CN107312728A - 一种高产高光学纯l‑丙氨酸的大肠杆菌及其应用 - Google Patents

一种高产高光学纯l‑丙氨酸的大肠杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物领域，具体公开了一种经离子束诱变发生基因突变的大肠杆菌，所述大肠杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2017年4月24日，保藏编号为CGMCC No.14067。该大肠杆菌可高效地生产高光学纯的L‑丙氨酸，所得L‑丙氨酸的纯度可达99.99％，产量可达141g/L。本发明提供的大肠杆菌，实现了高效生产高光学纯L‑丙氨酸的目标。

Description

一种高产高光学纯L-丙氨酸的大肠杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及微生物领域，具体地说，涉及一种高产高光学纯L- 丙氨酸的大肠杆菌。
背景技术
L-丙氨酸已广泛应用于医药及食品领域，并作为大宗氨基酸产品 中的一种。目前工业上生产L-丙氨酸有发酵法和酶转化法，满足市场 不同需求。
酶法制备L-丙氨酸原理是L-天门冬氨酸在脱羧酶作用下生产L- 丙氨酸。L-天门冬氨酸通常是由天门冬氨酸酶催化底物富马酸制备。 在酶法制备过程中释放出二氧化碳，从环保及原料损耗的角度，酶法 既不环保又不经济。酶法制备高光学纯L-丙氨酸产品可应用于手性药 物合成领域，并且市场价格也高于发酵法生产的L-丙氨酸产品。
应用L-丙氨酸生产领域发酵法技术来源于Zhang等报道(Zhang X. et al.，ApplMicrobiol Biotechnol，2007，77：355-366；张学礼等，中 国专利CN102329765A，2012，01，25；付刚等，湖北工业大学学报， 2017，32(1)；周哲敏等，微生物学通报，2015，42，2272-2281； 周哲敏等，中国专利CN104774790A，2015，07，15)。在大肠杆菌厌 氧发酵过程中，利用L-丙氨酸脱氢酶的逆反应，把丙酮酸转化成L- 丙氨酸，同时阻断厌氧过程中合成丁二酸、乙醇、乳酸、乙酸及甲酸 合成代谢途径，获得生产高浓度L-丙氨酸大肠杆菌工程菌。从生产成 本和原料利用率角度，发酵法优于酶法生产工艺。
高光学纯L-丙氨酸(ee值需达到99.98％)应用于手性药物合成领 域，如合成手性药物左氧氟沙星。高光学纯L-丙氨酸来源于酶法生产 L-丙氨酸工艺，高光学纯L-丙氨酸售价高于发酵法L-丙氨酸产品。已 报道的发酵法生产L-丙氨酸光学纯度(ee值)达到99.5％(周哲敏等， 中国专利CN104774790A，2015，07，15，Zhang X.et al.，Appl MicrobiolBiotechnol，2007，77：355-366)。
然而，现有技术在提高了所产L-丙氨酸纯度的同时，L-丙氨酸的 产量并未取得良好的进步。因此，亟需提供一种可高产高光学纯L- 丙氨酸的微生物，以实现高效生产高光学纯L-丙氨酸的目标。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种用于 生产高光学纯L-丙氨酸的大肠杆菌及其制备方法与应用。
为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
本发明提供一种经诱变筛选得到的发生基因突变的大肠杆菌，经 鉴定为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，保藏于中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北 辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)， 保藏日期为2017年4月24日，保藏编号为CGMCC No.14067。
本发明所提供的大肠杆菌是由大肠杆菌ATCC55124经诱变后筛 选得到的。具体为：取37℃培养16h大肠杆菌ATCC55124的LB斜 面，加无菌生理盐水10mL，刮下菌落，反复吹打并置摇床上振荡10 min，打散成单个细菌，用血球计数板计数，调整菌体浓度至106个/mL即成菌体悬液。取菌体悬液5mL置辐照皿中，利用12C+6离子束， 按照0Gy、30Gy、40Gy、50Gy、60Gy及70Gy的辐照剂量对上述 大肠杆菌菌体悬浮液分别进行辐照处理。将不同剂量辐照后的单个细 菌悬液梯度稀释后涂布在LB平板培养基上，于30℃培养箱中倒置培 养2-3天。然后转入摇瓶及发酵罐培养，筛选产L-丙氨酸浓度高、纯 度高的菌株。
后经过一系列试验验证发现，所筛选的菌株不仅可生产高光学纯 度的L-丙氨酸，还显著提高了L-丙氨酸的产量。
本发明进一步地提供了所述大肠杆菌在生产高光学纯L-丙氨酸 方面的应用。
所述大肠杆菌生产的L-丙氨酸的光学纯度(ee值)可达到99.99％ 以上。
在本发明的具体实施方式中，所述大肠杆菌生产L-丙氨酸的产量 可达141g/L。
需要说明的是，含有本发明所述大肠杆菌或其代谢产物/发酵产 物的试剂也属于本发明的保护范围。
本发明的有益效果在于：
本发明提供了一种可高效生产高光学纯L-丙氨酸的大肠杆菌， 应用本发明所述菌株生产的L-丙氨酸的光学纯度(ee值)可达 99.99％。不仅如此，本发明所述菌株还实现了高产L-丙氨酸的目标， 为工业生产高光学纯的L-丙氨酸提供了良好的途径。
具体实施方式
下面结合实例对本发明的具体实施方式做进一步详细描述，以大 肠杆菌工程菌具体改造过程为例说明本发明的内容。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商 业途径得到。
下述实施例中：
LB培养基：蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，配制体积 至1L。
实施例1
本实施例用于说明本发明大肠杆菌菌株在50升发酵罐中发酵生 产L-丙氨酸，具体如下：
将本发明提供的大肠杆菌菌株划线LB琼脂平板，37℃培养18小 时。
将平板培养的L-丙氨酸生产菌接种至摇瓶培养基(200ml)中培 养，该培养基含蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，氯化钠10g/L，灭菌 前使用10％氢氧化钠溶液(w/t)调至pH7.2，37℃下120rpm培养至 OD600达3.0。
将上述摇瓶种子按种子罐培养基体积的1％的接种量接入到种子 罐培养基中培养，50升种子罐种后培养基体积20升。种子罐培养基 含玉米浆10g/L，酵母浸粉10g/L，甘油5g/L，灭菌前使用10％氢氧 化钠溶液(w/t)调至pH7.2。在50升种子罐内培养种子，培养温度 37℃，培养通风比为1：0.3，控制罐压为0.03MPa，搅拌转速为300rpm， 培养至OD600达7.0。
将上述种子罐种液按发酵罐培养基体积的10％的接种量接入到 发酵罐培养基中培养，50升发酵罐种后培养基体积35升。发酵罐培 养基含磷酸氢二钾3.5g/L，磷酸二氢钾2.5g/L，一水合氯化钙0.05 g/L，七水合硫酸镁0.5g/L，硫酸铵0.8g/L，氯化锌0.0003g/L，二 水合钼酸钠0.0002g/L，二水合氯化铜0.0003g/L，硼酸0.0005g/L， 四水合氯化锰0.0002g/L，六水合氯化钴0.0003g/L，七水合硫酸亚铁 0.005g/L，葡萄糖145g/L。接种前用氨水调发酵液pH值至7.0。发 酵通风比为1：0.15，搅拌转速为200rpm，发酵培养温度37℃，控制 罐压为0.03MPa，使用氨水维持发酵液pH7.0。当发酵OD600至5.0 时停止通风，当残存葡萄糖低于0.5g/L时停止发酵。
分析方法：使用安捷伦(Agilent-1200)高效液相色谱仪对发酵 液中L-丙氨酸进行测定。发酵液中L-丙氨酸的定量使用安捷伦C18色 谱柱检测，L-丙氨酸光学纯度(ee值)使用日本住友OA6000色谱柱 进行测定。发酵液中葡萄糖含量使用SBA生物传感仪测定。
结果：发酵液中L-丙氨酸含量为141g/L，光学纯度(ee值)为 99.99％。
实施例2
本实施例用于说明本发明大肠杆菌菌株在10立方米发酵罐中发 酵生产L-丙氨酸，具体如下：
将本发明提供的大肠杆菌菌株划线LB琼脂平板，37℃培养18小 时。
将平板培养的L-丙氨酸生产菌接种至摇瓶培养基(700ml)中培 养，该培养基含蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，氯化钠10g/L。灭菌 前使用10％氢氧化钠溶液(w/t)调至pH7.2，37℃下120rpm培养至 OD600达3.0。
将上述摇瓶种子按一级种子罐培养基体积的1％的接种量接入到 种子罐培养基中培养，200升种子罐种后培养基体积70升。种子罐 培养基含玉米浆10g/L，酵母浸粉10g/L，甘油3g/L，灭菌前使用10％ 氢氧化钠溶液(w/t)调至pH7.2。在一级种子罐内培养种子，培养 温度37℃，培养通风比为1：0.3，控制罐压为0.03MPa，搅拌转速为 350rpm，培养至OD600达3.0。
将上述一级种子罐种液按二级种子罐培养基体积的10％的接种 量接入到二级种子罐培养基中培养，2000升二级种子罐种后培养基 体积700升。二级种子罐培养基含玉米浆10g/L，酵母浸粉10g/L， 甘油5g/L，灭菌前使用10％氢氧化钠溶液(w/t)调至pH7.2。在二级种子罐内培养种子，培养温度37℃，培养通风比为1：0.3，控制 罐压为0.03MPa，搅拌转速为250rpm，培养至OD600达7.0。
将上述二级种子罐种液按发酵罐培养基体积的10％的接种量接 入到发酵罐培养基中培养，10立方米发酵罐种后培养基体积7立方 米。发酵罐培养基含磷酸氢二钾3.5g/L，磷酸二氢钾2.5g/L，一水合 氯化钙0.05g/L，七水合硫酸镁0.5g/L，硫酸铵0.8g/L，氯化锌0.0003 g/L，二水合钼酸钠0.0002g/L，二水合氯化铜0.0003g/L，硼酸 0.0005g/L，四水合氯化锰0.0002g/L，六水合氯化钴0.0003g/L，七 水合硫酸亚铁0.005g/L，葡萄糖145g/L。接种前用氨水调发酵液pH 值至7.0。发酵通风比为1：0.15，搅拌转速为150rpm，发酵培养温度37℃，控制罐压为0.03MPa，使用氨水维持发酵液pH7.0。当发酵 OD600至5.0时停止通风，当残存葡萄糖低于0.5g/L时停止发酵。
分析方法：使用安捷伦(Agilent-1200)高效液相色谱仪对发酵 液中L-丙氨酸进行测定。发酵液中L-丙氨酸的定量使用安捷伦C18色 谱柱检测，L-丙氨酸光学纯度(ee值)使用日本住友OA6000色谱柱 进行测定。发酵液中葡萄糖含量使用SBA生物传感仪测定。
结果：发酵液中L-丙氨酸含量为141.7g/L，光学纯度(ee值) 为99.99％。
实施例3
本实施例用于说明本发明大肠杆菌菌株在CN102329765A公开的 发酵条件下发酵生产L-丙氨酸，具体如下：
种子培养基和发酵培养基组成为：葡萄糖120g/L，氯化铵5g/L， NaH2PO4 5g/L，Na2HPO4 5g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，CaCl2 2H2O 0.1g/L， 微量无机盐5ml/L，培养基pH6.5。
微量无机盐组成为：FeCl3·6H2O 1.5mg，CoCl2·6H2O 0.1mg， CuCl2·2H2O0.1mg，ZnCl2 0.1mg，Na2MoO4·2H2O 0.1mg，MnCl2·4H2O 0.2mg，蒸馏水定容至1L，过滤除菌。
250ml三角瓶中种子培养基为150ml，121℃灭菌15min。冷却 后接入本发明菌株CGMCC No.14067，培养温度为30℃，摇床转速 为50r/min，培养18h，用于发酵培养基接种。
3L发酵罐发酵培养基体积为2.4L，121℃灭菌15min。接种量为 0.1％(V/V)，发酵温度为30℃，搅拌转速为100rpm。发酵过程采用 氨水控制pH在6.5，发酵时间为48h。HPLC分析发酵液中L-丙氨 酸和有机酸含量：L-丙氨酸为117.9g/L，L-丙氨酸的光学纯度(ee 值)为99.99％；乳酸、乙酸、乙醇、丁二酸含量均低于0.1g/L。
实施例4
本对比例用于说明CN102329765A公开的大肠杆菌菌株在本发明 发酵条件下发酵生产L-丙氨酸。
本对比例与实施例1的区别仅在于，所使用的微生物为保藏号为 CGMCC No.4036的大肠杆菌。
结果：发酵液中L-丙氨酸含量为115.3g/L，光学纯度(ee值) 为99.5％。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详 尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本 领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础 上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (4)

1.一种用于生产高光学纯L-丙氨酸的大肠杆菌，其特征在于，保藏编号为CGMCCNo.14067，保藏日期为2017年4月24日。
2.权利要求1所述的大肠杆菌在生产高光学纯L-丙氨酸方面的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述L-丙氨酸的光学纯度(ee值)不小于99.99％。
4.含权利要求1所述大肠杆菌或其发酵产物的试剂。
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