KR20130135860A - 카다베린의 제조 방법 - Google Patents
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Abstract
종래의 발효법에 따른 제조 방법보다 효율적이면서, 또한 고수율로 카다베린을 제조할 수 있는, 신규한 카다베린의 제조 방법이 개시되어 있다. 카다베린의 제조 방법은, 카다베린을 생산하는 능력을 가지고, 또한 pH 5.5 이하에 있어서 내성(耐性)을 가지는 코리네형 세균을 배양하는 것을 포함한다. 바람직하게는, 코리네형 세균이 리신 탈탄산 효소 활성을 가지고, 또한, 바람직하게는, 코리네형 세균은, 호모세린 영양 요구성 및/또는 S-(2-아미노에틸)-L-시스테인 내성을 가진다.
Description
본 발명은, 카다베린 생산능을 가지는 코리네형 세균을 사용한 카다베린의 제조 방법에 관한 것이다.
카다베린은 디아민 구조를 가지고, 별명으로 1,5-펜탄디아민이나 펜타메틸렌디아민 등으로 불리고 있다. 최근 카다베린은, 폴리아미드의 모노머 원료로서 주목되고 있어, 대량생산이 요구되고 있다. 카다베린의 제조 방법으로서는, 코리네형 세균을 이용한 발효법이 알려져 있고, 구체적으로는, 카다베린 생산능을 가지고, 또한 카다베린의 선구 물질인 리신 합성능을 강화한 코리네형 세균의 발효에 의한 카다베린의 제조 방법(특허 문헌 1∼4, 비특허 문헌 1 참조)이나, 리신 탈탄산 효소 유전자의 카피수를 높임으로써 리신 탈탄산 효소 활성을 강화한 코리네형 세균의 발효에 의한 카다베린의 제조 방법(특허 문헌 5 참조)이 알려져 있다.
Stefaine Kind, Metabolic engineering.(메타볼릭엔지니어링) 12, 341-351, (2010)
본 발명의 과제는, 종래의 발효법에 따른 카다베린의 제조 방법보다 효율적이면서, 또한 고수율의 카다베린 제조 프로세스를 창출하는 것이다.
본 발명자는, 카다베린을 생산하는 능력을 가지고, 또한 pH 5.5 이하에 있어서 내성(耐性)을 가지는 코리네형 세균이 카다베린 생산균으로서 유용한 것을 발견하고, 본 발명을 완성시키기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 이하의 (1)∼(4)를 제공한다.
(1) 카다베린을 생산하는 능력을 가지고, 또한 pH 5.5 이하에 있어서 내성을 가지는 코리네형 세균을 배양하는 것을 포함하는, 카다베린의 제조 방법.
(2) 상기 코리네형 세균이 리신 탈탄산 효소 활성을 가지는, (1)에 기재된 카다베린의 제조 방법.
(3) 상기 코리네형 세균이 코리네박테리움속 및 브레비박테리움속으로 이루어지는 군으로부터 선택되는, (1) 또는 (2)에 기재된 카다베린의 제조 방법.
(4) 상기 코리네형 세균이 호모세린 영양 요구성 및/또는 S-(2-아미노에틸)-L-시스테인 내성을 가지는, (1)∼(3) 중 어느 하나에 기재된 카다베린의 제조 방법.
본 발명에 의하면, 종래의 발효법에 따른 카다베린의 제조 방법보다 효율적이면서, 또한 고수율로 카다베린을 제조할 수 있다.
상기한 바와 같이, 본 발명의 방법에서는, 코리네형 세균을 사용한다. 코리네형 세균은 호기성의 그람 양성 간균이며, 종래 브레비박테리움속으로 분류되어 있었지만, 현재, 코리네박테리움속에 통합된 세균도 포함된다(Int. J. Syst., Bacteriol., (1981) 41, p.225). 또한, 코리네박테리움속과 매우 근친인 브레비박테리움속세균을 포함한다.
이와 같은 코리네형 세균의 예로서, 코리네박테리움·아세토아시도필룸(Corynebacterium acetoacidophylum), 코리네박테리움·아세토글루타미쿰(Corynebacterium acetoglutamicum), 코리네박테리움·알카놀리티쿰(Corynebacterium alkanolyticum), 코리네박테리움·칼루나에(Corynebacterium callunae), 코리네박테리움·글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움·릴리움(Corynebacterium lilium), 코리네박테리움·멜라세콜라(Corynebacterium mellassecola), 코리네박테리움·서모아미노게네스(Corynebacterium thermoaminogenes), 코리네박테리움·에피시엔스(Corynebacterium efficiens), 코리네박테리움·허큘리스(Corynebacterium herculis), 브레비박테리움·디바리카툼(Brevivacterium divaricatum), 브레비박테리움·플라붐(Brevivacterium flavum), 브레비박테리움·임마리오필룸(Brevivacterium immariophilum), 브레비박테리움·락토퍼멘툼(Brevivacterium lactofermentum), 브레비박테리움·로제움(Brevivacterium roseum), 브레비박테리움·사카롤리티쿰(Brevivacterium saccharolyticum), 브레비박테리움·티오게니탈리스(Brevivacterium thiogenitalis), 코리네박테리움·암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes), 브레비박테리움·알붐(Brevivacterium album), 브레비박테리움·세리눔(Brevivacterium cerinum), 미크로박테리움·암모니아필룸(Microbacterium ammoniaphilum)을 들 수 있다.
또한, 각 코리네형 세균의 구체적인 균주로서, 코리네박테리움··아세토아시도필룸 ATCC13870, 코리네박테리움·아세토글루타미쿰 ATCC15806, 코리네박테리움·알카놀리티쿰 ATCC21511, 코리네박테리움·칼루나에 ATCC15991, 코리네박테리움·글루타미쿰 ATCC13020, ATCC13020, ATCC13060, 코리네박테리움·릴리움 ATCC15990, 코리네박테리움·멜라세콜라 ATCC17965, 코리네박테리움·에피시엔스 AJ12340(기탁 번호：FERMBP-1539), 코리네박테리움·허큘리스 ATCC13868, 브레비박테리움·디바리카툼 ATCC14020, 브레비박테리움·플라붐 ATCC13826, ATCC14067, AJ12418(기탁 번호：FERMBP-2205), 브레비박테리움·임마리오필룸 ATCC14068, 브레비박테리움·락토퍼멘툼탐 ATCC13869, 브레비박테리움·로제움 ATCC13825, 브레비박테리움·사카롤리티쿰 ATCC14066, 브레비박테리움·티오게니탈리스 ATCC19240, 코리네박테리움·암모니아게네스 ATCC6871, ATCC6872, 브레비박테리움·알붐 ATCC15111, 브레비박테리움·세리눔 ATCC15112, 미크로박테리움·안모니아피라스 ATCC15354를 예로 들 수 있다.
전술한 코리네형 세균은, 예를 들면, 아메리칸·타입·컬쳐·콜렉션(ATCC)으로부터 분양받을 수 있다. ATCC에서는 균주마다 대응하는 등록 번호를 부여하고 있고, 이 등록 번호는 ATCC의 카탈로그에 기재되어 이 번호를 참조하여 각 균주를 분양받을 수 있다.
본 발명에 있어서, 카다베린을 생산하는 능력을 가지는 코리네형 세균으로서는, 외부로부터 리신 탈탄산 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하는 것에 의해 리신 탈탄산 효소 활성을 가지게 된 코리네형 세균이 바람직하게 사용된다. 리신 탈탄산 효소 활성을 가지고 있으면, 리신을 원료로 하고, 이것을 탈탄산함으로써 카다베린을 생산할 수 있다.
리신 탈탄산 효소는 L-리신 탈탄산 효소인 것이 바람직하다. 또한, 리신 탈탄산 효소의 유래에 대해서는 특별히 제한은 없지만, 예를 들면, 바실러스·할로두란스(Bacillus halodurans), 바실러스·서브틸리스(Bacillus subtilis), 에세리키아·콜리(Escherichia coli；대장균), 셀레노모나스·루미난티움(Selenomonas ruminamtium), 비브리오·콜레라(Vibriocholerae), 비브리오·파라헤몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus), 스트렙토마이세스·코엘리칼라(Streptomyces coelicolor), 스트렙토마이세스·필로수스(Streptomyces pilosus), 에이케넬라·코로덴스(Eikenella corrodens), 유박테리움·아시다미노필룸(Eubacterium acidaminophilum), 살모네라·티피무리움(Salmonella typhimurium), 하프니아·알 베이(Hafnia alvei), 나이세리아·메닝기티디스(Neisseria meningitidis), 테르모플라즈마·아시도필룸(Thermoplasma acidophilum), 또는 피로코쿠스·아비시(Pyrococcus abyssi) 유래의 것이 바람직하게 사용되고, 안전성이 인정되고 있는 대장균 유래의 것이 보다 바람직하게 사용된다. 이들 리신 탈탄산 효소("LDC"라고 하는 경우가 있음)의 아미노산 서열 및 그것을 코딩하는 염기 서열은, 데이터베이스(GenBank)에 등록되어 있다. 예를 들면, 본 발명에 있어서 바람직하게 사용할 수 있는 대장균 유래의 LDC 유전자의 염기 서열은, GenBank Accession No.M76411로서 등록되어 있다.
본 발명에서 사용되는 리신 탈탄산 효소를 코딩하는 유전자는, 사용하는 코리네형 세균의 코돈 사용 빈도에 따라 핵산 서열을 재설계해도 된다. 그리고, 상기한 바와 같이, 전술한 각 생물 유래의 리신 탈탄산 효소 유전자는, 데이터베이스(GenBank)에 등록되어 있고, 생물명과 리신 탈탄산 효소를 키워드로서 검색하면 각 LDC 유전자의 염기 서열을 용이하게 알 수 있다.
리신 탈탄산 효소를 코딩하는 유전자로서는, 그 기능을 가지는 한, 상기한 각 생물종의 천연 LDC 유전자뿐만 아니라, 이들 LDC 유전자의 각 염기 서열에 있어서, 1개 또는 수개의 염기의 치환, 결실, 삽입 또는 부가된 폴리뉴클레오티드도 포함된다. 여기서, "수개"란, 통상 1∼40개, 바람직하게는 1∼30개, 보다 바람직하게는 1∼20개, 특히 바람직하게는 1∼10개, 최적으로 바람직하게는 1∼5개 정도이다. 또한, 상기 리신 탈탄산 효소를 코딩하는 유전자로서는, 그 기능을 가지는 한, 상기 유전자를 구성하는 폴리뉴클레오티드 또는 그 상보쇄의 전체 또는 그 일부와 엄격한(stringent) 조건에서 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드를 예로 들 수 있다. 여기서, "엄격한 조건에서 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드"란, 예를 들면, 원래의 염기 서열의 임의 중 적어도 20개, 바람직하게는 25개, 보다 바람직하게는 적어도 30개의 연속된 서열을 1개 또는 복수개 선택한 핵산 서열을 프로브로 하여, 공지의 하이브리다이세이션 기술[Current Protocols I Molecular Biology edit. Ausbel et al., (1987) Publish.John Wily & Sons Section 6.3-6.4] 등을 사용하여, 하이브리다이즈하는 핵산 서열이다. 여기서 엄격한 조건으로서는, 예를 들면, 50%의 포름아미드 존재 하에서 하이브리다이제이션 온도가 37℃, 보다 엄격한 조건으로서는 42℃, 더욱 엄격한 조건으로서는 65℃에서, 0.1∼2배 농도의 SSC 용액(1배 농도의 SSC 용액의 조성：150 mM의 염화 나트륨, 15 mM의 구연산 나트륨)을 사용하여 세정함으로써 달성할 수 있다. 또한, 상기 리신 탈탄산 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로서는, 그 기능을 가지는 한, 서열 동일성이, 통상 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 보다 바람직하게는 99% 이상 가지는 폴리뉴클레오티드라도 된다. 여기서, "서열 동일성"은, 서열을 비교하는 2개의 염기 서열의 염기가 가능한 한 많이 일치하도록 2개의 서열을 정렬시키고(필요에 따라 갭(gap)을 삽입함), 일치하는 염기의 수를 전체 염기수로 나눗셈하여, 백분율로 나타낸 수치를 의미한다. 양 측의 염기수가 상이한 경우에는, 긴 쪽의 염기수로 나눗셈한다. 서열 동일성을 산출하는 소프트웨어는 주지되어 있으며, 인터넷 상에서도 무료로 공개되어 있다. 이와 같은 리신 탈탄산 효소를 코딩하는 유전자는, 본래의 숙주 이외로부터도 취득할 수 있고, 본래의 숙주로부터 얻어진 유전자를, 당업자에게 주지의 인비트로 변이 처리, 또는 부위 특이적 변이 처리함으로써도 취득할 수 있다.
코리네형 세균에 리신 탈탄산 효소를 코딩하는 유전자(이하, "리신 탈탄산 효소 유전자" 또는 "LDC 유전자"라고 하는 경우가 있지만, 상기한 바와 같이 천연 유전자로 한정되는 것은 아님)를 도입하는 경우, 리신 탈탄산 효소 유전자는, 코리네형 세균 염색체 밖에서 유지되는 플라스미드 등에 있어서 유지되어 있어도 되고, 코리네형 세균의 염색체에 도입되어 유지되어 있어도 된다.
코리네형 세균의 염색체에 리신 탈탄산 효소 유전자를 도입하는 경우, 트랜스포존(transposon)을 이용함으로써 상동 재조합 또는 그것 자체의 전이능에 의해 리신 탈탄산 효소 유전자가 코리네형 세균의 염색체 중에 도입될 수 있다. 그리고, 도입하는 유전자 서열의 구축이나, 그 확인 방법에 대해서는 당업자에게 주지의 분자 생물학적 방법에 행해지는 것이며, 예를 들면, Sambrook et al., Molecular Clonig：A Laboratory Manual, Second Edition(1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, DNA Cloning：A Practical Approach, Volumes I and II(D. N. Glovered. 1985), F. M. Ausubel et al.(eds), Current Protocols in Molecular Biology(1994) John Wiley & Sons, Inc., PCR Technology：Principles and Application for DNA Amplication, H. Erlich, ed., Stockton Press 등을 참조할 수 있다.
상기 유전자 구축물의 코리네형 세균으로의 도입 방법은 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, 프로토플라스트(protoplast)법(Gene, (1985), 39, p.281-286), 일렉트로포레이션법(Bio/Technology, (1989), 7, 1067-1070) 등에 의해 도입할 수 있다.
그리고, 외래 LDC 유전자를 도입하고, 카타베린 생산능을 가지는 코리네형 세균은, 예를 들면, 특허 문헌 1에 기재되어 있는 바와 같이 공지되어 있다(하기 참고예 참조).
다음으로, pH 5.5 이하에 있어서 내성을 가지는 코리네형 세균에 대하여 구체적으로 설명한다.
코리네형 세균의 야생주는 pH 5.5 이하의 BHI 한천 배지에서는 콜로니를 형성할 수 없지만, 3일 배양하여 콜로니를 형성하는 주에 대해서는, pH 5.5 이하에 있어서 내성을 가지는 내성주인 것으로 판단할 수 있다. 그리고, 본 발명에 있어서는 pH 5.2 이하에 있어서 내성을 가지는 내성주가 바람직하게 사용할 수 있다.
코리네형 세균에 pH 5.5 이하에서의 내성을 부여하는 방법으로서는, 특별히 제한은 없지만, 예를 들면, 신주(新株)의 염색체에 어떠한 변이를 유발시키는 것이면 된다. 염색체에 변이를 도입하는 기술로서는, UV, 레이저 등의 조사에 의해 변이를 유발시키는 방법, 에탄술폰산 메틸(EMS), 니트로소구아니딘(NTG), 4-디메틸아미노벤젠디아조술폰산 나트륨(DAPA) 등의 변이 유발제를 사용하는 방법 등이 있다. 또한, 코리네형 세균을 배양하고 있을 때 생기는 자연 변이를 이용해도 된다. 그리고, 카다베린을 생산하는 능력을 가지고, 또한 pH 5.5 이하에서의 내성을 가지는 코리네형 세균을 제공하는 방법으로서는, 카다베린을 생산하는 능력을 가지는 코리네형 세균에 상기 내성을 부여해도 되고, 또한, 상기 내성이 부여된 코리네형 세균에 전술한 바와 같이 카다베린을 생산하는 능력을 부여해도 된다. 그리고, 상기한 돌연변이 유발 처리는, 미생물의 돌연변이 유발 처리에 채용되고 있는 주지의 조건에서 행하면 되고, 예를 들면, UV 조사의 경우, 조사량은 광원으로부터의 거리에 따라 다르지만, 통상, 10초∼30분 조사를 행한다. 또한, 상기한 NTG 등의 각 변이 유발제로 처리하는 경우에는, 처리 농도는, 예를 들면, 100μg/ml∼2μg/ml, 바람직하게는 300μg/ml∼1.3μg/ml이며, 이 농도의 배양액 중에서 예를 들면, 12시간∼48시간 배양함으로써 행할 수 있다.
이와 같은 돌연변이 유발 처리 후, pH 5.5 이하의 BHI 한천 배지 상에서 배양하고, 콜로니를 형성한 주를 스크리닝함으로써 pH 5.5 이하에서의 내성을 가지는 코리네형 세균을 얻을 수 있다. 그리고,하기 실시예에 구체적으로 기재한 바와 같이, NTG 처리에 의해, pH 5.5 이하에서의 내성을 획득한 주가 복수 얻어진 것에 의해 밝혀진 바와 같이, 돌연변이 유발 처리에 의해 pH 5.5 이하에서의 내성주를 재현성을 가지고 작출할 수 있다.
그 외에, 본 발명에서 사용하는 코리네형 세균은, 리신 합성능이 향상된 변이주인 것이 바람직하다. 리신 합성능이 향상된 변이주로서는, 예를 들면, L-리신 또는, L-스레오닌에 의한 피드백 저해가 해제된 변이주를 이용할 수 있다. 이들 변이주의 취득 방법으로서는, 예를 들면, 야생형주에, 앞의 예와 같은 변이 조작을 행한 후, S-(2-아미노에틸)-L-시스테인(AEC) 내성을 지표로 선택하여, L-리신 생산성을 가지게 된 변이주로부터 취득하는 방법을 예로 들 수 있다(특허 문헌 1 참조). 그리고, AEC 내성을 가지는지의 여부는, 특허 문헌 1에 기재된 바와 같이, 50μg/ml의 AEC를 포함하는 최소 한천 배지 상에서, 30℃에서 24시간 배양한 후에 증식이 일어나는지의 여부에 의해 판정할 수 있다.
또는, 야생형주에 AEC 내성을 부여하는 더욱 바람직한 방법으로서, 유전자 공학적 방법을 이용하는 방법이 있다. 유전자 공학적 방법을 이용하는 방법에는 특별히 제한은 없고, 예를 들면, 코리네형 세균으로 복제 가능한 재조합체 DNA를 사용하는 방법, 또는 상동 재조합에 의해 염색체 중의 목적 유전자를 재조합하는 방법이다. 예를 들면, 서열 번호 14로 기재된 아미노산 서열에 있어서 311번째의 아미노산 잔기가 Thr 이외의 아미노산으로 치환된 변이 아스파르토키나제 유전자("탈감작형 AK 유전자"라고 할 경우가 있음)를 가지는 것에 의해 S-(2-아미노에틸)-L-시스테인 내성을 획득할 수 있다. 더욱 바람직한 유전자 공학적 방법은, 코리네형 세균의 염색체에 있는 AK 유전자를 탈감작형 AK 유전자에 상동 재조합에 의해 재조합하는 방법이다. 또한, 탈감작형 AK 유전자는, AK 유전자에 원하는 변이를 도입하는 주지의 기법[예를 들면, 부위 지정 돌연변이(site-directed mutagenesis)]을 이용할 수 있고, 이를 위한 키트도 시판되고 있다.
또한, 리신 합성능이 향상된 변이주로서 AEC 내성 변이주 외에, 호모세린 영양 요구성 변이주를 예로 들 수 있다. 야생주는 호모세린 영양 요구성을 가지고 있지 않지만, 호모세린 영양 요구성주를 취득하는 방법으로서는, 앞서의 예와 마찬가지로, 예를 들면, 야생형주로부터 변이 조작을 행한 후, 호모세린 영양 요구성을 지표로 선택하고, L-리신 생산성을 가지게 된 변이주로부터 취득하는 방법이나, 유전자 공학적 방법에 의해 코리네형 세균의 호모세린데히드로게나제 활성을 결손시키는 방법을 예로 들 수 있다(특허 문헌 1).
또한, 야생형주에 호모세린 영양 요구성을 부여하는 더욱 바람직한 방법으로서, 상동 재조합에 의해 염색체 중의 호모세린데히드로게나제 유전자(이하 HOM 유전자로 약칭)에 그 외의 유전자를 삽입하는 방법 등에 의해 호모세린데히드로게나제 활성을 결손시키는 방법을 예로 들 수 있다. 그 외의 유전자에 특별히 제한은 없다. 바람직하게는 LDC 유전자이며, 더욱 바람직하게는 LDC 유전자가 야생형주로 구성적으로 발현할 수 있는 프로모터와 카세트로 되어 있는 것이다.
본 발명에서는, 상기 카다베린을 생산하는 능력을 가지고, 또한 2, 2-티오 비스 에틸아민에 대한 내성을 가지는 코리네형 세균을 배양함으로써 카다베린을 제조한다. 배양 방법으로서는, 회분 배양, 유가 배양 또는 연속 배양을 사용할 수 있다. 연속 배양의 경우, 예를 들면, 일본 특허출원 공개번호 2008-104453호 공보에 기재된 바와 같은 공지의 방법에 의해 연속 배양을 행하는 것이 바람직하다.
카다베린을 제조하기 위한 배양 배지로서는, 동화(assimilation) 가능한 탄소원 및 질소원 및 무기염류 등을 포함하는 통상의 영양 배지를 사용할 수 있다. 탄소원으로서는, 예를 들면, 글루코오스, 과당, 수크로오스, 말토오스, 전분 가수분해물 등의 당류, 에탄올 등의 알코올류, 아세트산, 락트산, 숙신산 등의 유기산류를 사용할 수 있다. 질소원으로서는, 암모니아, 염화 암모늄, 황산 암모늄, 탄산 암모늄, 아세트산 암모늄 등의 각종 무기 및 유기 암모늄 염류, 요소, 그 외에 질소 함유 화합물, 및 고기 엑기스, 효모 엑기스, 콘·스팁·리커, 대두 가수분해물 등의 질소 함유 유기물을 사용할 수 있다. 무기염으로서는 인산 제1 수소 칼륨, 인산 제2 수소 칼륨, 황산 암모늄, 염화 나트륨, 황산 마그네슘, 탄산칼슘 등을 사용할 수 있다. 그 외에, 필요에 따라 비오틴, 티아민, 비타민 B6 등의 미량 영양원을 가할 수 있다. 이들 미량 영양원은, 고기 엑기스, 효모 엑기스, 콘·스팁·리커, 카자미노산 등의 배지 첨가물로 대용할 수도 있다.
또한, 배양 배지에 카다베린의 전구체인 리신을 사전에 첨가해 두어도 된다. 배양 배지에 리신을 사전에 첨가해 두면, 코리네형 세균이 리신을 균체 내에 받아들이고, 리신 탈탄산 효소가 리신을 기질로 하여 카다베린으로 변환하므로, 카다베린의 제조 효율을 높일 수 있다. 배양 배지에 사전에 리신을 첨가하는 경우의 배양 배지 중의 리신 농도로서는 특별히 제한은 없지만, 코리네형 세균의 증식에 악영향을 미치지 않고, 또한, 리신 탈탄산 효소로의 저해가 일어나지 않는 농도가 바람직하고, 구체적으로는, 0.01 내지 2 M인 것이 바람직하다.
첨가하는 리신은 L-리신인 것이 바람직하다. 또한, 첨가하는 리신은 프리체라도 되고 리신염이라도 되지만, 리신염인 것이 바람직하고, 리신염으로서는 리신 염산염 또는 후술하는 디카르복시산 유래의 리신·디카르복시산 염이 바람직하고, 보다 바람직한 구체예로서는, 리신·아디프산염, 리신·세바스산염, 리신·1,12-도데칸디카르복시산 염, 리신·숙신산염, 리신·이소프탈산염, 리신·테레프탈산염을 들 수 있지만, 보다 바람직한 구체예로서는 리신·아디프산염을 들 수 있다.
배양 조건에는 특별히 제한은 없고, 진탕 배양, 심부(深部) 통기(通氣) 교반 배양 등의 호기적 조건 하에서 행한다. 배양 온도는 일반적으로 25℃∼42℃이며, 바람직하게는 28℃∼38℃이다. 배양 시간은, 통상 1일 내지 6일간이다.
배양 pH 조정에는 알칼리 측으로 조정하는 경우에는 암모니아를 사용하는 것이 바람직하고, 산성 측으로 조정하는 경우에는 염산 또는 디카르복시산을 사용하는 것이 바람직하고, 디카르복시산을 사용하는 것이 보다 바람직하다. 이들 중화제를 사용하여 배양 pH를 5∼8로, 바람직하게는 pH 6.5∼7.5로 제어하는 것이 바람직하다. 그리고, 중화제의 상태에 제한은 없으며, 기체, 액체, 고체 또는 수용액으로 사용된다. 특히 바람직하게는 수용액이다.
중화제로서 바람직하게 사용되는 디카르복시산에는 특별히 제한은 없지만, 바람직하게는, 상기 2개의 카르복실기 이외에는, 실질적으로 관능기가 존재하지 않는 디카르복시산이다. 여기서 말하는 관능기란, 폴리아미드 중합 반응(반응 조건으로서는, 예를 들면, 반응 온도 250∼270 ℃, 압력 10∼20 kg/cm2에서 반응 시간 1내지 5시간) 시에 아미노기나 카르복실기 등과 반응하여, 폴리머의 분지를 일으키거나 폴리머의 결정화도를 저하(결정화도 80% 이하)시키는 반응기이며, 예를 들면, 아미노기나 카르복실기가 여기에 해당하지만, 그 이외에는, 산성기(술폰산기, 인산기, 페놀성 수산기 등)나 알칼리성기(히드라지노기 등)나 양성자성(protonic) 극성 기(수산기 등)나 개열성(開裂性)을 가지는 기(에폭시기, 과산화기 등)나 그 외에 반응성이 높은 기(이소시아나트기 등)가 해당한다. 한편, 할로겐 치환기나 방향족 성 치환기, 에테르기, 에스테르기, 아미드기 등은 반응성이 낮으며, 여기서 말하는 관능기에는 해당하지 않는다.
디카르복시산으로서 보다 바람직하게는, 이하의 일반식 (1), (2) 또는 (3)으로 나타내는 디카르복시산이다.
HOOC-(CH2)m-COOH···(1)
(단, 일반식 (1)에 있어서, m=0∼16).
[화학식 1]
(단, 일반식 (2)에 있어서, n, o=0∼16).
[화학식 2]
(단, 일반식 (3)에 있어서, p, q=0∼16).
또한, 디카르복시산으로서 더욱 바람직하게는, 아디프산, 세바스산, 1,12-도데칸디카르복시산, 숙신산, 이소프탈산, 테레프탈산이다.
배양액 중의 카다베린은, 카다베린의 프리체 또는 카다베린염으로서 존재한다(그리고, 본 발명에서는 이들을 총칭하여 "카다베린"이라고 함). 배양액 중의 카다베린을 회수하기 위해서는 먼저, 배양액 중으로부터 코리네형 세균을 제거한다. 이 때, 코리네형 세균이 증식하고, 발효가 충분히 진행되어 카다베린이 생성된 후, 균체와 배양 상청액을 분리(분리 방법으로서는, 균체를 침전 제거·원심분리·막여과 분리)해도 되고, 또는 처음부터 균체를 유지재 등으로 분리·유지 또는 고정화하고 있어도 된다. 균체가 제거된 카다베린을 포함하는 배양액으로부터 카다베린을 회수하는 방법 자체는 이미 알려져 있으며, 예를 들면, 일본 특허출원 공개번호 2009-207495호 공보에 기재된 바와 같이 카다베린·디카르복시산 염으로서 정석하여 채취할 수도 있다. 또한, 일본 특허출원 공개번호 2009-29872호 공보에 기재된 바와 같이 NF막을 이용하여 카다베린의 프리체를 정제하여 채취할 수도 있다. 또한, 일본 특허출원 공개번호 2009-28045호 공보에 기재된 바와 같이 극성 유기용매로 추출하고, 증류함으로써 카다베린의 프리체를 채취할 수도 있다(하기 참고예 참조).
[실시예]
이하, 발명에 대하여, 실시예, 비교예를 예로 들어 상세하게 설명한다.
참고예 1 카다베린 및 리신 농도의 HPLC에 의한 분석 방법
분석 샘플 25μl에, 내표(內標)로서 1,4-디아미노부탄(0.03 M)을 25μl, 탄산수소 나트륨(0.075 M)을 150μl, 2,4-디니트로플루오로벤젠(0.2 M)의 에탄올 용액을 첨가 혼합하고 37℃에서 1시간 보온하고, 반응 용액 50μl를 1 ml 아세토니트릴에 용해시킨 후, 10,000 rpm으로 5분간 원심분리 한 후 상청액 10μl를 이하의 조건에서 HPLC 분석하였다.
사용 컬럼：CAPCELL PAK C18(시세이도)
이동상：0.1%(w/w) 인산 수용액：아세토니트릴 = 4.5：5.5
검출：UV 360nm.
참고예 2 L-리신 탈탄산 활성을 가지고, 또한 호모세린데히드로게나제 활성을 결손하고 있는 코리네박테리움·글루타미쿰(TR-CAD1주)의 제작(특허 문헌 1)
(1) HOM 유전자의 클로닝
HOM 활성을 결손시키기 위하여, N말단으로부터 300 아미노산 영역에 해당하는 유전자를 클로닝하였다.
데이터베이스(GenBank)에 등록되어 있는 HOM 유전자(Accession No.BA000036)의 염기 서열을 참고로 올리고 뉴클레오티드 프라이머 5'-gaagaattctaaacctcagcatctgcccc-3'(서열 번호 1) 및 5'-gaaggatccaaaggacttgtttaccgacgc-3'(서열 번호 2)를 합성하였다. 코리네박테리움·글루타미쿰 ATCC13032로부터 통상적인 방법에 따라 조제한 게놈 DNA의 용액을 증폭 주형으로 하여 0.2 ml의 마이크로 원심 튜브에 0.2μl씩 취하여, 각 프라이머를 20 pmol, 트리스 염산 완충액 pH 8.0(20 mM), 염화 칼륨(2.5 mM), 젤라틴(100μg/ml), 각각의 dNTP(50μM), LATaqDNA 폴리머라제(2단위)(타카라주조 제조)가 되도록 각 시약을 가하여, 전체량을 50μl로 하였다. DNA의 변성 조건 94℃, 30초, 프라이머의 어닐링 조건 55℃, 30초, DNA 프라이머의 신장 반응 조건 72℃, 3 분의 각 조건에서 BioRad사의 서멀 사이클러를 사용하여, 30 사이클 폴리머라제 연쇄 반응시켰다(이하 PCR법으로 약칭). 그리고, 본 참고예에 있어서의 PCR법은 특별히 언급하지 않는 이상 본 조건에 의해 행하였다. 이 PCR법에 의해 얻어진 산물을 1.0%의 아가로스에 의해 전기 영동하고, HOM 유전자를 포함하는 약 0.9 kb의 DNA 단편을 겔로부터 잘라내고 진·클린·키트(BIO101사 제조)에 의해 정제했다. 이 단편을, 제한 효소의 EcoRI 및 BamHI로 소화시키고, 얻어진 0.9 kb의 EcoRI-BamHI 단편을, 사전에 EcoRI 및 BamHI로 소화시켜 둔 pHSG298(타카라주조 제조)의 EcoRI/BamHI 간극에 라이게이션 키트 ver.1(타카라주조 제조)을 사용하여 삽입하고, 얻어진 플라스미드를 pHOM1으로 명명했다.
(2) LDC 발현 카세트의 작성
먼저, LDC를 코리네박테리움·글루타미쿰으로 구성적으로 발현시키기 위한 프로모터로서 카나마이신 내성 유전자의 프로모터의 클로닝을 행하였다.
데이터베이스(GenBank)에 등록되어 있는 pHSG299(Accession No.M19415)의 염기 서열을 참고로 올리고 뉴클레오티드 프라이머 5'-gaaccgcggcctgaatcgccccatcatcc-3'(서열 번호 3) 및 5'-gaaccatggccccttgtattactg-3'(서열 번호 4)를 합성하였다. 플라스미드 pHSG299를 증폭 주형으로 하고, 올리고 뉴클레오티드(서열 번호 3), (서열 번호 4)를 프라이머 세트로 한 PCR법에 의해 얻어진 산물을 1.0%의 아가로스겔에 의해 전기 영동하고, 카나마이신 내성 유전자의 프로모터 영역을 포함하는 0.3 kb의 DNA 단편을 겔로부터 잘라내고 진·클린·키트에 의해 정제했다. 이 단편을, 플라스미드 벡터 pT7blue(Novagen사 제조)의 EcoRV 절단 부위의 3'-말단에 T염기가 부가된 간극에, 라이게이션 키트 ver.1을 사용하여 삽입하고, 얻어진 플라스미드 중 제한 효소의 HindIII 및 SacII로 소화시켰을 때 3.2 kb의 단일 단편이 되는 플라스미드를 pKMP1으로 명명했다.
다음으로, LDC 유전자의 클로닝을 행하였다. 데이터베이스(GenBank)에 등록되어 있는 LDC 유전자(Accession No.M76411)의 염기 서열을 참고로 올리고 뉴클레오티드 프라이머 5'-gaaccatggacgttattgcaa-3'(서열 번호 5), 5'-gaaccgcggttattttttgctttcttcttt-3'(서열 번호 6)를 합성하였다. 에세리키아·콜리 ATCC10798로부터 통상적인 방법에 따라 조정한 게놈 DNA의 용액을 증폭 주형으로 하여 올리고 뉴클레오티드(서열 번호 5), (서열 번호 6)를 프라이머 세트로 한 PCR법에 의해 얻어진 산물을 1.0%의 아가로스겔에 의해 전기 영동하고, LDC 유전자를 포함하는 2.1 kb의 DNA 단편을 겔로부터 잘라내고 진·클린·키트에 의해 정제했다. 이 단편을, 플라스미드 벡터 pT7blue의 EcoRV 절단 부위의 3'-말단에 T염기가 부가된 간극에, 라이게이션 키트 ver.1을 사용하여 삽입하고, 얻어진 플라스미드 중 HindIII 및 NcoI로 소화시켰을 때 4.0 kb의 단일 단편이 되는 플라스미드를 pCADA로 명명했다.
마지막으로, pKMP1을 HindIII 및 NcoI로 소화시키고, 이 산물을 1.2%의 아가로스겔에 의해 전기 영동하고, 카나마이신 내성 유전자의 프로모터 영역을 포함하는 0.3 kb의 DNA 단편을 겔로부터 잘라내고 진·클린·키트에 의해 정제했다. 이와 같이 하여 얻어진 HindIII-NcoI 단편을, 사전에 HindIII 및 NcoI로 소화시켜 둔 pCADA의 HindIII/NcoI 간극에 라이게이션 키트 ver.1을 이용하고 삽입하고, 얻어진 플라스미드를 pTM100으로 명명했다.
(3) HOM 유전자 파괴 및 LDC 유전자 발현 벡터의 작성
pTM100를 SacII로 소화하고, 이 산물을 1.0%의 아가로스겔에 의해 전기 영동하고, LDC 발현 카세트를 포함하는 2.4 kb의 DNA 단편을 겔로부터 잘라내고 진·클린·키트에 의해 정제했다. 이와 같이 하여 얻어진 SacII 단편을, 사전에 SacII로 소화시켜 둔 pHOM1의 SacII 간극에 라이게이션 키트 ver.1을 이용하고 삽입하고, 얻어진 플라스미드를 pTM101로 명명했다.
(4) pTM101의 염색체로의 도입
코리네박테리움·글루타미쿰 ATCC13032(이하 ATCC13032주로 약칭)에 플라스미드 pTM101를, 전기 천공법[FEMS Microbiology Letters, 65, p.299(1989)]에 의해 도입하고, 카나마이신(25μg/ml)이 첨가되어 있는 LB[트립톤(10 g/l)(Bacto사 제조), 효모 엑기스(5 g/l)(Bacto사 제조), 염화 나트륨(10 g/l)] 한천 배지 상에서 선택하였다.
이와 같이 하여 선택된 형질 전환체로부터 통상적인 방법에 따라 게놈 DNA 용액을 조제했다. 이 게놈 DNA를 주형으로 하여, 올리고 뉴클레오티드(서열 번호 5)(서열 번호 6)를 프라이머 세트로서 사용한 PCR법을 행하고, 얻어진 산물을 1.0%의 아가로스겔에 의해 전기 영동한 바, 2.1 kb의 단일 밴드가 관찰되었다. 이러한 사실로부터, 선택된 형질 전환체가, HOM 유전자좌에, LDC 유전자가 삽입되어 있는 것을 확인할 수 있었다. 이 형질 전환체를, 코리네박테리움·글루타미쿰 TR-CAD1(이하 TR-CAD1주로 약칭)으로 명명했다.
13032주는 LDC 활성을 가지고 있지 않지만, TR-CAD1주는 LDC 활성을 가지고 있는 것이 확인되었다. 또한, 13032주는 HOM 활성을 가지고 있지만, TR-CAD1주는 HOM 활성을 결손하고 있었다. 13032주는 호모세린을 요구하지 않지만, TR-CAD1주는, 호모세린을 요구하였다. 이와 같이 하여, LDC 활성을 가지며, 또한 HOM 활성을 결손(호모세린 영양 요구성)하고 있는 코리네박테리움·글루타미쿰 TR-CAD1주를 제작할 수 있었다.
참고예 3 L-리신 탈탄산 활성을 가지며, 또한 호모세린 요구성을 가지고, 또한 S-(2-아미노에틸)-L-시스테인 내성을 가지는 코리네박테리움·글루타미쿰(TR-CAD2) 주의 제작(특허 문헌 1)
(1) 탈감작형 AK 유전자의 작성
AK 유전자에 변이를 도입하고, 탈감작형 AK 유전자를 작성하기 위해 AK 유전자를 클로닝하였다.
데이터베이스(GenBank)에 등록되어 있는 AK 유전자(Accession No.BA000036)의 염기 서열을 참고로 올리고 뉴클레오티드 프라이머 5'-acagaattcgtggccctggtcgtacagaa-3'(서열 번호 7) 및 5'-catctcgagttagcgtccggtgcctgcat-3'(서열 번호 8)를 합성하였다. 코리네박테리움·글루타미쿰 ATCC13032로부터 통상적인 방법에 따라 조정한 게놈 DNA의 용액을 증폭 주형으로 하여, 올리고 뉴클레오티드(서열 번호 7), (서열 번호 8)를 프라이머 세트로 한 PCR법에 의해 얻어진 산물을 1%의 아가로스겔에 의해 전기 영동하고, AK 유전자를 포함하는 약 1.3 kb의 DNA 단편을 겔로부터 잘라내고 진·클린·키트에 의해 정제했다. 이 단편을, EcoRI 및 XhoI로 소화하고, 얻어진 1.3 kb의 EcoRI-XhoI 단편을, 사전에 EcoRI 및 XhoI로 소화시켜 둔 pHSG396(타카라주조 제조)의 EcoRI/XhoI 간극에 라이게이션 키트 ver.1을 사용하여 삽입하고, 얻어진 플라스미드를 pAK1으로 명명했다.
다음으로, 클로닝한 AK 유전자의 931번째로부터 933번째의 acc(Thr)를 atg(Ile)로 변이시키기 위해 올리고 뉴클레오티드 프라이머 5'-cgacatcatcttcacctgcc-3'(서열 번호 9) 및 5'-ggcaggtgaagatgatgtcg-3'(서열 번호 10)를 합성하였다. pAK1을 증폭 주형으로 하여, 올리고 뉴클레오티드(서열 번호 9), (서열 번호 10)를 프라이머 세트로 하여 QuikChange 사이트디렉티드·뮤타제네시스·키트(스트라타진사 제조)를 이용하고 얻어진 플라스미드를 pTM102로 명명했다. 이 pTM102 중의 AK 유전자를 통상적인 방법에 의해 시퀀스(sequence)한 바, 목적한 대로 931번째로부터 933번째의 acc(Thr)가 atg(Ile)로 변이되어 있고, 탈감작형 AK 유전자가 작성되어 있는 것이 확인할 수 있었다.
(2) pTM102의 염색체로의 도입
데이터베이스(GenBank)에 등록되어 있는 pFK398(Accession No.D29826)의 염기 서열을 참고로 클로람페니콜 내성 유전자의 올리고 뉴클레오티드 프라이머 5'-acggtcgactcgcagaataaataaatcctggtg-3'(서열 번호 11) 및 5'-atgaggcctgagaggcggtttgcgtattgga-3'(서열 번호 12)를 합성하였다.
TR-CAD1주에 플라스미드 pTM102를, 전기 천공법에 의해 도입하고, 카나마이신(25μg/ml) 및 클로람페니콜(10μg/ml)이 첨가되어 있는 LB 한천 배지 상에서 선택하였다.
이와 같이 하여 선택된 형질 전환체로부터 통상적인 방법에 따라 게놈 DNA 용액을 조제했다. 이 게놈 DNA를 주형으로 하여, 올리고 뉴클레오티드(서열 번호 11)(서열 번호 12)를 프라이머 세트로서 사용한 PCR법을 행하고, 얻어진 산물을 1.0%의 아가로스겔에 의해 전기 영동한 바, 1.0 kb의 단일 밴드가 관찰되었다. 이러한 사실로부터, 선택된 형질 전환체가, AK 유전자좌에, 클로람페니콜 내성 유전자가 삽입되어 있는 것을 확인할 수 있었다. 이 형질 전환체를, 코리네박테리움·글루타미쿰 TR-CAD2(이하 TR-CAD2주로 약칭)로 명명했다.
(3) 탈감작형 AK 유전자의 TR-CAD2주의 염색체 상으로의 도입의 확인
데이터베이스(GenBank)에 등록되어 있는 AK 유전자(Accession No.BA000036)의 염기 서열을 참고로, AK의 N말단으로부터 상류 0.1 kb의 올리고 뉴클레오티드 프라이머 5'-ttggaacgcgtcccagtggc-3'(서열 번호 13)를 합성하였다.
TR-CAD2주로부터 통상적인 방법에 따라 게놈 DNA 용액을 조정하였다. 이 게놈 DNA를 주형으로 하여, 올리고 뉴클레오티드(서열 번호 12)(서열 번호 13)를 프라이머 세트로서 사용한 PCR법을 행하고, 얻어진 산물을 1.0%의 아가로스겔에 의해 전기 영동하고, AK 유전자 및 클로람페니콜 내성 유전자를 포함하는 3.1 kb의 DNA 단편을 겔로부터 잘라내고 진·클린·키트에 의해 정제했다. 이 단편을, 플라스미드 벡터 pT7blue의 EcoRV 절단 부위의 3'-말단에 T염기가 부가된 간극에, 라이게이션 키트 ver.1을 사용하여 삽입하고, 얻어진 플라스미드를 pAK2로 명명했다. 이 pAK2 중의 AK 유전자를 통상적인 방법에 의해 시퀀스한 바, 목적한 대로 변이가 포함되어 있는 것이 확인되었으므로, TR-CAD2주는 염색체 상에서 발현 가능한 탈감작형 AK 유전자가 도입된 것을 확인할 수 있었다. 이와 같이 하여, LDC 활성을 가지고, 또한 HOM 활성을 결손(호모세린 영양 요구성)하면서, 또한 AEC 내성을 가지는 코리네박테리움·글루타미쿰(TR-CAD2주)을 제작할 수 있었다.
실시예 1 카다베린을 생산하는 능력을 가지고, 또한 pH 5.5 이하에 있어서 내성을 가지는 코리네형 세균의 취득
상기한 바와 같이 얻어진, L-리신 탈탄산 효소 활성을 가지고, 또한 호모세린데히드로게나제 활성을 결손함으로써 호모세린 영양 요구성 변이주가 된 코리네박테리움·글루타미쿰(TR-CAD1주), 및 L-리신 탈탄산 효소 활성을 가지고, 또한 호모세린데히드로게나제 활성을 결손함으로써 호모세린 영양 요구성 변이주가 되고, 또한 S-(2-아미노에틸)-L-시스테인 내성(AEC 내성)을 가지는 코리네박테리움·글루타미쿰(TR-CAD2주)을, 각각 5 ml의 BHI(Brain Heart Infusion) 액체 배지에서 하룻밤 전배양(preculture)하고, 얻어진 전배양액 중 2.5 ml를 새로운 BHI 액체 배지에 식균하고, 탁도(A600)가 1∼2에 이를 때까지 배양했다. 배양 후, 균체를 트리스말레산 완충액으로 2회 세정하고, 세정된 균체를 12 ml의 트리스말레산 완충액에 현탁하고, 현탁액을 900μl씩 시험관에 나누어서 주입하고, 각각 640μg/ml의 NTG 용액을 첨가했다. 혼합 용액을, 30℃에서 40분 격렬하게 진탕하고, 2 ml의 BHI 배지에 현탁시키고 빙랭시켰다. 현탁액을 트리스말레산 완충액으로 2회 세정한 후, 50 ml의 BHI 배지를 첨가하고, 28℃에서 하룻밤 배양했다. 배양액을, 트리스말레산 완충액으로 2회 세정하고, pH 5.7, pH 5.5, pH 5.3, pH 5.2로 조정한 BHI 한천 배지(표 1)에서 2∼3일 배양한 후, 콜로니를 형성한 균체를 취득하고, 각각 TR-CADA1AC-0∼6주, TR-CADA2AC-0∼6주(표 2)로 하였다. 또한, 취득한 내성주는, 각각을 취득한 pH의 값으로 조정한 배지에서, 3일간 더 배양하고, 콜로니를 형성하는 것, 즉 상기 pH에 내성을 가지는 것을 확인하였다. 이 중, TR-CADA1AC-4주, TR-CADA2AC-5주는, 독립 행정법인 제품 평가 기술 기반 기구(NITE)에 각각 NITE BP-1004, NITE BP-1005로서 국제 기탁되어 있다.
[표 1]
[표 2]
실시예 2, 3, 비교예 1, 2
TR-CADA1AC-1∼6주(실시예 2), TR-CADA2AC-1∼6(실시예 3), TR-CADA1주(비교예 1), TR-CADA2주(비교예 2)에 의한 카다베린 발효를 행하였다. 멸균한 BHI 배지 5 ml에 각 주를 1백금이(platinum loop) 식균하고, 30℃에서 24시간 진탕하여 전전(前前) 배양을 행하였다. 이 전전 배양액을 전전 배양과 동일한 배지 50 ml에 전체량을 식균하고, 온도 30℃, 진폭 30 cm, 120 rpm의 조건 하에서 24시간 배양하여 전배양을 행하였다. 다음으로, 표 3에 나타내는 MMP 배지 950 ml에 전배양액 전체량을 식균하고, 멸균한 공기를 0.07 vvm으로 통기하면서, 온도 30℃, 교반날개 회전수 800 rpm, pH 6.7로 조정하면서 50시간 배양을 행하였다. 중화제로서 황산 수용액(3 M) 및 암모니아수(3 M)를 사용하였다.
[표 3]
배양 종료 후, 4℃, 8,000 rpm으로 10분간 원심분리함으로써 균체를 제거하고, 배양 상청액을 회수했다. 이 배양 상청액 중의 카다베린 및 리신을 HPLC에 의해 분석하였다. 또한, 글루코오스 농도의 측정에는, "글루코오스 테스트 와코 C"(등록상표)(와코순약사 제조)를 사용하였다. 카다베린:당의 수율[(카다베린대당 수율)(생산된 카다베린 중량/소비한 글루코오스 중량)×100(%)]을 계산하고, 이들 결과를 표 4에 나타내었다.
[표 4]
그 결과, 실시예 2와 비교예 1, 비교예 2, 및 실시예 3과 비교예 3, 비교예 4를 각각 비교하면, 신주에 대하여, pH 5.5이하의 pH 내성을 부여하는 것에 의해, 카다베린의 축적 농도 및 대당수율이 향상되어 있는 것이 밝혀졌다.
얻어진 배양 상청액으로부터의 카다베린의 회수는, 각종 공지의 방법에 의해 가능하다. 이하에서 바람직한 공지의 회수 방법을 예시한다.
참고예 4 배양 상청액으로부터의 카다베린의 회수
전술한 방법으로 얻어진 카다베린 발효액의 배양 상청액에 5규정의 수산화 나트륨을 첨가하고, pH를 13으로 조정한다. 이어서, 나노 여과막에 통과시켜, 무기염 성분 및 미량의 잔류 균체를 제거하고, 나노 여과막 투과액을 회수한다. 이어서, 회수한 나노 여과막 투과액을 역침투막에 통과시켜 카다베린 농도가 18 중량% 정도가 될 때까지 농축하고, 회수한다. 이어서, 회수한 농축액을 로터리 증발기 등에 의해 감압 농축함으로써 물을 제거하여, 50 중량% 정도의 카다베린 수용액을 얻을 수 있다. 다음으로, 클로로포름을 등량 가하여, 클로로포름 상(相)에 카다베린을 추출한다. 마지막으로, 이 클로로포름 상을, 감압 증류(30 mmHg, 80℃)함으로써 프리의 카다베린을 단리한다.
[산업상 이용가능성]
본 발명에 의해, 카다베린을 공업적으로 제조할 수 있다.
SEQUENCE LISTING
<110> TORAY INDUSTRIES, INC.
<120> A Method of producing cadaverine
<130> PF444-PCT
<160> 14
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 1
gaagaattct taaacctcag catctgcccc 30
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 2
gaaggatcca aaggacttgt ttaccgacgc 30
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> pHSG299
<400> 3
gaaccgcggc ctgaatcgcc ccatcatcc 29
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> pHSG299
<400> 4
gaaccatggc cccttgtatt actg 24
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 5
gaaccatgga cgttattgca a 21
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 6
gaaccgcggt tattttttgc tttcttcttt 30
<210> 7
<211> 29
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 7
acagaattcg tggccctggt cgtacagaa 29
<210> 8
<211> 29
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 8
catctcgagt tagcgtccgg tgcctgcat 29
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 9
cgacatcatc ttcacctgcc 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 10
ggcaggtgaa gatgatgtcg 20
<210> 11
<211> 33
<212> DNA
<213> pFK398
<400> 11
acggtcgact cgcagaataa ataaatcctg gtg 33
<210> 12
<211> 31
<212> DNA
<213> pFK398
<400> 12
atgaggcctg agaggcggtt tgcgtattgg a 31
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 13
ttggaacgcg tcccagtggc 20
<210> 14
<211> 421
<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 14
Val Ala Leu Val Val Gln Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala
1 5 10 15
Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala
20 25 30
Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp
35 40 45
Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg
50 55 60
Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu
65 70 75 80
Val Ala Met Ala Ile Glu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr
85 90 95
Gly Ser Gln Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg
100 105 110
Ile Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly
115 120 125
Lys Ile Cys Ile Val Ala Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg
130 135 140
Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala
145 150 155 160
Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val
165 170 175
Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys
180 185 190
Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly
195 200 205
Ser Lys Ile Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn
210 215 220
Val Pro Leu Arg Val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu
225 230 235 240
Ile Ala Gly Ser Met Glu Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr
245 250 255
Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile
260 265 270
Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp
275 280 285
Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu
290 295 300
Asp Gly Thr Thr Asp Ile Ile Phe Thr Cys Pro Arg Ser Asp Gly Arg
305 310 315 320
Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr
325 330 335
Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala
340 345 350
Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu
355 360 365
Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg
370 375 380
Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala
385 390 395 400
Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr
405 410 415
Ala Gly Thr Gly Arg
420
Claims (4)
- 카다베린을 생산하는 능력을 가지고, 또한 pH 5.5 이하에 있어서 내성(耐性)을 가지는 코리네형 세균을 배양하는 것을 포함하는 카다베린의 제조 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 코리네형 세균이 리신 탈탄산 효소 활성을 가지는, 카다베린의 제조 방법. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 코리네형 세균이 코리네박테리움속 및 브레비박테리움속으로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 카다베린의 제조 방법. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 코리네형 세균이 호모세린 영양 요구성 및/또는 S-(2-아미노에틸)-L-시스테인 내성을 가지는, 카다베린의 제조 방법.
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