CN101492689A

CN101492689A - 玉米c4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因及其在小麦生产中的应用

Info

Publication number: CN101492689A
Application number: CNA2009100643236A
Authority: CN
Inventors: 许为钢; 李艳; 张磊; 胡琳
Original assignee: Henan Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Henan Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2009-03-04
Filing date: 2009-03-04
Publication date: 2009-07-29

Abstract

本发明涉及一种玉米C₄型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因及其在小麦生产中的应用。该基因为序列表中的SEQ ID No：1所示，基因克隆载体为pMD19－pepc，真核表达载体为p3301－pepc，宿主菌为E.coli感受态细胞DH5α，该羧化酶具有SEQ ID No：2所示的氨基酸序列。本发明通过将玉米C₄型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶导入小麦，对转基因植株的功能分析表明，转基因植株的净光合速率较未转化对照实现了大幅度提高，增幅最大的提高了1.39倍，为目前提高C₃作物净光合速率幅度最大的一项研究。上述结果表明，本发明所涉及的玉米C₄型高光效pepc基因可实现小麦等C₃作物净光合速率的大幅度提高，将为小麦等C₃农作物高光效转基因育种提供重要的技术与材料支撑。

Description

玉米C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因及其在小麦生产中的应用

技术领域

本发明属于生物基因领域，具体涉及一种玉米(禾本科玉米属，Zea mays L.)中C₄型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase，PEPC)基因及其在小麦生产中的应用。

背景技术

小麦、水稻等农作物是我国主要的粮食作物，其生产能力及供需状况始终关系到我国国民经济发展和粮食安全等重大战略问题。从世界范围来看，世界粮食生产状况始终与各国政治、经济发展状况紧密联系，粮食生产量和储备量一有下降，国际粮价就大幅攀升，恐慌情绪就大势蔓延，对各国的政治经济形势造成重大影响；从国内来看，随着我国人口的增长，工业化和城镇化的快速发展，对粮食的需求将持续加大。同时，由于我国粮食作物种植面积不可能大幅度恢复增长，因此要保障我国粮食安全，唯一的出路是持续提高单产，这就要求在小麦、水稻等主要粮食作物的产量性状遗传改良方面获得跨越性的进展。

光合作用是一切绿色植物物质生产的基础，据估计，植物地上部干物质的90％来自于光合作用。因此，提高作物产量的关键是提高光能利用效率，从而提高单位面积的产量。而要大幅度提高光能利用率和实现超高产，必须采取合理株型(外在光合效率)和高光效(内在光合效率)相结合的技术路线。目前小麦、水稻等农作物单产水平的提高，主要是由于品种产量潜力遗传改良和生产条件改善的结果，而产量潜力的遗传改良主要是通过形态性状的改良和杂种优势等途径来实现的，在现有小麦、水稻等农作物品种产量水平已相对较高，且都已具有良好的形态结构，叶面积指数和收获系数都已接近极限的情况下，再单纯依靠上述途径已很难实现产量潜力的跨越式提高。在此背景下，国内外许多学者把目光纷纷投向光能利用效率的遗传改良研究，希望通过提高光合效率来实现生物学产量的大幅度提高，进而获得产量潜力改良的突破性进展。

根据光合作用途径的不同，植物可分为C₃型、C₄型和CAM(景天酸)型。C₄和CAM植物是在逆境下经过长期驯化，从C₃植物进化而来的。与小麦、水稻、大豆等C₃植物相比，玉米、高粱、甘蔗等C₄植物具有CO₂浓缩机制，光补偿点高，CO₂补偿点低，光呼吸弱，特别在高温、干旱等逆境条件下具有明显的光合优势。由于C₄植物具有高光合、高水分、高氮素利用效率以及高生物学产量，因此将C₄途径引入C₃植物以提高其光合效率和籽粒产量，一直是国内外生物学研究领域的重大科学命题。以前此方面的研究主要途径是同室筛选、细胞融合和远缘杂交等方法，但一直未获得突破性进展。近年来日趋成熟的转基因技术由于可以打破物种间的生殖隔离，实现基因在不同物种中的交流，因此已成为解决农作物重要性状遗传改良瓶颈问题的主要技术途径。

PEPC是C₄光合途径中第一个也是最关键的酶，其主要分布在C₄植物叶肉细胞的叶绿体内，形成CO₂浓缩机制，为维管束鞘细胞进行的C₃途径提供CO₂。1999年Maurice S.B.Ku等将玉米pepc基因转入水稻，获得的转基因植株PEPC活性较未转化对照高110倍，转pepc基因水稻已具备初级的CO₂浓缩机制，CO₂补偿点降低，光呼吸显著减弱，光饱和点、净光合速率及羧化效率明显提高，耐光抑制和光氧化能力显著增强，产量较未转化对照可提高10％-30％。但是，该项研究所利用的pepc基因全长接近9kb，目的片段过大，对于小麦、水稻等农作物的规模化遗传转化研究难度较大。因此，通过筛选不同玉米自交系材料，获得高光效玉米种质资源作为pepc基因的供体材料，并从中克隆C₄型pepc基因的cDNA序列，可获得优异的C₄型pepc基因供体材料，并可克隆出片段显著减小、适合于小麦、水稻等农作物规模化遗传转化的目的基因，为C₃农作物高光效基因工程研究提供重要的基因来源。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提供了一种玉米中编码C₄型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)基因的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列，还提供了该基因在C₃型农作物小麦生产中的应用。

本发明的技术方案是：

玉米C₄型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因克隆、生物信息学分析包括以下过程：

(1)玉米高光效材料筛选。通过光合特性分析、酶活测定等手段，从大量玉米种质资源中筛选出高光效玉米材料；(2)目的基因克隆与载体构建。从玉米自交系Z561中提取总RNA，反转录合成cDNA。根据GenBank(登录号：X15238)中公布的序列，设计一对引物，以cDNA为模板进行PCR扩增，得到目的条带并回收，通过T/A克隆法连接到pMD-19T载体上，形成含目的基因的克隆载体pMD19-pepc，热激法将克隆载体导入E.coli感受态细胞DH5a，并进行目的基因测序。利用双酶切的方法，将目的基因重组进真核表达载体pCAMBIA3301；(3)生物信息学分析。针对获得的目的基因序列，用生物信息学软件进行同源性分析、氨基酸序列进化树分析和功能位点分析；(4)pepc在小麦中的应用。

本发明的玉米C₄型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因是下列核苷酸序列之一：

(1)序列表中的SEQ ID No：1所示的核苷酸序列；

(2)编码SEQ ID No：2所示的蛋白质序列的核苷酸序列。

所述的玉米C₄型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因，其特征在于：所述基因的引物序列如下，

P1：5′-GCAGATCTGCTCCAACCATCTCGCTTCCGTG-3′和

P2：5′-GGCACGTGGCCGCCTAGCCAGTGTTCTGCAT-3′。

所述基因的克隆载体为pMD19-pepc，真核表达载体为p3301-pepc，宿主菌为E.coli感受态细胞DH5α。

所述玉米C₄型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶具有所述核苷酸序列编码的氨基酸序列。

所述的玉米C₄型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶具有SEQ ID No：2所示的氨基酸序列。

所述的玉米C₄型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因在提高小麦高光效基因工程育种及生产中的应用。

本发明的积极效果：

1.通过同源克隆法从玉米材料中克隆了C₄型高光效磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因，并进行了生物信息学分析，提供了玉米C₄型pepc基因的核苷酸序列、编码的氨基酸序列以及生物学信息。

2.提高光合效率是小麦等农作物超高产育种的重要技术途径。本项研究通过将玉米C₄型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的真核表达载体pCAMBIA3301用基因枪法导入小麦，用分子手段验证外源pepc基因在转基因小麦植株中的整合和表达。对转基因植株的功能分析(光合特性分析)结果表明，转基因植株的净光合速率较未转化对照实现了大幅度提高，增幅最大的提高了1.39倍，为目前国内外提高C₃作物净光合速率幅度最大的一项研究。上述结果表明，本发明所涉及的玉米C₄型高光效pepc基因可实现小麦等C₃作物净光合速率的大幅度提高，将为小麦等C₃农作物高光效转基因育种提供重要的技术与材料支撑，因此具有重大的现实意义。

3.获得的高光效转基因小麦种质为揭示C₄途径关键酶基因在C₃作物中的遗传与表达规律提供重要的理论支撑，为C₃作物高光效转基因育种提供重要的共性技术基础，因此对于C₃作物高光效基因工程研究具有重要的理论意义。

附图说明：

图1玉米C₄型pepc基因cDNA的PCR产物电泳结果

图2玉米C₄型PEPC蛋白与其它C₃、C₄植物PEPC蛋白进化树分析结果

图3玉米C₄型PEPC蛋白功能位点分析结果

图4玉米C₄型PEPC蛋白与其它C₃、C₄植物PEPC蛋白氨基酸部分序列比较

图5转基因植株pepc基因的PCR产物电泳分析

图中1-8，10-16：部分转基因植株；17：阳性对照(质粒)；18：非转基因对照植株；9：DNA分子量标准。

图6转基因小麦pepc基因表达的RT-PCR检测

图中，1-6：转基因植株；ck：非转基因对照植株。

图7转基因T₀代pepc基因Southern杂交检测

图中，1：阳性对照；2：非转基因对照植株；3-8：部分转基因植株。

实施例1：玉米C₄型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)基因的克隆及生物信息学分析

1.材料与方法

1.1材料

1.1.1植物材料及试剂

本发明所涉及玉米自交系材料由河南省农业科学院粮食作物研究所提供。

实验用RNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒均购自天为时代公司，MLV反转录试剂盒购自Promega公司，LA-TaqDNA聚合酶、pMD-19T克隆载体、大肠杆菌(Escherichia coli)菌株DH5α感受态细胞制备试剂盒均为TaKaRa公司产品，植物表达载体pCOMBIA3301为本实验室保存，限制性内切酶为MBI公司产品，氨苄青霉素为Amersco公司产品，其余试剂为进口或国产分析纯。

1.1.2引物设计及合成

根据已报道的玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)基因的cDNA序列(GenBank登录号：X15238)，利用Primer 5.0软件设计一对引物，序列为：

P1：5′--GCTCCAACCATCTCGCTTCCGTG--3′

P2：5′--GCCGCCTAGCCAGTGTTCTGCAT--3′，

所用引物由上海生物工程公司合成。

1.2方法

1.2.1高光效玉米自交系筛选

选择8月份晴朗无云的天气，利用CIRAS-1光合分析系统和叶绿素荧光动力学分析仪分析玉米种质资源的光合特性，并于室内分析上述种质资源的PEPC酶活性。

1.2.2总RNA提取及反转录

在晴天中午光照较强时，提取玉米幼嫩叶片总RNA，进行反转录。总RNA提取及cDNA合成参照RNA提取试剂盒和MLV反转录试剂盒说明书进行。

1.2.3PCR产物的克隆与测序

1.2.3.1PCR反应

以cDNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体系如下：

ddH2O 30.9μl

Buffer 5μl

dNTP(20mM，mix) 10μl

P1 1μl

P2 1μl

质粒DNA 1.6μl

LA-Taq 0.5μl

PCR反应程序采用两步法进行，94℃预变性5min；94℃变性30s，62℃复性30s，72℃延伸3min，35个循环；然后72℃延伸10min。

1.2.3.2克隆载体构建

PCR产物用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，切下3kb的目的条带，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的片段。将回收的目的片段与克隆载体pMD-19进行连接，连接体系如下：

目的片段 4.5μl

pMD-19 0.5μl

SolutionI 5μl

Total 10μl

16℃连接过夜。

从-80℃冰箱取出100μl感受态细胞DH5a，解冻，加入10μl连接液，冰浴30分钟，42℃水浴90秒，取出Eppendorf管后立即置于冰浴中放置2-3分钟，其间不要摇动离心管。加入37℃的LB(不含抗生素)培养基600μl，37℃振荡培养1小时。4000rpm离心2分钟，吸除600μl培养液，留下100μl培养基悬浮菌液。菌液与4μlIPTG及40μl X-gal混合涂含有50mg/Ap的LB平板上，37℃12-16小时。挑选白色菌落于含50mg/L的氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃剧烈振荡下培养过夜。碱裂解法提取质粒，琼脂糖凝胶电泳检测重组质粒大小，经PCR和酶切鉴定后，进行测序。

1.2.3.3真核表达载体构建

首先对质粒pMD19-pepc进行Pml I和Bgl II双酶切消化，回收pepc基因目的片段，与经过Pml I和Bgl II双酶切的质粒pCOMBIA3301连接，转化E.coliDH5a菌株，经卡那霉素抗性筛选，将含有pepc基因的阳性克隆命名为p3301-pepc。连接反应程序为：

Ligase Buffer 1μl

pCOMBIA3301 4μl

目的片段 4μl

T4DNAligase 1μl

22℃恒温过夜。

从-80℃冰箱取出100μl感受态细胞DH5a，解冻，加入10μl连接液，冰浴30分钟，42℃水浴90秒，取出Eppendorf管后立即置于冰浴中放置2-3分钟，其间不要摇动离心管。加入37℃的LB(不含抗生素)培养基600μl，37℃振荡培养1小时。4000rpm离心2分钟，吸除600μl培养液，留下100μl培养基悬浮菌液。菌液涂于含有50mg/L卡那霉素的LB平板上，37℃、250rpm小时。挑选菌落于含50mg/L卡那霉素的LB液体培养基，37℃、250rpm振荡下培养过夜。碱裂解法提取质粒，琼脂糖凝胶电泳检测重组质粒大小，经PCR和酶切鉴定。

1.2.3.4pepc基因序列生物信息学分析

将核苷酸测序结果在NCBI服务器上用Blast搜索软件进行同源性基因检索分析，利用互联网在http://www.expasy.org/tools/protparam.html上对玉米pepc基因所表达的蛋白质氨基酸序列进行理化性质分析，应用DNAMAN软件对8个PEPC蛋白氨基酸序列做系统进化分析。

2.结果与分析

2.1玉米C₄型pepc基因的克隆

以玉米总RNA为模板，Oligo(dT)₁₅为引物反转录合成总cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳结果，在3kb处有一条亮带(见附图1)，回收该片段与测序载体连接后进行测序。

2.2玉米C₄型pepc基因cDNA序列测定

核苷酸序列分析表明，该开放阅读框全长2910bp，编码970个氨基酸，如SEQ ID No：1和SEQ ID No：2所示序列。与已登陆的玉米pepc基因(X15238)相比，核苷酸序列中有16处碱基差异，分别为第105、291、621、651、657、669、798、803、852、1168、1416、1531、1543、1614、1785和1795位。上述核苷酸序列的差异导致蛋白质水平上5处氨基酸差异，其中第803，1168，1531，1614和1795位的变化使编码的氨基酸分别由非极性的Ala变为酸性的Asp，非极性的Phe变为非极性的Leu，非极性的Pro变为极性的Ser，酸性的Asp变为酸性的Glu，酸性的Asp变为极性的Tyr，其它碱基的变化不影响氨基酸编码。

2.3玉米CX型PEPC蛋白氨基酸序列分析

利用互联网在http://www.expasy.org/tools/protparam.html上对玉米pepc基因所表达的蛋白质氨基酸序列进行理化性质分析，表明该基因由970个氨基酸组成，分子量为109.359KD，等电点PI为5.77，分子式C₄₈₈₃H₇₇₂₆N₁₃₄₄O₁₄₄₄S₃₁，不稳定系数为45.74。

2.4玉米PEPC蛋白氨基酸序列的系统进化分析

应用DNAMAN软件对8个PEPC蛋白氨基酸序列做系统进化分析。从系统进化树中可以看出(见附图2)，所克隆的玉米C₄型PEPCase与甘蔗和高粱的C₄型遗传距离最近，与谷子C₄型次之。谷子C₄型先与C₃型PEPC聚为一类，然后再与C₄型聚合，表明玉米C₄型PEPCase与甘蔗和高粱的C₄型同源性高于与谷子C₄型PEPCase的同源性。

2.5玉米C₄型PEPC编码蛋白质的功能位点分析

在EMBL服务器上用Iterproscan软件对克隆的玉米C₄型PEPC编码蛋白质的功能位点进行分析，结果表明，玉米PEPC蛋白质氨基酸序列有7个保守区(见附图3)。其中，15-970氨基酸序列为该蛋白质的功能域部分，177位的组氨酸(H)可能与草酰乙酸(OAA)的形成有关，606位的赖氨酸(K)和639位的组氨酸(H)可能与底物PEP结合有关，731位的缬氨酸(V)和780位的丝氨酸(S)为C₄型PEPCase特性，而在C₃和CAM植物中，PEPCase在731位和780位左右的氨基酸分别是异亮氨酸(I)和丙氨酸(A)(见附图4)，C末端731位和780位的氨基酸分别是缬氨酸(V)和丝氨酸(S)，表明是该基因是一个C₄型基因。C末端区域包含有高度保守的赖氨酸残基，推测可能是PEP结合位点。另外，还含有与催化机制有关的高度保守区域。

实施例2玉米C₄型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因导入小麦及其功能分析

1.材料与方法

1.1材料

1.1.1植物材料及试剂

5个小麦品种(系)：周麦19、00H97-54-2-7、郑麦9023、17-1和新麦18由河南省农科院小麦研究中心分子育种研究室提供。基因枪试剂及耗材购自美国伯乐公司，PCR试剂购自大连宝生物公司，其余试剂为进口或国产分析纯。

1.2方法

1.2.1目的基因的转化、筛选与再生

以5个小麦品种(系)的幼胚为受体材料。取开花后12-14d的穗中部、大小一致的未成熟种子，用70％的酒精表面消毒1min，无菌水冲洗3次后用0.1％的HgCl₂消毒10min，无菌水冲洗3-4次。无菌条件下剥出幼胚(1mm左右)，于含有2mg/L 2，4-D的MS诱导培养基上暗培养4-5d后，置于高渗培养基上渗透处理4-6h，基因枪轰击后高渗处理16h，转至愈伤诱导培养基。培养2周后转至草丁膦抗性筛选再生培养基，连续筛选2代，每代2周，经过筛选的抗性苗转至生根培养基，生根、壮苗后移入花盆中。

1.2.2转化植株的PCR分析鉴定

CTAB法提取草丁膦抗性植株和对照植株叶片的总DNA，用于转化植株目的基因的PCR筛选，所用引物为P3：5’-TGGAAGGGCGTGCCTAAGTT-3’和P4：5，-ATGCCGAGGTGCGTGGTGAT-3’。目的片段大小为668bp，扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性15s，58℃复性15s，72℃延伸30s，34个循环；72℃延伸10min。

1.2.3转基因小麦pepc基因表达的半定量RT-PCR分析

在晴天晴朗条件下，提取对照和转基因小麦植株幼嫩叶片总RNA，并进行反转录。分别以其cDNA为模板进行半定量RT-PCR分析。pepc基因引物与PCR鉴定时相同，Actin基因作为内参对照，引物序列为

AP1：5′-GTTCCAATCTATGAGGGATACACGC-3′；

AP2：5′-GAACCTCCACTGAGAACAACATTACC-3′。

PCR程序为94℃预变性2min；94℃变性15s，55℃复性15s，72℃延伸15s，34个循环；72℃延伸10min。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.4转基因Southern杂交

Southern杂交由北京鼎国生物技术有限公司完成。取部分经PCR检测的转基因植株和未转化阴性对照DNA用HindIII酶切、电泳、洗胶、转膜、预杂交后，质粒p3301-pepc用Pml I和Bgl II双酶切，以酶切获得的pepc基因片段为探针进行杂交，洗膜后在-70℃冰箱中放射自显影3-4天。

1.2.5T₀代转基因小麦植株气体交换测定

在小麦孕穗期，选择上午11时晴朗无云天气时，利用CIRAS-1便携式光合测定系统(选自英国PP System公司)测定转基因和对照植株叶片的净光合速率。每株测定倒一叶、倒二叶和倒三叶，取其平均值。测定时叶室温度为26℃左右，光照强度1000-1100μmol m-2s-1，环境温度25℃左右。

2.结果与分析

2.1转玉米C₄型pepc基因的获得及PCR检测结果

本研究共获得400株草丁膦抗性再生植株，其中周麦19抗性再生植株52株，00H97-54-2-7抗性再生植株92株，郑麦9023抗性再生植株122株，17-1抗性再生植株83株，新麦18抗性再生植株51株。提取所有抗性再生植株总DNA，进行PCR扩增，对照植株均未扩增出目标条带，抗性再生植株中有344株扩增出668bp的目的条带(见附图5)，其中周麦19有49株，00H97-54-2-7有87株，郑麦9023有86株，17-1有73株，新麦18有47株。周麦19、00H97-54-2-7、郑麦9023、17-1和新麦18转化植株的PCR阳性频率分别为1.53％，4.01％，2.57％，2.10％和0.76％(见表1)。初步证明目的基因已整合到小麦DNA中。

表1基因枪转化不同基因型小麦的转化频率

其中PCR阳性频率＝(PCR阳性植株数/轰击幼胚总数)×100

2.2转基因小麦pepc基因表达的半定量RT-PCR检测结果

取1株对照和6株转基因小麦植株，提取总RNA，分别进行pepc基因和Actin基因的RT-PCR扩增。以Actin基因确定PCR的循环数为35时进入平台期，因此PCR取34个循环。用Actin调整模板用量，当扩增产物的亮度基本一致时，可确定模板浓度一致，以用于pepc基因扩增。扩增结果见图7，对照植株没有扩增出目的条带，而6株转基因小麦植株均扩增出668bp的目标条带。不同转基因植株表达pepc的量存在较大差异，1号和2号的表达量明显高于其它植株，3号表达量较低。内参Actin基因的表达在对照和转基因植株间没有差别，表明玉米pepc基因在小麦基因组中得到了正确转录。见附图6。

2.3转基因小麦Southern杂交验证

Southern杂交结果显示，所选取的经PCR检测的转基因植株均出现1至多条杂交带，证明玉米高光效pepc基因已经整合进转基因植株中，见附图7。

2.4T0代转基因小麦植株净光合速率测定结果

在5个受体材料中分别选择生育期和对照一致的转基因T0代PCR阳性植株测定其净光合速率。由表2可看出，在所检测的28株转基因植株中，除周麦19有3株光合速率低于对照外，其余25株均高于对照(占89.3％)，光合速率比对照增加3％-30％的有6株，占21.4％；增加30％-100％的有14株，占50％；增加100％以上的有5株，占17.9％。光合速率最高的(20.03)转基因植株较未转化对照(8.37)提高了139％。光合速率增幅除在00H97-54-2和郑麦9023间无差异以外，其余不同材料间差异明显，可能与所检测植株数目较少有关。17-1增幅100％以上的占62.5％，新麦18增幅在30％-100％之间。此结果证明转入的玉米pepc基因在小麦中得到了正确表达，并使部分转基因植株净光合速率明显提高。

表2转基因植株净光合速率频率分布

序列表

<110>河南省农业科学院

<120>一种玉米C₄型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的基因

<130>PCR产物的克隆与测序

<160>2

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>2913

<212>DNA

<213>禾本科玉米属(Zea mays L.)

<400>1

atggcgtcga ccaaggcacc cggccccggc gagaagcacc actccatcga cgcgcagctc 60

cgtcagctgg tcccaggcaa ggtctccgag gacgacaagc tcatcgagta cgatgcgctg 120

ctcgtcgacc gcttcctcaa catcctccag gacctccacg ggcccagcct tcgcgaattt 180

gtccaggagt gctacgaggt ctcggccgac tacgagggca aaggagacac gacgaagctg 240

ggcgagctcg gcgccaagct cacggggctg gcccccgccg acgccatcct cgtggcgagc 300

tccatcctgc acatgctcaa cctcgccaac ctggccgagg aggtgcagat cgcgcaccgc 360

cgccgcaaca gcaagctcaa gaaaggtggg ttcgccgacg agggctccgc caccaccgag 420

tccgacatcg aggagacgct caagcgcctc gtgtccgagg tcggcaagtc ccccgaggag 480

gtgttcgagg cgctcaagaa ccagaccgtc gacctcgtct tcaccgcgca tcccacgcag 540

tccgcccgcc gctcgctcct gcagaaaaac gccaggatcc ggaattgtct gacccagctg 600

aatgccaagg acatcactga cgacgacaag caggagctcg atgaggctct gcagagagag 660

atccaagcag ccttcagaac cgatgaaatc aggagggcac aacccacccc ccaggacgaa 720

atgcgctatg ggatgagcta catccatgag actgtatgga agggcgtgcc taagttcttg 780

cgccgtgtgg atacagccct gaagaatatc ggcatcaatg agcgccttcc ctacaatgtt 840

tctctcattc ggttctcttc ttggatgggt ggtgaccgcg atggaaatcc aagagttacc 900

ccggaggtga caagagatgt atgcttgctg gccagaatga tggctgcaaa cttgtacatc 960

gatcagattg aagagctgat gtttgagctc tctatgtggc gctgcaacga tgagcttcgt 1020

gttcgtgccg aagagctcca cagttcgtct ggttccaaag ttaccaagta ttacatagaa 1080

ctctggaagc aaattcctcc aaacgagccc taccgggtga tactaggcca tgtaagggac 1140

aagctgtaca acacacgcga gcgtgctcgc catctgctgg cttctggagt ttctgaaatt 1200

tcagcggaat cgtcatttac cagtatcgaa gagttccttg agccacttga gctgtgctac 1260

aaatcactgt gtgactgcgg cgacaaggcc atcgcggacg ggagcctcct ggacctcctg 1320

cgccaggttt tcacgttcgg gctctccctg gtgaagctgg acatccggca ggagtcggag 1380

cggcacaccg acgtgatcga cgccatcacc acgcacctcg gcatcgggtc gtaccgcgag 1440

tggtccgagg acaagcggca ggagtggctg ctgtcggagc tgcgaggcaa gcgcccgctg 1500

ctgcccccgg accttcccca gaccgaggag atcgccgacg tcatcggcgc gttccacgtc 1560

ctcgcggagc tcccgcccga cagcttcggc ccctacatca tctccatggc gacggccccc 1620

tcggacgtgc tcgccgtgga gctcctgcag cgcgagtgcg gcgtgcgcca gccgctgccc 1680

gtggtgccgc tgttcgaaag gctggcctac ctgcagtcgg cgcccgcgtc cgtggagcgc 1740

ctcttctcgg tggactggta catggaccgg atcaagggca agcagcaggt catggtcggc 1800

tactccgact ccggcaagga cgccggccgc ctgtccgcgg cgtggcagct gtacagggcg 1860

caggaggaga tggcgcaggt ggccaagcgc tacggcgtca agctcacctt gttccacggc 1920

cgcggaggca ccgtgggcag gggtggcggg cccacgcacc ttgccatcct gtcccagccg 1980

ccggacacca tcaacgggtc catccgtgtg acggtgcagg gcgaggtcat cgagttctgc 2040

ttcggggagg agcacctgtg cttccagact ctgcagcgct tcacggccgc cacgctggag 2100

cacggcatgc acccgccggt ctctcccaag cccgagtggc gcaagctcat ggacgagatg 2160

gcggtcgtgg ccacggagga gtaccgctcc gtcgtcgtca aggaggcgcg cttcgtcgag 2220

tacttcagat cggctacacc ggagaccgag tacgggagga tgaacatcgg cagccggcca 2280

gccaagagga ggcccggcgg cggcatcacg accctgcgcg ccatcccctg gatcttctcg 2340

tggacccaga ccaggttcca cctccccgtg tggctgggag tcggcgccgc attcaagttc 2400

gccatcgaca aggacgtcag gaacttccag gtcctcaaag agatgtacaa cgagtggcca 2460

ttcttcaggg tcaccctgga cctgctggag atggttttcg ccaagggaga ccccggcatt 2520

gccggcttgt atgacgagct gcttgtggcg gaagaactca agccctttgg gaagcagctc 2580

agggacaaat acgtggagac acagcagctt ctcctccaga tcgctgggca caaggatatt 2640

cttgaaggcg atccattcct gaagcagggg ctggtgctgc gcaaccccta catcaccacc 2700

ctgaacgtgt tccaggccta cacgctgaag cggataaggg accccaactt caaggtgacg 2760

ccccagccgc cgctgtccaa ggagttcgcc gacgagaaca agcccgccgg actggtcaag 2820

ctgaacccgg cgagcgagta cccgcccggc ctggaagaca cgctcatcct caccatgaag 2880

ggcatcgccg ccggcatgca gaacactggc tag 2913

<210>2

<211>970

<212>PRT

<213>禾本科玉米属(Zea mays L.)

<400>2

Met Ala Ser Thr Lys Ala Pro Gly Pro Gly Glu Lys His His Ser

1 5 10 15

Ile Asp Ala Gln Leu Arg Gln Leu Val Pro Gly Lys Val Ser Glu

20 25 30

Asp Asp Lys Leu Ile Glu Tyr Asp Ala Leu Leu Val Asp Arg Phe

35 40 45

Leu Asn Ile Leu Gln Asp Leu His Gly Pro Ser Leu Arg Glu Phe

50 55 60

Val Gln Glu Cys Tyr Glu Val Ser Ala Asp Tyr Glu Gly Lys Gly

65 70 75

Asp Thr Thr Lys Leu Gly Glu Leu Gly Ala Lys Leu Thr Gly Leu

80 85 90

Ala Pro Ala Asp Ala Ile Leu Val Ala Ser Ser Ile Leu His Met

95 100 105

Leu Asn Leu Ala Asn Leu Ala Glu Glu Val Gln Ile Ala His Arg

110 115 120

Arg Arg Asn Ser Lys Leu Lys Lys Gly Gly Phe Ala Asp Glu Gly

125 130 135

Ser Ala Thr Thr Glu Ser Asp Ile Glu Glu Thr Leu Lys Arg Leu

140 145 150

Val Ser Glu Val Gly Lys Ser Pro Glu Glu Val Phe Glu Ala Leu

155 160 165

Lys Asn Gln Thr Val Asp Leu Val Phe Thr Ala His Pro Thr Gln

170 175 180

Ser Ala Arg Arg Ser Leu Leu Gln Lys Asn Ala Arg Ile Arg Asn

185 190 195

Cys Leu Thr Gln Leu Asn Ala Lys Asp Ile Thr Asp Asp Asp Lys

200 205 210

Gln Glu Leu Asp Glu Ala Leu Gln Arg Glu Ile Gln Ala Ala Phe

215 220 225

Arg Thr Asp Glu Ile Arg Arg Ala Gln Pro Thr Pro Gln Asp Glu

230 235 240

Met Arg Tyr Gly Met Ser Tyr Ile His Glu Thr Val Trp Lys Gly

245 250 255

Val Pro Lys Phe Leu Arg Arg Val Asp Thr Ala Leu Lys Asn Ile

260 265 270

Gly Ile Asn Glu Arg Leu Pro Tyr Asn Val Ser Leu Ile Arg Phe

275 280 285

Ser Ser Trp Met Gly Gly Asp Arg Asp Gly Asn Pro Arg Val Thr

290 295 300

Pro Glu Val Thr Arg Asp Val Cys Leu Leu Ala Arg Met Met Ala

305 310 315

Ala Asn Leu Tyr Ile Asp Gln Ile Glu Glu Leu Met Phe Glu Leu

320 325 330

Ser Met Trp Arg Cys Asn Asp Glu Leu Arg Val Arg Ala Glu Glu

335 340 345

Leu His Ser Ser Ser Gly Ser Lys Val Thr Lys Tyr Tyr Ile Glu

350 355 360

Leu Trp Lys Gln Ile Pro Pro Asn Glu Pro Tyr Arg Val Ile Leu

365 370 375

Gly His Val Arg Asp Lys Leu Tyr Asn Thr Arg Glu Arg Ala Arg

380 385 390

His Leu Leu Ala Ser Gly Val Ser Glu Ile Ser Ala Glu Ser Ser

395 400 405

Phe Thr Ser Ile Glu Glu Phe Leu Glu Pro Leu Glu Leu Cys Tyr

410 415 420

Lys Ser Leu Cys Asp Cys Gly Asp Lys Ala Ile Ala Asp Gly Ser

425 430 435

Leu Leu Asp Leu Leu Arg Gln Val Phe Thr Phe Gly Leu Ser Leu

440 445 450

Val Lys Leu Asp Ile Arg Gln Glu Ser Glu Arg His Thr Asp Val

455 460 465

Ile Asp Ala Ile Thr Thr His Leu Gly Ile Gly Ser Tyr Arg Glu

470 475 480

Trp Ser Glu Asp Lys Arg Gln Glu Trp Leu Leu Ser Glu Leu Arg

485 490 495

Gly Lys Arg Pro Leu Leu Pro Pro Asp Leu Pro Gln Thr Glu Glu

500 505 510

Ile Ala Asp Val Ile Gly Ala Phe His Val Leu Ala Glu Leu Pro

515 520 525

Pro Asp Ser Phe Gly Pro Tyr Ile Ile Ser Met Ala Thr Ala Pro

530 535 540

Ser Asp Val Leu Ala Val Glu Leu Leu Gln Arg Glu Cys Gly Val

545 550 555

Arg Gln Pro Leu Pro Val Val Pro Leu Phe Glu Arg Leu Ala Tyr

560 565 570

Leu Gln Ser Ala Pro Ala Ser Val Glu Arg Leu Phe Ser Val Asp

575 580 585

Trp Tyr Met Asp Arg Ile Lys Gly Lys Gln Gln Val Met Val Gly

590 595 600

Tyr Ser Asp Ser Gly Lys Asp Ala Gly Arg Leu Ser Ala Ala Trp

605 610 615

Gln Leu Tyr Arg Ala Gln Glu Glu Met Ala Gln Val Ala Lys Arg

620 625 630

Tyr Gly Val Lys Leu Thr Leu Phe His Gly Arg Gly Gly Thr Val

635 640 645

Gly Arg Gly Gly Gly Pro Thr His Leu Ala Ile Leu Ser Gln Pro

650 655 660

Pro Asp Thr Ile Asn Gly Ser Ile Arg Val Thr Val Gln Gly Glu

665 670 675

Val Ile Glu Phe Cys Phe Gly Glu Glu His Leu Cys Phe Gln Thr

680 685 690

Leu Gln Arg Phe Thr Ala Ala Thr Leu Glu His Gly Met His Pro

695 700 705

Pro Val Ser Pro Lys Pro Glu Trp Arg Lys Leu Met Asp Glu Met

710 715 720

Ala Val Val Ala Thr Glu Glu Tyr Arg Ser Val Val Val Lys Glu

725 730 735

Ala Arg Phe Val Glu Tyr Phe Arg Ser Ala Thr Pro Glu Thr Glu

740 745 750

Tyr Gly Arg Met Asn Ile Gly Ser Arg Pro Ala Lys Arg Arg Pro

755 760 765

Gly Gly Gly Ile Thr Thr Leu Arg Ala Ile Pro Trp Ile Phe Ser

770 775 780

Trp Thr Gln Thr Arg Phe His Leu Pro Val Trp Leu Gly Val Gly

785 790 795

Ala Ala Phe Lys Phe Ala Ile Asp Lys Asp Val Arg Asn Phe Gln

800 805 810

Val Leu Lys Glu Met Tyr Asn Glu Trp Pro Phe Phe Arg Val Thr

815 820 825

Leu Asp Leu Leu Glu Met Val Phe Ala Lys Gly Asp Pro Gly Ile

830 835 840

Ala Gly Leu Tyr Asp Glu Leu Leu Val Ala Glu Glu Leu Lys Pro

845 850 855

Phe Gly Lys Gln Leu Arg Asp Lys Tyr Val Glu Thr Gln Gln Leu

860 865 870

Leu Leu Gln Ile Ala Gly His Lys Asp Ile Leu Glu Gly Asp Pro

875 880 885

Phe Leu Lys Gln Gly Leu Val Leu Arg Asn Pro Tyr Ile Thr Thr

890 895 900

Leu Asn Val Phe Gln Ala Tyr Thr Leu Lys Arg Ile Arg Asp Pro

905 910 915

Asn Phe Lys Val Thr Pro Gln Pro Pro Leu Ser Lys Glu Phe Ala

920 925 930

Asp Glu Asn Lys Pro Ala Gly Leu Val Lys Leu Asn Pro Ala Ser

935 940 945

Glu Tyr Pro Pro Gly Leu Glu Asp Thr Leu Ile Leu Thr Met Lys

950 955 960

Gly Ile Ala Ala Gly Met Gln Asn Thr Gly

965 970

Claims

1、一种玉米C₄型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因，其特征在于：该基因是下列核苷酸序列之一：

(1)序列表中的SEQ ID No：1所示的核苷酸序列；

(2)编码SEQ ID No：2所示的蛋白质序列的核苷酸序列。

2、根据权利要求1所述的基因，其特征在于：该基因为序列表中的SEQ IDNo：1所示的核苷酸序列。

3、根据权利要求1所述的玉米C₄型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因，其特征在于：所述基因的引物序列如下，

P1：5′-GCAGATCTGCTCCAACCATCTCGCTTCCGTG-3′和

P2：5′-GGCACGTGGCCGCCTAGCCAGTGTTCTGCAT-3′。

4、根据权利要求1所述的玉米C₄型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因，其特征在于：所述基因的克隆载体为pMD19-pepc，真核表达载体为p3301-pepc，宿主菌为E.coli感受态细胞DH5α。

5、一种玉米C₄型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，其特征在于：该羧化酶具有权利要求1所述核苷酸序列编码的氨基酸序列。

6、一种权利要求5所述的玉米C₄型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，其特征在于：该羧化酶具有SEQ ID No：2所示的氨基酸序列。

7、权利要求1所述的玉米C₄型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因在提高小麦高光效基因工程育种及生产中的应用。