CN106498005A - 聚乙烯吡咯烷酮提高木质纤维素酶解糖化得率的方法 - Google Patents

聚乙烯吡咯烷酮提高木质纤维素酶解糖化得率的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了聚乙烯吡咯烷酮提高木质纤维素酶解糖化得率的方法，其特征在于，将木质纤维素或预处理后的木质纤维素加入缓冲溶液中，或者是将木质纤维素连同相应的预处理液加入缓冲溶液中，再加入PVP和纤维素酶，加热反至40～60℃反应，得到木质纤维素的糖化水解液；PVP的重均分子量为2500‐100000，PVP与木质纤维素的质量比为0.2‐25：100。本发明方法中添加剂PVP相比于一般的酶解糖化促进剂，可以更显著的提高木质纤维素中纤维素的酶解糖化得率，添加适量的PVP，就可以使木质纤维素中纤维素的酶解效率净提高6.3‐69.1％。

Description

聚乙烯吡咯烷酮提高木质纤维素酶解糖化得率的方法
技术领域
本发明属于木质纤维素酶解技术领域，特别涉及一种以非离子表面活性剂聚乙烯吡咯烷酮(PVP)作为酶解助剂，提高木质纤维素酶解糖化得率的方法。
背景技术
石油资源日益枯竭，环境问题日益突出，利用木质纤维素原料生产生物乙醇和化学品的研究成为近年来的研究热点。由于木质纤维素具有来源丰富、价格低廉、可再生等特点，为避免与人争粮，木质纤维素将成为生物乙醇生产最具潜力的原料。木质纤维素生产生物乙醇通常包括预处理、酶解、发酵、蒸馏等工艺。但目前该工艺面临着众多的瓶颈问题，如预处理成本高、酶解效率低、纤维素酶利用效率低等，导致了生物乙醇的总生产成本高，制约着生物乙醇的工业化生产。
为了达到较高的葡萄糖转化率，先前的学者们发现通过添加表面活性剂可以有效地增强纤维素的水解，降低纤维素酶的用量。Castanon和Wilke通过添加Tween 80将旧报纸48h的酶解转化率提高了14％(Eriksson et al.,2002)。Tween 20的添加可以将微晶纤维素的酶解转化率提高35％(Ooshima et al.,1986b)。牛血清蛋白的添加可以将预处理后的玉米秸秆72h酶解效率从82％提高到92％，同时降低了β‐糖苷酶的用量(Yang&Wyman，2006)，虽然目前添加剂的使用可以降低纤维素酶的用量，提高酶解效率，但是距离实际的工业化生产目标仍然有一定的距离，寻找更加高效清洁的表面活性剂是研究者们的一个重要目标。
发明内容
为了克服木质纤维素酶解工艺现有技术所存在的酶解效率低、可发酵糖浓度低、生产成本高等缺点，本发明提供了用重均分子量为2500‐100000的PVP作为酶解助剂显著提高木质纤维素酶解糖化得率的方法。
聚乙烯吡咯烷酮(PVP)作为一种合成水溶性高分子化合物，具有水溶性高分子化合物的一般性质，胶体保护作用、成膜性、粘结性、吸湿性、增溶或凝聚作用。聚乙烯基吡咯烷酮作为高分子表面活性剂，在不同的分散体系中，可作为分散剂、乳化剂、增稠剂、流平剂、粒度调节剂、抗再沉淀剂、凝聚剂、助溶剂和洗涤剂。聚乙烯吡咯烷酮优异的溶解性能及生理相容性，被广泛应用于医药卫生、食品加工、日用化妆品、洗涤剂等等。但是其用作木质纤维素酶解糖化的促进剂却未见研究和报道。本发明发现用重均分子量为2500‐100000的PVP作为酶解助剂，可以显著的提高木质纤维素酶解糖化得率。本发明还发现，将预处理液与木质纤维素底物直接加缓冲液稀释酶解糖化的方法，既可以省去木质纤维素底物与预处理液分离的工艺，也可以回收预处理液中的单糖，实现木质纤维素资源的综合利用。
根据木质纤维素原料和预处理条件的不同，一般在预处理液中残留有酶解和发酵的抑制剂，酚类化合物就是其中一种，而PVP能与特定多酚化合物(如单宁)形成络合物，减缓其对酶解和发酵的抑制作用，因而可以省去木质纤维素底物与预处理液分离的传统步骤，节约水资源，简化操作。PVP对于木质纤维素酶解糖化的促进有利于降低纤维素乙醇的生产成本，有助于推动纤维素乙醇的工业化。
本发明的目的通过下述方案实现：
聚乙烯吡咯烷酮提高木质纤维素酶解糖化得率的方法：将木质纤维素或预处理后的木质纤维素加入缓冲溶液中配置成酶解液，或者是将木质纤维素连同相应的预处理液加入缓冲溶液中配置成酶解液，再加入PVP和纤维素酶，加热反至40～60℃反应，得到木质纤维素的糖化水解液；所述PVP的重均分子量为2500‐100000，所述PVP与木质纤维素干重的质量比为0.2‐25：100。
为进一步实现本发明目的，优选地，所述缓冲溶液为醋酸‐醋酸钠、柠檬酸‐柠檬酸钠和磷酸盐缓冲液中至少一种。缓冲液的作用主要是为了保证酶解液的pH在酶解前后没有太大的变化，同时控制一定的离子强度，保证纤维素酶能有较高的活性。
优选地，所述缓冲液的pH为4.0～6.5，离子强度为25～400mmol/L。
优选地，所述纤维素酶的用量以木质纤维素中的葡聚糖含量计为1～20FPU/g。
优选地，所述反应的时间为24～96h。
优选地，所述木质纤维素为滤纸纤维素、微晶纤维素(Avicel)、松木、桉木、杨木、水曲柳、沙棘、伯树、杉木、桦木、玉米芯、玉米秸秆、麦秆、甘蔗渣、稻草、稻壳、食用菌基质、花生壳中的至少一种。
优选地，所述预处理液是木质纤维素对应的预处理方法所得到的液体，如稀酸(DA)法和酸性亚硫酸预处理(SPORL)法得到的液体，一般含有较多的的酶解和发酵抑制物，根据预处理的方式不同而不同。
优选地，所述预处理的方式包括：生物法、机械粉碎法、挤出法、微波处理法、超声处理法、碱处理法、酸处理法、臭氧分解法、有机溶剂法、离子液体处理法、蒸汽爆破法、水热法、氨气爆破法和湿氧化法中的至少一种。
优选地，所述木质纤维素干重与酶解液质量比为1‐30：100。通常需要适当控制木质纤维素干重与酶解液质量的比，当低于1质量％时，酶解后糖浓度很低，工业应用的价值低，当高于30质量％时，酶解液的粘度很大，木质纤维素水化困难，输送不方便。因此，将木质纤维素的浓度控制在1‐30质量％是适宜的，但是适当超出上述范围也是可以的。
优选地，所述加入PVP和纤维素酶前的酶解液的pH为4.0～6.5。进一步优选酶解液的pH为4.8‐6.0。如果酶解液的pH低于4.0或高于6.5，纤维素的酶解糖化效率将会有较为明显的下降，因为目前纤维素酶的最适pH在5.0附近，过高或过低都会影响纤维素酶的活性，但是只要加入PVP，还是可以提高木质纤维素酶解糖化得率。
本发明中，PVP的分子量对木质纤维素的酶解有较大影响，重均分子量超过100000的PVP需要较多的量才能显著促进纤木质纤维素的酶解糖化。
本发明中，PVP的掺量对木质纤维素的酶解糖化有较大的影响，PVP的掺量较少时，对酶解糖化的促进作用不明显，随着PVP的添加量逐渐增大，对木质纤维素的酶解糖化作用逐渐增强，当达到一定的掺量时，酶解糖化增加不明显甚至开始下降，且生产成本增加。所述PVP掺量与木质纤维素的比为0.2‐25质量％。
本发明中，对纤维素酶没有特定的要求，对于目前普遍使用的Celluclast 1.5L和Cellic CTec2都有很好的促进作用。
本发明中，纤维素酶添加量越多，木质纤维素酶解糖化率越高，但是纤维素酶的成本较高，因此添加量不能过高，纤维素酶的添加量较低时，木质纤维素酶解糖化不完全，原料中的纤维素不能充分的转化成单糖。所以，纤维素酶的添加量以木质纤维素中的葡聚糖含量计为1～20FPU/g。更优选地，所述纤维素酶的添加量以木质纤维素中的葡聚糖含量计为3～10FPU/g。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：
(1)本发明利用了广泛使用的非离子表面活性剂PVP，其来源方便、价格低廉，有优良的生理惰性，是一种绿色环保的添加剂。
(2)本发明方法中添加剂PVP相比于一般的酶解糖化促进剂，可以更显著的提高木质纤维素中纤维素的酶解糖化得率，添加适量的PVP，就可以使木质纤维素中纤维素的酶解效率净提高6.3‐69.1％。
(3)本发明所述的方法，PVP可以与预处理液中糖化和发酵抑制物多酚类物质(单宁)络合，可以省去木质纤维素底物与预处理液的分离工艺，并且可以回收预处理液中的糖，实现木质纤维素资源的综合利用。
(4)本发明所述的方法中，木质纤维素的酶解糖化在较广的pH范围(4.0‐6.5)内都有较好的促进作用。
(5)本发明方法有利于降低生物乙醇的生产成本。
(6)本发明将PVP直接加到含有预处理液的底物中，酶解效率也有很好的提高，省去木质纤维素底物与预处理液的分离，节约了水资源，避免了环境污染，对于降低实际生产成本也具有重要意义。
附图说明
图1是不同重均分子量的PVP对桉木‐DA的酶解促进效果对比图。
图2是不同重均分子量PVP对微晶纤维素的酶解促进作用效果图，包含实施例1。
图3是不同重均分子量PVP对桉木‐DA的酶解促进作用效果图，包含实施例4。
图4是不同重均分子量PVP对不同底物含量的桉木‐DA的酶解促进效果图，包含实施例9。
图5是SPORL法处理的桉木和相应的预处理液一起酶解的情况下，添加PEG 4600、PVP 24000、PVP 160000后的酶解效果对比，包含实施例12。
具体实施方式
为更好地理解本发明，下面结合附图和实施例对本发明作进一步的描述，但本发明的实施方式不限于此。下列实施例中所用试剂均可从市场购买得到。实施例水解液中葡萄糖浓度是通过生物传感分析仪(SBA‐40E，山东省生物科学研究院)测定的。
实施例1
取100质量份PH101微晶纤维素，加入到5000质量份pH为4.8，离子强度为50mmol/L的醋酸‐醋酸钠缓冲溶液中，加入0.25质量份PVP 24000，再加入5FPU/g的纤维素酶，在50℃温度下反应72h。反应结束后，固液分离获得纤维素水解液，通过生物传感分析仪测定葡萄糖含量，统计结果如表1所示。
实施例2
取100质量份稀酸法预处理过的桉木(桉木‐DA)，加入到5000质量份pH为6.0，离子强度为100mmol/L的磷酸盐缓冲溶液中，加入5质量份PVP 10000，再加入3FPU/g以木质纤维素中的葡聚糖含量计的纤维素酶，在50℃温度下反应72h。反应结束后，固液分离获得木质纤维素水解液，通过生物传感分析仪测定葡萄糖含量，统计结果如表1所示。
实施例3
取100质量份稀酸法预处理过的桉木，加入到5000质量份pH为4.0，离子强度为25mmol/L的醋酸‐醋酸钠缓冲溶液中，加入5质量份PVP 10000，再加入3FPU/g以木质纤维素中的葡聚糖含量计的纤维素酶，在50℃温度下反应72h。反应结束后，固液分离获得木质纤维素水解液，通过生物传感分析仪测定葡萄糖含量，统计结果如表1所示。
实施例4
取100质量份稀酸法预处理过的桉木，加入到5000质量份pH为4.8，离子强度为50mmol/L的醋酸‐醋酸钠缓冲溶液中，加入5质量份PVP 10000，再加入5FPU/g，以木质纤维素中的葡聚糖含量计的纤维素酶，在50℃温度下反应72h。反应结束后，固液分离获得木质纤维素水解液，通过生物传感分析仪测定葡萄糖含量，统计结果如表1所示。
实施例5
取100质量份稀酸法预处理过的桉木，加入到5000质量份pH为4.8，离子强度为200mmol/L的醋酸‐醋酸钠缓冲溶液中，加入5质量份PVP 10000，再加入20FPU/g以木质纤维素中的葡聚糖含量计的纤维素酶，在50℃温度下反应72h。反应结束后，固液分离获得木质纤维素水解液，通过生物传感分析仪测定葡萄糖含量，统计结果如表1所示。
实施例6
取100质量份酸性亚硫酸钠预处理过的松木，加入到5000质量份pH为5.5，离子强度为25mmol/L的柠檬酸‐柠檬酸钠缓冲溶液中，加入5质量份PVP 24000，再加入3FPU/g以木质纤维素中的葡聚糖含量计的纤维素酶，在40℃温度下反应72h。反应结束后，固液分离获得木质纤维素水解液，通过生物传感分析仪测定葡萄糖含量，统计结果如表1所示。
实施例7
取100质量份酸性亚硫酸钠预处理过的桉木(桉木‐SPORL)，加入到5000质量份pH为4.5，离子强度为25mmol/L的柠檬酸‐柠檬酸钠缓冲溶液中，加入5质量份PVP 8000，再加入3FPU/g以木质纤维素中的葡聚糖含量计的纤维素酶，在50℃温度下反应48h。反应结束后，固液分离获得木质纤维素水解液，通过生物传感分析仪测定葡萄糖含量，统计结果如表1所示。
实施例8
取100质量份稀酸法预处理过的桉木，加入到2000质量份pH为4.8，离子强度为25mmol/L的柠檬酸‐柠檬酸钠缓冲溶液中，加入5质量份PVP 24000，再加入3FPU/g以木质纤维素中的葡聚糖含量计的纤维素酶，在50℃温度下反应72h。反应结束后，固液分离获得木质纤维素水解液，通过生物传感分析仪测定葡萄糖含量，统计结果如表1所示。
实施例9
取100质量份稀酸法预处理过的桉木，加入到1000质量份pH为4.8，离子强度为50mmol/L的柠檬酸‐柠檬酸钠缓冲溶液中，加入5质量份PVP 10000，再加入3FPU/g以木质纤维素中的葡聚糖含量计的纤维素酶，在50℃温度下反应72h。反应结束后，固液分离获得木质纤维素水解液，通过生物传感分析仪测定葡萄糖含量，统计结果如表1所示。
实施例10
取100质量份圣泉玉米芯残渣，加入到5000质量份pH为4.8，离子强度为50mmol/L的柠檬酸‐柠檬酸钠缓冲溶液中，加入5质量份PVP 8000，再加入3FPU/g以木质纤维素中的葡聚糖含量计的纤维素酶，在50℃温度下反应96h。反应结束后，固液分离获得木质纤维素水解液，通过生物传感分析仪测定葡萄糖含量，统计结果如表1所示。
实施例11
取100质量份稀酸法预处理过的桉木和相应的300质量份预处理液(预处理的固液比为1：3，干重约500.00g木片原料，硫酸的用量为木片干重的1.1％，将硫酸水溶液倒于水平式旋转蒸煮器内，加入木片，设定蒸煮温度为165℃，其中升温时间为50min，保温时间为60min，蒸煮压力为0.8MPa，反应完后分离得到的液体)，加入到2200质量份pH为4.8，离子强度为50mmol/L的柠檬酸‐柠檬酸钠缓冲溶液中，加入5质量份PVP 10000，再加入3FPU/g以木质纤维素中的葡聚糖含量计的纤维素酶，在50℃温度下反应72h。反应结束后，固液分离获得木质纤维素水解液，通过生物传感分析仪测定葡萄糖含量，统计结果如表1所示。
实施例12
取100质量份酸性亚硫酸钠预处理过的桉木和相应的300质量份预处理液(预处理的固液比为1：3，干重约500.00g木片原料，硫酸的用量为木片干重的1.1％，亚硫酸氢钠用量为木片干重的4％，将硫酸水溶液倒于水平式旋转蒸煮器内，加入木片，再加入亚硫酸氢钠，设定蒸煮温度为165℃，其中升温时间为50min，保温时间为60min，蒸煮压力为0.8MPa，反应完后分离得到的液体)，加入到4700质量份pH为4.8，离子强度为50mmol/L的醋酸‐醋酸钠缓冲溶液中，加入5质量份PVP 24000，再加入3FPU/g以木质纤维素中的葡聚糖含量计的纤维素酶，在50℃温度下反应72h。反应结束后，固液分离获得木质纤维素水解液，通过生物传感分析仪测定葡萄糖含量，统计结果如表1所示。
以上实施例同时做了添加了相同质量份PEG 4600(将实施例中的PVP换成等质量份数的常用的纤维素酶解助剂PEG 4600，其他条件不变)和空白(将实施例中的PVP换成相应的等质量份数的缓冲液，其他条件不变)对比例，与采用本发明方法的实施例进行木质纤维素酶解糖化得率的比较。
表1各实施例和对比例木质纤维素酶解糖化得率的比较
以上实施例中纤维素酶是目前被广泛使用的Cellic CTec2。木质纤维素酶解糖化得率如表1所示。相对于没有加入PVP空白对比例，本发明实施例的酶解糖化得率都有显著的增加。对于不同的木质纤维素底物，改变酶解的pH、缓冲液的类型、离子强度、底物的固含量、酶载量，适宜浓度的不同重均分子量的PVP对木质纤维素的酶解糖化都有很好的促进作用，与空白相比，酶解糖化得率净增加6.3％‐69.1％，与目前普遍使用的添加剂PEG 4600，酶解糖化得率也有明显提高。
图1是在pH 4.8，酶载量3FPU/g葡聚糖条件下，1g/L不同分子量的PVP对桉木‐DA的酶解效果对比，可看到当PVP的重均分子量在8000‐40000的时候，对酶解的促进作用最为明显，随着PVP的重均分子量增加到160000，对酶解的促进作用有下降的趋势，当PVP重均分子量增加到360000，酶解促进效果有明显的下降。
图2和图3(包含实施例1和实施例4)分别是pH 4.8，酶载量5FPU/g葡聚糖条件下，不同重均分子量的PVP对微晶纤维素和桉木‐DA的酶解促进效果随浓度的变化趋势，可以看到当PVP的重均分子量较低时，在较低的浓度下就可以促进微晶纤维素和木质纤维素的酶解，当PVP的重均分子量达到1300000时，需要更大的浓度才能明显的促进微晶纤维素和木质素纤维素的酶解。
图4(包含实施例9)是在pH 4.8，酶载量3FPU/g葡聚糖的条件下，不同底物固含的条件下，PEG 4600和PVP 10000对桉木‐DA的酶解效果的对比，可以看到PVP10000在不同固含量的条件下对桉木‐DA的酶解促进效果均比PEG 4600要好。
图5(包含实施例12)是在pH 4.8，酶载量3FPU/g葡聚糖的条件下，在添加了预处理液的条件下，添加1g/L PEG 4600、PVP 24000和PVP 160000对桉木‐SPORL酶解的促进作用，可以看到重均分子量为24000的PVP对添加了预处理液的底物的酶解促进作用比重均分子量为160000的PVP和PEG 4600都要更明显。
实施例11～12是没有分离预处理液直接进行的酶解实验，避免了预处理液的分离，不仅节约水资源，保护环境，对于降低实际生产成本也具有重要意义。
上述实施例仅仅为说明本发明，本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.聚乙烯吡咯烷酮提高木质纤维素酶解糖化得率的方法，其特征在于，将木质纤维素原料加入缓冲溶液中配置成酶解液，再加入PVP和纤维素酶，加热至40～60℃反应，得到木质纤维素的糖化水解液；所述PVP的重均分子量为2500‐100000，所述PVP与木质纤维素干重的质量比为0.2‐25：100。
2.根据权利要求1所述的聚乙烯吡咯烷酮提高木质纤维素酶解糖化得率的方法，其特征在于，所述缓冲溶液为醋酸‐醋酸钠、柠檬酸‐柠檬酸钠和磷酸盐缓冲液中至少一种。
3.根据权利要求1或2所述的聚乙烯吡咯烷酮提高木质纤维素酶解糖化得率的方法，其特征在于，所述酶解液的pH为4.0～6.5，缓冲溶液的离子强度为25～400mmol/L。
4.根据权利要求1所述的聚乙烯吡咯烷酮提高木质纤维素酶解糖化得率的方法，其特征在于，所述纤维素酶的用量以木质纤维素中的葡聚糖含量计为1～20FPU/g。
5.根据权利要求1所述的聚乙烯吡咯烷酮提高木质纤维素酶解糖化得率的方法，其特征在于，所述反应的时间为24～96h。
6.根据权利要求1所述的聚乙烯吡咯烷酮提高木质纤维素酶解糖化得率的方法，所述木质纤维素原料是木质纤维素、预处理后的木质纤维素或含有预处理液的木质纤维素原料；所述预处理液为木质纤维素原料对应的预处理得到的液体。
7.根据权利要求6所述的聚乙烯吡咯烷酮提高木质纤维素酶解糖化得率的方法，其特征在于，所述木质纤维素为滤纸纤维素、微晶纤维素、松木、桉木、杨木、水曲柳、沙棘、伯树、杉木、桦木、玉米芯、玉米秸秆、麦秆、甘蔗渣、稻草、稻壳、食用菌基质和花生壳中的至少一种。
8.根据权利要求6所述的聚乙烯吡咯烷酮提高木质纤维素酶解糖化得率的方法，其特征在于，所述预处理的方式包括：生物法、机械粉碎法、挤出法、微波处理法、超声处理法、碱处理法、酸处理法、臭氧分解法、有机溶剂法、离子液体处理法、蒸汽爆破法、水热法、氨气爆破法和湿氧化法中的至少一种。
9.根据权利要求1所述的聚乙烯吡咯烷酮提高木质纤维素酶解糖化得率的方法，其特征在于，所述木质纤维素干重与酶解液质量比为1‐30：100。
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