JP2011148735A - 遺伝子 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】以下の(1)又は(2)のタンパク質又はペプチドをコードする遺伝子:
(1)配列番号2の1〜180番、32〜71番、32〜126番、32〜174番、87〜126番、87〜174番、及び135〜174番のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるタンパク質又はペプチド、
(2)配列番号2の1〜180番、32〜71番、32〜126番、32〜174番、87〜126番、87〜174番、及び135〜174番のいずれかで表されるアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ糖認識活性を有するタンパク質又はペプチド。
【選択図】図1
Description
(1)配列番号2の1〜180番、32〜71番、32〜126番、32〜174番、87〜126番、87〜174番、及び135〜174番のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるタンパク質又はペプチド、
(2)配列番号2の1〜180番、32〜71番、32〜126番、32〜174番、87〜126番、87〜174番、及び135〜174番のいずれかで表されるアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ糖認識活性を有するタンパク質又はペプチドを提供する。
(A.ツチスギタケレクチン)
ツチスギタケは、担子菌モエギタケ科に属するキノコの一種である。レクチンは、生物界に広く存在し、糖を特異的に認識して結合するタンパク質の総称である。分子内サブドメイン内に糖認識サイトを一つしか持っていない場合でも、多くの分子は多量体を形成するため、糖鎖分子を介した架橋形成能を有する。
PTLをコードする遺伝子(以下、PTL遺伝子と記載する)は、すでに特定されているN末端部分のアミノ酸配列に基づき、ツチスギタケのcDNAあるいはcDNAライブラリーから周知の方法に従ってクローニングすることができる。例えば、cDNAに対して、上記部分アミノ酸配列から作製されるプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応(以下、PCRと記載する)を行い、得られた増幅断片によりツチスギタケcDNAライブラリーから目的とするPTL遺伝子をクローニングする。あるいは、cDNAライブラリーを作製することなく、RACE法を利用してcDNAから目的のPTL遺伝子をクローニングする。一般に、cDNAライブラリーからの全長cDNAの取得は困難であることが多く、ここではRACE法によるクローニングについて説明する。
まず、ツチスギタケよりmRNAを調製する。mRNAの供給源は、ツチスギタケの傘、菌褶、菌輪、菌柄、脚苞、菌糸等子実体の一部であっても、子実体全体であってもよいが、子実体全体が好ましい。
こうして得られたmRNAを鋳型として、市販のキット、例えばマラソン(登録商標) cDNA アンプリフィケーション キット(Clontech社製)等を用いて、オリゴ(dT)プライマー及び逆転写酵素によって一本鎖cDNAを合成した後、一本鎖cDNAから二本鎖cDNAを合成する。
得られた二本鎖cDNAに、適切なアダプターを付加した後、アダプタープライマーと、例えば表6に示すような遺伝子特異的プライマー(Gene Specific Primer、以下GSPと記載する)を用いてPCRを行う。得られる5’−RACE産物、及び3’−RACE産物の末端の塩基配列を決定し、その配列から、新たに5’側及び3’側GSPを作製してPCRを行い、目的とする完全長cDNAを取得する。
得られたPTL cDNAは、ダイレクトシークエンス法、あるいはpGEM−T easy ベクター(Promega社製)、pBlue Script SK(+)(Stratagene社製)、pCR2.1(Invitrogen社製)等の市販のプラスミドベクターにサブクローニングするサイクルシークエンス法により塩基配列解析を行う。塩基配列の決定は、マキサム−ギルバートの化学修飾法、M13ファージを用いるジデオキシヌクレオチド鎖終結法等の公知の手法により行うことができる。自動塩基配列解析装置(BECKMAN COULTER社製:CEQTM 8000 Genetic Analysis System等)を用いる方法が簡便で好ましい。
上記の方法により単離されるPTL遺伝子(cDNA)は、配列番号1に示す695塩基からなる塩基配列を有する。配列番号1の塩基配列は、コドン表に基づいて配列番号2に示す180アミノ酸残基に変換される。図1にアミノ酸配列の特徴を示す。図1中、糖認識ドメイン(Carbohydrate Recognition Domain)と見なされるCRD1、CRD2及びCRD3の部分配列は、天然PTLのN末端アミノ酸配列の分析結果(40アミノ酸残基)と相同性が非常に高い(80%以上)。さらに、これらのペプチド同士の相同性もまた、表1に示すように非常に高い。
(1)配列番号2の1〜180番、32〜71番、32〜126番、32〜174番、87〜126番、87〜174番、及び135〜174番のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるタンパク質又はペプチド、
(2)配列番号2の1〜180番、32〜71番、32〜126番、32〜174番、87〜126番、87〜174番、及び135〜174番のいずれかで表されるアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ糖認識活性を有するタンパク質又はペプチド。
アミノ酸配列及び塩基配列の範囲の意味づけを表2に示す。
本発明者らは、このPTLの効果的な精製法を開発した(特許文献6)。しかし、その方法は、天然に生息しているツチスギタケを原料として用いているため、天候や季節による原料確保の問題が含まれていた。
PTL遺伝子を含む組換えベクターは、公知のベクターにPTL遺伝子を連結(挿入)することによって得ることができる。前記ベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター等を用いることができる。
PTL遺伝子を導入した形質転換体は、上述の組換えベクターをPTL遺伝子が発現しうる態様で宿主中に導入することによって得ることができる。宿主としては、PTL遺伝子を発現できるものであれば特に限定されない。例えば、エッシェリヒア・コリ(Escherichia coli)等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)等のバチルス属、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロテイ(Rhizobium melilotei)等のリゾビウム属に属する細菌、サッカロミセス・セルビシエ(Saccharomyce scervisiae)、サッカロミセス・ポンベ(S.pombe)等の酵母、サル細胞(COS細胞)、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO細胞)等の動物細胞、Sf19、Sf21等の昆虫細胞、カイコ(Bombyx mori)等の昆虫、並びに大豆(Glycine max)、ウキクサ(Spirodela polyrhiza)等の植物を挙げることができる。
PTLタンパク質は、前項(2.形質転換体の作出)で記載の形質転換体を培養又は生育し、その培養物から該タンパク質を採取することによって得ることができる。形質転換体を培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。或いは前項(1.組換えベクターの作製)で記載の組換えベクターを無細胞タンパク質合成系に供し、インビトロでタンパク質又はペプチドを発現させることによって得ることもできる。
〔実施例1〕(ツチスギタケ由来のレクチン遺伝子のクローニング)
本発明者らは、先のPCT/JP2009/003346(発明の名称:α1→6フコース特異的レクチン)にPTLのアミノ酸配列をProtein Peptide Sequencer PPSQ−21 System((株)島津製作所製)を用いて解析した結果を示した。得られたN末端のアミノ酸配列を基に、5’RACE法及び3’RACE法により、レクチン遺伝子のクローニングを、以下の手順で試みた。
ツチスギタケ子実体を、乳鉢と乳棒により液体窒素中で破砕した。100mgの破砕サンプルにトリゾル試薬(Invitrogen社製)を1mL加え、全RNAを抽出した。全RNAからのmRNAの精製は、Poly(A)+ Isolation キット from Total RNA(NIPPON GENE社製)を用いて、該当キットの説明書に従いmRNAを精製した。
精製したmRNAからの2本鎖cDNA合成は、マラソン(登録商標) cDNA アンプリフィケーション キット(Clontech社製)を用いて行った。すなわち、2.5μLのmRNA溶液(460ng)に、付属のcDNA Synthesis プライマー溶液(10μM)を0.5μL加えた。溶液を、70℃で2分間加熱後、氷上で2分間静置した。続いて、表3に記載の反応組成にて、42℃で1時間反応させ、1本鎖cDNA反応液を調製した。
調製した2本鎖cDNAへのアダプター配列の付加は、マラソン(登録商標) cDNA アンプリフィケーション キット(Clontech社製)に付属しているアダプターを用いて行った。すなわち、2.5μLの2本鎖cDNA溶液を、表5に記載の反応組成にて、16℃で1晩反応させ、アダプター配列が付加した2本鎖cDNA(アダプター配列付加2本鎖cDNA溶液)を調製した。
ペプチドシーケンンサー:Protein Peptide Sequencer PPSQ−21 System((株)島津製作所製)で解析したPTLのN末端部分アミノ酸配列を基に、縮重プライマーを作製した。表6に示す4種類のプライマーを作製した。NGSP_sence_PTL及びNGSP_antisence_PTLは、それぞれ、GSP_sence_PTL及びGSP_antisence_PTLの内側の配列を基に作製した。
PCRは、Takara Ex−Taq(登録商標)(タカラバイオ株式会社製)を用いて行った。まず、先に得られたcDNAを鋳型として、マラソン(登録商標) cDNA アンプリフィケーション キット(Clontech社製)に付属しているアダプタープライマーとGSP_sence_PTL(5’RACE)又はGSP_antisence_PTL(3’RACE)を用いて、表7に記載の反応組成及び表8に記載の反応条件で、一次PCRを行った。一次PCR産物は、分析時まで4℃に保存した。一次PCRによって、DNA断片が増幅されたことを、PCR産物のアガロース電気泳動、及びエチジウムブロマイド染色にて確認した。
次に、増幅されたDNA断片を鋳型としてマラソン(登録商標) cDNA アンプリフィケーション キット(Clontech社製)に付属しているnested−アダプタープライマーとNGSP_sence_PTL(5’RACE)又はNGSP_antisence_PTL(3’RACE)を用いて、表9に記載の反応組成及び表10に記載の反応条件で、二次PCR(nested−PCR)を行った。二次PCR産物は、分析時まで4℃に保存した。
得られたDNA断片を、pGEM−T easy ベクター(Promega社製)を用いて、TAクローニングした。まず、表11に記載の反応液を調製し、室温で1時間反応させた。
こうして精製されたプラスミドを用いて、挿入された5’RACE並びに3’RACEによるDNA断片の塩基配列を決定した。塩基配列の決定には、DNAシーケンサーを用いた。すなわち、Dye Terminater法とキャピラリーシーケンスによるCEQTM 8000 Genetic Analysis System (BECKMAN COULTER社製)を用いて、塩基配列を決定した。
上記で得られた全長配列のコーディング領域に、ヒスチジンタグ(Hisタグ)を付加し発現させた。まず、表2に示すrPTL0の塩基配列の遺伝子断片に制限酵素配列を付加し、pET27bベクター(Novagen社製)のHisタグ配列の上流へ挿入した。
得られた上清を、HiTrap Chelating HP(GE ヘルスケアバイオサイエンス社製)にて、表2に示すrPTL7のアフィニティー精製を行った。精製結果を、図3に示す。予想通りの22kDaのバンドを検出した。以上のことから、pET27b/PTL0プラスミドから、rPTL7の発現を確認し、そしてrPTL7を精製することができた。
上記で得られた全長配列のうち、PTLのN末端アミノ酸配列と相同性の高い領域を発現させた。まず、表2に示すrPTL1、rPTL2及びrPTL3の3種類の塩基配列の遺伝子断片に、停止コドン(TAA)と制限酵素配列を付加した。pET51bベクター(Novagen社製)のStrep・Tag(登録商標)II配列の下流へ挿入して、3種類の組換えベクターを作製した。
得られた上清を、Strep・Tactin(登録商標) superflow column(Novagen社製)にて、表2に示すrPTL8、rPTL9及びrPTL10のアフィニティー精製を行った。精製結果を、図4に示す。予想通りの7.3kDa、13.2kDa、18.3kDaのバンドを検出した。以上のことから、rPTL8、rPTL9、及びrPTL10の発現を確認し、そしてrPTL8、rPTL9及びrPTL10を精製することができた。
上記で得られた全長配列のうち、PTLのN末端アミノ酸配列と相同性の高い領域のみを発現させた。まず、表2に示すrPTL1〜6の6種類の塩基配列の遺伝子断片の前後に、開始コドン(ATG)と停止コドン(TAA)並びに制限酵素配列を付加した。タグ配列を除いたpET51bベクター(Novagen社製)へ挿入して、6種類の組換えベクターを作製した。
得られた上清を、PBSで平衡化したチログロブリン固定化アガロースに供した。PBSでカラムを洗浄後、0.2Mアンモニアで溶出した。溶出した画分を、SDS−PAGE及びCBB染色により解析した。その結果を図5に示す。予想通りそれぞれ、4.6kDa、10.5kDa、15.6kDa、4.6kDa、9.7kDa、4.5kDaのバンドを検出した。以上のことから、rPTL1〜6の発現を確認し、そしてrPTL1〜6を精製することができた。
フコースα1→6糖鎖を持つ糖タンパク質してチログロブリンを用意し、またフコースα1→6糖鎖を持たない糖タンパク質としてトランスフェリンを用意した。これら糖タンパク質をガラス基板に固定化し、GlycoStationTM Reader 1200(GPバイオサイエンス社製)を用いて糖タンパク質アレイを行った。まず、精製した組換えPTLを、Cy3 Mono−Reactive Dye Pack(GE ヘルスケアバイオサイエンス社製)の説明書に従ってCy3標識した。500mM グリシン、1% Triton X − 100、 1mM CaCl2、 1mM ZnCl2、0.8% NaClを含むトリス緩衝液(pH7.4、以下Probing bufferと記載する)中に標識化組換えPTLを懸濁させ、糖タンパク質を固定化したガラス基板に標識化組換えPTLを供した。20℃で一晩反応させた後、Probing bufferでガラス基板を洗浄した。
rPTL8のN末端に付加させたStrep・Tag(登録商標)II配列をRecombinant Enterokinase(Novagen社製)により除去した。まず、精製したrPTL8を表17記載の反応組成にて、室温で一晩反応させた。反応後の溶液を実施例5と同様の操作を行い、糖タンパク質アレイにて特異性を解析した。その結果を、図7に示す。
図8に示す構造のピリジルアミノ(PA)化糖鎖を用意した。FAC−1(島津製作所製)を用いて、フロンタルアフィニティクロマトグラフィーを行った。まず、rPTL1〜3を、NHS−活性化セファロース(GEヘルスケアバイオサイエンス社製)の説明書に従って、rPTL−セファロースを作製した。0.8% NaClを含む10mM トリス緩衝液(pH7.4、以下TBSと記載する)中に、rPTL−セファロースを懸濁させ、ミニチュアカラム(φ2mm x 10mm, 31.4μL)に充填した。作製したカラムを、ステンレスホルダーに差し込み、FAC−1装置に接続した。流速及びカラム温度を、それぞれ0.125ml/min及び25℃に保った。前記TBSでミニチュアカラムを平衡後、過剰容積(0.5ml〜4ml)のPA化糖鎖(3.75nM又は7.5nM)を、自動サンプリング装置あるいは手動インジェクション装置を用いてカラム中へ注入した。
サケツバタケ子実体を原料に、実施例1と同様の操作を行い、塩基配列を決定した。解析結果から、サケツバタケ由来レクチン(以下、SRLと記載)cDNAの全長配列(図9、配列番号7)が決定された。SRLの全長配列をコドン表に基づいて変換したアミノ酸配列(図9、配列番号8)は、開始コドン(ATG)から停止コドン(TAA)まで、179個のアミノ酸をコードしていた。また、PTL cDNAからのアミノ酸配列と比較したところ、2ヶ所のアミノ酸欠失、及び1ヶ所のアミノ酸付加、並びに59ヶ所のアミノ酸置換が確認された。
(1)配列番号8の1〜179番、30〜68番、30〜123番、30〜172番、85〜123番、85〜172番、及び134〜172番のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるタンパク質又はペプチド、
(2)配列番号8の1〜179番、30〜68番、30〜123番、30〜172番、85〜123番、85〜172番、及び134〜172番のいずれかで表されるアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ糖認識活性を有するタンパク質又はペプチド。
上記7種類のアミノ酸配列の範囲の意味づけを表22に示す。
実施例2と同様の操作を行い、rSRL0(全長cDNA)を得た。その結果を、図10に示す。予想通りの15.6kDaのバンドを検出した。以上のことから、rSRLの発現を確認し、そしてrSRLを精製することができた。
実施例5と同様の操作を行い、rSRLの特異性を解析した。その結果を、図11に示す。図11から、rSRLは、フコースα1→6糖鎖を持つ糖タンパク質に結合し、かつフコースα1→6糖鎖を持たない糖タンパク質には結合しないことがわかる。
Claims (8)
- 以下の(1)又は(2)のタンパク質又はペプチドをコードする遺伝子:
(1)配列番号2の1〜180番、32〜71番、32〜126番、32〜174番、87〜126番、87〜174番、及び135〜174番のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるタンパク質又はペプチド、
(2)配列番号2の1〜180番、32〜71番、32〜126番、32〜174番、87〜126番、87〜174番、及び135〜174番のいずれかで表されるアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ糖認識活性を有するタンパク質又はペプチド。 - 前記配列番号2のアミノ酸配列をコードする遺伝子が、配列番号1で示される、請求項1に記載の遺伝子。
- 請求項1又は2に記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
- 請求項3に記載の組換えベクターを宿主に導入して得られる形質転換体。
- 請求項4に記載の形質転換体から発現した組換えタンパク質又はペプチド。
- 請求項4に記載の形質転換体を培養又は生育することを特徴とする、組換えタンパク質又はペプチドの製造方法。
- 請求項3に記載の組換えベクターを無細胞タンパク質合成系に供して組換えタンパク質又はペプチドを発現させることを特徴とする、組換えタンパク質又はペプチドの製造方法。
- 請求項5に記載の組換えタンパク質又はペプチドを、タグ配列及び/又は糖認識活性を介したアフィニティー精製にかけることを特徴とする、組換えタンパク質又はペプチドの製造方法。
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