CN104673732B - 一种大肠杆菌表达菌株及在大肠杆菌中生物合成木香烃内酯的方法 - Google Patents

一种大肠杆菌表达菌株及在大肠杆菌中生物合成木香烃内酯的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种大肠杆菌表达菌株，所述大肠杆菌表达菌株含有并能够表达基因AtoB、HMGS、tHMGR、ERG12、ERG8、MVD1、Idi、IspA、TpGAS、CiGAO、AaCPR和CiCOS。本发明还提供了一种在大肠杆菌中生物合成木香烃内酯的方法，所述方法为将前述大肠杆菌表达菌株进行发酵培养，使其生物合成木香烃内酯。本发明的在大肠杆菌中生物合成木香烃内酯的方法，木香烃内酯的产量可达20mg/L，是一种高产木香烃内酯的新的生产途径，为木香烃内酯的大规模工业生产奠定了基础，具有重要的经济价值和社会效益。

Description

一种大肠杆菌表达菌株及在大肠杆菌中生物合成木香烃内酯 的方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体地，涉及一种大肠杆菌表达菌株及在大肠杆菌中生物合成木香烃内酯的方法。
背景技术
倍半萜(terpenoids)是自然界中结构最多样化的化合物，这类的化合物中很多具有重要的生物学活性和工业价值。倍半萜内酯(sesquiterpene lactone)是其中重要的亚类，它们主要存在于菊科植物中，经甲羟戊酸途径(MVA pathway)合成。倍半萜内酯中有几种化合物已经被证明具有重要的生物医学活性，如青蒿素（artemisinin）具有治疗疟疾的功能，小白菊内酯（parthenolide）可以用来治疗偏头痛，蛔蒿素（santonin）具有驱虫的功效，毒胡萝卜素（thapsigargin）具有抗癌的作用，山莴苣苦素（lactucopicrin）具有镇静止痛的作用，堆心菊内酯（helenalin）可抗炎症。而木香烃内酯（costunolide）是自然界中最简单的倍半萜内酯，是其他倍半萜内酯的前体，并且本身具有抗癌、抗病毒、抗真菌及免疫抑制等功能。其中，木香烃内酯具有以下特征：化学名称(3aS,6E,10E,11aR)-6,10-dimethyl-3-methylene-3,3a,4,5,8,9-hexahydrocyclodeca[b]furan-2(11aH)-one，分子式C15H20O2，分子量232.32，CAS号553-21-9，结构式木香烃内酯在植物体内的含量极低，所以实现木香烃内酯的微生物体内生物全合成途径具有重要的科研价值及社会效益。
2011年，Ikezawa等人在酿酒酵母中建立了生物合成木香烃内酯的途径(IkezawaN, J.C.,Nguyen D.T.,Kim S.U,O’Maille P.E.,Spring O.,Ro D.K..Lettucecostunolide synthase(CYP71BL2)and its homolog(CYP71BL1)from sunflowercatalyze distinct regio-and stereoselective hydroxylations in sesquiterpenelactone metabolism.Journal of biological chemistry,2011,286(24):21601-21611)，木香烃内酯的产量为9.3mg/L。同年，Liu等人分别在酵母和烟草中生物合成了木香烃内酯(Liu Q.,Majdi M.,Cankar K.,Goedbloed M.,Charnikhova T.,Verstappen F.W.A.,deVos R.C.H.,Beekwilder J.,van der Krol S.,Bouwmeester H.J..Reconstitution ofthe costunolide biosynthetic pathway in yeast and Nicotiana benthamiana.PLoSONE,2011,6(8):e23255.doi:10.1371/journal.pone.0023255)，在酵母中木香烃内酯的最高产量为28mg/L，烟草中为60ng/g FW。
以上建立的木香烃内酯的生物合成途径均是在真核生物中实现的，然而，迄今为止，并没有在原核生物如大肠杆菌(Escherichia coli)中生物合成木香烃内酯的报道。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的是提供一种大肠杆菌表达菌株及在大肠杆菌中生物合成木香烃内酯的方法。
本发明的发明人在研究中发现，木香烃内酯的生物体内合成包含多个步骤：大肠杆菌本身具有1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸途径(DXP途径)，能够合成木香烃内酯的倍半萜前体法尼基焦磷酸（FPP），通过在大肠杆菌表达菌株中建立甲羟戊酸途径（MVA途径），使MVA途径与DXP途径结合，来增强倍半萜前体法尼基焦磷酸（FPP）的合成；然后通过在大肠杆菌中表达木香烃内酯合成相关的基因可以异源合成木香烃内酯，从而实现木香烃内酯在大肠杆菌中的生物合成。
因此，为了实现上述目的，一方面，本发明提供了一种大肠杆菌表达菌株，所述大肠杆菌表达菌株含有并能够表达基因AtoB、HMGS、tHMGR、ERG12、ERG8、MVD1、Idi、IspA、TpGAS、CiGAO、AaCPR和CiCOS。
另一方面，本发明还提供了一种在大肠杆菌中生物合成木香烃内酯的方法，所述方法为将所述大肠杆菌表达菌株进行发酵培养，使其生物合成木香烃内酯。
较真核生物酵母和烟草而言，大肠杆菌作为最简单的模式生物，其背景清晰，生长快速，易于规模化发酵培养，成本低廉；而且本发明通过将MVA途径、DXP途径以及由倍半萜前体法尼基焦磷酸（FPP）合成木香烃内酯途径有机地结合在一起，能够显著提高木香烃内酯的产量，木香烃内酯的产量可达20mg/L，提供了一种高产木香烃内酯的新的生产途径，也为木香烃内酯的大规模工业生产奠定了基础，具有重要的经济价值和社会效益。
本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
图1为本发明的在大肠杆菌中生物合成木香烃内酯的途径示意图；
图2为菌株BL21COS的发酵产物和木香烃内酯标准品的HPLC结果，其中，1是木香烃内酯标准品，2是BL21COS的发酵产物，在42.6min处的峰为木香烃内酯峰。
图3为菌株BL21GAA和BL21BMM的发酵产物的HPLC结果，其中，3是BL21GAA的发酵产物，4是BL21BMM的发酵产物，在42.6min处无木香烃内酯峰。
图4为菌株BL21COS发酵产物的HPLC新峰的MS图谱；
图5为木香烃内酯标准品的MS图谱。
具体实施方式
以下结合图1-图5对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
一方面，本发明提供了一种大肠杆菌表达菌株，所述大肠杆菌表达菌株含有并能够表达基因AtoB、HMGS、tHMGR、ERG12、ERG8、MVD1、Idi、IspA、TpGAS、CiGAO、AaCPR和CiCOS。
本发明中，基因AtoB、HMGS、tHMGR、ERG12、ERG8、MVD1、Idi、IspA为完成MVA途径的相关基因，可以分别为来自酿酒酵母的羟甲基戊二酰辅酶A合成酶基因HMGS(GenBank:GeneID:854913)、羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因tHMGR(GenBank:GeneID:854900)、甲羟戊酸激酶基因ERG12(GenBank:GeneID:855248)、磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8(GenBank:GeneID:855260)、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶基因MVD1(GenBank:GeneID:855779)，及来自大肠杆菌的乙酰乙酰辅酶A硫解酶基因AtoB(GenBank:GeneID:946727)、异戊烯基焦磷酸（IPP）异构酶基因Idi(GenBank:GeneID:949020)、法尼基焦磷酸(FPP)合成酶基因IspA(GenBank:GeneID:945064)。其中，需要说明的是，虽然大肠杆菌体内含有基因AtoB、Idi和IspA，但是由于大肠杆菌本身的这三种基因的表达量很低，为了能够更好的完成MVA途径，优选情况下，将这三种基因克隆至大肠杆菌表达载体中使其高效表达至完成MVA途径所需的表达量。
本发明中，基因TpGAS、CiGAO、AaCPR和CiCOS为由倍半萜前体法尼基焦磷酸（FPP）合成木香烃内酯过程中的相关基因，可以来自菊科植物。优选地，TpGAS、CiGAO、AaCPR和CiCOS分别为来自艾菊属的香叶烯（germacrene）A合成酶基因TpGAS(GenBank:JF819848.1)、来自菊苣的香叶烯（germacrene）A氧化酶基因CiGAO(GenBank:GU256644.1)、来自青蒿的NADPH细胞色素P450氧化还原酶基因AaCPR(GenBank:DQ318192.1)和来自菊苣的木香烃内酯（costunolide）合成酶基因CiCOS(GenBank:JF816041.1)。
本发明中，大肠杆菌表达菌株含有并能够表达基因AtoB、HMGS、tHMGR、ERG12、ERG8、MVD1、Idi、IspA、TpGAS、CiGAO、AaCPR和CiCOS是指对大肠杆菌表达菌株进行发酵培养时，大肠杆菌表达菌株能够将上述基因翻译为相应蛋白，并使相应蛋白发挥其作用。
优选地，大肠杆菌表达菌株是通过用含有基因AtoB、HMGS、tHMGR、ERG12、ERG8、MVD1、Idi、IspA、TpGAS、CiGAO、AaCPR和CiCOS的表达载体对大肠杆菌进行转化而得到的。
本发明中，对表达载体的种类没有特殊要求，可以为能够在大肠杆菌中表达目的基因的本领域常用的各种表达载体，例如质粒等。
本领域技术人员应该理解的是，表达载体的构建方法可以采用本领域常用的各种方法，如将目的基因经过酶切处理后连接至载体中，在此不再赘述。
表达载体优选包括大肠杆菌表达载体V1和大肠杆菌表达载体V2，大肠杆菌表达载体V1优选含有基因AtoB、HMGS、tHMGR、ERG12、ERG8、MVD1、Idi和IspA，大肠杆菌表达载体V2优选含有基因TpGAS、CiGAO、AaCPR和CiCOS。
本发明中，大肠杆菌表达载体V1优选为pBbA5c-MevT(CO)-MBIS(CO,ispA)。将所述载体pBbA5c-MevT(CO)-MBIS(CO,ispA)转化大肠杆菌表达菌株，通过在大肠杆菌中高效表达大肠杆菌来源的AtoB、Idi和IspA，及经过密码子优化的来自酿酒酵母的HMGS、tHMGR、ERG12、ERG8和MVD1，可以在大肠杆菌中建立MVA途径，如图1所示，其中，MVA途径与大肠杆菌本身的1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸途径(DXP途径)并存，用于增强倍半萜前体FPP的合成。
本发明中，大肠杆菌表达载体V2优选为pCW-GAO-CPR-GAS-COS，所述pCW-GAO-CPR-GAS-COS的制备方法优选包括以下步骤：
（a）以引物GAOASEI/GAOSPEI为引导，以核苷酸序列如SEQ ID No：2所示的基因CiGAO为模板进行PCR扩增反应，扩增产物经AseI和SpeI酶切后连入经NdeI和XbaI酶切的质粒pCWori-A13AMO-AACPRct中，构建得到质粒pCW-GAO-CPR；其中，引物GAOASEI的核苷酸序列如SEQ ID No：4所示，引物GAOSPEI的核苷酸序列如SEQ ID No：5所示；
（b）以引物GASSALI/GASXHOI为引导，以核苷酸序列如SEQ ID No：1所示的基因TpGAS为模板进行PCR扩增反应，扩增产物经SalI和XhoI酶切后连入经SalI酶切的质粒pCW-GAO-CPR中，构建得到质粒pCW-GAO-CPR-GAS；其中，引物GASXHOI的核苷酸序列如SEQ IDNo：6所示，引物GASSALI的核苷酸序列如SEQ ID No：7所示；
（c）以引物COSSALI/COSXHOI为引导，以核苷酸序列如SEQ ID No：3所示的基因CiCOS为模板进行PCR扩增反应，扩增产物经SalI和XhoI酶切后连入经SalI酶切的质粒pCW-GAO-CPR-GAS中，构建得到大肠杆菌表达载体pCW-GAO-CPR-GAS-COS；其中，引物COSXHOI的核苷酸序列如SEQ ID No：8所示，引物COSSALI的核苷酸序列如SEQ ID No：9所示。
将所述载体pCW-GAO-CPR-GAS-COS转化大肠杆菌表达菌株，通过在大肠杆菌中表达经过密码子优化的来自菊科植物的木香烃内酯合成相关的基因异源合成木香烃内酯（如图1所示）。其中，NADPH细胞色素P450氧化还原酶AaCPR在木香烃内酯合成过程中作为CiGAO,CiCOS酶氧化还原的分子伴侣（redox partner）。
本领域技术人员应该理解的是，大肠杆菌、酵母、植物及动物等在表达蛋白质时，都表现有不同程度的密码子偏爱性。将MVA途径中的来自酿酒酵母的5个基因和木香烃内酯合成途径中的来自菊科植物的木香烃内酯合成相关的4个基因进行密码子优化，可以使目标蛋白在大肠杆菌表达系统中更有效地表达。
本发明中，在步骤（a）-步骤（c）中，PCR扩增反应的反应体系可以为常规的PCR扩增反应体系，优选为：5×phusion HF缓冲液10μl，2.5mM dNTP2.5μl，50μM正向引物0.5μl，50μM反向引物0.5μl，模板0.5μl，Phusion DNA聚合酶0.5μl，水35.5μl。
本发明中，在步骤（a）-步骤（c）中，PCR扩增反应的反应程序可以为常规的PCR扩增反应程序，例如可以为：94-95℃预变性4-5分钟；96-98℃变性20-30秒，55-60℃退火30-60秒，72℃延伸30-120秒，28-32个循环；72℃延伸8-10分钟。优选为：95℃预变性5分钟；98℃变性20秒，56℃退火45秒，72℃延伸2分钟，30个循环；72℃延伸10分钟。
本发明中，对大肠杆菌表达菌株的种类没有特殊要求，可以为能够表达目的基因的本领域常用的各种大肠杆菌表达菌株，例如，所述大肠杆菌表达菌株可以为BL21(DE3)或MG1655。为了使目的基因能够得到更好的表达，所述大肠杆菌表达菌株优选为BL21(DE3)。
本发明中，所述大肠杆菌表达菌株优选为BL21COS，其是将大肠杆菌表达载体pBbA5c-MevT(CO)-MBIS(CO,ispA)和pCW-GAO-CPR-GAS-COS共同转化大肠杆菌BL21(DE3)后经筛选得到的大肠杆菌表达菌株。
另一方面，本发明提供了一种在大肠杆菌中生物合成木香烃内酯的方法，所述方法为将前述大肠杆菌表达菌株进行发酵培养，使其生物合成木香烃内酯。
本发明中，所述发酵培养的方法可以为将所述大肠杆菌表达菌株在加入有作为筛选标记用抗生素的LB液体培养基中35-38℃下培养10-16小时，然后将培养液按1-2体积%的转接量转接至加入有相同抗生素的M9液体培养基中35-38℃下培养，当OD600为0.4-0.6时加入终浓度为0.5-1.0mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，28-30℃下诱导培养36-72小时。
本领域技术人员应该理解的是，在发酵培养时，LB液体培养基和M9液体培养基中加入的抗生素为大肠杆菌表达菌株中含有的表达载体上的作为筛选标记用的抗生素，所述抗生素的浓度为本领域的常规选择。所述1-2体积%的转接量是指在每100ml的M9液体培养基中加入1-2ml培养液。
本发明中，将大肠杆菌表达菌株BL21COS进行发酵培养时，所述发酵培养的方法优选为将大肠杆菌表达菌株BL21COS在加入有20-50mg/L氯霉素和100-150mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基中35-38℃下培养10-16小时，然后将培养液按1-2体积%的转接量转接至加入有20-50mg/L氯霉素和100-150mg/L氨苄青霉素的M9液体培养基中35-38℃下培养，当OD600为0.4-0.6时加入终浓度为0.5-1.0mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG），28-30℃下诱导培养36-72小时。
实施例
以下的实施例将对本发明作进一步的说明，但并不因此限制本发明。
以下实施例中，大肠菌株BL21(DE3)和大肠杆菌DH5α均可市售获得，大肠菌株BL21(DE3)用于本发明中所有基因的表达，大肠杆菌DH5α用于本发明中所有基因的克隆。
大肠杆菌表达载体pBbA5c-MevT(CO)-MBIS(CO,ispA)购自Addgene，货号35151，由Taek_Soon Lee和Jay Keasling提供(参见Peralta-Yahya P.P.,Ouellet M.,Chan R.,Mukhopadhyay A.,Keasling J.D.,Lee T.S.,Identification and microbialproduction of a terpene-based advanced biofuel.Nature communication,2:483,doi:10.1038/ncomms1494)，所述质粒携带来自于酿酒酵母的根据大肠杆菌进行密码子优化的HMGS、tHMGR、ERG12、ERG8和MVD1及大肠杆菌来源的AtoB，Idi和IspA八个MVA途径中相关蛋白的编码基因。
大肠杆菌表达载体pCWori-A13AMO-AACPRct购自Addgene，货号20117，由美国加利福尼亚州立大学的Jay Keasling提供(参见Chang M.C.Y.,Eachus R.A.,Trieu W.,RoD.K.,Keasling J.D.,Engineering Escherichia coli for production offunctionalized terpenoids using plant P450s.Nature Chemical Biology,3(5):274-277)。
Phusion高保真DNA聚合酶购自Thermo公司。
所用引物均由深圳华大基因科技有限公司合成，引物序列见表1，其中下划线部分表示酶切位点。
表1
实施例1大肠杆菌中MVA途径的构建
将质粒pBbA5c-MevT(CO)-MBIS(CO,ispA)用化学转化的方法转入大肠杆菌BL21(DE3)，所述转化方法具体为：取100μl感受态细胞BL21(DE3)于冰上，10分钟后加入1μl质粒pBbA5c-MevT(CO)-MBIS(CO,ispA)，轻轻混匀，冰上放置30分钟后，42℃热激90秒，取出立即于冰上放置2分钟，加入600μl LB液体培养基，37℃，150rpm摇床复苏培养30分钟，然后将菌液涂布在含氯霉素的LB平板上。用氯霉素抗性筛选转化菌株，得到建立好MVA途径的大肠杆菌BL21BMM，作为空白对照菌株。
实施例2含有木香烃内酯合成相关基因TpGAS、CiGAO、AaCPR和CiCOS大肠杆菌表达载体构建
（1）基因TpGAS为来自艾菊属的香叶烯（germacrene）A合成酶基因TpGAS(GenBank:JF819848.1)；基因CiGAO为来自菊苣的香叶烯（germacrene）A氧化酶基因CiGAO(GenBank:GU256644.1)；基因CiCOS为来自菊苣的木香烃内酯（costunolide）合成酶基因CiCOS(GenBank:JF816041.1)；根据Genbank提供序列将上述三个基因进行密码子优化，优化后的基因TpGAS的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示，优化后的基因CiGAO的核苷酸序列如SEQ IDNo：2所示，优化后的基因CiCOS的核苷酸序列如SEQ ID No：3所示，优化后的基因TpGAS、CiGAO和CiCOS由上海捷瑞生物工程有限公司合成。另外，基因AaCPR来自质粒pCWori-A13AMO-AACPRct中的AACPRct。
（2）以引物GAOASEI/GAOSPEI为引导，以前述合成的优化后的基因CiGAO为模板进行PCR扩增，PCR扩增反应的反应体系为：5×phusion HF缓冲液10μl，2.5mM dNTP2.5μl，50μM正向引物0.5μl，50μM反向引物0.5μl，模板0.5μl，Phusion DNA聚合酶0.5μl，水35.5μl。
PCR扩增反应的反应程序为：95℃预变性5分钟；98℃变性20秒，56℃退火45秒，72℃延伸2分钟，30个循环；72℃延伸10分钟。
经PCR扩增得到去掉自身膜定位信号的CiGAO，扩增产物由AseI和SpeI酶切后连入经NdeI和XbaI酶切的质粒pCWori-A13AMO-AACPRct中，构建得到携带CiGAO和AaCPR的表达质粒pCW-GAO-CPR。
（3）以引物GASSALI/GASXHOI为引导，以前述合成的优化后的基因TpGAS为模板进行PCR扩增，PCR扩增反应的反应体系和反应程序同步骤（2）中的PCR扩增反应。PCR扩增产物经SalI和XhoI酶切后连入经SalI酶切的质粒pCW-GAO-CPR中，构建得到携带TpGAS、CiGAO和AaCPR的表达质粒pCW-GAO-CPR-GAS。
（4）以引物COSSALI/COSXHOI为引导，以前述合成的优化后的基因CiCOS为模板进行PCR扩增，PCR扩增反应的反应体系和反应程序同步骤（2）中的PCR扩增反应。经PCR扩增得到去掉自身膜定位信号的CiCOS，扩增产物经SalI和XhoI酶切后连入经SalI酶切的质粒pCW-GAO-CPR-GAS中，构建得到携带TpGAS、CiGAO、AaCPR和CiCOS的大肠杆菌表达载体pCW-GAO-CPR-GAS-COS。
实施例3木香烃内酯生物合成途径在大肠杆菌中的重构
将表达载体pBbA5c-MevT(CO)-MBIS(CO,ispA)和实施例2中构建的表达载体pCW-GAO-CPR-GAS-COS共同转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)，转化方法为：取100μl感受态细胞BL21(DE3)于冰上，10分钟后加入1μl表达载体pBbA5c-MevT(CO)-MBIS(CO,ispA)和1μl表达载体pCW-GAO-CPR-GAS-COS，轻轻混匀，冰上放置30分钟后，42℃热激90秒，取出立即于冰上放置2分钟，加入600μlLB液体培养基，37℃，150rpm摇床复苏培养30分钟，然后将菌液涂布在含氯霉素和氨苄青霉素的LB平板上。利用氯霉素和氨苄青霉素抗性筛选同时携带两种表达载体的BL21(DE3)转化菌株BL21COS，并通过提取质粒进行酶切验证。
对比例1
按照与实施例3相同的方法，将表达载体pBbA5c-MevT(CO)-MBIS(CO,ispA)和实施例2中构建的表达载体pCW-GAO-CPR-GAS共同转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)，构建得到对照菌株BL21GAA。
实施例4菌株BL21BMM、BL21COS和BL21GAA的发酵培养
将菌株BL21BMM、BL21COS和BL21GAA分别在2mL加入有25mg/L氯霉素和100mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基中37℃培养12小时，之后分别将培养液按1体积%的转接量（0.5mL）转接入50mL加入有25mg/L氯霉素和100mg/L氨苄青霉素的M9液体培养基中37℃培养，当OD600约为0.6时加入终浓度为1.0mM的IPTG进行诱导，30℃继续培养48个小时。在大肠杆菌中生物合成木香烃内酯的具体途径如图1所示。
实施例5木香烃内酯的检测
（1）将实施例4最终的发酵液用等体积的乙酸乙酯萃取，萃取液旋蒸浓缩至无乙酸乙酯液体；每50ml发酵液的乙酸乙酯萃取液旋蒸干燥后加入1ml甲醇溶解；甲醇溶解液12000rpm，离心5min，取上清，进行HPLC测定。通过安捷伦液相色谱仪对发酵产物进行HPLC分析，其中，进行HPLC测定的条件包括：C18柱（4.6×250mm）；检测波长201nm；流动相A=水(含0.1体积%甲酸)，B=甲醇；流速=1ml/min；梯度洗脱条件：0–5min5体积%B，6–45min5体积%B到100体积%B（6–45min内B的浓度均匀增加）；进样量50μl。结果见图2和图3。菌株BL21COS、BL21GAA、BL21BMM的发酵产物和木香烃内酯标准品的HPLC结果相比，BL21COS在出峰时间42.6min时出现了一个新峰，并与木香烃内酯标准品的出峰时间一致，而BL21GAA和BL21BMM在42.6min处均无上述木香烃内酯峰。
（2）对步骤（1）中看到的BL21COS新峰进行LC-MS分析，其中，进行LC-MS分析的条件包括：C18柱（4.6×250mm）；检测波长201nm；流动相A=水(含0.1体积%甲酸),B=甲醇；流速=1ml/min；梯度洗脱条件：0–5min5体积%B，6–45min5体积%B到100体积%B（6–45min内B的浓度均匀增加）；进样量50μl；ESI正离子源，分子量扫描范围50–1000。结果见图4。该峰的MS图谱上有木香烃内酯的MS特征峰233.15和255.13，与图5所示木香烃内酯标准品的MS特征峰相一致，表明步骤（1）中看到的新峰就是目标产物木香烃内酯，且经测定，菌株BL21COS发酵液中的木香烃内酯的产量为20mg/L。
本发明的在大肠杆菌中生物合成木香烃内酯的方法，木香烃内酯的产量可达20mg/L，提供了一个高产木香烃内酯的新的生产途径，为木香烃内酯的大规模工业生产奠定了基础，具有重要的经济价值和社会效益。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (6)

1.一种大肠杆菌表达菌株，其特征在于，所述大肠杆菌表达菌株含有并能够表达基因AtoB（GenBank: GeneID:946727）、HMGS（GenBank: GeneID:854913）、tHMGR（GenBank:GeneID: 854900）、ERG12（GenBank: GeneID:855248）、ERG8（GenBank: GeneID:855260）、MVD1（GenBank: GeneID:855779）、Idi（GenBank: GeneID:949020）、IspA（GenBank:GeneID:945064）、TpGAS（GenBank: JF819848.1）、CiGAO（GenBank: GU256644.1）、AaCPR（GenBank: DQ318192.1）和CiCOS（GenBank: JF816041.1），其中，所述大肠杆菌表达菌株是通过用含有基因AtoB、HMGS、tHMGR、ERG12、ERG8、MVD1、Idi、IspA、TpGAS、CiGAO、AaCPR和CiCOS的表达载体对大肠杆菌进行转化而得到的，所述表达载体包括大肠杆菌表达载体V1和大肠杆菌表达载体V2，所述大肠杆菌表达载体V1含有基因AtoB、HMGS、tHMGR、ERG12、ERG8、MVD1、Idi和IspA，所述大肠杆菌表达载体V2含有基因TpGAS、CiGAO、AaCPR和CiCOS，所述大肠杆菌表达载体V1为pBbA5c-MevT(CO)-MBIS(CO, ispA)，所述大肠杆菌表达载体V2为pCW-GAO-CPR-GAS-COS，所述pCW-GAO-CPR-GAS-COS的制备方法包括以下步骤：
（a）以引物GAOASEI/GAOSPEI为引导，以核苷酸序列如SEQ ID No：2所示的基因CiGAO为模板进行PCR扩增反应，扩增产物经AseI和SpeI酶切后连入经NdeI和XbaI酶切的质粒pCWori-A13AMO-AACPRct中，构建得到质粒pCW-GAO-CPR；其中，引物GAOASEI的核苷酸序列如SEQ ID No：4所示，引物GAOSPEI的核苷酸序列如SEQ ID No：5所示；
（b）以引物GASSALI/GASXHOI为引导，以核苷酸序列如SEQ ID No：1所示的基因TpGAS为模板进行PCR扩增反应，扩增产物经SalI和XhoI酶切后连入经SalI酶切的质粒pCW-GAO-CPR中，构建得到质粒pCW-GAO-CPR-GAS；其中，引物GASXHOI的核苷酸序列如SEQ ID No：6所示，引物GASSALI的核苷酸序列如SEQ ID No：7所示；
（c）以引物COSSALI/COSXHOI为引导，以核苷酸序列如SEQ ID No：3所示的基因CiCOS为模板进行PCR扩增反应，扩增产物经SalI和XhoI酶切后连入经SalI酶切的质粒pCW-GAO-CPR-GAS中，构建得到大肠杆菌表达载体pCW-GAO-CPR-GAS-COS；其中，引物COSXHOI的核苷酸序列如SEQ ID No：8所示，引物COSSALI的核苷酸序列如SEQ ID No：9所示。
2.根据权利要求1所述的大肠杆菌表达菌株，其中，在步骤（a）-步骤（c）中，所述PCR扩增反应的反应程序均为：94-95℃预变性4-5分钟；96-98℃变性20-30秒，55-60℃退火30-60秒，72℃延伸30-120秒，28-32个循环；72℃延伸8-10分钟。
3.根据权利要求1-2任意一项所述的大肠杆菌表达菌株，其中，转化的大肠杆菌菌株为BL21(DE3)或MG1655。
4.一种在大肠杆菌中生物合成木香烃内酯的方法，其特征在于，将权利要求1-3任意一项所述的大肠杆菌表达菌株进行发酵培养，使其生物合成木香烃内酯。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述发酵培养的方法为将权利要求1-3任意一项所述大肠杆菌表达菌株在加入有作为筛选标记用抗生素的LB液体培养基中35-38℃下培养10-16小时，然后将培养液按1-2体积%的转接量转接至加入有相同抗生素的M9液体培养基中35-38℃下培养，当OD600为0.4-0.6时加入终浓度为0.5-1.0mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，28-30℃下诱导培养36-72小时。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述发酵培养的方法为将大肠杆菌表达菌株BL21COS在加入有20-50mg/L氯霉素和100-150mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基中35-38℃下培养10-16小时，然后将培养液按1-2体积%的转接量转接至加入有20-50mg/L氯霉素和100-150mg/L氨苄青霉素的M9液体培养基中35-38℃下培养，当OD600为0.4-0.6时加入终浓度为0.5-1.0mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，28-30℃下诱导培养36-72小时；其中，所述大肠杆菌表达菌株BL21COS是将大肠杆菌表达载体pBbA5c-MevT(CO)-MBIS(CO, ispA)和pCW-GAO-CPR-GAS-COS共同转化大肠杆菌BL21(DE3)后经筛选得到的大肠杆菌表达菌株。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101157676A (zh) * 2007-07-25 2008-04-09 北京星昊医药股份有限公司 木香烃内酯的制备方法
CN102329765A (zh) * 2010-08-31 2012-01-25 安徽华恒生物工程有限公司 一种高产l-丙氨酸的xz-a26菌株及构建方法与应用
CN102584759A (zh) * 2012-02-08 2012-07-18 淮海工学院 一种木香烃内酯提取方法

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101157676A (zh) * 2007-07-25 2008-04-09 北京星昊医药股份有限公司 木香烃内酯的制备方法
CN102329765A (zh) * 2010-08-31 2012-01-25 安徽华恒生物工程有限公司 一种高产l-丙氨酸的xz-a26菌株及构建方法与应用
CN102584759A (zh) * 2012-02-08 2012-07-18 淮海工学院 一种木香烃内酯提取方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Identifi cation and microbial production of a terpene-based advanced biofuel;Pamela P. Peralta-Yahya等;《NATURE COMMUNICATIONS》;20110927(第2期);讨论和材料部分 *
Lettuce Costunolide Synthase (CYP71BL2) and Its Homolog (CYP71BL1) from Sunflower Catalyze Distinct Regio- and Stereoselective Hydroxylations in Sesquiterpene Lactone Metabolism;Nobuhiro Ikezawa等;《JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》;20110617;第286卷(第24期);21601-21611 *
Reconstitution of the Costunolide Biosynthetic Pathway in Yeast and Nicotiana benthamiana;Qing Liu等;《PLOS ONE》;20110831;第6卷(第8期);第3和8页，图1，材料和方法部分 *

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