsSD操纵子，构建出菌株BSF6。
本发明涉及的基因操作见图1，图1中“X”表示敲除，下划线表示过表达，虚线表示该途径不在本申请讨论的范围内。
本发明中的菌株代号如BSF1～BSF6，BSF30等是为了方便描述，但不应理解为对本发明的限定。
表1菌株构建所用引物序列
实施例6：利用构建的菌株进行手性2，3-丁二醇摇瓶发酵
将BSF30菌株在含105g/L葡萄糖的LB(Y)培养基中(250mL锥形瓶装液量100mL，摇床转速100rpm)37℃培养216小时，生成48.30g/L D-(-)-2，3-丁二醇和4.23g/L3-羟基丁酮，2，3-丁二醇的生产力为0.23g/(L·h)，达到理论最大得率的92％，副产物乳酸、乙酸和琥珀酸的积累量分别为0.51、0.02和0.26g/L，该结果为三次实验平均值，使用液相色谱检测。手性2，3-丁二醇的色谱检测见图2，其中，A为3种2，3-丁二醇标准品的混合物的峰图(依次为L-(+)-2，3-丁二醇，D-(-)-2，3-丁二醇，meso-2，3-丁二醇)，B为BSF30的发酵产物检测峰图。使用GC-FID检测，使用手性柱HP-chiral 20b column(Agilent Technologies)。在上述发酵条件下，发酵150小时之内，生成的meso-2，3-丁二醇的量小于0.02g/L，手性纯度大于99％。在上述发酵条件下，当发酵时间超过150小时后，生成的meso-2，3-丁二醇的量逐渐增加，在第216小时，生成的meso-2，3-丁二醇的量达到1.5g/L，手性纯度为96.9％。
接种方式为：首先在LB固体平板上活化菌株，在37℃过夜培养后，挑单菌落接种装有5mL LB培养基的试管，培养12小时左右，接种LB(Y)培养基，初始OD为0.05。
LB(Y)培养基配方为：7.5g/L蛋白胨，15g/L酵母提取物，7.5g/L的NaCl，调节pH至7.0，0.1Mpa压力下灭菌20min。
从发酵结果可以看出，本发明所构建的生产高纯度手性D-(-)-2，3-丁二醇的枯草芽孢杆菌菌株能够达到较高的D-(-)-2，3-丁二醇生产速率和得率，并积累很少的副产物，具有很好的应用前景。
本发明构建的菌株，其基因型为B.subtilis 168ΔuppΔacoAΔbdhAΔptaΔldh；P43-alsS-alsD-bdhA-udhA，erm，neo。在发酵150小时内，BSF30可以利用葡萄糖生产手性纯度达99％以上的D-(-)-2，3-丁二醇。
本发明的菌株的构建，其步骤的前后顺序不限定，本领域的技术人员按本发明公开的内容达到本发明的目的均属于本发明的保护范围。
参考文献1Fabret C，Ehrlich SD，Noirot P.2002.A new mutation delivery system forgenome-scale approaches in Bacillus subtilis.Mol Microbiol 46(1)：25-36.
Claims (3)
1.一种生产高纯度手性D-(-)-2，3-丁二醇的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株构建方法，其特征是包括如下步骤：在枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis168中敲除2，3-丁二醇的直接底物乙偶姻的降解途径中acoA基因、敲除乙偶姻还原酶编码基因bdhA、敲除副产物乙酸生成途径pta基因和敲除副产物乳酸生成途径ldh基因，使用P43强启动子过表达合成支路alsSD操纵子、使用P43强启动子过表达D-(-)-2，3-丁二醇脱氢酶编码基因bdhA和使用P43强启动子过表达还原力平衡过程转氢酶编码基因udhA。
2.权利要求1所述的方法构建的生产高纯度手性D-(-)-2，3-丁二醇的枯草芽孢杆菌菌株。
3.权利要求3的生产高纯度手性D-(-)-2，3-丁二醇的枯草芽孢杆菌菌株的用途。
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