KR101869642B1

KR101869642B1 - 핵산 대사 경로가 약화된 l-글루타민 고생산능 변이 균주 및 이를 이용하는 l-글루타민의 제조 방법

Info

Publication number: KR101869642B1
Application number: KR1020170023787A
Authority: KR
Inventors: 홍인표; 김봉기; 최민진; 김석수
Original assignee: 대상 주식회사
Priority date: 2017-02-22
Filing date: 2017-02-22
Publication date: 2018-06-20

Abstract

본 발명은 핵산 생합성 경로를 약화시켜 L-글루타민(glutamine)의 생산능을 향상시키는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 변이 균주 및 이를 이용하는 L-글루타민의 제조 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 리보포스페이트 피로포스포키나아제를 암호화하는 prsA 유전자의 개시코돈을 치환하여 약화 또는 불활성화시킴으로써 L-글루타민 생산능을 향상시키는 코리네박테리움 속 균주 및 이를 이용하는 L-글루타민의 제조 방법을 제공한다.

Description

핵산 대사 경로가 약화된 L-글루타민 고생산능 변이 균주 및 이를 이용하는 L-글루타민의 제조 방법{MUTANT STRAIN WITH ENHANCED L-GLUTAMINE PRODUCTION VIA REDUCED FLUX OF NUCLEIC ACID AND METHOD FOR PREPARING OF L-GLUTAMINE USING THE SAME}

본 발명은 핵산 생합성 경로를 약화시켜 L-글루타민(glutamine)의 생산능을 향상시키는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 변이 균주 및 이를 이용하는 L-글루타민의 제조 방법에 관한 것이다.

L-글루타민은 L-글루타민산 계열 아미노산의 일종으로, 세포재생능력에 효과가 있는 것으로 확인되면서 화장품 원료로서 수요가 증가하고 있으며, 이의 노화방지 효과에 대한 연구도 계속되고 있다. 또한, L-글루타민은 영양제, 소화기궤양 치료제, 알콜중독 치료제, 뇌기능 향상제 등 의약용으로 꾸준히 활용되고 있다. 한편, L-글루타민은 원래 필수아미노산이 아닌 것으로 분류되어 왔으나, 근래에 들어 필수아미노산의 기능성을 갖게 되는 컨디셔날 필수아미노산(Conditional Essential Amino acid)으로 확인되어 그 중요성이 한층 강조되고 있는 실정이다.

L-글루타민의 생산 효율을 개선하기 위한 주된 방법으로는 글루타민 생합성 경로의 유전자의 발현을 증가시키기 위하여 해당 유전자의 복사 수를 증가시키거나 유전자의 프로모터를 변형시켜 생합성 경로 상의 효소 활성을 조절하는 방법이 이용되어 왔으며, 이 외에도, 브리비박테리움 락토퍼멘텀 (Brevibacterium 　 lactofermentum)으로부터 글루타메이트 디하이드로게나제를 암호화하는 유전자를 도입(한국 등록특허 제10-0196689호)하는 등의 예가 알려진 바 있다. 그러나, 핵산 생합성 경로 상에서 글루타민의 이용을 감소시킴으로써 해당 아미노산의 생산 효율을 개선하는 방법에 대한 연구는 부족한 실정이다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허 문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

한국 등록특허 제10-0196689호

본 발명은 핵산 생합성 경로를 약화시켜 L-글루타민(glutamine)의 생산능을 향상시키는 코리네박테리움 속 변이 균주 및 이를 이용하는 L-글루타민의 제조 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 리보포스페이트 피로포스포키나아제를 암호화하는 prsA 유전자의 개시코돈을 치환하여 활성을 약화 또는 불활성화시킴으로써 포스포리보실 피로포스페이트(phosphoribosyl pyrophosphate, PRPP)의 공급을 저해하고, 이로써 L-글루타민 생산능을 향상시키는 코리네박테리움 속 균주 및 이를 이용하는 L-글루타민의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 일 양상은 리보포스페이트 피로포스포키나아제의 활성이 약화 또는 불활성화되는 L-글루타민의 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 변이 균주를 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 변이 균주는 리보포스페이트 피로포스포키나아제를 암호화하는 prsA 유전자의 발현이 감소되어 활성이 약화 또는 불활성화되는 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 변이 균주는 prsA 유전자의 번역 개시코돈에 위치특이적 변이가 유발되어 prsA 유전자의 발현이 감소되는 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 위치특이적 변이는 상기 prsA 유전자의 번역 개시코돈 ATG를 GTG로 치환하는 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 코리네박테리움 속 균주는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)일 수 있다.

본 발명의 일 양상은 (a) 상기 코리네박테리움 속 변이 균주를 배지에서 배양하는 단계; 및 (b) 상기 배양된 변이 균주 및 배양 배지에서 L-글루타민을 회수하는 단계를 포함하는 L-글루타민의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 코리네박테리움 속 균주는 코리네박테리움 글루타미쿰일 수 있다.

본 발명은 중심대사 경로와 경쟁관계의 회로인 핵산 생합성 경로의 효소 활성을 약화시킨 코리네박테리움 속 변이 균주를 제공하여, 야생형에 비하여 생산 수율을 향상시킴으로써 보다 효율적이고 경제적으로 L-글루타민을 제조할 수 있는 효과를 발휘한다.

도 1은 모주(KFCC-10694 균주) 및 본 발명의 일 실시예에 따른 변이 균주(prsA::a1G 균주)에서의 prsA 유전자에서 발현된 리보포스페이트 피로포스포키나아제 활성을 확인한 결과를 나타낸다.
도 2 및 3은 실험실 수준(Flask) 및 소규모 공정 수준(30L 발효기)에서 본 발명의 일 실시예에 따른 변이 균주의 글루타민 생산능을 나타낸다.

본 발명의 일 양태는 리보포스페이트 피로포스포키나아제의 활성이 약화 또는 불활성화되는 L-글루타민의 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 변이 균주를 제공한다.

본 발명자들은 L-글루타민 생산성 향상에 있어서 핵산 생합성 경로로 우회하는 첫번째 효소인 리보포스페이트 피로포스포키나아제의 활성을 약화시킴으로써 탄소흐름을 감소시켜 L-글루타민 수율 향상이 가능하다는 점을 발견하고 이에 기인하여 발명을 완성하기에 이르렀다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 변이 균주는 리보포스페이트 피로포스포키나아제를 암호화하는 prsA 유전자의 발현이 감소되어 활성이 약화 또는 불활성화되고, 이로써 포스포리보실 피로포스페이트(PRPP)의 공급을 저해시킴으로써 L-글루타민이 핵산 생합성 경로에서 소비되는 것을 방지하여 이의 생산능을 향상시킬 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "활성이 약화"는 세포 내에서 전체적인 효소 활성 정도가 야생형 균주 또는 변형전의 균주에 비하여 낮은 경우, 이들의 조합을 포함하며, 본 명세서에서 사용되는 용어 "불활성화"는 효소 등 단백질을 암호화하는 유전자의 발현이 야생형 균주 또는 변형전의 균주에 비하여 전혀 이루어지지 않는 경우 또는 발현이 되더라도 발현된 단백질의 활성이 없는 경우를 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "발현의 감소"는 유전자의 발현량이 본래의 발현량보다 감소된 것을 의미한다. 미생물에서 발현을 감소시키고자 하는 경우에는 유전자 번역의 개시 코돈을 치환시켜 그 발현을 감소시키거나, 기존에 존재하는 유전자의 발현량이 감소하도록 유전공학적으로 조작할 수 있다. 발현 조절을 위하여 서열을 변형하는 방법은 상기 발현 조절 서열의 핵산 서열에 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현 조절 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 약한 프로모터로 교체하는 등의 방법으로써 수행할 수 있다. 상기 발현 조절서열에는 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사와 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 발현을 감소시키는 유전자가 변이시키고자 하는 미생물 내에 존재하는 경우, 예를 들어, 상기 유전자의 발현을 작동시키는 고유의 프로모터(native promoter)를 약한 프로모터(weak promoter)로 치환 혹은 변이를 도입함으로써 상기 유전자의 발현을 감소시킬 수 있다. 나아가, 기존의 유전자의 전부 또는 일부를 결실시킴으로써 상기 유전자의 발현을 감소시킬 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "일부"는 폴리뉴클레오티드의 서열의 전부 아닌 것을 가리키는 것으로, 1 내지 300개, 바람직하게는 1 내지 100개, 보다 바람직하게는 1 내지 50개일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 prsA 유전자의 발현 감소는 prsA 뉴클레오타이드 서열의 치환을 통하여 일어날 수 있으며, 구체적으로는 prsA 유전자의 번역 개시 코돈에 위치특이적 변이가 유발되어 나타나는 것일 수 있다. 구체적으로는, 상기 prsA 유전자의 번역 개시 코돈의 위치특이적 변이는 prsA 유전자의 번역 개시 코돈 ATG을 GTG 또는 TTG로, 바람직하게는 GTG로 치환함으로써 일어날 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 코리네박테리움 속 변이 균주를 제작하기 위하여는 형질전환이 되지 않은 코리네박테리움 속 균주로부터 형질전환된 코리네박테리움 속 균주를 분리 및 수득하는 단계를 포함한다.

본 발명에서, 상기 형질전환된 균주를 분리 및 수득하는 단계를 실시하는데 있어서 선택 표지된 벡터를 이용할 수 있고, 본 발명에서 이용하는 선택표지는 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 구체적으로는 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자를 포함하며, 바람직하게는 암피실린, 카나마이신 내성 유전자, 보다 바람직하게는 카나마이신 내성 유전자이나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 이용하는 벡터는 플라스미드, 파지(phage) 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 코리네박테리움 속 균주는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes ), 코리네박테리움 아세토액시도필럼(Corynebacterium acetoacidophilum), 코리네박테리움 아세토글루타미쿰(Corynebacterium acetoglutamicum), 코리네박테리움 알카노리티쿰(Corynebacterium alkanolyticum), 코리네박테리움 칼루내(Corynebacterium callunae), 코리네박테리움 릴리움(Corynebacterium lilium), 코리네박테리움 멜라쎄콜라(Corynebacterium melassecola), 코리네 박테리움 써모아미노게네스(Corynebacterium thermoaminogenes), 코리네박테리움 에피시엔스(Corynebacterium efficiens), 코리네박테리움 헤르쿨리스(Corynebacterium herculis) 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 상기 코리네박테리움 속 균주는 코리네박테리움 글루타미쿰이며, 구체적으로는 기탁번호 KFCC-10694의 기탁 균주일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 양상은 (a) 본 발명에 따른 코리네박테리움 변이 균주를 배지에서 배양하는 단계; 및 (b) 상기 배양된 균주 및 배양 배지에서 L-글루타민을 회수하는 단계를 포함하는 L-글루타민의 제조 방법을 제공한다.

본 발명에 이용되는 균주는 당업계에 공지된 배양 방법을 통해 배양될 수 있다. 배지로는 천연배지 또는 합성배지를 사용할 수 있다. 배지의 탄소원으로는 예를 들어 글루코오스, 수크로오스, 덱스트린, 글리세롤, 녹말 등이 사용될 수 있고, 질소원으로는 펩톤, 육류 추출물, 효모 추출물, 건조된 효모, 대두 케이크, 우레아, 티오우레아, 암모늄염, 나이트레이트 및 기타 유기 또는 무기 질소-함유 화합물이 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

배지에 포함되는 무기염으로는 마그네슘, 망간, 포타슘, 칼슘, 철 등의 포스페이트, 나이트레이트, 카보네이트, 클로라이드 등이 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 탄소원, 질소원 및 무기염의 성분 이외에 아미노산, 비타민, 핵산 및 그와 관련된 화합물들이 배지에 첨가될 수 있다.

배양물의 온도는 27 내지 40, 보다 바람직하게는 30 내지 37일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 배양 기간은 유용 물질의 원하는 생산량이 수득될 때까지 계속될 수 있으며, 바람직하게는 10 내지 100 시간일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 L-글루타민을 회수하는 단계는 본 발명의 미생물의 배양 방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 기술 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양액으로부터 목적하는 L-글루타민을 회수할 수 있으며, 상기 회수 단계는 정제 공정을 포함할 수 있다.

이하 하나 이상의 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 재조합 벡터의 제작

균주의 핵산 생합성 경로에서 리보포스페이트 피로포스포키나아제를 약화시키기 위하여, prsA 유전자의 개시코돈을 ATG 에서 GTG로 치환시킨 재조합 벡터를 제조하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 게놈 상에서 prsA 유전자 개시코돈 ATG에서 A를 중심으로 좌측암 618 bp 부분과 우측암 797 bp 부분을 PCR로 증폭하여 오버랩 PCR(overlap PCR) 방법으로 연결한 후 재조합 벡터인 pCGI(문헌[Kim et al., Journal of Microbiological Methods 84 (2011) 128-130] 참조)에 클로닝하였다. 상기 플라스미드를 pCGIprs(a1G)라고 명명하였다. 상기 플라스미드를 제작하기 위하여 각각의 유전자 단편을 하기 표 1의 프라이머를 사용하여 증폭하였다.

프라이머			서열번호
prsA 좌측암 단편 증폭 프라이머	정방향	5'-cagctcaaggatgcaact-3'	1
prsA 좌측암 단편 증폭 프라이머	역방향	5'-tgtttccagtgagcagtcacgagagtctgcttagccttcc-3'	2
prsA 우측암 단편 증폭 프라이머	정방향	5'-ggaaggctaagcagactctcgtgactgctcactggaaaca-3'	3
prsA 우측암 단편 증폭 프라이머	역방향	5'-ggatcagagaacacaccg-3'	4

이상의 프라이머를 이용하여 아래의 조건 하에 PCR을 수행하였다. Thermocycler(TP600, TAKARA BIO Inc., 일본)를 이용하여 각각의 데옥시뉴클레오타이드 트리포스페이트(dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 100 μM가 첨가된 반응액에 올리고뉴클레오타이드 1 pM, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 염색체 DNA 10 ng을 템플레이트로 이용하여, pfu-X DNA 폴리머라제 혼합물(솔젠트 사) 1 유닛의 존재 하에 25 내지 30주기 수행하였다.

PCR은 (i) 변성(denaturation) 단계 : 94 에서 30 초, (ii) 결합(annealing) 단계 : 55 에서 30 초, 및 (iii) 확장(extension) 단계 : 72 에서 1 내지 2 분(1 kb당 2 분의 중합시간 부여)의 조건에서 실시하였다.

이와 같이 제조된 유전자단편을 제한효소(HindIII/EcoR1)를 이용하여, pCGI 벡터에 클로닝하였다. 상기 벡터를 대장균(E. coli) DH5a에 형질전환시키고, 50 ㎍/㎖의 카나마이신(kanamycin)을 함유하는 LB-한천플레이트 상에 도말하여, 37에서 24시간 배양하였다. 최종 형성되는 콜로니를 분리하여 삽입물(insert)이 정확히 벡터에 존재하는지 확인한 후, 이 벡터를 분리하여 코리네박테리움 글루타미쿰 균주의 재조합에 사용하였다.

상기 방법에서 공통적으로 진행된 과정으로서, 해당 유전자들의 증폭은 코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum) ATCC 13032 genomic DNA로부터 PCR 방법으로 증폭하여 전략에 따라 적합한 제한효소로 절단한 후, pCGI 벡터에 삽입하여 E. coli DH5a에서 선별하였다. 염색체의 유전자 염기 치환(Chromosomal base substitution)은 각각 단편의 유전자를 개별 증폭하여 오버랩 PCR로 목적 DNA 단편을 제조하였다. 유전자 조작 시 PCR 증폭 효소로는 Ex Taq 중합효소(Takara), Pfu 중합효소(Solgent)를 이용하였고, 각종 제한효소 및 DNA modifying 효소는 NEB 제품을 사용하였으며, 공급된 버퍼 및 프로토콜에 따라 사용하였다.

실시예 2. 변이 균주의 제조

상기 pCGIprs(a1G) 벡터를 이용하여 변이 균주(prsA::alG)를 제조하였다. 상기 벡터의 최종 농도가 1㎍/㎕ 이상 되도록 준비하여 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC-10694에 전기천공법(문헌[Tauch et al., FEMS Microbiology letters 123 (1994) 343-347] 참조)을 사용하여 1차 재조합을 유도하였다. 이때, 전기천공한 균주를 카나마이신이 20㎍/㎕ 포함되는 LB-한천플레이트에 도말하여 콜로니를 분리한 후 게놈상의 유도한 위치에 적절히 삽입되었는지 PCR 및 염기서열 분석을 통해 확인하였다. 이렇게 분리된 균주를 다시 2차 재조합을 유도하기 위하여 스트렙토마이신(streptomycine) 40㎍/㎕ 농도로 함유한 LB-한천액체배지에 접종하고, 하룻밤 이상 배양하여 동일 농도의 스트렙토마이신(streptomycine)를 함유한 한천플레이트에 도말하여 콜로니를 분리하였다. 최종 분리한 콜로니 중에서 카나마이신에 대한 내성 여부를 확인한 후, 항생제 내성이 없는 균주를 선별하여 prsA 유전자의 개시코돈이 GTG로 치환되었는지 염기서열 분석을 통해 확인하였다(문헌[Schafer et al., Gene 145 (1994) 69-73] 참조).

실험예 1. 리보포스페이트 피로포스포키나아제 효소의 활성 측정

prsA 유전자의 발현 감소에 의해 리보포스페이트 피로포스포키나아제 효소의 활성이 감소여부를 확인하고자 NovoCIB사(FRANCE)의 PRECICE® PRPP Assay법에 준하여 실험을 수행하였다.

실험 결과, 상기 실시예 2에 따른 균주에서 prsA 유전자의 발현감소 유도에 따른 리보포스페이트 피로포스포키나아제 효소의 활성이 모주 (코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC-10694 균주)에 비하여 약 57%수준으로 감소함을 확인하였다(도 1 참조).

실험예 2. 100㎖ 플라스크를 사용한 글루타민 생산능 확인

상기 모주 및 실시예 2 에서 제작된 균주를 이용하여 생산능의 강화 정도를 확인 및 비교하였다.

평가를 위하여, 각 균주를 LB 고체 배지에서 밤새 배양하고, 하기 표 2의 조성을 갖는 배지 10㎖이 담긴 100㎖의 플라스크에 접종하였다. 균주 접종 후 72시간 동안 배양하고, 그로부터 수득된 L-글루타민의 농도를 측정하였다(하기 표 3 및 도 2 참조).

성분	플라스크 배지 농도
포도당	8%
HVP	1%
비프 추출물	0.05%
요소	0.15%
(NH₄)₂SO₄	4.41%
비오틴	1.5 μg/L
티아민-HCl	2000 μg/L
시스테인-HCl	200 mg/L
M-100	200 mg/L
CaCl₂	0.25%
MgSO₄	0.05%
FeSO₄	10 ppm
MnSO₄	10 ppm
ZnSO₄	20 ppm
KH₂PO₄	0.05%
K₂HPO₄	0.05%
CaCO₃	0.5%

	GLN상대함량(%)	상대수율(%)	GLN(%)	대당수율(%)
모주	100	100	2.58	37.1
prsA::a1G	142	135	3.71	50.1

상기 실험 결과, 상기 표 3에 나타난 바와 같이, 본 발명의 prsA 유전자의 개시코돈을 대체한 경우, 글루타민 생산량은 모주에 비하여 약 43.8% 향상되었고, 대당수율은 약 35.0% 향상되었다.

따라서, 본 발명에서 유전자의 개시코돈을 치환하여 리보포스페이트 피로포스포키나아제를 약화시킴에 따라, PRPP의 양이 감소함으로써 결과적으로 L-글루타민의 생산능이 증가된 것을 확인할 수 있었다.

실험예 3. 30L 배양기를 사용한 글루타민 생산능 확인

평가를 위하여, 각 균주를 LB 고체 배지에서 밤새 배양하고, 하기 표 4의 조성을 갖는 배지가 담긴 30L의 Jar 발효기에 접종하였다. 균주 접종 후 76시간 동안 배양하고, 그로부터 수득된 L-글루타민의 농도를 측정하였다(하기 표 5 및 도 3 참조).

성분	사입 배지 농도
포도당	20%
HVP	2.5%
CSP	0.208%
(NH₄)₂SO₄	0.930%
비오틴	1 μg/L
티아민-HCl	2000 μg/L
시스테인-HCl	700 mg/L
M-100	360 mg/L
CaCl₂	0.1%
MgSO₄	0.088%
FeSO₄	20 ppm
MnSO₄	24 ppm
ZnSO₄	60 ppm
KH₂PO₄	0.162%
K₂HPO₄	0.107%

	GLN상대함량(%)	상대수율(%)
모주	100	100
prsA::a1G	142	135

상기 실험 결과, 상기 표 5에 나타난 바와 같이, 본 발명의 prsA 유전자의 개시코돈을 대체한 경우, 글루타민 생산량은 모주에 비하여 약 42.3% 향상되었고, 대당수율은 약 34.5% 향상되었다.

따라서, 본 발명에서 prsA 유전자의 개시코돈을 치환하여 리보포스페이트 피로포스포키나아제를 약화시킴에 따라, PRPP의 양이 감소함으로써 결과적으로 L-글루타민의 생산능이 증가된 것을 확인할 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로, 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> Daesang Corporation <120> MUTANT STRAIN WITH ENHANCED L-GLUTAMINE PRODUCTION VIA REDUCED FLUX OF NUCLEIC ACID AND METHOD FOR PREPARING OF L-GLUTAMINE USING THE SAME <130> PN160281 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> prsA primer (forward) <400> 1 cagctcaagg atgcaact 18 <210> 2 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> prsA primer (reverse) <400> 2 tgtttccagt gagcagtcac gagagtctgc ttagccttcc 40 <210> 3 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> prsA primer (forward) <400> 3 ggaaggctaa gcagactctc gtgactgctc actggaaaca 40 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> prsA primer (reverse) <400> 4 ggatcagaga acacaccg 18

Claims

리보포스페이트 피로포스포키나아제(ribo-phosphate-pyrophosphokinase)를 암호화하는 prsA 유전자의 발현이 감소되어 리보포스페이트 피로포스포키나아제의 활성이 약화 또는 불활성화되는 L-글루타민의 생산능을 가지는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 변이 균주.
삭제
제 1 항에 있어서,
상기 변이 균주는 prsA 유전자의 번역 개시코돈에 위치특이적 변이가 유발되어 prsA 유전자의 발현이 감소되는 것인 코리네박테리움 속 변이 균주.
제 3 항에 있어서,
상기 위치특이적 변이는 상기 prsA 유전자의 번역 개시코돈 ATG를 GTG로 치환하는 것인 코리네박테리움 속 변이 균주.
제 1 항에 있어서,
상기 코리네박테리움 속 균주는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)인 것인 코리네박테리움 속 변이 균주.
(a) 제 1 항에 따른 코리네박테리움 속 변이 균주를 배지에서 배양하는 단계; 및
(b) 상기 배양된 변이 균주 및 배양 배지에서 L-글루타민을 회수하는 단계
를 포함하는 L-글루타민의 제조 방법.
제 6 항에 있어서,
상기 변이 균주는 prsA 유전자의 번역 개시코돈에 위치특이적 변이가 유발되어 prsA 유전자의 발현이 감소되는 것인 L-글루타민의 제조 방법.
제 6 항에 있어서,
상기 코리네박테리움 속 균주는 코리네박테리움 글루타미쿰인 것인 L-글루타민의 제조 방법.