CN106434736A

CN106434736A - 一种在酵母细胞中异源表达制备纤维二糖差向异构酶的方法

Info

Publication number: CN106434736A
Application number: CN201611195685.5A
Authority: CN
Inventors: 彭晴; 张宇微; 胡广东; 魏晨阳; 乔宇; 石波
Original assignee: NATIONAL ANIMAL HUSBANDRY STATION; Feed Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: NATIONAL ANIMAL HUSBANDRY STATION; Feed Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2016-12-21
Filing date: 2016-12-21
Publication date: 2017-02-22
Anticipated expiration: 2036-12-21
Also published as: CN106434736B

Abstract

本发明公开了一种在酵母细胞中异源表达制备纤维二糖差向异构酶的方法。本发明所提供的方法为以酵母细胞为表达系统，制备蛋白甲或蛋白乙；所述蛋白甲为纤维二糖差向异构酶；所述蛋白乙包括纤维二糖差向异构酶，还包括信号肽和/或标签肽。所述蛋白甲为氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质。所述蛋白乙为氨基酸序列是序列表中序列4所示的蛋白质。实验证明，本发明所提供的方法可制备纤维二糖差向异构酶，且制备的纤维二糖差向异构酶的酶活力高、稳定性好，对表乳糖的生产具有重要的经济价值和现实意义。

Description

一种在酵母细胞中异源表达制备纤维二糖差向异构酶的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种在酵母细胞中异源表达制备纤维二糖差向异构酶的方法。

背景技术

糖类化合物亦称为碳水化合物，是自然界中存在最为广泛的一大类物质。其化学结构因单糖的构成、连接方式、糖链的长度和空间构型等的不同而呈现多样性，并决定了其独特的生物学功效。大量的研究已证明，功能性寡糖具有独特的生理功能，如改善人类和动物肠道微生物中益生菌的菌群和数量、促进维生素和矿物质的吸收以及提高机体免疫能力等等。糖类化合物的代谢与生物酶是不可分割的，许多生物酶，譬如糖苷水解酶类、糖基转移酶类、糖苷磷酸化酶类和糖类异构酶/差向异构酶类对于糖类化合物的代谢起着决定性的作用，对于功能糖产品的工业化制备和生产有着极其重要的意义。

纤维二糖差向异构酶(Cellobiose 2-epimerase，EC 5.1.3.11，CE)最早在白色瘤胃球菌(Ruminococcusalbus)中被发现，该酶能够将纤维素和乳糖还原端的D-葡萄糖差向异构化为D-甘露糖，是目前已知的碳水化合物异构酶/差向异构酶中唯一可以对寡糖进行差向异构化的酶。来源于白色瘤胃球菌的纤维二糖差向异构酶(RaCE)具有催化纤维寡糖、乳糖和表乳糖(Epilactose)的差向异构化能力，对乳糖和纤维二糖的转化效率约为30％。已知的纤维二糖差向异构酶主要来源于以下微生物，即脆弱拟杆菌(Bacteroidesfragilis)、海洋红嗜热盐菌(Rhodothermusmarinus)、嗜热细菌DSM 6724(Dictyoglomusturgidum)、溶纤维真细菌(Eubacteriumcellulosolvens)和白色瘤胃球菌(R.albus)。目前已知的纤维二糖差向异构酶最适pH值均为中性，但来源物种不同其最适温度也各异，如来源于嗜热菌海洋红嗜热盐菌(R.arinus)和嗜热细菌DSM 6724(D.turgidum)的纤维二糖差向异构酶最适温度在70-80℃，而来源于白色瘤胃球菌(R.albus)的纤维二糖差向异构酶最适温度是30℃。

纤维二糖差向异构酶差向异构化乳糖的产物表乳糖。研究表明，表乳糖能显著提高钙、铁在大鼠肠道内的吸收以及促进大鼠肠道乳酸杆菌和双歧杆菌等益生菌的增殖，显示出益生元特性。在酶法制备表乳糖工艺中，如何获得高活性高表达量的纤维二糖差向异构酶是大量制备表乳糖的关键因素之一，但是由于大肠杆菌表达体系的局限性，如胞内表达、蛋白表达量低、稳定性差等缺点，使得在实际生产中难以大量获取制备表乳糖所需的纤维二糖差向异构酶。

目前对纤维二糖差向异构酶的异源表达都是在大肠杆菌(Escherichia coli)表达系统中进行的。2008年Shigeaki Ito等对来源于白色瘤胃球菌(R.albus)的纤维二糖差向异构酶在E.coliBL21(DE3)中进行了异源表达，2012年Jung-Eun Kim等对来源于嗜热细菌DSM 6724(D.turgidum)的纤维二糖差向异构酶在E.coliER256中进行了异源表达。而将纤维二糖差向异构酶在毕赤酵母(Pichia pastoris)中进行异源表达还未见任何报道。毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点，如胞外表达、蛋白表达量高、蛋白稳定性好、回收简便等，且操作简单。毕赤酵母比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何制备纤维二糖差向异构酶。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种制备纤维二糖差向异构酶的方法。

本发明所提供的制备纤维二糖差向异构酶的方法，可为以酵母细胞为表达系统，制备蛋白甲或蛋白乙；所述蛋白甲为纤维二糖差向异构酶；所述蛋白乙包括纤维二糖差向异构酶，还包括信号肽和/或标签肽。

上述方法中，所述信号肽可为促使蛋白分泌到细胞外的分泌信号肽。所述信号肽具体可为alpha信号肽。

上述方法中，“以酵母细胞为表达系统，制备蛋白甲或蛋白乙”的实现方式可包括如下步骤：

(1)将基因甲或基因乙导入所述酵母细胞，得到重组酵母细胞；所述基因甲为编码所述蛋白甲的DNA分子；所述基因乙为编码所述蛋白乙的DNA分子；

(2)培养重组酵母细胞，得到所述蛋白甲或所述蛋白乙。

上述方法中，所述基因甲可通过重组表达载体甲导入所述酵母细胞。所述基因乙可通过重组表达载体乙导入所述酵母细胞。所述重组表达载体甲可为含有所述基因甲并表达所述蛋白甲的重组质粒。所述重组表达载体乙可为含有所述基因乙并表达所述蛋白乙的重组质粒。

上述方法中，所述蛋白甲可为a1)或a2)或a3)：

a1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；

a2)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

a3)将a1)或a2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的功能相同的蛋白质。

其中，序列表中序列2可由389个氨基酸残基组成。

为了使a1)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
FLAG	8	DYKDDDDK
			Strep-tag II	8	WSHPQFEK
c-myc	10	EQKLISEEDL

上述a3)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述a3)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述a3)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

上述方法中，所述蛋白乙可为b1)或b2)或b3)：

b1)氨基酸序列是序列表中序列4所示的蛋白质；

b2)在序列表中序列4所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

b3)将b1)或b2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的功能相同的蛋白质。

其中，序列表中序列4可由486个氨基酸残基组成。

上述方法中，所述基因甲可为c1)或c2)或c3)：

c1)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；

c2)与c1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述蛋白甲的DNA分子；

c3)在严格条件下与c1)或c2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述蛋白甲的DNA分子。

上述方法中，所述基因乙可为d1)或d2)或d3)：

d1)核苷酸序列是序列表中序列3所示的DNA分子；

d2)与d1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述蛋白乙的DNA分子；

d3)在严格条件下与d1)或d2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述蛋白乙的DNA分子。

序列表中序列1可由1170个核苷酸组成，序列表中序列1的核苷酸编码序列表中序列2所示的氨基酸序列。序列表中序列3可由1461个核苷酸组成，序列表中序列3的核苷酸编码序列表中序列4所示的氨基酸序列。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码所述蛋白甲或所述蛋白乙的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的所述蛋白甲或所述蛋白乙的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码所述蛋白甲或所述蛋白乙，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码所述蛋白甲或所述蛋白乙的核苷酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述方法中，所述重组表达载体甲为在表达载体的多克隆位点插入所述基因甲得到的重组质粒。上述方法中，所述重组表达载体乙为在表达载体的多克隆位点插入所述基因乙得到的重组质粒。所述表达载体可为载体pPIC9K。

所述重组表达载体具体可为重组质粒pPIC9K-RaCE。所述重组质粒pPIC9K-RaCE为将载体pPIC9K的EcoRI识别序列和NotI识别序列间的DNA小片段替换为核苷酸序列是序列表中的序列1自5’末端起第1至1167位所示的DNA分子，得到的重组质粒。

上述任一所述的方法中，所述酵母细胞可为毕赤酵母。所述毕赤酵母具体可为毕赤酵母GS115。

所述重组酵母细胞具体可为将重组质粒pPIC9K-RaCE转化毕赤酵母GS115，得到的重组酵母细胞。所述重组酵母细胞具体可为将重组质粒pPIC9K-RaCE-WT转化毕赤酵母GS115，得到的重组酵母细胞。

上述任一所述重组表达载体甲或上述任一所述重组表达载体乙也属于本发明的保护范围。

上述任一所述重组酵母细胞也属于本发明的保护范围。

上述任一所述重组表达载体甲或上述任一所述重组表达载体乙，或，上述任一所述重组酵母细胞在制备纤维二糖差向异构酶中的应用也属于本发明的保护范围。

上述任一所述蛋白甲或上述任一所述蛋白乙也属于本发明的保护范围。

上述任一所述基因甲或上述任一所述基因乙也属于本发明的保护范围。

实验证明，本发明所提供的方法可制备纤维二糖差向异构酶，且制备的纤维二糖差向异构酶的酶活力高、稳定性好，对表乳糖的生产具有重要的经济价值和现实意义。

附图说明

图1为重组纤维二糖差向异构酶的TLC检测结果。

图2为SDS-PAGE检测结果。

图3为实施例1步骤五中表乳糖含量的测定结果。

图4为表乳糖标准品溶液的HPLC检测结果。

图5为乳糖溶液的HPLC检测结果。

图6为反应液的HPLC检测结果。

图7为不同间隔时间取样时重组纤维二糖差向异构酶的转化率。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

毕赤酵母GS115和载体pPIC9K均为Invitrogen公司的产品。限制性内切酶EcoRI和限制性内切酶NotI均为NEB公司的产品。琼脂粉、生物素、蛋白胨(peptone)和无氨基酵母氮源(YNB)均为索莱宝生物科技有限公司的产品。表乳糖标准品为美国药典委员会(USP)的产品。甲醇、甘油、氯化钠、葡萄糖、乳糖均为国药集团化学试剂北京有限公司的产品。蛋白胨(tryptone)和酵母提取物均为OXOID公司的产品。载体pEASY-T1为北京全式金生物技术有限公司的产品，产品目录号为CT111-01。

LB液体培养基：将酵母提取物0.5g、蛋白胨(tryptone)1.0g和氯化钠1.0g用适量蒸馏水溶解，然后用蒸馏水定容至100mL，调节pH值至7.0，121℃灭菌20min。

YPD液体培养基：将蛋白胨(peptone)2.0g、酵母提取物1.0g和葡萄糖2.0g用适量蒸馏水溶解，然后用蒸馏水定容至100mL，115℃灭菌30min。

YPD固体培养基：YPD液体培养基中加入琼脂粉并使其浓度为2％(w/v)。

MD固体培养基：将2.0g琼脂糖溶于80mL蒸馏水中，121℃灭菌15min；待温度冷却至50℃后，在超净台加入10mL10×YNB、10mL10×葡萄糖和0.2mL500×生物素。

10×YNB：13.4g无氨基酵母氮源(YNB)溶于100mL蒸馏水中，过滤灭菌，4℃保存。

10×葡萄糖：10.0g葡萄糖溶于10mL去离子水，过滤除菌，4℃保存。

500×生物素：将20mg生物素溶于100mL蒸馏水中，过滤灭菌。

BMGY培养基：将酵母提取物l0.0g和蛋白胨(peptone)20.0g溶于700mL去离子水，121℃灭菌15min；冷却后加入100mL pH6.0、1M磷酸钾缓冲液、100mL 10×YNB、2mL 500×生物素和100mL 10×甲醇，4℃保存。

10×甲醇：5mL甲醇与95mL去离子水混合，过滤除菌，4℃保存。

BMMY培养基：将酵母提取物l0.0g和蛋白胨(peptone)20.0g溶于700mL去离子水，121℃灭菌15min；冷却后加入100mL pH6.0、1M磷酸钾缓冲液、100mL 10×YNB、2mL 500×生物素和100mL 10×甘油，4℃保存。

10×甘油：100mL甘油与900mL去离子水混合，湿热灭菌，4℃保存。

TLC检测的具体步骤如下：将1μL样本液点样于TLC分析板上进行TLC检测(展层剂为正丁醇：乙酸：水＝2:1:1(v/v/v)，显色剂为硫酸：甲醇＝5:95(v/v))。以混合品(由表乳糖标准品和乳糖按质量浓度比为1:1混合而成)和乳糖作为标准对照。

HPLC-ELSD检测条件：色谱系统为Waters 2695高效液相色谱；检测器为蒸发光检测器(ELSD)；色谱柱为Sugar-D(20I.D×250mm)；柱温为30℃；流动相为乙腈：水＝4:1(v/v)；流速为1.0mL/min；检测时间为30min；ELSD条件为：雾化温度45℃，蒸发温度60℃。

实施例1、重组纤维二糖差向异构酶的制备

一、重组质粒pPIC9k-RaCE的构建

1、采用人工合成序列表的序列1所示的双链DNA分子作为模板，采用F1和R1组成的引物对进行PCR扩增，得到约1200bp的PCR扩增产物。。

F1：5’-CCCGGAATTCATGATGATAAGTGAGATAAGACA-3’；

R1：5’-AAATATGCGGCCGCGATATCTACTCCGCGTGTG-3’。

2、将步骤1得到的PCR扩增产物和载体pEASY-T1连接，得到中间质粒。

3、用限制性内切酶EcoRI和NotI双酶切中间质粒，回收约1200bp的酶切产物。

4、用限制性内切酶EcoRI和NotI双酶切载体pPIC9K，回收约9.3kb的载体骨架。

5、将酶切产物与载体骨架连接，得到重组质粒pPIC9K-RaCE。

根据测序结果，对重组质粒pPIC9K-RaCE进行结构描述如下：将载体pPIC9K的EcoRI识别序列和NotI识别序列间的DNA小片段替换为核苷酸序列是序列表中的序列1自5’末端起第1至1167位所示的DNA分子。重组质粒pPIC9K-RaCE中，序列表的序列1自5’末端起第1至1167位所示的DNA分子与载体骨架上alpha分泌因子的编码序列融合，形成序列表中的序列3所示的融合基因，表达序列表中的序列4所示的融合蛋白。理论上，融合蛋白的分子量为43.7kDa。

二、重组酵母细胞的获得和鉴定

1、重组酵母细胞的获得

(1)用限制性内切酶SacI酶切重组质粒pPIC9K-RaCE，获得线性化质粒。

(2)采用电击法将线性化质粒转化毕赤酵母GS115(转化过程中，需涂布在MD固体培养基上，30℃培养48h)，得到重组酵母细胞。

2、重组酵母细胞的鉴定

随机选取步骤1获得的8个重组酵母细胞(依次命名为重组酵母细胞1-重组酵母细胞8)进行鉴定。

(1)将重组酵母细胞(重组酵母细胞1、重组酵母细胞2、重组酵母细胞3、重组酵母细胞4、重组酵母细胞5、重组酵母细胞6、重组酵母细胞7或重组酵母细胞8)的单克隆接种于1mL BMGY培养基，30℃、250rpm振荡培养72h，得到培养体系1。

(2)将培养体系1按1:100(v/v)接种于0.5mLBMMY培养基，30℃、250rpm振荡培养96h(培养过程中，每24h加入甲醇并使其在体系中的浓度为1％(v/v)，第一次加入甲醇的时间为培养24h后)，得到培养体系2。

(3)取培养体系2，8000rpm离心10min，收集上清液。

(4)TLC检测

(a1)制备反应体系(80μL)：将10μL上清液和70μL乳糖溶液(溶剂为水)混合，得到反应体系；反应体系中，乳糖的初始浓度为10mg/mL。

(a2)完成步骤(a1)后，取反应体系，30℃水浴4h，得到样本液。

(a3)完成步骤(a1)后，进行TLC检测。

TLC检测结果见图1(混标为混合品，1为重组酵母细胞1，2为重组酵母细胞2，3为重组酵母细胞3，4为重组酵母细胞4，5为重组酵母细胞5，6为重组酵母细胞6，7为重组酵母细胞7，8为重组酵母细胞8)。结果表明，重组酵母细胞1、重组酵母细胞2和重组酵母细胞7均可将乳糖差向异构为表乳糖，因此，重组酵母细胞1、重组酵母细胞2和重组酵母细胞7均鉴定为阳性克隆。将重组酵母细胞1命名为RaCE/GS115-1。将重组酵母细胞2命名为RaCE/GS115-2。将将重组酵母细胞7命名为RaCE/GS115-7。

三、对照酵母细胞的获得

按照上述步骤二中1的方法，将重组质粒pPIC9k-RaCE替换为载体pPIC9K，其它步骤均不变，得到对照酵母细胞。

四、重组纤维二糖差向异构酶的制备

1、将酵母细胞(RaCE/GS115-1、RaCE/GS115-2、RaCE/GS115-7、对照酵母细胞或毕赤酵母GS115)的单克隆接种于200mL BMGY培养基，30℃、250rpm振荡培养48h，得到培养体系甲。

2、将培养体系甲按1:100(v/v)接种至100mLBMMY培养基，30℃、250rpm振荡培养96h(培养过程中，每24h加入甲醇并使其在体系中的浓度为1％(v/v)，第一次加入甲醇的时间为培养24h后)，得到培养体系乙。

3、取培养体系乙，8000rpm离心10min，收集上清液，即为粗酶液。

将上清液进行SDS-PAGE。部分实验结果见图2(最左边的泳道为蛋白Marker，1为RaCE/GS115-1，2为RaCE/GS115-2，7为RaCE/GS115-7)。结果表明，融合蛋白(即重组纤维二糖差向异构酶)存在于培养RaCE/GS115-1、RaCE/GS115-2或RaCE/GS115-7得到的上清液中，而不存在于培养对照酵母细胞或毕赤酵母GS115的上清液中。融合蛋白显示单一分子量条带，对应分子量为43.7kDa，与理论上的蛋白大小完全一致。

采用Bradford法(Bradford M M.A rapid and sensitive method for thequantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle ofprotein-dye binding[J].Analytical Biochemistry,1976,72(1-2):248-54.)检测粗酶液中的蛋白质浓度，结果表明，培养RaCE/GS115-1、RaCE/GS115-2和RaCE/GS115-7获得的上清液中蛋白浓度依次为0.32mg/mL、0.36mg/mL和0.35mg/mL。

五、重组纤维二糖差向异构酶的酶活测定

1、取步骤四中培养RaCE/GS115-1收集的粗酶液，用BMMY培养基稀释100倍，得到待测酶液甲。取步骤四中培养RaCE/GS115-2收集的粗酶液，用BMMY培养基稀释100倍，得到待测酶液乙。取步骤四中培养RaCE/GS115-7收集的粗酶液，用BMMY培养基稀释100倍，得到待测酶液丙。取步骤四中培养对照酵母细胞收集的粗酶液，用BMMY培养基稀释100倍，得到待测酶液丁。取步骤四中培养毕赤酵母GS115收集的粗酶液，用BMMY培养基稀释100倍，得到待测酶液戊。

2、测定重组纤维二糖差向异构酶的酶活力

测定重组纤维二糖差向异构酶的酶活力的方法具体如下：

(1)取1mL待测酶液(待测酶液甲、待测酶液乙、待测酶液丙、待测酶液丁或待测酶液戊)，加入9mL乳糖溶液(溶剂为水)，得到反应体系；反应体系中，乳糖的初始浓度为10mg/mL；

(2)完成步骤(1)后，取反应体系，先30℃水浴1h、2h、3h、4h或24h，然后96℃金属浴15min，最后冰浴5min，终止反应，得到反应液；

(3)完成步骤(2)后，取反应液，离心，收集上清液并用0.22μm滤膜过滤，得到上样液；

(4)将上样液、表乳糖标准品溶液(浓度为10mg/mL，溶剂为水)和乳糖溶液(浓度为10mg/mL，溶剂为水)分别进行HPLC-ELSD(上样量均为5μL)，通过检测峰面积来测定重组纤维二糖差向异构酶的酶活力，每单位重组纤维二糖差向异构酶活力的定义为在30℃条件下，每分钟生成1μmol表乳糖所需的酶量；然后计算重组纤维二糖差向异构酶的比酶活。

重组纤维二糖差向异构酶的酶活力(U/mL)＝表乳糖含量(μmol/mL)÷60(min)×10(反应体系)×100(稀释倍数)

表乳糖含量(g/L)＝表乳糖峰面积(mAu*s)×10mg/mL÷47542030(mAu*s)

乳糖含量(g/L)＝乳糖峰面积(mAu*s)×10mg/mL÷53541927(mAu*s)

重组纤维二糖差向异构酶的比酶活(U/mg)＝重组纤维二糖差向异构酶的酶活力(U/mL)÷蛋白含量(mg/mL)。

步骤四中培养RaCE/GS115-1收集的粗酶液、步骤四中培养RaCE/GS115-2收集的粗酶液和步骤四中培养RaCE/GS115-7收集的粗酶液的表乳糖含量详见图3。

测定结果如下：步骤四中培养RaCE/GS115-1收集的粗酶液的酶活力为57.81U/mL，比酶活为180.24U/mg；步骤四中培养RaCE/GS115-2收集的粗酶液的酶活力为66.14U/mL，比酶活为181.62U/mg；步骤四中培养RaCE/GS115-7收集的粗酶液的酶活力为57.44U/mL，比酶活为161.42U/mg；比文献(Ito S,Taguchi H,Hamada S,et al.Enzymatic properties ofcellobiose 2-epimerase from Ruminococcusalbus and the synthesis of rareoligosaccharides by the enzyme[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2008,79(3):433-41.)记载的利用大肠杆菌表达系统表达的重组纤维二糖差向异构酶的比酶活(比酶活为3.5U/mg)大大提高。步骤四中培养对照酵母细胞收集的粗酶液的酶活力为0U/mL；步骤四中培养毕赤酵母GS115收集的粗酶液的酶活力为0U/mL。

实施例2、重组纤维二糖差向异构酶在制备表乳糖中的应用

反应液(体积为400mL)：将乳糖溶液(溶剂为水)和100mL实施例1步骤四中培养RaCE/GS115-2收集的上清液混合，得到反应液；反应液中，乳糖的初始浓度为200g/L。

反应条件：37℃水浴24h。

实验过程中，间隔时间(即反应1h、反应2h、反应3h、反应4h和反应24h)取反应液，作为样本液。将样本液、表乳糖标准品溶液(浓度为10mg/mL，溶剂为水)和乳糖溶液(浓度为10mg/mL，溶剂为水)分别进行TLC检测和HPLC-ELSD检测。

计算不同间隔时间取样时，乳糖差向异构为表乳糖的转化率。转化率＝表乳糖浓度(mg/mL)/乳糖初始浓度(mg/mL)×100％。

表乳糖标准品溶液的HPLC检测结果见图4(保留时间为13.963min)。乳糖溶液的HPLC检测结果见图5(保留时间为17.753min)。间隔时间24h取的反应液的HPLC检测结果见图6(表乳糖的保留时间为13.933，乳糖的保留时间为17.810)。不同间隔时间取样时的转化率的结果见图7。

结果表明，随着反应时间的延长，重组纤维二糖差向异构酶逐渐差向异构乳糖为表乳糖，转化率最高达到24％。

<110> 中国农业科学院饲料研究所全国畜牧总站

<120> 一种在酵母细胞中异源表达制备纤维二糖差向异构酶的方法

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1170

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

atgatgataa gtgagataag acatgaactg acagatcaca ttataccatt ctggaacaag 60

ctgcgcgatg atgagaacgg gggattctac ggatacctca gctacgggct ggaacttgac 120

aagaaggcag ataagggtgt tatactgcat tcgaggatac tgtggttcta ttcaaacgct 180

tatatgacac tgggcggtga tgagcttctt gacaatgcaa agcacgctta tgagttcata 240

aagaacaact gtatcgacta tgaatacggt ggagtatact ggatgatgga ctttgagggc 300

aagtctgcgg ataccatgaa gcatacttac aatatcgctt ttgctatata tgcgctgtca 360

agctattaca gagcgagcgg tgacaaggaa gctctcgcgc tggcatacag gctttttgag 420

gacatagaaa agaatactct tgatgagtac ggctaccgcg aagcttttga caggcagtgg 480

aggcttgtgg ataatgaggc gctcagcgag aacggtctga aggctgacaa gaccatgaat 540

gctatacttc accttattga agcgtatact gagctgtaca aggcagacgg taacgagaag 600

gtagctgaca ggctgaaatt ccagttggga cagatgaggg atatagtata tacccccgat 660

accaatgccc tgaaggtatt ctttgataca gctttcaatc tggtcggaga tatacattcc 720

tacgggcatg acattgaagc cacatggctt atggacagag cctgcgatgt actgggcgat 780

gaggatctga aaaagcagtt cgctgaaatg aacctgaaga tatcccataa tatacaggat 840

atagctcttg aggacggtgc actgaacaat gagcgcgaca agaacgagat agacaagacc 900

cgcgtatggt gggtacaggc tgaggctgtt gtgggattca taaatgctta tcagcacagc 960

ggcgatgaaa agttccttga atctgcaaag agcgtatggg agaatatcaa ggagtacatc 1020

atagacaagc gtgagggcgg tgaatggtat tccgaggtca cctttgaaca tactcctcac 1080

gactacaagg aaacggtcgg tccctggaag tgtccttatc ataacggcag aatgtgtatg 1140

gaagtcatca cacgcggagt agatatctga 1170

<210> 2

<211> 389

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 2

Met Met Ile Ser Glu Ile Arg His Glu Leu Thr Asp His Ile Ile Pro

1 5 10 15

Phe Trp Asn Lys Leu Arg Asp Asp Glu Asn Gly Gly Phe Tyr Gly Tyr

20 25 30

Leu Ser Tyr Gly Leu Glu Leu Asp Lys Lys Ala Asp Lys Gly Val Ile

35 40 45

Leu His Ser Arg Ile Leu Trp Phe Tyr Ser Asn Ala Tyr Met Thr Leu

50 55 60

Gly Gly Asp Glu Leu Leu Asp Asn Ala Lys His Ala Tyr Glu Phe Ile

65 70 75 80

Lys Asn Asn Cys Ile Asp Tyr Glu Tyr Gly Gly Val Tyr Trp Met Met

85 90 95

Asp Phe Glu Gly Lys Ser Ala Asp Thr Met Lys His Thr Tyr Asn Ile

100 105 110

Ala Phe Ala Ile Tyr Ala Leu Ser Ser Tyr Tyr Arg Ala Ser Gly Asp

115 120 125

Lys Glu Ala Leu Ala Leu Ala Tyr Arg Leu Phe Glu Asp Ile Glu Lys

130 135 140

Asn Thr Leu Asp Glu Tyr Gly Tyr Arg Glu Ala Phe Asp Arg Gln Trp

145 150 155 160

Arg Leu Val Asp Asn Glu Ala Leu Ser Glu Asn Gly Leu Lys Ala Asp

165 170 175

Lys Thr Met Asn Ala Ile Leu His Leu Ile Glu Ala Tyr Thr Glu Leu

180 185 190

Tyr Lys Ala Asp Gly Asn Glu Lys Val Ala Asp Arg Leu Lys Phe Gln

195 200 205

Leu Gly Gln Met Arg Asp Ile Val Tyr Thr Pro Asp Thr Asn Ala Leu

210 215 220

Lys Val Phe Phe Asp Thr Ala Phe Asn Leu Val Gly Asp Ile His Ser

225 230 235 240

Tyr Gly His Asp Ile Glu Ala Thr Trp Leu Met Asp Arg Ala Cys Asp

245 250 255

Val Leu Gly Asp Glu Asp Leu Lys Lys Gln Phe Ala Glu Met Asn Leu

260 265 270

Lys Ile Ser His Asn Ile Gln Asp Ile Ala Leu Glu Asp Gly Ala Leu

275 280 285

Asn Asn Glu Arg Asp Lys Asn Glu Ile Asp Lys Thr Arg Val Trp Trp

290 295 300

Val Gln Ala Glu Ala Val Val Gly Phe Ile Asn Ala Tyr Gln His Ser

305 310 315 320

Gly Asp Glu Lys Phe Leu Glu Ser Ala Lys Ser Val Trp Glu Asn Ile

325 330 335

Lys Glu Tyr Ile Ile Asp Lys Arg Glu Gly Gly Glu Trp Tyr Ser Glu

340 345 350

Val Thr Phe Glu His Thr Pro His Asp Tyr Lys Glu Thr Val Gly Pro

355 360 365

Trp Lys Cys Pro Tyr His Asn Gly Arg Met Cys Met Glu Val Ile Thr

370 375 380

Arg Gly Val Asp Ile

385

<210> 3

<211> 1461

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 3

atgagatttc cttcaatttt tactgcagtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct 60

ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt 120

tactcagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat 180

aacgggttat tgtttataaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta 240

tctctcgaga aaagagaggc tgaagcttac gtagaattca tgatgataag tgagataaga 300

caggaactga cagatcacat tataccattc tggaacaagc tgcgcgatga tgagaacggg 360

ggattctacg gatacctcag ctacgggctg ggacttgaca agaaggcaga taagggtgtt 420

atactgcatt cgaggatact gtggttctat tcaaacgctt atatgacact gggcggtgat 480

gagcttcttg acaatgcaaa gcacgcttat gagttcataa agaacaactg catcgactat 540

gaatacggtg gagtatactg gatgatggac tttgagggca agcctgcgga taccatgaag 600

catacttaca atatcgcttt tgctatatat gcgctgtcaa gctattacag agcgagcggt 660

gacaaggaag ctctcgcgct ggcatacagg ccttttgagg acatagaaaa gaatactctt 720

tatgagtacg gctaccgcga agcttttgac aggcagtgga ggcttgtgga taatgaggcg 780

ctcagcgaga acggtctgaa ggctgacaag accatgaatg ctatacttca ccttattgaa 840

gcgtataccg agctgtacaa ggcagacggt aacgagaagg tagctgacag gctgaagttc 900

cagctgggac agatgaggga tatagtatat acccccgata caaatgcgct gaaggtattc 960

tttgatacag ctttcaatct ggtcggagat atacattcct acgggcatga cattgaagcc 1020

acatggctta tggacagagc ctgcgatgta ctgggcgatg aggatctgaa aaagcagttc 1080

gctgaaatgg acctgaagat atcccataat atacaggata tagctcttga ggacggtgcg 1140

ctgaacaatg agcgcgacaa gaacgagata gacaagaccc gcgtatggtg ggtacaggct 1200

gaggctgttg tgggattcat aaatgcttat cagcacagcg gcgatgaaaa gttccttgaa 1260

tctgcaaaga gcgtatggga gaatatcaag gagtacatca tagacaagcg tgagggcggt 1320

gaatggtatt ccgaggtcac ctttgaccat actcctcacg actataagga aacggtcggt 1380

ccctggaagt gtccttatca taacggcaga atgtgtatgg aagtcatcac acgcggagta 1440

gatatcgcgg ccgcgaatta a 1461

<210> 4

<211> 486

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 4

Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser

1 5 10 15

Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln

20 25 30

Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe

35 40 45

Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu

50 55 60

Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val

65 70 75 80

Ser Leu Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala Tyr Val Glu Phe Met Met Ile

85 90 95

Ser Glu Ile Arg Gln Glu Leu Thr Asp His Ile Ile Pro Phe Trp Asn

100 105 110

Lys Leu Arg Asp Asp Glu Asn Gly Gly Phe Tyr Gly Tyr Leu Ser Tyr

115 120 125

Gly Leu Gly Leu Asp Lys Lys Ala Asp Lys Gly Val Ile Leu His Ser

130 135 140

Arg Ile Leu Trp Phe Tyr Ser Asn Ala Tyr Met Thr Leu Gly Gly Asp

145 150 155 160

Glu Leu Leu Asp Asn Ala Lys His Ala Tyr Glu Phe Ile Lys Asn Asn

165 170 175

Cys Ile Asp Tyr Glu Tyr Gly Gly Val Tyr Trp Met Met Asp Phe Glu

180 185 190

Gly Lys Pro Ala Asp Thr Met Lys His Thr Tyr Asn Ile Ala Phe Ala

195 200 205

Ile Tyr Ala Leu Ser Ser Tyr Tyr Arg Ala Ser Gly Asp Lys Glu Ala

210 215 220

Leu Ala Leu Ala Tyr Arg Pro Phe Glu Asp Ile Glu Lys Asn Thr Leu

225 230 235 240

Tyr Glu Tyr Gly Tyr Arg Glu Ala Phe Asp Arg Gln Trp Arg Leu Val

245 250 255

Asp Asn Glu Ala Leu Ser Glu Asn Gly Leu Lys Ala Asp Lys Thr Met

260 265 270

Asn Ala Ile Leu His Leu Ile Glu Ala Tyr Thr Glu Leu Tyr Lys Ala

275 280 285

Asp Gly Asn Glu Lys Val Ala Asp Arg Leu Lys Phe Gln Leu Gly Gln

290 295 300

Met Arg Asp Ile Val Tyr Thr Pro Asp Thr Asn Ala Leu Lys Val Phe

305 310 315 320

Phe Asp Thr Ala Phe Asn Leu Val Gly Asp Ile His Ser Tyr Gly His

325 330 335

Asp Ile Glu Ala Thr Trp Leu Met Asp Arg Ala Cys Asp Val Leu Gly

340 345 350

Asp Glu Asp Leu Lys Lys Gln Phe Ala Glu Met Asp Leu Lys Ile Ser

355 360 365

His Asn Ile Gln Asp Ile Ala Leu Glu Asp Gly Ala Leu Asn Asn Glu

370 375 380

Arg Asp Lys Asn Glu Ile Asp Lys Thr Arg Val Trp Trp Val Gln Ala

385 390 395 400

Glu Ala Val Val Gly Phe Ile Asn Ala Tyr Gln His Ser Gly Asp Glu

405 410 415

Lys Phe Leu Glu Ser Ala Lys Ser Val Trp Glu Asn Ile Lys Glu Tyr

420 425 430

Ile Ile Asp Lys Arg Glu Gly Gly Glu Trp Tyr Ser Glu Val Thr Phe

435 440 445

Asp His Thr Pro His Asp Tyr Lys Glu Thr Val Gly Pro Trp Lys Cys

450 455 460

Pro Tyr His Asn Gly Arg Met Cys Met Glu Val Ile Thr Arg Gly Val

465 470 475 480

Asp Ile Ala Ala Ala Asn

485

Claims

1.一种制备纤维二糖差向异构酶的方法，其特征在于：以酵母细胞为表达系统，制备蛋白甲或蛋白乙；所述蛋白甲为纤维二糖差向异构酶；所述蛋白乙包括纤维二糖差向异构酶，还包括信号肽和/或标签肽。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：“以酵母细胞为表达系统，制备蛋白甲或蛋白乙”的实现方式包括如下步骤：

(2)培养重组酵母细胞，得到所述蛋白甲或所述蛋白乙。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述基因甲通过重组表达载体甲导入所述酵母细胞；所述基因乙通过重组表达载体乙导入所述酵母细胞；所述重组表达载体甲为含有所述基因甲并表达所述蛋白甲的重组质粒；所述重组表达载体乙为含有所述基因乙并表达所述蛋白乙的重组质粒。

4.如权利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于：

所述蛋白甲为a1)或a2)或a3)：

a1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；

a3)将a1)或a2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的功能相同的蛋白质；

所述蛋白乙为b1)或b2)或b3)：

b1)氨基酸序列是序列表中序列4所示的蛋白质；

5.如权利要求2至4中任一所述的方法，其特征在于：

所述基因甲为c1)或c2)或c3)：

c1)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；

c3)在严格条件下与c1)或c2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述蛋白甲的DNA分子；

所述基因乙为d1)或d2)或d3)：

d1)核苷酸序列是序列表中序列3所示的DNA分子；

6.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述重组表达载体甲为在表达载体的多克隆位点插入所述基因甲得到的重组质粒；所述重组表达载体乙为在表达载体的多克隆位点插入所述基因乙得到的重组质粒。

7.权利要求3至6中任一所述重组表达载体甲或重组表达载体乙。

8.权利要求2至6中任一所述重组酵母细胞。

9.权利要求7所述重组表达载体甲或重组表达载体乙，或，权利要求8所述重组酵母细胞在制备纤维二糖差向异构酶中的应用。

10.权利要求1至4中任一所述蛋白甲或蛋白乙。