CN108660103A - 一种高产l-丙氨酸的基因工程菌及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物工程技术领域，具体公开一种高产L‑丙氨酸的基因工程菌及其构建方法。所述高产L‑丙氨酸的基因工程菌，保藏号为CGMCC No.15180，具有发酵产生高浓度L‑丙氨酸的能力，其是通过敲除大肠杆菌染色体的丙氨酸消旋酶基因、D‑乳酸脱氢酶基因、丙酮酸甲酸裂解酶基因、磷酸乙酰转移酶基因及乙酸激酶基因后，将人工合成的L‑丙氨酸脱氢酶基因与L‑丙氨酸外运蛋白基因整合到大肠杆菌染色体上得到。本发明提供的高产L‑丙氨酸的基因工程菌，使更多的葡萄糖用于合成丙氨酸，提高基因表达效率，增加丙氨酸积累量，提高最终丙氨酸的产量。

Description

一种高产L-丙氨酸的基因工程菌及其构建方法

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种高产L-丙氨酸的基因工程菌及其构建方法。

背景技术

L-丙氨酸在食品和医药领域有着广泛的用途。在食品领域，L-丙氨酸的添加可明显提高食品及饮料中的蛋白质利用率，食用后能迅速恢复疲劳，振奋精神。L-丙氨酸可提高腌制品的腌制效果并改善风味，提高含醇饮料的质量等。 L-丙氨酸具有独特的改善风味效果，它与其它氨基酸配合能加强食品、饮料风味。它还可以改善有机酸的酸味，添加后能使有机酸更接近天然果酸的酸味。在医药领域，L-丙氨酸是合成维生素B6的重要原料，同时也是营养剂补糖氨基酸营养输液的主要成分。由L-丙氨酸组成的复合氨基酸注射液-《14氨基酸注射液-800》是主治肝脑病新药，可治疗肝功能不全时氨基酸代谢紊乱，促使肝昏迷病人苏醒。L-丙氨酸还是一种很好的利尿药。

目前L-丙氨酸的生产是以天门冬氨酸为原料，通过酶催化技术(天冬氨酸脱羧酶)来生产。由于天冬氨酸的生产是以顺酐为原料的，因此L-丙氨酸的生产成本及售价严重依赖于石油价格。而微生物发酵法生产L-丙氨酸和酶催化技术相比有诸多优点：首先，用葡萄糖代替天冬氨酸作为生产原料。酶催化技术以天冬氨酸为原材料。目前天冬氨酸的生产是以顺酐为原料，顺酐的资源紧张和价格高涨导致天冬氨酸的供给也存在着巨大的隐患。微生物发酵法技术是以葡萄糖为原料。葡萄糖属于可再生生物质资源，目前主要是通过玉米淀粉制得，将来可以从木质纤维素中提炼，成本可以长期保持在稳定的水平。利用葡萄糖为原材料，既有很大的价格优势，又能长期维持价格的稳定。

微生物发酵法中大肠杆菌是表达外源基因用于发酵生产有用基因产物的最常用平台微生物之一，丙氨酸的发酵生产以大肠杆菌发酵为主。但是大肠杆菌细胞中丙氨酸的生物合成是在谷氨酰胺-丙酮酸氨基转移酶催化下进行的；此酶催化活性较低，不能满足丙氨酸生产菌株培育的要求，且大肠杆菌体内葡萄糖除了转化为丙氨酸外还有其他代谢途径。因此，在减少大肠杆菌细胞中葡萄糖构成的碳流流向其他代谢途径的前提下，丙氨酸生产菌株多采用向大肠杆菌导入具有较强丙氨酸合成能力的外源基因的方法获得。然而，目前丙氨酸生产菌株多采用引入来自革兰氏阳性菌，特别是芽孢杆菌属菌株的高活性L-丙氨酸脱氢酶基因，但它们的GC含量、密码子偏好与大肠杆菌有较大不同，因此直接在大肠杆菌中引入上述基因极有可能因转录与翻译机制的差异造成外源基因表达量降低，进而影响丙氨酸积累，此外，大肠杆菌L-丙氨酸外运蛋白(alaE) 基因在染色体上只有一个拷贝，不能满足过量丙氨酸的外运而引起丙氨酸胞内积累，最终导致合成途径的反馈抑制而影响产量。

发明内容

针对现有基因工程大肠杆菌中外源基因表达量低，影响丙氨酸积累量，且大肠杆菌L-丙氨酸外运蛋白不能满足过量丙氨酸的外运而引起丙氨酸胞内积累，最终导致合成途径的反馈抑制而影响产量等问题，本发明提供一种高产 L-丙氨酸的基因工程菌及其构建方法。

为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：

一种高产L-丙氨酸的基因工程菌，保藏号为CGMCC No.15180。

相对于现有技术，本发明提供的高产L-丙氨酸的基因工程菌，其属大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，该菌株于2018年1月12日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)”，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路，其保藏号为CGMCC No.15180，敲除大肠杆菌染色体的丙氨酸消旋酶基因、D-乳酸脱氢酶基因、丙酮酸甲酸裂解酶基因、磷酸乙酰转移酶基因及乙酸激酶基因后，减少丙氨酸的代谢及减少葡萄糖的其他代谢途径，使更多的葡萄糖用于合成丙氨酸；同时，将人工合成的L-丙氨酸脱氢酶基因整合到大肠杆菌染色体，提高基因表达效率，进而增加丙氨酸积累量；此外，将L-丙氨酸外运蛋白基因整合到大肠杆菌染色体，使产生的丙氨酸不断的被外运，促进大肠杆菌不断地合成丙氨酸，进一步地增加丙氨酸积累量，提高最终丙氨酸的产量。

进一步地，本发明还提供所述高产L-丙氨酸的基因工程菌的构建方法。该构建方法，包括以下步骤：

(1)将L-丙氨酸脱氢酶基因按照大肠杆菌的密码子偏好进行优化，并进行全长人工合成，得到人工合成的L-丙氨酸脱氢酶基因；

(2)敲除大肠杆菌染色体的丙氨酸消旋酶基因、D-乳酸脱氢酶基因、丙酮酸甲酸裂解酶基因、磷酸乙酰转移酶基因及乙酸激酶基因；

(3)将步骤(1)中所得的人工合成的L-丙氨酸脱氢酶基因整合到步骤 (2)中所得的大肠杆菌染色体的丙氨酸消旋酶基因处后，将L-丙氨酸外运蛋白基因整合到大肠杆菌染色体的β-半乳糖苷酶基因处；

(4)将步骤(3)中所得到的大肠杆菌进行连续传代培养，得到高产L- 丙氨酸的基因工程菌。

相对于现有技术，本发明提供的高产L-丙氨酸的基因工程菌的构建方法，敲除大肠杆菌染色体的丙氨酸消旋酶基因、D-乳酸脱氢酶基因、丙酮酸甲酸裂解酶基因、磷酸乙酰转移酶基因及乙酸激酶基因减少丙氨酸的代谢及减少葡萄糖的其他代谢途径，使更多的葡萄糖用于合成丙氨酸；同时，将人工合成的 L-丙氨酸脱氢酶基因整合到大肠杆菌染色体的丙氨酸消旋酶基因处，人工合成的L-丙氨酸脱氢酶基因更加符合大肠杆菌的密码子偏好，提高基因表达效率，进而增加丙氨酸积累量；此外，将L-丙氨酸外运蛋白基因整合到大肠杆菌染色体的β-半乳糖苷酶基因处，使产生的丙氨酸不断的被外运，促进大肠杆菌不断地合成丙氨酸，进一步地增加丙氨酸积累量，提高最终丙氨酸的产量。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例中大肠杆菌的葡萄糖代谢过程图及基因敲除和整合的示意图。

图2是本发明实施例中以ldhA为例的大肠杆菌基因敲除流程图。

图3是发明实施例中以嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus，G.s.)的L-丙氨酸脱氢酶(alaD)基因为例的大肠杆菌基因敲入流程图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实施例提供一种高产L-丙氨酸的基因工程菌。该高产L-丙氨酸的基因工程菌，保藏号为CGMCC No.15180。

本发明实施例提供的高产L-丙氨酸的基因工程菌，敲除大肠杆菌染色体的丙氨酸消旋酶基因、D-乳酸脱氢酶基因、丙酮酸甲酸裂解酶基因、磷酸乙酰转移酶基因及乙酸激酶基因后，减少丙氨酸的代谢及减少葡萄糖流向其它代谢途径，使更多的葡萄糖用于合成丙氨酸；同时，将人工合成的L-丙氨酸脱氢酶基因整合到大肠杆菌染色体，提高基因表达效率，进而增加丙氨酸积累量；此外，将L-丙氨酸外运蛋白基因整合到大肠杆菌染色体，使产生的丙氨酸不断的被外运，促进大肠杆菌不断地合成丙氨酸，进一步地增加丙氨酸积累量，提高最终丙氨酸的产量。

本发明在提供该高产L-丙氨酸的基因工程菌的前提下，还进一步提供了该高产L-丙氨酸的基因工程菌的构建方法。

在一实施例中，该构建方法包括以下步骤：

(1)将L-丙氨酸脱氢酶基因按照大肠杆菌的密码子偏好进行优化，并进行全长人工合成，得到人工合成的L-丙氨酸脱氢酶基因；

(2)敲除大肠杆菌染色体的丙氨酸消旋酶基因、D-乳酸脱氢酶基因、丙酮酸甲酸裂解酶基因、磷酸乙酰转移酶基因及乙酸激酶基因(如图1所示)；

(3)将步骤(1)中所得的人工合成的L-丙氨酸脱氢酶基因整合到步骤 (2)中所得的大肠杆菌染色体的丙氨酸消旋酶基因处后，将L-丙氨酸外运蛋白基因整合到大肠杆菌染色体的β-半乳糖苷酶基因处(如图1所示)；

(4)将步骤(3)中所得到的大肠杆菌进行连续传代培养，得到高产L- 丙氨酸的基因工程菌。

下面对上述制备方法做进一步的解释说明：

优选地，步骤(1)中，所述人工合成的方法为：将L-丙氨酸脱氢酶基因根据大肠杆菌的密码子偏好进行密码子优化并进行全长人工合成，将tac启动子和转录终止子rrnBT1分别加入到基因的5'和3'端并添加5'-UTR，得到人工合成的L-丙氨酸脱氢酶基因，使L-丙氨酸脱氢酶基因更符合大肠杆菌的密码子偏好，提高L-丙氨酸脱氢酶基因在大肠杆菌染色体上的表达效率。

优选地，所述人工合成的L-丙氨酸脱氢酶基因序列如SEQ ID NO.1所示。

优选地，步骤(1)中，所述L-丙氨酸脱氢酶基因包括嗜热脂肪地芽孢杆菌编码的L-丙氨酸脱氢酶基因、球形芽孢杆菌编码的L-丙氨酸脱氢酶基因或枯草芽孢杆菌编码的L-丙氨酸脱氢酶基因，便于提升大肠杆菌生产L-丙氨酸的能力。

优选地，所述tac启动子基因序列如SEQ ID NO.2所示。

优选地，所述转录终止子rrnBT1基因序列如SEQ ID NO.3所示。

优选地，所述L-丙氨酸外运蛋白基因选自大肠杆菌本身，有利于基因的过表达，满足过量丙氨酸的外运而引起丙氨酸胞内积累。

优选地，所述大肠杆菌包括大肠杆菌K-12系列菌株、大肠杆菌B系列菌株、大肠杆菌C系列菌株、大肠杆菌W系列菌株。

进一步优选地，所述大肠杆菌为Escherichia.coli K-12substr.MG1655，此菌株的基因序列已经被完全测定，属于全测序菌株，便于进行基因敲除，以及根据大肠杆菌的密码子偏好来优化L-丙氨酸脱氢酶基因。

优选地，所述5'-UTR序列为AGGAGGAAATGTA，以提供相应的mRNA 上的核糖体结合位点。

优选地，所述优化的L-丙氨酸脱氢酶基因序列的拷贝数≥1，增强大肠杆菌的合成丙氨酸的能力。

优选地，所述L-丙氨酸外运蛋白基因序列拷贝数≥1，增强丙氨酸的外运能力，促进大肠杆菌不断地合成丙氨酸，进一步地增加丙氨酸积累量。

本发明实施例提供的高产L-丙氨酸的基因工程菌的构建方法，敲除大肠杆菌染色体的丙氨酸消旋酶基因、D-乳酸脱氢酶基因、丙酮酸甲酸裂解酶基因、磷酸乙酰转移酶基因及乙酸激酶基因减少丙氨酸的代谢及减少葡萄糖的其他代谢途径，使更多的葡萄糖用于合成丙氨酸；同时，将人工合成的L-丙氨酸脱氢酶基因整合到大肠杆菌染色体的丙氨酸消旋酶基因处，人工合成的L-丙氨酸脱氢酶基因更加符合大肠杆菌的密码子偏好，提高基因表达效率，进而增加丙氨酸积累量；此外，将L-丙氨酸外运蛋白基因整合到大肠杆菌染色体的β- 半乳糖苷酶基因处，使产生的丙氨酸不断的被外运，促进大肠杆菌不断地合成丙氨酸，进一步地增加丙氨酸积累量，提高最终丙氨酸的产量。

为了更好的说明本发明实施例提供的高产L-丙氨酸的基因工程菌及其构建方法，下面通过实施例做进一步的举例说明。

实施例1

一种高产L-丙氨酸的基因工程菌，保藏号为CGMCC No.15180，具有发酵产生高浓度L-丙氨酸的能力，其是通过敲除大肠杆菌染色体的丙氨酸消旋酶基因、D-乳酸脱氢酶基因、丙酮酸甲酸裂解酶基因、磷酸乙酰转移酶基因及乙酸激酶基因后，将人工合成的L-丙氨酸脱氢酶基因与L-丙氨酸外运蛋白基因整合到大肠杆菌染色体上得到。

该高产L-丙氨酸的基因工程菌构建，包括如下步骤：

(a)敲除大肠杆菌染色体的丙氨酸消旋酶基因、D-乳酸脱氢酶基因、丙酮酸甲酸裂解酶基因、磷酸乙酰转移酶基因及乙酸激酶基因：

1.D-乳酸脱氢酶(ldhA)基因的敲除(如图2所示)：

1.1电转感受态细胞的制备

甘油管保藏的大肠杆菌MG1655菌株，在LB培养基平板上划线分离，得到单菌落，挑取单菌落接种到5mL的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。过夜培养的菌液按照1:100的比例接种到100mL的LB液体培养基中，37℃震荡培养约90min，中间定时取样测其OD600的数值，菌体浓度生长到OD600 为0.4左右为宜。培养好的菌液置于冰上约20min，使其充分冷却。然后转移至50mL离心管中，转速3600g，4℃离心5min，离心完成后，弃去上清，加入少量预冷的无菌超纯水，使菌体重悬，然后加入预冷的超纯水至45mL，相同的离心条件离心，弃去上清，再次加入预冷的超纯水，重复离心一次，离心结束后，弃去上清，加入预冷的10％的无菌甘油，相同条件离心，结束后加入1mL的10％的无菌甘油，重新悬浮菌体沉淀，按每份40μL分装到1.5mL 离心管中，于-80℃保存，备用。

1.2pKD46质粒的转化

将40μL的MG1655感受态细胞与1μL的pkD46质粒混合，加入到2mm 电击杯中，轻弹底部使其混匀，电转电压设置为2.5kV，电击后查看电击时间常数Tc，Tc在5.7ms左右电击效果良好。

电击后，在电击杯中迅速加入1mL的LB液体培养基，转移到1.5mL的离心管中，30℃震荡培养2h，培养完成后，取100μL菌液，涂布于 LB+100μg/mL氨苄青霉素(以下简称Amp100)平板上，30℃倒置培养36h。

1.3MG1655/pKD46的诱导及电转感受态细胞的制备

上步实验中Amp100抗性平板上长出的单菌落命名为MG1655/pKD46，挑取其单菌落接种到5mL的LB+Amp100液体培养基中，30℃震荡培养过夜。过夜培养的菌液按1:100的比例加入到100mL的LB+Amp100液体培养基中，加入终浓度10-60mM的L-阿拉伯糖，培养至OD600约0.4，冷却后制备电转感受态细胞，制备方法如上所述。

1.4线性DNA(打靶分子)的扩增

以pKD3为模板，扩增含有FRT位点的氯霉素抗性基因片段，琼脂糖凝胶电泳检测无误后，用试剂盒进行回收，最后用无菌超纯水进行洗脱保存。PCR 反应体系及反应程序如表1、2所示。

表1用于ldhA基因敲除的线性DNA打靶分子PCR组分

其中，ldhAH1P1Frw为ldhA基因打靶分子5'引物，ldhAH2P2Rev为ldhA 基因打靶分子3'引物。

表2用于ldhA基因敲除的线性DNA打靶分子PCR条件

1.5线性DNA(打靶分子)的转化

取诱导好的MG1655/pKD46感受态细胞40μL和4μL(约400ng)线性DNA，加入到2mm电击杯中，电击电压设置为2.5kV，Tc为5.7ms，转化效果良好，电击完成后，加入1mL的LB液体培养基，转移至无菌的1.5mL离心管中， 37℃振荡培养2h，培养完成后，5300g常温离心2min，剩余约50μL培养基，重悬菌体，全部涂布于LB+氯霉素25μg/mL(Cam25)平板上，30℃倒置培养 24h。

1.6抗性重组子的鉴定及pKD46质粒的消除

将上步中氯霉素平板上长出来的抗性单菌落进行初步鉴定后，挑取平板上单菌落在LB+Cam25过夜培养，取100μL菌液于100℃煮沸裂解5min，3000g 离心1min，保留上清作为PCR模板。分别设计靶基因上游的正向引物 ldhAupFrw和氯霉素抗性基因内部的反向引物catintRev，以及氯霉素抗性基因内部的的正向引物CATintFrw和靶基因下游的反向引物ldhAdwnRev，进行 PCR扩增反应，阳性重组子可获得分子量确定的扩增产物。PCR反应体系及反应程序如表3、4所示。此步骤可选择相应野生型菌落的过培养菌液的PCR 反应作为空白对照。

表3ΔldhA::cat重组子的PCR组分

表4ΔldhA::cat重组子的PCR鉴定条件

步骤	温度(℃)	时间	返回	循环
					1	95	3min
2	95	15s
					3	56.2	15s
4	72	1min	2	24
					5	72	10min

鉴定得到的阳性重组子接种到5mL含氯霉素的LB液体培养基中，43℃培养过夜，LB，LB+Amp100，LB+Cam25平板分别划线，挑取LB+Cam25平板单菌落重复液体培养，再划线培养，以消除助手质粒pKD46。

1.7抗性基因的消除

将检测为阳性重组子的单菌落接种到5mL的LB+Cam25液体培养基中， 37℃过夜培养。然后按照1:100的比例接种到100mL的LB+Cam25液体培养基中，37℃震荡培养至OD600为0.4，按之前的方法制备电转感受态细胞，电击转化pCP20质粒，30℃震荡培养2h后，取100μL菌液涂布于含氨苄和氯霉素的LB平板上，30℃培养36h。生长出来的单菌落用上述中的方法进行PCR 验证，以菌液为模板，用靶基因上下游的正反向引物进行PCR反应，同时以相应野生型为对照组。

鉴定出来的基因敲除菌，利用相同的温敏培养方式(即pKD46质粒消除方法)消除pCP20质粒，之后甘油管保藏，得到MG1655-ΔldhA菌株。

2.取MG1655-ΔldhA菌株，与ldhA基因的敲除策略一致，进一步进行丙氨酸消旋酶(dadX)基因的敲除、丙酮酸甲酸裂解酶(pflB)基因、磷酸乙酰转移酶(Pta)基因及乙酰激酶(Ack)基因的敲除，得到MG1655- ΔdadXΔldhAΔpflBΔpta-ack菌株，备用，其中，所用到的相关引物如表5.所示。

表5

(b)L-丙氨酸脱氢酶基因、L-丙氨酸外运蛋白基因整合：

1.L-丙氨酸脱氢酶基因整合(如图3所示)：由金维智公司筛选优化合成得到嗜热脂肪地芽孢杆菌L-丙氨酸脱氢酶(alaD_G.s.)基因(序列如SEQ ID NO.22所示)，在L-丙氨酸脱氢酶基因的首尾部分别加入tac启动子(序列如 SEQ ID NO.2所示)和转录终止子rrnBT1(序列如SEQ ID NO.3所示)，得到优化的alaD_G.s.基因(序列如SEQ ID NO.1所示)。

与基因敲除策略基本相似，取MG1655-ΔdadXΔldhAΔpflBΔpta-ack菌株，以pKD3为模板，alaDP1Frw和dadXH2P2Rev为引物扩增含有FRT位点的氯霉素抗性基因片段a，然后再以tacalaDFrw和rrnBT1alaDRev为引物从重组质粒pUC57-alaD质粒上扩增人工合成的alaD_G.s.基因。以alaD_G.s.基因为模板，以dadxH1tacFrw和alaDP1Rev进行PCR为alaD片段添加dadX基因同源臂 H1和cat片段(含有FRT位点的氯霉素抗性基因片段)同源臂P1，记为片段 b，最后以a，b为模板，以dadXH1P1Frw和dadXH2P2Rev为引物扩增敲入所需的新cat片段(含有FRT位点的氯霉素抗性基因片段，dadX基因同源臂及 alaD_G.s.基因)。按照上述敲除的策略进行实验，最终cat片段消除，使优化的alaD_G.s.基因留在了dadX基因位点处，得到MG1655- ΔdadX::alaD_G.s.ΔldhAΔpflBΔpta-ack菌株，其中，所用到的引物如表6所示。

2.取MG1655-ΔdadX::alaD_G.s.ΔldhAΔpflBΔpta-ack菌株，与alaD_G.s.基因整合策略基本相似，进行L-丙氨酸外运蛋白(L-alanine exporter，AlaE)基因整合，使AlaE基因整合到β-半乳糖苷酶(lacZ)基因处，得到MG1655- ΔdadX::alaD_G.s.ΔlacZ::alaEΔldhAΔpflBΔpta-ack菌株，其中，所用到的引物如表6所示。

表6

(c)在发酵罐中对大肠杆菌进行连续传代培养，得到高产L-丙氨酸的基因工程菌MG1655-ΔdadX::alaD_G.s.ΔlacZ::alaEΔldhAΔpflBΔpta-ack菌株。

实施例2

生产L-丙氨酸

MG1655-ΔdadX::alaD_G.s.ΔlacZ::alaEΔldhAΔpflBΔpta-ack菌株发酵培养，生产丙氨酸。

种子培养基组成为：甘油5g/L，酵母粉24g/L，大豆蛋白胨12g/L，三水磷酸氢二钾16.43g/L，磷酸二氢钾2.31g/L。

250mL三角瓶中种子培养基为40mL，冷却后接入MG1655- ΔdadX::alaD_G.s.ΔlacZ::alaEΔldhAΔpflBΔpta-ack，培养温度为35-37℃，摇床转速为220rpm，生长周期7-16h，OD值为16-18即可，用于发酵培养基接种。

发酵培养基组成为：A组分：酵母浸提物8g/L，甜菜碱2g/L，磷酸二氢钾3g/L，七水硫酸镁2g/L，七水硫酸亚铁20ppm，氯化钙3ppm，七水硫酸锌 5ppm，四水硫酸锰1ppm，五水硫酸铜2ppm，四水钼酸铵0.3ppm，硼砂 0.4ppm，六水氯化钴2ppm；B组分：葡萄糖50g/L，用开水分别溶解A组分与B组分，115℃消毒10min，A液先添加24％氨水35mL/L，然后用10％磷酸调节A液的pH到7.5后与B液混合，再用氨水调节pH到7.2，无菌水定容到终体积的50％。

250mL三角瓶中培养成熟的种子为40mL，接入40ml发酵培养基，用封口膜密封瓶口，继续发酵培养，发酵温度为35℃-37℃，旋转摇床转速为 100rpm，发酵时间为16h。

为了更好的说明本发明的技术方案，下面还通过对比例和本发明的实施例做进一步的对比。

对比例1

MG1655-ΔdadX::alaD_G.s.ΔldhAΔpflBΔpta-ack菌株发酵培养，生产丙氨酸。发酵条件与实施例2中相同。

为了更好的说明本发明实施例提供的高产L-丙氨酸的基因工程菌的特性，使用安捷伦(Agilent-1200)高效液相色谱仪对实施例2和对比例1中的发酵液 L-丙氨酸含量进行测定，结果如表7所示。

表7

标号	发酵时间	OD600	pH	L-丙氨酸含量(g/L)
					实施例2	16h	6.01	5.62	12.93
对比例	16h	6.77	6.42	5.82
					出发菌株	16h	___	7.21	0.39

由以上数据可得，在敲除磷酸乙酰转移酶(Pta)基因及乙酰激酶(Ack) 基因进一步减少大肠杆菌细胞中葡萄糖其他代谢途径的前提下，人工合成的alaD_G.s.基因更加符合大肠杆菌的密码子偏好，提高基因表达效率，进而增加丙氨酸积累量，在此基础上，AlaE基因的整合，使大肠杆菌的外运丙氨酸的能力增强，使产生的丙氨酸不断的被外运，促进大肠杆菌不断地合成丙氨酸，进一步地增加丙氨酸积累量，提高最终丙氨酸的产量。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 河北大学；精晶药业股份有限公司

<120> 一种高产 L-丙氨酸的基因工程菌及其构建方法

<160> 33

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1216

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

gagctgttga caattaatca tcggctcgta taatgtgtgg aggaggaaat gtaatgaaga 60

tcggcattcc gaaagaaatc aaaaataacg aaaatcgtgt tgcaattacc cctgctggtg 120

ttatgacact ggtgaaggcc ggccatgagg tttatgttga gacagaaggc ggcgccggca 180

gtggctttag cgatagcgaa tacgaaaaag ccggtgcagc cgatcgttgc cgtacctggc 240

gtgatgcatg gaccgccgag atggtgctga aagtgaaaga gccgttagcc cgcgagtttc 300

gctactttcg ccctggtctg atcctgttta cctacctgca cctggccgca gcagagcgtg 360

tgacaaaggc cgtggtggaa cagaaagtgg tgggcatcgc ctatgagacc gtgcagctgg 420

caaatggtag cctgccgctg ctgaccccga tgagcgaagt tgccggtcgc atgagtgtgc 480

aggtgggtgc ccagtttctg gaaaaaccgc acggtggcaa aggtattctg ctgggtggtg 540

tgccgggtgt tcgccgtggc aaagtgacca ttattggtgg cggtaccgcc ggtaccaatg 600

cagccaagat tggcgtgggc ttaggcgccg acgttaccat cctggacatt aacgcagagc 660

gcctgcgcga attagacgat ctgtttggcg accatgtgac caccctgatg agcaatagct 720

accacattgc cgagtgtgtg cgtgagagcg atctggttgt tggtgcagtg ctgattccgg 780

gcgcaaaggc caaactggtg accgaggaga tggttcgcag catgaccccg ggtagcgtgc 840

tggtggacat tgccatcgat cagggcggca tttttgaaac caccgatcgc gtgaccaccc 900

acgatgatcc gacctacgtg aaacatggcg tggttcacta tgcagtggcc aatatgccgg 960

gcgcagtgcc gcgtacaagc acctttgccc tgacaaatgt gaccatcccg tacgccctgc 1020

aaatcgccaa taaaggttat cgcgccggct gtctggataa tccggccctg ctgaagggca 1080

ttaacacctt agatggccac atcgtgtacg aagcagttgc cgccgcccac aacatgccgt 1140

acacagatgt gcatagcctg ctgcatggct aaataaaacg aaaggctcag tcgaaagact 1200

gggcctttcg ttttat 1216

<210> 2

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

gagctgttga caattaatca tcggctcgta taatgtgtgg 40

<210> 3

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

ataaaacgaa aggctcagtc gaaagactgg gcctttcgtt ttat 44

<210> 4

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

aggaggaaat gta 13

<210> 5

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

tttatagcac aaaacagtac gacaagaagt acctgcaaca ggtgaacgag ttgagcgatt 60

gtgtaggctg 70

<210> 6

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

tttcgccttt ttccagattg cttaagtttt gcagcgtagt ctgagaaata gaattagcca 60

tggtccatat 70

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

atgtttaacc gttcagttga aggttg 26

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

tcattactta cacatcccgc ca 22

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

aggtacattg agcaactgac tgaa 24

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

ttcagtcagt tgctcaatgt acct 24

<210> 11

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

agaatgaagt aaacgtccgt gacttcattc agaaaaacta cactccgtac ttgagcgatt 60

gtgtaggctg 70

<210> 12

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

catagattga gtgaaggtac gagtaataac gtcctgctgc tgttctttag gaattagcca 60

tggtccatat 70

<210> 13

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 13

atggctttgc attgcttaac ctggaagagg caataacgtt acgtgagcgc ttgagcgatt 60

gtgtaggctg 70

<210> 14

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 14

atgatttttt tgcacccaga agacgttgcc tccgatccgg cttacaacaa gaattagcca 60

tggtccatat 70

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 15

tccgagctta atgaaaagtt agcca 25

<210> 16

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 16

gcagtcacct taaagtatag atagctgac 29

<210> 17

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 17

cagcgatccc atatgaggat ctaag 25

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 18

tatcatgggc aatggctctg t 21

<210> 19

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 19

gaattagcca tggtccatat agaataaaaa accggaaata gtgattattt ccggttcaga 60

tatccgcagc 70

<210> 20

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 20

acgctctatg gctccctga 19

<210> 21

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 21

ggtaagtatg caaagtggga tggc 24

<210> 22

<211> 1132

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 22

aggaggaaat gtaatgaaga tcggcattcc gaaagaaatc aaaaataacg aaaatcgtgt 60

tgcaattacc cctgctggtg ttatgacact ggtgaaggcc ggccatgagg tttatgttga 120

gacagaaggc ggcgccggca gtggctttag cgatagcgaa tacgaaaaag ccggtgcagc 180

cgatcgttgc cgtacctggc gtgatgcatg gaccgccgag atggtgctga aagtgaaaga 240

gccgttagcc cgcgagtttc gctactttcg ccctggtctg atcctgttta cctacctgca 300

cctggccgca gcagagcgtg tgacaaaggc cgtggtggaa cagaaagtgg tgggcatcgc 360

ctatgagacc gtgcagctgg caaatggtag cctgccgctg ctgaccccga tgagcgaagt 420

tgccggtcgc atgagtgtgc aggtgggtgc ccagtttctg gaaaaaccgc acggtggcaa 480

aggtattctg ctgggtggtg tgccgggtgt tcgccgtggc aaagtgacca ttattggtgg 540

cggtaccgcc ggtaccaatg cagccaagat tggcgtgggc ttaggcgccg acgttaccat 600

cctggacatt aacgcagagc gcctgcgcga attagacgat ctgtttggcg accatgtgac 660

caccctgatg agcaatagct accacattgc cgagtgtgtg cgtgagagcg atctggttgt 720

tggtgcagtg ctgattccgg gcgcaaaggc caaactggtg accgaggaga tggttcgcag 780

catgaccccg ggtagcgtgc tggtggacat tgccatcgat cagggcggca tttttgaaac 840

caccgatcgc gtgaccaccc acgatgatcc gacctacgtg aaacatggcg tggttcacta 900

tgcagtggcc aatatgccgg gcgcagtgcc gcgtacaagc acctttgccc tgacaaatgt 960

gaccatcccg tacgccctgc aaatcgccaa taaaggttat cgcgccggct gtctggataa 1020

tccggccctg ctgaagggca ttaacacctt agatggccac atcgtgtacg aagcagttgc 1080

cgccgcccac aacatgccgt acacagatgt gcatagcctg ctgcatggct aa 1132

<210> 23

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 23

atggctttgc attgcttaac ctggaagagg caataacgtt acgtgagcgc ttgagcgatt 60

gtgtaggctg 70

<210> 24

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 24

atgatttttt tgcacccaga agacgttgcc tccgatccgg cttacaacaa gaattagcca 60

tggtccatat 70

<210> 25

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 25

gagctgttga caattaatca tcggctcgta taatgtgtgg aggaggaaat gtaatgaa 58

<210> 26

<211> 65

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 26

ataaaacgaa aggcccagtc tttcgactga gcctttcgtt ttatttagcc atgcagcagg 60

ctatg 65

<210> 27

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 27

atggctttgc attgcttaac ctggaagagg caataacgtt acgtgagcgc gagctgttga 60

caattaatca 70

<210> 28

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 28

cagcctacac aatcgctcaa ataaaacgaa aggcccagtc tttcgactga gcctttcgtt 60

<210> 29

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 29

aacgaaaggc tcagtcgaaa gactgggcct ttcgttttat ttgagcgatt gtgtaggctg 60

<210> 30

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 30

gagcgcaacg caattaatgt gagttagctc actcattagg ttgagcgatt gtgtaggctg 60

<210> 31

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 31

atatggacca tggctaattc gcgatatacg ctatgcgaaa atgcagatgg caatgagatc 60

<210> 32

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 32

gatctcattg ccatctgcat tttcgcatag cgtatatcgc gaattagcca tggtccatat 60

<210> 33

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 33

ccaggtagcg aaagccattt tttgatggac catttcggca gtcgcgaaaa gaagagtcag 60

Claims (9)

1.一种高产L-丙氨酸的基因工程菌，其特征在于：保藏号为CGMCC No.15180。

2.权利要求1所述的高产L-丙氨酸的基因工程菌的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)将L-丙氨酸脱氢酶基因按照大肠杆菌的密码子偏好进行优化，并进行全长人工合成，得到人工合成的L-丙氨酸脱氢酶基因；

(2)敲除大肠杆菌染色体的丙氨酸消旋酶基因、D-乳酸脱氢酶基因、丙酮酸甲酸裂解酶基因、磷酸乙酰转移酶基因及乙酸激酶基因；

(3)将步骤(1)中所得的人工合成的L-丙氨酸脱氢酶基因整合到步骤(2)中所得的大肠杆菌染色体的丙氨酸消旋酶基因处后，将L-丙氨酸外运蛋白基因整合到大肠杆菌染色体的β-半乳糖苷酶基因处；

(4)将步骤(3)中所得到的大肠杆菌进行连续传代培养，得到高产L-丙氨酸的基因工程菌。

3.如权利要求2所述的高产L-丙氨酸的基因工程菌的构建方法，其特征在于：步骤(1)中，所述人工合成的方法为：将L-丙氨酸脱氢酶基因根据大肠杆菌的密码子偏好进行密码子优化并进行全长人工合成，将tac启动子和转录终止子rrnBT1分别加入到基因的5'和3'端并添加5'-UTR，得到人工合成的L-丙氨酸脱氢酶基因。

4.如权利要求3所述的高产L-丙氨酸的基因工程菌的构建方法，其特征在于：所述人工合成的L-丙氨酸脱氢酶基因序列如SEQ ID NO.1所示。

5.如权利要求2所述的高产L-丙氨酸的基因工程菌的构建方法，其特征在于：步骤(1)中，所述L-丙氨酸脱氢酶基因选自嗜热脂肪地芽孢杆菌编码的L-丙氨酸脱氢酶基因、球形芽孢杆菌编码的L-丙氨酸脱氢酶基因或枯草芽孢杆菌编码的L-丙氨酸脱氢酶基因。

6.如权利要求3所述的高产L-丙氨酸的基因工程菌的构建方法，其特征在于：所述tac启动子基因序列如SEQ ID NO.2所示。

7.如权利要求3所述的高产L-丙氨酸的基因工程菌的构建方法，其特征在于：所述转录终止子rrnBT1序列如SEQ ID NO.3所示。

8.如权利要求2所述的高产L-丙氨酸的基因工程菌的构建方法，其特征在于：所述L-丙氨酸外运蛋白基因选自大肠杆菌本身。

9.如权利要求2所述的高产L-丙氨酸的基因工程菌的构建方法，其特征在于：所述优化的L-丙氨酸脱氢酶基因序列的拷贝数≥1，和/或

所述L-丙氨酸外运蛋白基因序列拷贝数≥1。