CN101153291A - 一种直接酶解植物秸秆发酵生产2.3-丁二醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及直接酶解植物秸秆发酵生产2.3－丁二醇的方法：从山东荣城造纸厂漂白车间附近的污染土中，分离得到具有高纤维素酶活并具产2.3－丁二醇能力的芽孢杆菌，以秸秆类或木质纤维素作唯一碳源，使用该芽孢杆菌在培养基不外加纤维素酶的条件下，进行固态发酵生产2.3－丁二醇。本发明针对石油资源短缺和价格飞涨，开发石油替代，利用秸秆类可再生资源通过微生物发酵生产关键性平台化合物－2.3－丁二醇，实现秸秆类生物质的高值化利用；克服目前微生物发酵产2.3－丁二醇方法中存在的不能直接利用纤维素作碳源和理化预处理易产生发酵抑制物的问题以及液态发酵导致提取难的问题。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵领域，特别涉及利用一株具有分泌纤维素酶能力的芽孢杆菌，在不外加纤维素酶条件下，直接利用秸秆发酵产2.3-丁二醇的方法。
背景技术
2.3-丁二醇作为一种潜在的非常有价值的平台化合物，在国际上引起了广泛的关注。它是一种无色无味的手性化合物，分子量90.12kDa，沸点较高(180-184℃)，凝固点较低(-60℃)，是优良的抗冻剂。作为化工中间体，它可以经脱水转化为具有高燃烧值在燃料添加剂方面广泛应用的丁二酮和在合成橡胶上广泛应用的1.3-丁二烯；通过缩合、聚合等反应可生成别的化合物，如：苯乙烯，辛烷和2.3-丁二醇二乙酸酯等等，作为添加剂可广泛应用于油墨、化妆品、洗液、防冻剂、熏蒸剂、软化剂、增塑剂、炸药和药物的手性载体等等。在材料和纺织生产加工行业分别用来生产聚丁烯对苯二酸酯树脂、γ-丁内酯和斯潘德克斯弹性纤维等等。由于它的如此广泛的用途，国际市场上的需求在不断高涨。特别是环境上的考虑，作为液体燃料添加剂在当今世界内引起了更加重视。
细菌类微生物发酵生产2.3-丁二醇的代谢途径研究得已非常清楚(附图1)，主要涉及到乙酰乳酸合成酶、乙酰乳酸脱羧酶、3-羟基丁酮还原酶和3-羟基丁酮氧化酶等关键酶，这为微生物发酵生产2.3-丁二醇提供了很好的理论依据。以葡萄糖作为初始底物细菌微生物发酵生产2.3-丁二醇的终产品除2.3-丁二醇外，通常还伴有3-羟基丁酮、乙酸、乙醇、乳酸和琥珀酸等。其中3-羟基丁酮经3-羟基丁酮还原酶还原可生成2.3-丁二醇，该反应是可逆的。2.3-丁二醇有三种立体异构体：右旋(dextro-)、左旋(levo-)和中间(meso-)异构体形式。通常，不同微生物能产生其中的两种立体异构体形式。
目前广泛报道产2.3-丁二醇的菌种有克雷伯氏菌(Klebsiella)、枯草芽孢杆菌(B.Ssubtilis)、多粘类芽孢杆菌(B.Polymyxa)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、产气气杆菌(Aerobacter aerogenes)、产气肠杆菌(Enterobacter aeroyenes)、沙雷氏菌、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、产气气杆菌(Aerobacter aerogenes)、阴沟肠杆菌(Enterbacter cloacae)以及沙雷氏菌属(Serratia)和假单胞菌属(Pseudomonas)的一些微生物。其中克雷伯氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)和多粘类芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)产2.3-丁二醇能力和潜力较大，因而研究得也较广泛(Yu&Saddler，appl.Environ.Microbiol.，1982，777-784.)。但这些研究大多是直接以葡萄糖或者以纤维素的酸/碱/酶法水解糖液作为碳源，未见到有能直接利用纤维素作碳源的研究报道。
目前大多利用液态发酵生产2.3-丁二醇，由于发酵液含水量很大而2.3-丁二醇沸点又很高，所以这给后续的提取工艺带来了很大的困难。如：全蒸发、膜蒸馏、真空膜蒸馏以及有机溶剂萃取等等(M.J.Syu.Appl.Microbiol.Biotechnol.，2001，55：10-18)。因而本发明在本课题有着多年来固态发酵相关研究的深刻认识和良好基础上，采用固态发酵生产2.3-丁二醇。
尽管以天然可再生资源的木质纤维废弃物作为碳源具有很强的经济可行性，但由于纤维素酶的昂贵价格以及理化预处理导致水解物中的发酵抑制物等问题，使纤维质类可再生资源通过微生物发酵生产2.3-丁二醇难以工业化。鉴于此，本发明公开了一种直接以秸秆作为唯一碳源，在不外加纤维素酶的条件下通过微生物液体和固态发酵生产2.3-丁二醇的方法，能够解决生产2.3-丁二醇时，必须外加纤维素酶或用理化预处理常常导致糖液中存在发酵抑制物的问题；通过固态发酵还能够解决液态发酵时2.3-丁二醇浓度低，难以蒸馏提取和提取成本偏高的问题。
发明内容
本发明的目的在于针对上述2.3-丁二醇研究开发中的技术难点和存在的问题，提供一种利用一株具有分泌纤维素酶能力的芽孢杆菌，在不外加纤维素酶条件下，直接利用秸秆发酵产2.3-丁二醇的方法。本发明的技术方案如下：
本发明提供的直接酶解植物秸秆发酵制备2.3-丁二醇的方法，该方法为：提供一具有分泌纤维素酶能力的芽孢杆菌；以秸秆类或木质纤维素作唯一碳源，使用该芽孢杆菌在培养基不外加纤维素酶的条件下，进行发酵生产2.3-丁二醇；其具体步骤如下：
1)取山东荣城造纸厂漂白车间附近的污染土，分离得到具有高纤维素酶活并具产2.3-丁二醇能力的芽孢杆菌，该芽孢杆菌在结晶纤维素平板上37℃培养40h，菌落特征为：表面无光泽、椭圆型、黄白色黏液状、有香味，易挑起，生长旺盛；
2)碱处理秸秆粉：
在植物秸秆粉料中加入质量百分比浓度为2％的NaOH溶液得植物秸秆碱液，并在85℃水浴中处理1h，水洗至中性，60℃烘干得碱处理后的秸秆粉料，备用；所述植物秸秆碱液中的固液质量比1∶5；
3)将碱处理后的秸秆粉料进行液体发酵培养或者固态发酵培养制备2.3-丁二醇：
所述的将碱处理后的秸秆粉料进行液体发酵培养制备2.3-丁二醇步骤如下：
从步骤1)芽孢杆菌的保藏斜面上，挑取一环接种在种子培养基上，30-37℃，160-220rpm震荡条件下培养12-24h后制得芽孢杆菌种子液；
所得芽孢杆菌种子液按体积比7-12％的比例转接于未经优化的液体发酵培养基中，30-37℃，160-220rpm震荡发酵培养96-144h；之后，发酵液经100-120目过滤除去发酵液中残渣，得到的过滤液在4000-8000转/min，离心5-20min后获得上清液，上清液再在40-60℃进行减压蒸馏；蒸馏的冷凝回收液再通过精馏，收取175-183℃馏分即为2.3-丁二醇；
所述液体发酵培养基的组成及配比为：NaCl 5g，蛋白胨5g，碱处理后的麦草秸秆粉50g，自来水1000ml，搅拌混匀后调pH6.5-7.0，121℃灭菌20min：
所述将碱处理后的秸秆粉料进行固态发酵培养制备2.3-丁二醇的步骤如下：
从步骤1)芽孢杆菌的保藏斜面上，挑取一环接种在种子培养基上，30-37℃，160-220rpm震荡条件下培养12-24h后制得芽孢杆菌种子液；
所得芽孢杆菌种子液按重量比的7-10％的比例转接于未经优化的固态发酵培养基中，30-37℃，180-220rpm震荡培养培养120-144h；固态发酵完毕后，再在索氏抽提器中用正丁醇、醋酸正丁醇或醋酸乙酯有机溶剂，反复抽提6h，循环回流4-6次/h，得到的粗提液再在旋转蒸发仪上经40-60℃下减压浓缩至体积不变时即得2.3-丁二醇；
所述的固态发酵培养基组成及配比为：碱处理植物秸秆粉250g，无机盐溶液1L，所述无机盐溶液中含KH2PO44g，(NH4)2SO416g，和MgSO41g，搅拌混匀后调pH6.5-7.0，121℃灭菌20min。
所述的植物秸秆为麦草、稻草或玉米秸秆。
本发明的具高纤维素酶活和2.3-丁二醇产生能力菌株的选择：
1)取至山东荣城造纸厂漂白车间附近的污染土，经平板涂布和反复划线培养，分离到具有纤维素酶活的芽孢杆菌。
2)兼具高纤维素酶活和2.3-丁二醇产生能力菌株的选择。对步骤1)得到的芽孢杆菌，通过乙酰甲基甲醇反应试验来初步确定能产2.3-丁二醇的菌株，然后对这些菌株进行纤维素刚果红培养基试验，通过透明圈大小进一步选择高产纤维素酶获的菌株，选取透明圈较大的菌株编号保藏。
3)步骤2)所获得的编号菌株进行液体发酵试验，通过定期间隔取样来检测纤维素滤纸酶活和2.3-丁二醇含量，通过比较从而获得了一株兼具高纤维素酶活和2.3-丁二醇产生能力的菌株。
4)步骤3)所获得菌株进行液态和固态发酵2，3-丁二醇。在未经优化的情况下，步骤3)获得的芽孢杆菌株直接进行液体或固态摇瓶发酵实验，发酵条件：30-37℃，160-220rpm摇瓶培养96-144h。检测方法为：纤维素酶活用纤维素酶滤纸酶活力来表示，定义为每分钟水解滤纸条(1×6cm)纤维素生成1μmol葡萄糖的1ml发酵液中的酶量为一个酶活力单位(IU)；2.3-丁二醇的测定方法为比色法(Westerfeld，1945.J.Biol.Chem，161：495-502；Speckman & Collins，1968.Anal.Biochem，22：154-160)和气相色谱法。
本发明提供的直接酶解植物秸秆发酵生产2.3-丁二醇的方法，具有如下优点：
以秸秆类可再生资源代替石油作原料，原料丰富，再生循环迅速，环境友好，
原料成本大大降低；秸秆类生物质作为发酵用碳源不需酶解或酸碱等预处理，降低了预处理成本的同时缩短了生产周期；采用固态发酵体系，提高了单位体积发酵液中目的产物含量，便于产品的提取分离；固态发酵体系在提取分离时有利于节约能耗和化学试剂消耗。总之，本发明针对石油资源短缺和价格飞涨，开发石油替代，利用秸秆类可再生资源通过微生物发酵生产关键性平台化合物-2.3-丁二醇，实现秸秆类生物质的高值化利用；克服目前微生物发酵产2.3-丁二醇方法中存在的不能直接利用纤维素作碳源和理化预处理易产生发酵抑制物的问题以及液态发酵导致提取难的问题。
附图说明
附图1葡萄糖作碳源产2.3-丁二醇的代谢途径及2.3-丁二醇循环；灰色部分是常见的细菌产2.3-丁二醇的路线(参见Juni E，Heym GA(1956).J Bacteriol71：425-432)；
附图2培养40hCMC平板上一株具有多粘类芽孢杆菌菌落特征照片
具体实施方式
筛选分离本发明的能分泌纤维素酶和产2.3-丁二醇能力的芽孢杆菌株，步骤如下：
1)菌株的分离
从山东荣城造纸厂漂白车间附近采土样10g，放入已灭菌的盛有90ml水和玻璃珠的三角瓶中，摇瓶剧烈震荡30min；沸水浴中保持10min后，以无菌水进行梯度稀释(10-2-10-8)，分别取0.2ml加入分离平板中均匀涂布完毕后，于37℃培养16-24h，挑取菌落形态差异明显的单菌落再在平板上进行反复划线培养3-4次，即获得纯株芽孢杆菌。该芽孢杆菌在结晶纤维素平板上30-37℃培养24-40h，菌落特征为：表面无光泽、椭圆型、黄白色黏液状、有香味，易挑起，生长旺盛。
2)从步骤1)获得的芽孢杆菌中，选择具备有氧发酵产2.3-丁二醇能力的菌株并保存；
通过乙酰甲基甲醇反应(V.P.反应)对上述芽孢杆菌进行初步定性鉴定(这是由于乙酰甲基甲醇(3-羟基丁酮)为2.3-丁二醇的前体化合物-如附图1所述的代谢途径，可经在相关代谢途径中广泛存在的3-羟基丁酮还原酶还原为2.3-丁二醇，因此，此定性测定方法被广泛采用)：从步骤1)分离获得的芽孢杆菌斜面上，挑取一环接种在乙酰甲基甲醇反应(V.P.反应)培养基中37℃静置培养24-48h，鉴别出V.P.反应阳性的芽孢杆菌，其中一部分菌株在发酵液面上形成菌膜；挑取在液面上形成漂浮菌膜的菌株再进行摇瓶V.P.反应试验24-48h，进一步获得了摇瓶V.P.反应阳性的菌株。这样就获得了能有氧发酵产2.3-丁二醇的菌株，编号保存。
所述乙酰甲基甲醇反应(V.P.反应)培养基(g/L)：蛋白胨5，葡萄糖5，NaCl 5，自来水1L，pH7.0-7.2，121℃灭菌15min；
所述菌种保藏培养基(g/L)：KH2PO4 1，蛋白胨5，酵母膏5，葡萄糖1，琼脂20，自来水1L，pH7.0-7.2，121℃灭菌15min；
3)兼具高纤维素酶活和2.3-丁二醇产生能力菌株的获得
以接种环在步骤2)所获得的菌株斜面上轻轻粘一下，然后在结晶纤维素平板上划线培养12-40h，挑取生长良好的单菌落就获得了初步具有纤维素酶活的菌株，把该菌株再点接在纤维素刚果红培养基上，培养12-40h后，观察菌落周围的透明圈情况，透明圈的大小可大致反映菌株产纤维素酶活的高低；选取透明圈较大的菌株进行液体和固态摇瓶发酵试验，通过定期间隔取样以进一步检测纤维素滤纸酶活和2.3-丁二醇含量。通过比较，获得了一株兼具高纤维素酶活和2.3-丁二醇产生能力的菌株，编号保藏；
步骤3)所述的检测方法为：纤维素酶活用纤维素酶滤纸酶活力来表示，定义为每分钟水解滤纸条(1×6cm)纤维素生成1μmol葡萄糖的1ml发酵液中的酶量为一个酶活力单位(IU)；2.3-丁二醇的测定方法为比色法(Westerfeld，1945.J.Biol.Chem，161：495-502；Speckman & Collins，1968.Anal.Biochem，22：154-160)和气相色谱法。
所述结晶纤维素平板培养基(g/L)：结晶纤维素2，蛋白胨5，Na2HPO4 0.1，KH2PO4 0.5，MgSO4·7H2O 0.5，NaCL 1，水洗3-4遍的琼脂粉15，自来水1L。pH 7.0-7.5，115℃/20min灭菌；
所述纤维素刚果红培养基(g/L)：KH2PO4 0.5，MgSO4 0.25，纤维素粉1.88，刚果红0.2，琼脂20，明胶2.0，pH7.0；
所述液体发酵培养基(g/L)：NaCl 5，蛋白胨5，碱处理后的麦草秸秆粉50，自来水1L，pH6.5-7.0，121℃灭菌20min；
所述固态发酵培养基(g/L)：碱处理麦草粉250，无机盐溶液1L(其中含KH2PO4 4，(NH4)2SO4 16，MgSO4 1)；
碱处理秸秆粉：粉碎并过60目筛分后的秸秆粉，以固液质量比1∶5加入2％NaOH溶液在85℃水浴中处理1h，水洗至中性，60℃烘干备用。下面通过具体实施例进一步描述本发明：
实施例1
从筛选得到的能分泌纤维素酶和产2.3-丁二醇能力的芽孢杆菌株保藏斜面上，挑取一环接种在25ml种子培养基上(三角瓶体积为100ml)，30-37℃，160-220rpm震荡条件下培养12-24h后，按接种量7-12％转接入碱处理后的秸秆为唯一碳源的50ml液体发酵培养基中(三角瓶体积为250ml)震荡发酵培养，培养条件为：30-37℃，160-220rpm培养96-144h；每隔24h取样测纤维素酶滤纸酶活和2.3-丁二醇含量；其纤维素酶最大滤纸酶活可达0.18-0.26IU/ml；2.3-丁二醇产量在0.14-0.24g/L；
发酵培养完毕，首先进行100-120目过滤以除去发酵液中残渣，过滤液经进一步离心(4000-8000转/min，5-20min)后，在40-60℃减压蒸馏，得到的冷凝回收液再进行精馏，回流比控制在3-4∶1，收取175-183℃馏分，即为2.3-丁二醇；
所获得2.3-丁二醇0.12-0.23g，纯度大于90％。
所述种子培养基与乙酰甲基甲醇反应(V.P.反应)培养基相同；
实施例2
从菌种试管斜面上挑取一环接种在25ml种子培养基上三角瓶(三角瓶体积为100ml)，震荡(160-220rpm，30-37℃)培养12-24h后，按接种量10-13％转接入碱处理秸秆为唯一碳源的固态发酵培养基中三角瓶(三角瓶体积为250ml)震荡培养，在固态发酵培养基上装样量：10g碱处理麦草+40ml无机盐溶液，培养条件：30-37℃，180-220rpm摇瓶(体积为250ml)培养120-144h，每隔24h取样测纤维素酶滤纸酶活和2.3-丁二醇含量；纤维素酶滤纸酶活可达2.1-4.7IU/g干料，2.3-丁二醇产量可在0.026-0.067g/g干料；固态发酵完毕后，再在索氏抽提器中用正丁醇、醋酸正丁醇或醋酸乙酯等有机溶剂，反复抽提6h，循环回流4-6次/h，得到的粗提液再在旋转蒸发仪上经40-60℃下减压浓缩至体积不变时即得2.3-丁二醇0.27-0.81g，纯度为80-90％。
本发明所提供的利用微生物直接发酵秸秆类生物质生产2.3-丁二醇的方法具有原料价廉易得、发酵产2.3-丁二醇浓度高，产品便于提取等优点。
Claims (1)
1.一种直接酶解植物秸秆发酵制备2.3-丁二醇的方法，该方法为：提供一具有分泌纤维素酶能力的芽孢杆菌；以秸秆类或木质纤维素作唯一碳源，使用该芽孢杆菌在培养基不外加纤维素酶的条件下，进行发酵生产2.3-丁二醇；其具体步骤如下：
1)取山东荣城造纸厂漂白车间附近的污染土，分离得到具有高纤维素酶活并具产2.3-丁二醇能力的芽孢杆菌，该芽孢杆菌在结晶纤维素平板上37℃培养40h，菌落特征为：表面无光泽、椭圆型、黄白色黏液状、有香味，易挑起，生长旺盛；
2)碱处理秸秆粉：
在植物秸秆粉料中加入质量百分比浓度为2％的NaOH溶液得植物秸秆碱液，并在85℃水浴中处理1h，水洗至中性，60℃烘干得碱处理后的秸秆粉料，备用；所述植物秸秆碱液中的固液质量比1∶5；
3)将碱处理后的秸秆粉料进行液体发酵培养或者固态发酵培养制备2.3-丁二醇：
所述的将碱处理后的秸秆粉料进行液体发酵培养制备2.3-丁二醇步骤如下：
从步骤1)芽孢杆菌的保藏斜面上，挑取一环接种在种子培养基上，30-37℃，160-220rpm震荡条件下培养12-24h后制得芽孢杆菌种子液；
所得芽孢杆菌种子液不经优化，按体积比7-12％的比例将该芽孢杆菌种子液转接于液体发酵培养基中，30-37℃，160-220rpm震荡发酵培养96-144h；之后，发酵液经100-120目过滤除去发酵液中残渣，得到的过滤液在4000-8000转/min，离心5-20min后获得上清液，上清液再在40-60℃进行减压蒸馏；蒸馏的冷凝回收液再通过精馏，收取175-183℃馏分即为2.3-丁二醇；
所述液体发酵培养基的组成及配比为：NaCl 5g，蛋白胨5g，碱处理后的麦草秸秆粉50g，自来水1000ml，搅拌混匀后调pH6.5-7.0，121℃灭菌20min；
所述将碱处理后的秸秆粉料进行固态发酵培养制备2.3-丁二醇的步骤如下：
从步骤1)芽孢杆菌的保藏斜面上，挑取一环接种在种子培养基上，30-37℃，160-220rpm震荡条件下培养12-24h后制得芽孢杆菌种子液；
所得芽孢杆菌种子液不经优化，按重量比的7-10％的比例转接于固态发酵培养基中，30-37℃，180-220rpm震荡培养培养120-144h；固态发酵完毕后，再在索氏抽提器中用正丁醇、醋酸正丁醇或醋酸乙酯有机溶剂，反复抽提6h，循环回流4-6次/h，得到的粗提液再在旋转蒸发仪上经40-60℃下减压浓缩至体积不变时即得2.3-丁二醇；
所述的固态发酵培养基组成及配比为：碱处理植物秸秆粉250g，无机盐溶液1L，所述无机盐溶液中含KH2PO4 4g，(NH4)2SO4 16g，和MgSO4 1g，搅拌混匀后调pH6.5-7.0，121℃灭菌20min。
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