CN105593368A - 2,3-丁二醇的生成能力得到增加的重组微生物及利用其的2,3-丁二醇的生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基因，上述基因对具有乙偶姻与2,3-丁二醇之间的转换活性的酶进行编码，并具有SEQ？ID？NO.12的碱基序列。并且，本发明涉及由上述基因进行编码的蛋白质。并且，本发明涉及上述蛋白质的活性受到抑制的重组微生物。

Description

2,3-丁二醇的生成能力得到增加的重组微生物及利用其的2,3-丁二醇的生产方法
技术领域
本发明涉及2,3-丁二醇的生成能力得到增加的重组微生物及利用其的2,3-丁二醇的生产方法。
背景技术
作为具有四个碳和两个羟基(-OH)的乙醇中之一(CH3CHOHCHOHCH3)的2,3-丁二醇可使用作为合成橡胶制备工序的原料物质的1，3-丁二烯(1，3-Butadiene)、燃料添加剂及用作溶剂的甲基乙基酮(MEK，Methylethylketone)进行化学催化剂转换(Jietal.,Biotechnol.Adv.,29:351,2011)。并且，2,3-丁二醇与汽油(Gasoline)混合而可适用为辛烷助推器(octanebooster)，从而是产业上非常重要的中间体(Celinskaetal.,Biotechnol.Adv.,27:715,2009)。
2,3-丁二醇可通过化学合成工序和微生物发酵工序来生产。但是，由于通过上述工序生产2,3-丁二醇的价格非常高，因而不生产商业性规模的2,3-丁二醇。另一方面，最近，随着与通过微生物发酵工序生产2,3-丁二醇技术的飞跃发展一同，对化石原料物质的价格急剧上升和国际环境污染的制约强化，从而对以通过微生物发酵的生物为基础的2,3-丁二醇生产的关心和研究开发的重要性增大。
以通过微生物发酵工序的生物为基础的2,3-丁二醇的生产研究分为发酵工序最佳化(温度、pH、溶解氧等)和微生物开发(微生物挖掘、掌握生理学特性、突然变异、基因操作等)领域来进行。在发酵工序最佳化方面，查明了可有效生产2,3-丁二醇的温度、pH、溶解氧浓度等多种条件(Jietal.,Bioresour.Technol.,100:3410,2009；Nakashimadaetal.,J.Biosci.Bioeng.,90:661,2000；Nakashimadaetal.,Biotechnol.Lett.,20:1133,1998)。但是，由于通过上述条件下的微生物发酵工序的2,3-丁二醇生产的生产率(Productivity)及收率(Yield)仍然低，实际难以直接适用于商业工序。并且，在发酵过程中，存在与2,3-丁二醇一同，生成包含乳酸的多种有机酸(Organicacids)和包含乙醇的多种乙醇(Alcohols)等多种副产物(By-products)的缺点。
副产物的生成不仅降低对生物原料物质的2,3-丁二醇的收率，而且在从培养液回收2,3-丁二醇的过程中需要巨大的分离及纯化费用。因此，有关2,3-丁二醇生产的微生物开发研究主要向减少副产物的方向进行。代表性地，Ji等通过向野生型产酸克雷伯菌菌株露出物理/化学突然变异方法中之一的紫外线(UV)，来成功地部分抑制了作为副产物的多种有机酸的生成(Jietal.,Biotechnol.Lett.,30:731,2008)。与此同时，将离子束(Ionbeam)方式适用于肺炎克雷伯菌菌株来增加生物质消耗速度，从而可提高2,3-丁二醇的生产(Maetal.,Appl.Microbiol.Biotechnol.,82:49,2009)。在有关通过选择性基因操作的副产物减少的研究中，去除参与作为主要副产物中之一的乳酸(Lacticacid)生成的基因(ldhA)来制备的变异微生物在一般条件下表示最佳的性能。并且，还有为了减少作为副产物的乙醇的生成而去除参与乙醇生成的基因(adhE、aldA)的例(Jietal.,Appl.Microbiol.Biotechnol.,85:1751,2010)。并且，还有在乳酸菌(LAB，lacticacidbacteria)中降低参与甲酸生成的酶(pyruvate-formatelyase)的活性的例(WO2010/037114A1)。
本发明人确认了具有2,3-丁二醇的转换能力的基因，确认抑制上述基因的活性的重组微生物的2,3-丁二醇生成能力得到增加且所生成的2,3-丁二醇的消耗受到抑制，并完成了本发明。
发明内容
技术问题
本发明的目的在于，提供2,3-丁二醇的生成能力得到增加的重组微生物及利用其的2,3-丁二醇的生产方法。
技术方案
为了达成上述目的，本发明提供基因，上述基因对具有乙偶姻与2,3-丁二醇之间的转换活性的酶进行编码，并具有SEQIDNO.12的碱基序列。
并且，本发明提供重组载体，其特征在于，包含上述基因。
并且，本发明提供由上述基因进行编码的蛋白质。并且，本发明提供重组微生物，其特征在于，上述蛋白质的活性受到抑制。
并且，本发明提供2,3-丁二醇的生成能力得到增加的重组微生物，具有2,3-丁二醇及乳酸生物合成途径，其特征在于，上述蛋白质的活性受到抑制。
并且，本发明提供2,3-丁二醇的生成能力得到增加的重组微生物，具有2,3-丁二醇及乳酸生物合成途径，其特征在于，具有乙偶姻与2,3-丁二醇之间的转换活性，向2,3-丁二醇的转换活性低于向乙偶姻的转换活性的酶受到抑制。
并且，本发明提供2,3-丁二醇的生产方法，上述2,3-丁二醇的生产方法包括：对上述重组微生物进行培养的步骤；以及从通过上述步骤得到的培养液中回收2,3-丁二醇的步骤。
发明的效果
本发明的重组微生物增加2,3-丁二醇的生成能力，并减少已生产的2,3-丁二醇的消耗率。并且，根据重组微生物的培养的乙偶姻积累率低。
附图说明
图1表示2,3-丁二醇生成菌株中的2,3-丁二醇的生物合成途径(图1的(A)部分)及消耗途径(图1的(B)部分及图1的(C)部分)。
图2图示有关存在于产酸克雷伯菌内的2,3-丁二醇合成的基因操纵子。
图3中，为了确认有关存在于产酸克雷伯菌内的2,3-丁二醇合成的基因的细胞内功能，图示化大肠杆菌(E.coliJM109)表达重组载体制作过程。
图4表示重组大肠杆菌的分批式发酵时2,3-丁二醇的生成能力，图5表示乙偶姻的生成能力(●：pBRbudRAB/E.coliJM109、▲：pBRbudRABC/E.coliJM109、■：pBRbudRABD/E.coliJM109)。
图6为在M9最少培养基中，以2,3-丁二醇作为唯一的碳源来使重组克雷伯氏菌菌株生长的结果，图7为残留的2,3-丁二醇的浓度(●：KO△ldhA、▲：KO△dhA△budC、■：KO△ldhA△dar.◆：KO△ldhA△budC△dar.)。
图8至图11表示分批式发酵多个重组克雷伯氏菌菌株来生产2,3-丁二醇的结果(图8：KO△ldhA，图9：KO△ldhA△budC，图10：KO△ldhA△dar，图11：KO△ldhA△budC△dar)。
具体实施方式
本发明涉及基因，上述基因对具有乙偶姻与2,3-丁二醇之间的转换活性的酶进行编码，并具有SEQIDNO.12的碱基序列。
并且，本发明涉及重组载体，其特征在于，包含上述基因。
并且，本发明涉及由上述基因进行编码的蛋白质。并且，本发明涉及重组微生物，其特征在于，上述蛋白质的活性受到抑制。
并且，本发明涉及2,3-丁二醇的生成能力得到增加的重组微生物，具有2,3-丁二醇及乳酸生物合成途径，其特征在于，上述蛋白质的活性受到抑制。
并且，本发明涉及2,3-丁二醇的生成能力得到增加的重组微生物，具有2,3-丁二醇及乳酸生物合成途径，其特征在于，具有乙偶姻与2,3-丁二醇之间的转换活性，向2,3-丁二醇的转换活性低于向乙偶姻的转换活性的酶受到抑制。
并且，本发明涉及2,3-丁二醇的生产方法，上述2,3-丁二醇的生产方法包括：培养上述重组微生物的步骤；以及从通过上述步骤得到的培养液中回收2,3-丁二醇的步骤。
以下，详细说明本发明。
乙偶姻与2,3-丁二醇的转换活性
本发明的重组微生物具有2,3-丁二醇的生成能力。在本发明的重组微生物中，2,3-丁二醇经由乙偶姻生成，并且，2,3-丁二醇转换为乙偶姻。其被称为乙偶姻与2,3-丁二醇之间的转换活性，尤其，被称为相互转换活性。
与此相关的2,3-丁二醇的生物合成途径记载在图1的(A)部分中。另一方面，大部分的多个2,3-丁二醇生产菌株可利用2,3-丁二醇作为唯一碳源，此时，2,3-丁二醇通过将乙偶姻作为中间物质来消耗，众所周知，其途径为以下两种。其中，途径2中，通过“2,3-丁二醇循环”，2分子的2,3-丁二醇转换为1分子的2,3-丁二醇和2分子的醋酸(aceticacid)。
途径1
2,3-丁二醇→乙偶姻→乙醛(acetaldehyde)、乙酰辅酶A(Acetyl-CoA)→三羧酸途径(图1的(B)部分)。
途径2
2,3-丁二醇→乙偶姻→二乙酰(Diacetyl)→醋酸(aceticacid)、乙酰丙酮(AAc，acetylacetoin)→醋酸(aceticacid)及乙酰丁二醇(ABD，acetylbutanediol)(图1的(C)部分)。
具有SEQIDNO.12的碱基序列的基因
本发明涉及基因，上述基因对具有乙偶姻和2,3-丁二醇之间的转换活性的酶进行编码，并具有SEQIDNO.12的碱基序列。并且，本发明涉及重组载体，其特征在于，包含上述基因。作为上述载体，只要是质粒等在本领域中一般使用的载体即可，其种类没有特别限制。
并且，本发明涉及由上述基因进行编码的蛋白质。上述蛋白质可包括SEQIDNO.11的氨基酸序列或与其具有90％以上的同源性的氨基酸序列。
重组微生物
本发明的重组微生物为2,3-丁二醇的生成能力得到增加的重组微生物，具有2,3-丁二醇及乳酸生物合成途径，具有乙偶姻与2,3-丁二醇之间的转换活性，向2,3-丁二醇的转换活性低于向乙偶姻的转换活性的酶受到抑制。
并且，本发明的重组微生物具有2,3-丁二醇及乳酸生物合成途径，是由SEQIDNO.12的基因进行编码的蛋白质的活性受到抑制的重组微生物。由上述SEQIDNO.12的基因进行编码的蛋白质可以为具有SEQIDNO.11的氨基酸序列的蛋白质、与SEQIDNO.11具有90％以上的同源性的氨基酸序列的蛋白质、AR2蛋白质或与AR2酶活性相同90％以上的蛋白质等。
上述蛋白质的活性可由上述蛋白质的表达抑制、酶活性抑制等来抑制。例如，上述蛋白质的活性使对蛋白质进行编码的基因，例如，dar基因、SEQIDNO.12的基因或与其具有90％以上的同源性的基因缺失或在上述基因中引起突然变异(变异、取代或删除一部分碱基，或导入一部分碱基来抑制正常基因的表达等的突然变异)，或调节转录过程或翻译过程中的基因表达等，本发明所属技术领域的普通技术人员可选择适当的方法来抑制上述蛋白质的活性。
本发明的重组微生物的将丙酮酸盐转换为乳酸盐的途径也可受到抑制。乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase)调节丙酮酸盐转换为乳酸盐。通过抑制上述乳酸脱氢酶，可抑制将丙酮酸盐转换为乳酸盐的途径。上述乳酸脱氢酶的抑制可由乳酸脱氢酶的表达抑制、乳酸脱氢酶的酶活性抑制等来实现。例如，使作为对乳酸脱氢酶进行编码的基因的ldhA缺失或在上述基因中引起突然变异(变异、取代或删除一部分碱基，或导入一部分碱基来抑制正常基因的表达等的突然变异)，或调节转录过程或翻译过程中的基因表达等，本发明所属技术领域的普通技术人员可选择适当的方法来抑制乳酸脱氢酶。
2,3-丁二醇转换酶参与2,3-丁二醇的生成和消耗，本发明的重组微生物的双重消耗活性高的dar基因受到抑制，2,3-丁二醇生产维持原样，所生成的2,3-丁二醇的消耗减少。因而，2,3-丁二醇的生产率，即，生成能力得到增加。并且，当生产2,3-丁二醇时，代表性的多个副产物中之一的乙偶姻的积累也减少，从而可节减分离/纯化工序的费用。
上述重组微生物为具有2,3-丁二醇的生成能力的微生物。上述重组微生物可选自由克雷伯氏菌(Klebsiella)属、芽孢杆菌(Bacillus)属、肠杆菌(Enterobacter)属组成的组中，优选地，上述重组微生物为克雷伯氏菌属。
2,3-丁二醇的生产方法
本发明涉及2,3-丁二醇的生产方法，上述2,3-丁二醇的生产方法包括：对本发明的重组微生物进行培养的步骤；以及从通过上述步骤得到的培养液中回收2,3-丁二醇的步骤。
在好氧条件下进行上述培养，优选地，在微好氧条件(microaerobiccondition)下进行。例如，上述培养中，当培养时，一边供给氧，即，空气，一边进行，作为具体例，其可通过搅拌来实现，但并不局限于此。
参照详细说明的多种实施例可使本发明的优点和特征以及实现这些优点和特征的方法更加明确。但是，本发明不局限于以下所公开的多种实施例，能够以相互不同的各种方式实现，本实施例只用于使本发明的公开内容更加完整，有助于本发明所属技术领域的普通技术人员完整地理解发明的范畴，本发明根据发明要求保护范围而定义。
材料及方法
产酸克雷伯菌KCTC12133BP△ldhA(KO△ldhA)菌株
通过以下方法制备了缺失乳酸脱氢化酶(乳酸脱氢酶，ldhA)的产酸克雷伯菌KCTC12133BP△ldhA(KO△ldhA)菌株。首先，为了克隆产酸克雷伯菌的乳酸脱氢酶，利用SEQIDNO.3及SEQIDNO.4的引物通过聚合酶链式反应(PCR)扩增了作为靶基因的ldhA(SEQIDNO.1)的同源部位1(SEQIDNO.2)。并且，利用SEQIDNO.6及SEQIDNO.7的引物通过聚合酶链式反应扩增了同源部位2(SEQIDNO.5)。之后，同时将同源部位1和同源部位2作为模具，通过聚合酶链式反应扩增，来完成了接合同源部位1和同源部位2的脱氧核糖核酸片段(SEQIDNO.8)。为了提高靶基因的重组概率，所完成的上述脱氧核糖核酸片段可包含抗生素抗性基因等，为了去除重组于染色体内的抗生素抗性基因，可包含对果聚糖蔗糖酶进行编码的sacB基因。
所制作的上述脱氧核糖核酸片段利用电穿孔法(electroporation，25uF，200Ω，18kV/cm)传递至产酸克雷伯菌野生型，利用微生物本身所具有的同源重组机制来去除靶基因。
表1
实验例1：2,3-丁二醇转换酶
以产酸克雷伯菌KCTC12133BP的基因组信息为基础，利用京都基因与基因组百科全书数据库(KEGGdatabase)(http://www.genome.jp/kegg/)和美国国家生物技术信息中心数据库(NCBIdatabase)((http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)探索了与2,3-丁二醇的合成及消耗途径有关的多种酶。其结果，确认了已知基因组信息的所有多种产酸克雷伯菌具有至少两种2,3-丁二醇转换酶(AR1及AR2)。利用其图示化的基因组如图2。
上述AR1的氨基酸序列记载在SEQIDNO.9中，作为对其进行编码的基因的budC的碱基序列为SEQIDNO.10。另一方面，AR2的氨基酸序列记载在SEQIDNO.11中，作为对其进行编码的基因的dar的碱基序列为SEQIDNO.12(表2)。
表2
众所周知，包含克雷伯氏菌属微生物，到目前为止，多种2,3-丁二醇生产微生物具有一种2,3-丁二醇转换酶。并且，一般的克雷伯氏菌属微生物中，相当于AR1的2,3-丁二醇转换酶与有关多种酶(ALDC及ALS)一同以操纵子形式存在(Oppermann,U.etal.,Chem.Biol.Interact.143:247-253)。即，确认如下：在本发明中确认的AR2为以往已知的新酶，AR2具有如以下(1)至(3)等的2,3-丁二醇转换酶的特征。
(1)2,3-丁二醇转换酶在酶组中属于短链脱氢酶(shortchaindehydrogenase)/还原酶(reductase)(SDR)组，短链脱氢酶/还原酶的特征具有250～350左右的氨基酸序列。
(2)2,3-丁二醇转换酶在N-末端(terminal)部分具有作为辅酶的NADH部位(glycine-richTGXXXGXG和NNAGmotifs)。
(3)2,3-丁二醇转换酶具有Asn-Ser-Tyr-Lys氨基酸序列的催化剂活性部位(catalytictetrad)及活性部位(YXXXK)。
实验例2：2,3-丁二醇转换酶的确认
制作如图3所示的重组质粒，来通过实验确认了AR1及AR2的2,3-丁二醇转换活性。此时，作为基本载体使用了pBBR1MCS，其特征在于，包含氯霉素抗性因子(Kovach,M.E.,etal.,Biotechniques16:800-802)。
pBRbudRAB包含活性转录因子(TA)、乙酰乳酸合成酶(ALS)、乙偶姻脱羧酶(ALDC)，因而预料只能合成乙偶姻。pBRbudRABC全部具有活性转录因子、乙酰乳酸合成酶、乙偶姻脱羧酶、2,3-丁二醇转换酶(AR1)，因而预料可生产2,3-丁二醇。另一方面，作为实验对象的pBRbudRAD具有活性转录因子、乙酰乳酸合成酶、乙偶姻脱羧酶、2,3-丁二醇转换酶(AR2)，从而根据AR2的功能确定是否生产2,3-丁二醇。
将所制作的上述质粒转化于大肠杆菌(E.coliJM109)来制备了重组大肠杆菌。并且，利用上述重组大肠杆菌来执行发酵，在所有培养过程中，为了维持导入的重组载体，可包含浓度为30μg/ml的氯霉素。上述发酵以如下方式执行：将上述重组大肠杆菌接种在包含9g/L的葡萄糖(50mM，glucose)的250ml的复合培养基，来在37℃温度下培养16小时后，将从中得到的培养液接种在3L的复合培养基，并且，发酵条件如下：微好氧条件(micro-aerobiccondition、好气速度为1vvm、搅拌速度为400rpm)、初期葡萄糖浓度为90g/L、pH为6.8、培养温度为37℃。为了调节发酵中的pH，使用了5N的NaOH。相对于上述重组大肠杆菌，采集了发酵中的样品，测定所采集的试样的OD600(opticaldensity)来测定生长速度，并在13000rpm条件下，将采集的试样离心分离10分钟后，通过液相色谱法(HPLC)分析了上清液的代谢产物及2,3-丁二醇的浓度。
其结果，发酵24小时后，pBRbudRAB/E.coliJM109生产2.0g/L的2,3-丁二醇及30.0g/L的乙偶姻，与此相反，pBRbudRABC/E.coliJM109生产了34.0g/L的2,3-丁二醇及4.7g/L的乙偶姻。作为实验对象的pBRbudRABD/E.coliJM109生产了12.6g/L的2,3-丁二醇及13.0g/L的乙偶姻(图4：2,3-丁二醇的生产能力，图5：乙偶姻的生产能力。●：pBRbudRAB/E.coliJM109、▲：pBRbudRABC/E.coliJM109、■：pBRbudRABD/E.coliJM109)。
即，确认如下：虽然与包含对AR1进行编码的budC基因的重组菌株相比2,3-丁二醇合成能力低，但包含对AR2进行编码的dar基因的重组菌株也可生产2,3-丁二醇。因而，AR1及AR2均确认为具有2,3-丁二醇的转换活性的酶。
实验例3：缺失了AR1及AR2的重组菌株的制备
相对于在实验例2中确认为2,3-丁二醇转换酶的AR1(budC基因进行编码)及AR2(dar基因进行编码)，为了使对各酶进行编码的基因从产酸克雷伯菌基因组缺失，利用了微生物的同源性重组机制。使产酸克雷伯菌的靶基因不活化的重组脱氧核糖核酸片段包括需要去除的基因的同源部位(homologousregion)，为了提高重组概率，可包含sacB基因，上述sacB基因对用于去除重组于抗生素抗性基因等和染色体内的抗生素抗性基因的果聚糖蔗糖酶进行编码。由此，若将制作的脱氧核糖核酸片段导入于对象微生物(产酸克雷伯菌)，则通过位于脱氧核糖核酸片段内基因的同源部位和微生物基因组的基因之间的重组酶(recombinase)的重组机制去除靶基因。
通过以下方法制备了用于使产酸克雷伯菌的AR1(budC)和AR2(dar)缺失的重组质粒。
首先，为了使AR1缺失，利用SEQIDNO.14及SEQIDNO.15引物通过聚合酶链式反应扩增作为靶基因的budC(SEQIDNO.10)的同源部位1(SEQIDNO.13)，并利用SEQIDNO.17及SEQIDNO.18引物通过聚合酶链式反应扩增了同源部位2(SEQIDNO.16)。之后，同时将同源部位1(SEQIDNO.13)和同源部位2(SEQIDNO.16)作为模具，通过聚合酶链式反应扩增，来完成了接合同源部位1和同源部位2的脱氧核糖核酸片段(SEQIDNO.19)(表3)。
表3
并且，为了使AR2缺失，利用SEQIDNO.21及SEQIDNO.22引物通过聚合酶链式反应扩增作为靶基因的dar(SEQIDNO.12)的同源部位1(SEQIDNO.20)，并利用SEQIDNO.24及SEQIDNO.25引物通过聚合酶链式反应扩增了同源部位2(SEQIDNO.23)。之后，同时将同源部位1(SEQIDNO.20)和同源部位2(SEQIDNO.23)作为模具，通过聚合酶链式反应扩增，来完成了接合同源部位1和同源部位2的脱氧核糖核酸片段(SEQIDNO.26)(表4)。
表4
准备了缺失乳酸脱氢化酶(ldhA)的产酸克雷伯菌KCTC12133BP△ldhA(KO△ldhA)。并且，分别通过电穿孔法(electroporation，25uF，200Ω，18kV/cm)将上述SEQIDNO.19、SEQIDNO.26的脱氧核糖核酸片段导入于产酸克雷伯菌(KO△ldhA)。由此，分别制作了在KO△ldhA中去除了AR1(budC)的重组菌株(KO△ldhA△budC)及去除了AR2(dar)的重组菌株(KO△ldhA△dar)。
并且，以去除了AR1(budC)的重组菌株(KO△ldhA△budC)为对象导入pKOVdeltaAR2质粒，来完成了还去除AR2(dar)的重组菌株(KO△ldhA△budC△dar)。
导入上述脱氧核糖核酸片段后，用于基因缺失的一般过程经过抗生素抗性测试(test)和蔗糖(sucrose)耐性测试(test)，并执行菌落聚合酶链式反应，来确认到去除了相应的基因。
实验例4：AR1及AR2的功能的确认
利用将乙偶姻作为中间物质的2,3-丁二醇的消耗途径，来确认了AR1及AR2蛋白质的功能。具体地，在M9最少培养基中，使用2,3-丁二醇作为唯一碳源，来观察了多种重组产酸克雷伯菌菌株的生长及残留2,3-丁二醇的浓度。将多种上述菌株划线培养(streaking)于LB固体培养基，来在30℃温度下培养16小时后，在3ml的LB液体培养基中将单一菌落培养8小时。利用M9最少培养基将从中得到的培养液清洗两次，来去除多种残留的LB成分，接着，接种于包含10g/L的2,3-丁二醇的100ml的M9基本培养基来进行培养。在上述多种重组菌株的培养中采集了样品。测定采集的上述试样的OD600(opticaldensity)来测定生长速度，在13000rpm条件下，将所采集的试样离心分离10分钟后，利用液相色谱法分析了上清液的代谢产物及2,3-丁二醇浓度。
其结果，对AR2进行编码的dar基因完整地留在基因组的多种菌株(KO△ldhA和KO△ldhA△budC)利用2,3-丁二醇作为碳源来生长，随着生长，残留2,3-丁二醇的浓度也下降。相反，去除了dar基因的多种菌株(KO△ldhA△dar和KO△ldhA△budC△dar)经过200小时的培养后均未生长，残留2,3-丁二醇的浓度也维持了培养初期浓度。即，与对AR1进行编码的budC的有无无关地，根据AR2(dar)的有无，还利用2,3-丁二醇作为碳源，或不利用2,3-丁二醇作为碳源(图6：生长结果.●：KO△ldhA、▲：KO△ldhA△budC、■：KO△ldhA△dar、◆：KO△ldhA△budC△dar.图7：残留2,3-丁二醇的浓度.●：KO△ldhA、▲：KO△ldhA△budC、■：KO△ldhA△dar.◆：KO△ldhA△budC△dar.)。
因而，在与2,3-丁二醇消耗有关的两种途径中，最核心的酶判断为AR2，并确认了在细胞内，AR2起到使2,3-丁二醇转换为乙偶姻的2,3-丁二醇脱氢酶(2,3-butanedioldehydrogenase)的功能。
若将其与实验例1及实验例2的结果进行综合，则确认了AR2具有乙偶姻与2,3-丁二醇之间的转换活性，并使乙偶姻转换为2,3-丁二醇的活性高于使2,3-丁二醇转换为乙偶姻的活性。相反，确认了AR1具有乙偶姻与2,3-丁二醇之间的转换活性，并使2,3-丁二醇转换为乙偶姻的活性高于使乙偶姻转换为2,3-丁二醇的活性。
实验例5：2,3-丁二醇的生产
对上述实验例3中制作的多种重组菌株进行培养来生产了2,3-丁二醇。此时，作为比较例使用了产酸克雷伯菌KCTC12133BP△ldhA(KO△ldhA)。
将多种重组菌株分别接种于包含9g/L的葡萄糖(50mM，glucose)的250ml的复合培养基中，并在37℃温度下培养16小时后，将从中得到的培养液接种于3L的复合培养基来进行发酵。此时，发酵条件如下：微好氧条件(micro-aerobiccondition、好氧速度为1vvm、搅拌速度为400rpm)、初期葡萄糖浓度为90g/L、pH为6.8、培养温度为37℃。为了调节发酵中的pH使用了5N的NaOH。相对于上述重组克雷伯氏菌采集发酵中的样品，并通过测定采集的试样的OD600(opticaldensity)来测定了生长速度，在13000rpm条件下，将所采集的试样离心分离10分钟后，利用液相色谱法分析了上清液的代谢产物及2,3-丁二醇浓度。
其结果，缺失了AR1的重组菌株(KO△ldhA△budC)与作为比较例的KO△ldhA(图8)相比，2,3-丁二醇的生产率低，相反，乙偶姻积累更多(图9)。相反，在缺失了AR2的菌株(KO△ldhA△dar)的情况下，直到糖消耗时间点为止，表示了与作为比较例的KO△ldhA类似的2,3-丁二醇生产率，糖消耗完后，2,3-丁二醇消耗率及乙偶姻积累率低于比较例(图10)。另一方面，均缺失了AR1和AR2的菌株几乎不能生产2,3-丁二醇，而表示了高的乙偶姻生产率(图11)。因而，确认了去除AR2且AR1完整地留下来的菌株(KO△ldhA△dar)在2,3-丁二醇生产及发酵完后对保管非常有利(表5)。
表5
产业上的可利用性
本发明涉及2,3-丁二醇的生成能力得到增加的重组微生物及利用其的2,3-丁二醇的生产方法。
序列表自由文本
SEQIDNO.1为ldhA的基因碱基序列，SEQIDNO.2为其同源部位1，SEQIDNO.3及SEQIDNO.4为用于其的聚合酶链式反应扩增的引物。SEQIDNO.5为ldhA的同源部位2，SEQIDNO.6及SEQIDNO.7为用于其的聚合酶链式反应扩增的引物。SEQIDNO.8为接合ldhA的上述同源部位1及同源部位2的脱氧核糖核酸片段。
SEQIDNO.9为AR1的氨基酸序列，SEQIDNO.10为作为对其进行编码的基因的budC的碱基序列。
SEQIDNO.11为AR2的氨基酸序列，SEQIDNO.12为作为对其进行编码的基因的dar的碱基序列。
SEQIDNO.13为budC的同源部位1，SEQIDNO.14及SEQIDNO.15为用于其聚合酶链式反应扩增的多种引物。SEQIDNO.16为budC的同源部位2，SEQIDNO.17及SEQIDNO.18为用于其聚合酶链式反应扩增的多种引物。SEQIDNO.19为接合budC的上述同源部位1及同源部位2的脱氧核糖核酸片段。
SEQIDNO.20为dar的同源部位1，SEQIDNO.21及SEQIDNO.22为用于其聚合酶链式反应扩增的多种引物。SEQIDNO.23为dar的同源部位2，SEQIDNO.24及SEQIDNO.25为用于其聚合酶链式反应扩增的多种引物。SEQIDNO.26为接合dar的上述同源部位1及同源部位2的脱氧核糖核酸片段。

Claims (13)

1.一种基因，其特征在于，对具有乙偶姻与2,3-丁二醇之间的转换活性的酶进行编码，并具有SEQIDNO.12的碱基序列。
2.根据权利要求1所述的重组载体，其特征在于，包含所述基因。
3.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于，由所述基因进行编码。
4.根据权利要求3所述的蛋白质，其特征在于，具有SEQIDNO.11的氨基酸序列。
5.一种重组微生物，其特征在于，权利要求3所述的蛋白质的活性受到抑制。
6.一种2,3-丁二醇的生成能力得到增加的重组微生物，具有2,3-丁二醇及乳酸生物合成途径，其特征在于，权利要求3所述的蛋白质的活性受到抑制。
7.根据权利要求6所述的重组微生物，其特征在于，将丙酮酸盐转换为乳酸盐的途径也受到抑制。
8.根据权利要求6所述的重组微生物，其特征在于，乳酸脱氢酶的活性也受到抑制。
9.根据权利要求6所述的重组微生物，其特征在于，作为对乳酸脱氢酶进行编码的基因的ldhA缺失或受到抑制。
10.根据权利要求6所述的重组微生物，其特征在于，所述重组微生物为克雷伯氏菌。
11.一种2,3-丁二醇的生成能力得到增加的重组微生物，其具有2,3-丁二醇及乳酸生物合成途径，其特征在于，具有乙偶姻与2,3-丁二醇之间的转换活性，向2,3-丁二醇的转换活性高于向乙偶姻的转换活性的酶受到抑制。
12.根据权利要求11所述的重组微生物，其特征在于，将丙酮酸盐转换为乳酸盐的途径也受到抑制。
13.一种2,3-丁二醇的生产方法，其特征在于，包括：
对权利要求5至12中任一项所述的重组微生物进行培养的步骤；以及
从通过所述步骤得到的培养液中回收2,3-丁二醇的步骤。
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