KR101851467B1

KR101851467B1 - 핵산 대사 경로가 약화된 아미노산 고생산능 변이 균주 및 이를 이용한 아미노산의 제조 방법

Info

Publication number: KR101851467B1
Application number: KR1020160155242A
Authority: KR
Inventors: 박석현; 김일권; 박동철
Original assignee: 대상 주식회사
Priority date: 2016-11-21
Filing date: 2016-11-21
Publication date: 2018-04-25

Abstract

본 발명은 핵산 생합성 경로를 약화시켜 L-라이신(lysine)의 생산능을 향상시키는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 변이 균주 및 이를 이용한 L-라이신의 제조 방법에 관한 것으로, 오탄당 회로에서 핵산 드노보(de novo) 생합성 경로로 흐르는 첫번째 효소인 리보포스페이트 피로포스포키나아제(ribo-phosphate-pyrophosphokinase)를 암호화하는 유전자인 prs의 발현을 약화시킴으로써 L-라이신의 생산능을 향상시키는 코리네박테리움 속 변이 균주 및 이를 이용하는 L-라이신의 제조 방법을 제공한다.

Description

핵산 대사 경로가 약화된 아미노산 고생산능 변이 균주 및 이를 이용한 아미노산의 제조 방법{MUTANT STRAIN WITH ENHANCED AMINO ACID PRODUCTION VIA REDUCED FLUX OF NUCLEIC ACID AND METHOD FOR PREPARING OF AMINO ACID USING THE SAME}

본 발명은 핵산 생합성 경로를 약화시켜 L-라이신(lysine)의 생산능을 향상시키는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 변이 균주 및 이를 이용한 L-라이신의 제조 방법에 관한 것이다.

L-라이신은 사람 혹은 동물의 체내에서 합성이 되지 않는 필수아미노산 중 하나로, 외부로부터 섭취해야 하는 필수 아미노산이다. L-라이신은 주로 식품, 의약품 그리고 사료에의 첨가용으로 널리 사용되고 있으며, 이에 따라 L-라이신을 산업적으로 생산하는 것이 경제적으로 매우 중요한 공정으로 인식되어온 바, 그 생산 효율성을 극대화 하는 방법이 수십년 동안 연구되어 왔다.

1950년대부터 L-라이신의 생합성 경로가 연구된 이래, 현재 대부분이 코리네박테리움 속과 브레비박테리움(Brevibacterium) 속의 미생물을 이용한 발효에 의하여 생산되고 있으며, 이후 꾸준히 L-라이신의 생산량이 증대되어 세계적으로 L-라이신의 시장은 매년 5% 이상 증가하고 있다.

L-라이신의 생산 효율을 개선하기 위한 주된 방법으로는 라이신 생합성 경로의 유전자의 발현을 증가시키기 위하여 해당 유전자의 복사 수를 증가시키거나 유전자의 프로모터를 변형시켜 생합성 경로 상의 효소 활성을 조절하는 방법이 이용되어 왔으며, 이 외에도, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)로부터 시트르산 신타제를 암호화하는 유전자를 도입(일본 특허공보 제(평)7-121228호)하는 등 이종 박테리아 유래 유전자를 도입하는 예도 알려진 바 있다.

한편, 종래의 L-라이신 고생산 균주를 만들기 위하여 중점적으로 연구된 부분 중 하나는 NADPH 공급능 향상에 관한 것이다. 이는 L-라이신을 생합성하기 위하여 세포 내에 필수적으로 충분히 존재해야 하는 보조인자(cofector)로서, 대부분 산화적 오탄당 회로의 활성화에 의하여 그 공급이 증가된다. 이로 인해, 오탄당 회로의 탄소원 흐름을 증가시켜 L-라이신 생합성 과정을 원할하게 해주는 방법등이 널리 연구되었다. 그러나 이러한 방법을 비롯한 종래 기술로는 생산성을 향상시키는데 한계점에 이르렀다. 또한 오탄당 회로의 흐름이 증가된 균주에서는 중심대사 경로를 우회하는 대사 흐름을 거치므로 탄소원에 대한 라이신 수득률 측면에서는 불리할 수 있으며, 이에 오탄당 생합성 경로의 최적화가 요구된다. 따라서, L-라이신 균주의 수율 향상을 위하여 해당 경로의 탄소원 절감이 필요한 실정이다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허 문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

일본 특허공보 제(평)7-121228호

본 발명은 핵산 생합성 경로를 약화시켜 L-라이신의 생산능을 향상시키는 코리네박테리움 속 변이 균주 및 이를 이용하는 L-라이신의 제조 방법에 관한 것으로, 오탄당 회로에서 핵산 드노보(de novo) 생합성 경로로 흐르는 첫번째 효소인 리보포스페이트 피로포스포키나아제(ribo-phosphate-pyrophosphokinase)를 암호화하는 유전자인 prs의 발현을 약화시킴으로써 L-라이신의 생산능을 향상시키는 코리네박테리움 속 변이 균주 및 이를 이용하는 L-라이신의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 일 양태는 리보포스페이트 피로포스포키나아제의 활성이 약화 또는 불활성화되는 L-라이신의 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 변이 균주를 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 변이 균주는 리보포스페이트 피로포스포키나아제를 암호화하는 prs 유전자의 발현이 감소되어 활성이 약화 또는 불활성화되는 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 변이 균주는 prs 유전자의 번역 개시코돈에 위치특이적 변이가 유발되어 prs 유전자의 발현이 감소되는 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 위치특이적 변이는 prs 유전자의 번역 개시 코돈 ATG를 GTG 또는 TTG로 치환함으로써 발생하는 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 코리네박테리움 속 변이 균주는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)일 수 있다.

본 발명의 일 양태는 (a) 제 1 항에 코리네박테리움 속 변이 균주를 배지에서 배양하는 단계; 및 (b) 상기 배양된 변이 균주 및 배양 배지에서 L-라이신을 회수하는 단계를 포함하는 L-라이신의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 코리네박테리움 속 변이 균주는 코리네박테리움 글루타미쿰인 것일 수 있다.

본 발명은 오탄당 회로의 대사흐름 강화를 위한 주요 유전자의 프로모터를 강화시키는 것뿐만 아니라, 경쟁관계의 회로인 중심대사 경로의 효소의 활성을 약화시킨 코리네박테리움 속 변이 균주를 제공하여, 야생형에 비하여 생산 수율을 향상시킴으로써 보다 효율적이고 경제적으로 L-라이신을 제조할 수 있는 효과를 발휘한다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 플라스미드 pCGI의 구조를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 플라스미드 pCGI_A1G의 구조를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 코리네박테리움 속 변이 균주에서 prs 유전자의 대사 경로를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 변이 균주(KPW1 균주)에서의 리보포스페이트 피로포스포키나아제의 활성 변화를 나타낸다.

본 발명자들은 L-라이신 생산성 향상에 있어서 필수 조건인 오탄당 회로 활성화에 따라 수반되는 당 회로의 탄소원 흐름이 증가하는 부분에 착안하여 그 효율을 최적화 하고자 하였다. 오탄당 회로로부터 핵산 생합성 경로로 우회하는 첫번째 효소인 리보포스페이트 피로포스포키나아제의 활성을 약화시킴으로써 탄소흐름을 감소시켜 L-라이신 수율 향상이 가능하다는 점을 발견하고 이에 기인하여 발명을 완성하기에 이르렀다(도 3 참조).

본 명세서에서 사용되는 용어 "활성이 약화"는 세포 내에서 전체적인 효소 활성 정도가 천연형 균주 또는 변형전의 균주에 비하여 낮은 경우, 이들의 조합을 포함하며, 본 명세서에서 사용되는 용어 "불활성화"는 효소 등 단백질을 암호화하는 유전자의 발현이 천연형 균주 또는 변형전의 균주에 비하여 전혀 이루어지지 않는 경우 또는 발현이 되더라도 발현된 단백질의 활성이 없는 경우를 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "발현의 감소"는 유전자의 발현량이 본래의 발현량보다 감소된 것을 의미한다. 미생물에서 발현을 감소시키고자 하는 경우에는 유전자 번역의 개시 코돈을 치환시켜 그 발현을 감소시키거나, 기존에 존재하는 유전자의 발현량이 감소하도록 유전공학적으로 조작할 수 있다. 발현 조절을 위하여 서열을 변형하는 방법은 상기 발현 조절 서열의 핵산 서열에 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현 조절 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 약한 프로모터로 교체하는 등의 방법으로써 수행할 수 있다. 상기 발현 조절서열에는 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사와 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 발현을 감소시키는 유전자가 변이시키고자 하는 미생물 내에 존재하는 경우, 예를 들어, 상기 유전자의 발현을 작동시키는 고유의 프로모터(native promoter)를 약한 프로모터(weak promoter)로 치환 혹은 변이를 도입함으로써 상기 유전자의 발현을 감소시킬 수 있다. 나아가, 기존의 유전자의 전부 또는 일부를 결실시킴으로써 상기 유전자의 발현을 감소시킬 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "일부"는 폴리뉴클레오티드의 서열의 전부 아닌 것을 가리키는 것으로, 1 내지 300개, 바람직하게는 1 내지 100개, 보다 바람직하게는 1 내지 50개일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 prs 유전자의 발현이 감소는 prs 뉴클레오타이드 서열의 치환을 통하여 일어날 수 있으며, 구체적으로는 prs 유전자의 번역 개시 코돈에 위치특이적 변이가 유발되어 나타나는 것일 수 있다. 구체적으로는, 상기 prs 유전자의 번역 개시 코돈에 위치특이적 변이는 prs 유전자의 번역 개시 코돈 ATG을 GTG 또는 TTG로, 바람직하게는 GTG로 치환함으로써 일어날 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 코리네박테리움 속 변이 균주를 제작하기 위하여는 형질전환이 되지 않은 코리네박테리움 속 균주로부터 형질전환된 코리네박테리움 속 균주를 분리 및 수득하는 단계를 포함한다.

본 발명에서, 상기 형질전환된 균주를 분리 및 수득하는 단계를 실시하는데 있어서 선택 표지된 벡터를 이용할 수 있고, 본 발명에서 이용하는 선택표지는 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 구체적으로는 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자를 포함하며, 바람직하게는 암피실린, 카나마이신 내성 유전자, 보다 바람직하게는 카나마이신 내성 유전자이나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 이용하는 벡터는 플라스미드, 파지(phage) 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 코리네박테리움 속 균주는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 아세토액시도필럼(Corynebacterium acetoacidophilum), 코리네박테리움 아세토글루타미쿰(Corynebacterium acetoglutamicum), 코리네박테리움 알카노리티쿰(Corynebacterium alkanolyticum), 코리네박테리움 칼루내(Corynebacterium callunae), 코리네박테리움 릴리움(Corynebacterium lilium), 코리네박테리움 멜라쎄콜라(Corynebacterium melassecola), 코리네 박테리움 써모아미노게네스(Corynebacterium thermoaminogenes), 코리네박테리움 에피시엔스(Corynebacterium efficiens), 코리네박테리움 헤르쿨리스(Corynebacterium herculis) 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 상기 코리네박테리움 속 균주는 코리네박테리움 글루타미쿰이며, 구체적으로는 기탁번호 KTCC13032 (K070)의 기탁 균주일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 양상은 (a) 본 발명에 따른 코리네박테리움 변이 균주를 배지에서 배양하는 단계; 및 (b) 상기 배양된 균주 및 배양 배지에서 L-라이신을 회수하는 단계를 포함하는 L-라이신의 제조 방법을 제공한다.

본 발명에 이용되는 균주는 당업계에 공지된 배양 방법을 통해 배양될 수 있다. 배지로는 천연배지 또는 합성배지를 사용할 수 있다. 배지의 탄소원으로는 예를 들어 글루코오스, 수크로오스, 덱스트린, 글리세롤, 녹말 등이 사용될 수 있고, 질소원으로는 펩톤, 육류 추출물, 효모 추출물, 건조된 효모, 대두 케이크, 우레아, 티오우레아, 암모늄염, 나이트레이트 및 기타 유기 또는 무기 질소-함유 화합물이 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

배지에 포함되는 무기염으로는 마그네슘, 망간, 포타슘, 칼슘, 철 등의 포스페이트, 나이트레이트, 카보네이트, 클로라이드 등이 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 탄소원, 질소원 및 무기염의 성분 이외에 아미노산, 비타민, 핵산 및 그와 관련된 화합물들이 배지에 첨가될 수 있다.

배양물의 온도는 27 내지 40℃, 보다 바람직하게는 30 내지 37℃일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 배양 기간은 유용 물질의 원하는 생산량이 수득될 때까지 계속될 수 있으며, 바람직하게는 10 내지 100 시간일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 L-라이신을 회수하는 단계는 본 발명의 미생물의 배양 방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 기술 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양액으로부터 목적하는 L-라이신을 회수할 수 있으며, 상기 회수 단계는 정제 공정을 포함할 수 있다.

이하, 하나 이상의 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

아래 실시예에서 특별한 언급이 없는 방법은 일반적으로 사용되는 분자생물학적인 방법을 사용하였다. 예를 들면, 플라스미드 DNA 분리, 제한 효소 처리, 연결(ligation), 표준 형질전환 등은 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbour Laboratories, USA] 등에 기재되어 있으며, 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

실시예 1. 재조합 벡터의 제작

균주의 오탄당 회로에서 리보포스페이트 피로포스포키나아제를 약화시키기 위하여, prs 유전자의 개시코돈을 ATG 에서 GTG로 치환시키기 위한 재조합 벡터를 제조하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 게놈 상에서 prs 유전자 개시코돈 ATG에서 A를 중심으로 좌측암 500 bp 부분과 우측암 500 bp 부분을 PCR로 증폭하여 오버랩 PCR(overlap PCR) 방법으로 연결한 후 재조합 벡터인 pCGI(문헌[Kim et al., Journal of Microbiological Methods 84 (2011) 128-130] 참조)에 클로닝하였다. 상기 플라스미드를 pCGIprs(A1G)라고 명명하고, 도 2에 나타내었다. 상기 플라스미드를 제작하기 위하여 각각의 유전자 단편을 하기 표 1의 프라이머를 사용하였다.

이상의 프라이머를 이용하여 아래의 조건 하에 PCR을 수행하였다. Thermocycler(TP600, TAKARA BIO Inc., 일본)를 이용하여 각각의 데옥시뉴클레오타이드 트리포스페이트(dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 100 μM가 첨가된 반응액에 올리고뉴클레오타이드 1 pM, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 염색체 DNA 10 ng을 템플레이트로 이용하여, pfu-X DNA 폴리머라제 혼합물(솔젠트 사) 1 유닛의 존재 하에 25 내지 30주기 수행하였다.

PCR은 (i) 변성(denaturation) 단계 : 94 ℃에서 30 초, (ii) 결합(annealing) 단계 : 55 ℃에서 30 초, 및 (iii) 확장(extension) 단계 : 72 ℃에서 1 내지 2 분(1 kb당 2 분의 중합시간 부여)의 조건에서 실시하였다.

이와 같이 제조된 유전자단편을 제한효소(HindIII/EcoR1)를 이용하여, pCGI 벡터에 클로닝하였다. 상기 벡터를 대장균(E. coli) DH5a에 형질전환시키고, 50 ㎍/㎖의 카나마이신(kanamycin)을 함유하는 LB-한천플레이트 상에 도말하여, 37℃에서 24시간 배양하였다. 최종 형성되는 콜로니를 분리하여 삽입물(insert)이 정확히 벡터에 존재하는지 확인한 후, 이 벡터를 분리하여 코리네박테리움 글루타미쿰 균주의 재조합에 사용하였다.

상기 방법에서 공통적으로 진행된 과정으로서, 해당 유전자들의 증폭은 코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum) ATCC 13032 genomic DNA로부터 PCR 방법으로 증폭하여 전략에 따라 적합한 제한효소로 절단한 후, pCGI 벡터에 삽입하여 E. coli DH5a에서 선별하였다. 염색체의 유전자 염기 치환(Chromosomal base substitution)은 각각 단편의 유전자를 개별 증폭하여 오버랩 PCR로 목적 DNA 단편을 제조하였다. 유전자 조작 시 PCR 증폭 효소로는 Ex Taq 중합효소(Takara), Pfu 중합효소(Solgent)를 이용하였고, 각종 제한효소 및 DNA modifying 효소는 NEB 제품을 사용하였으며, 공급된 버퍼 및 프로토콜에 따라 사용하였다.

실시예 2. 변이 균주의 제조

상기 pCGIprs(A1G) 벡터를 이용하여 변이 균주인 KPW1 균주를 제조하였다. 상기 벡터의 최종 농도가 1 ㎍/㎕ 이상 되도록 준비하여 코리네박테리움 글루타미쿰 K070 균주(기탁번호 : KTCC13032)에 전기천공법(문헌[Tauch et al., FEMS Microbiology letters 123 (1994) 343-347] 참조)을 사용하여 1차 재조합을 유도하였다. 이때, 전기천공한 균주를 카나마이신이 20 ㎍/㎕ 포함되는 LB-한천플레이트에 도말하여 콜로니를 분리한 후 게놈상의 유도한 위치에 적절히 삽입되었는지 PCR 및 염기서열 분석을 통해 확인하였다. 이렇게 분리된 균주를 다시 2차 재조합을 유도하기 위하여 스트렙토마이신(streptomycine)을 함유한 LB-한천액체배지에 접종하고, 하룻밤 이상 배양하여 동일 농도의 스트렙토마이신(streptomycine)를 함유한 한천배지에 도말하여 콜로니를 분리하였다. 최종 분리한 콜로니 중에서 카나마이신에 대한 내성 여부를 확인한 후, 항생제 내성이 없는 균주들 중 prs 유전자의 개시코돈이 GTG로 치환되었는지 염기서열 분석을 통해 확인하였다(문헌[Schafer et al., Gene 145 (1994) 69-73] 참조).

실험예 1. 변이 균주의 L-라이신 생산능 확인

상기 실시예 2에서 수득한 코리네박테리움 글루타미쿰 KPW1균주의 L-라이신 생산능의 향상 여부를 판단하기 위하여 L-라이신의 생산량 증가 정도를 측정하였다. 이를 위하여 LB-한천플레이트에서 KPW1 균주를 40 시간 동안 배양하고, 이를 생산 배지에 옮겨 접종하였다. 이때, 주 배지는 동일한 100 ㎖ 배플 플라스크(baffle flask)에 10 ㎖의 배지를 준비하여 접종하였으며, 사용된 배지는 하기 표 2에 나타내었다. 상기 배양물을 180 rpm의 회전식 진탕기에서 30 ℃, 44시간 동안 배양하였다. 최종적으로 배양물의 상등액에서 L-라이신의 함량을 측정하였으며, 실험 결과는 하기 표 3에 나타내었다.

상기 실험 결과, 본 발명에 따른 KPW1 균주는 K070 균주와 비교하여, L-라이신의 생산량이 2.7g/L (약 3.9%) 증가되고, 단위 균체당 생산량이 0.25g/gDCW (약 5.24%) 증가되었음을 확인할 수 있었다.

실험예 2. 효소의 활성 측정

상기 실시예 2에서 수득한 코리네박테리움 글루타미쿰 KPW1 균주는 prs 유전자의 개시코돈이 GTG 형태로 치환되어 그 발현을 감소시키고자 한 것으로, 이로 인하여 유도된 바에 의하면 해당 유전자에 의해 만들어지는 리보포스페이트 피로포스포키나아제의 활성 또한 변화될 것이라는 예상이 가능하였다. 이를 확인하기 위하여, K070 균주 및 KPW1 균주를 50l 발효조에서 배양시키고, 대수증식기에 채취한 샘플을 이용하여 효소 활성을 측정하였다.

상기 실험 결과, 본 발명에 따른 KPW1 균주에서 리보포스페이트 피로포스포키나아제의 활성이 K070에서의 활성에 비하여 약 40% 감소 하였음을 확인할 수 있었다(도 4 참조).

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로, 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> Daesang Corporation <120> MUTANT STRAIN WITH ENHANCED AMINO ACID PRODUCTION VIA REDUCED FLUX OF NUCLEIC ACID AND METHOD FOR PREPARING OF AMINO ACID USING THE SAME <130> PN160217 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> prs primer (forward) <400> 1 ctagaagctt acccacggtt tcgactccac 30 <210> 2 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> prs primer (reverse) <400> 2 tgtttccagt gagcagtcac gaggatcctg cttagccttc 40 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> prs primer (forward) <400> 3 gtgactgctc actggaaaca 20 <210> 4 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> prs primer (reverse) <400> 4 gtacgaattc ctagttttcc ttgatgtgat c 31

Claims

리보포스페이트 피로포스포키나아제(ribo-phosphate-pyrophosphokinase)를 암호화하는 prs 유전자의 발현이 감소되어 리보포스페이트 피로포스포키나아제의 활성이 약화 또는 불활성화되는 L-라이신의 생산능을 가지는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 변이 균주.
삭제
제 1 항에 있어서,
상기 변이 균주는 prs 유전자의 번역 개시코돈에 위치특이적 변이가 유발되어 prs 유전자의 발현이 감소되는 것인 코리네박테리움 속 변이 균주.
제 3 항에 있어서,
상기 위치특이적 변이는 상기 prs 유전자의 번역 개시코돈 ATG를 GTG 또는 TTG로 치환함으로써 발생하는 것인 코리네박테리움 속 변이 균주.
제 1 항에 있어서,
상기 코리네박테리움 속 변이 균주는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)인 것인 코리네박테리움 속 변이 균주.
(a) 제 1 항의 코리네박테리움 속 변이 균주를 배지에서 배양하는 단계; 및
(b) 상기 배양된 변이 균주 및 배양 배지에서 L-라이신을 회수하는 단계
를 포함하는 L-라이신의 제조 방법.
제 6 항에 있어서,
상기 변이 균주는 prs 유전자의 번역 개시코돈에 위치특이적 변이가 유발되어 prs 유전자의 발현이 감소되는 것인 L-라이신의 제조 방법.
제 6 항에 있어서,
상기 코리네박테리움 속 변이 균주는 코리네박테리움 글루타미쿰인 것인 L-라이신의 제조 방법.