NO166301B - Reagenssystem for detektering av en spesiell polynukleotidsekvens i et forsoeksmedium ved nukleinsyrehybridisering og anvendelse av dette. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører reagenssystemer for detektering av en spesiell polynukleotidsekvens i et for-søksmedium ved nukleinsyrehybridisering, samt anvendelse av reagenssystemet.

Prinsippet for nukleinsyrehybridiseringsanalyser ble utviklet ved arbeider innenfor feltet rekombinant DNA

som et middel til bestemmelse og isolering av spesielle polynukleotid -basesekvenser av interesse. Det ble funnet at enkeltkjedede nukleinsyrer, f.eks. DNA og RNA, slik som de foreligger ved å denaturere de dobbeltkjedede formene, vil hybridisere eller rekombinere under egnede betingelser med komplementære enkeltkjedede nukleinsyrer. Ved merking av slike komplementære probe nukleinsyrer med en lett detekterbar kjemisk gruppe ble det gjort mulig å detektere nærvær av en hvilken som helst polynukleotidsekvens av interesse,

med et forsøksmedium, som inneholder prøvenukleinsyrer på enkeltkjedet form.

I tillegg til feltet til rekombinant DNA, kan den analytiske hybridiseringsteknikken anvendes ved detektering av viktige polynukleotider innen området human- og veterinærmedisin, jordbruk, og næringsmiddelteknologi bl.a. Spesielt kan teknikken benyttes til å detektere og identifisere etiologiske agenser som

som f.eks. bakterier og viruser, og undersøke bakterier med hensyn til antibiotisk resistens; a lette diagnosen av genetiske forstyrrelser som f.eks. sigdcelleanemi og thalassemia, og å detektere kreftceller. En generell oversikt over teknikken og dens nåværende og antatte frem-tidige betydning, finnes i Biotechnology (august 1983),

side 471-478.

Følgende informasjon er tilveiebragt for å gjøre kjent informasjon som antas å være relevant i forbindelse med foreliggende oppfinnelse.

Teknikkens stand vedrørende metoder for nukleinsyrehybridiseringsanalyse innbefatter generelt immobilisering av prøvenukleinsyre på en fast bærer. Hybridisering mellom spesielle basesekvenser eller gener av interesse, i prøvenukleinsyren, bestemmes ved å separere den faste bæreren fra resten av reaksjonsblandingen som inneholder ubundet merket probe, etterfulgt av detektering av merket på den faste bæreren.;

Nødvendigheten av å immobilisere prøvenukleinsyrer for

å gjennomføre de hittil kjente hybridiseriirgsanalysene medfører to betydelige problemer. For det første er de fremgangsmåtene som må gjennomføres for å

oppnå immobilisering generelt tidkrevende og utgjør et ekstra trinn som er uønsket for rutinemessig anvendelse i et klinisk laboratorium. For det andre kan proteiner og andre materialer i den heterogene prøven, spesielt i tilfellet med kliniske prøver, påvirke immobiliseringen av prøvenukleinsyrene.

Som alternativer til immobilisering av prøvenukleinsyrer og tilsats av merket probe, kan man benytte en immobilisert probe og merke prøvenukleinsyre in situ, eller man kan benytte en dual hybridiseringsteknikk som krever to prober, hvorav den ene mobiliseres og den andre merkes (Methods in Enzymology 65 :468 (1968); og Gene 21:77-86(1983)). Det første alternativet

er imidlertid enda mindre ønskelig fordi in situ-merking av prøvenukleinsyrene stiller større krav til tekniske ferdigheter enn man kan vente hos klinisk laboratoriepersonale, og det foreligger ingen enkel, pålitelig fremgangsmåte for å overvåke merkeutbyttet. Dette kan være et betydelig problem dersom merkemediet inneholder forskjellige mengder av inhibitorer for merkings-reaksjon. Den duale hybridiseringsteknikken har den ulempen at den krever en ekstra reagens og et ekstra inkuberingstrinn, og kinetikken for hybridiserings-

reaksjonen kan være langsom og lite effektiv. Nøyaktigheten ved analysen kan også være variabel dersom komplementariteten til de to probene med prøvesekvensen er variabel.

Teknikker for direkte detektering av det polynukleotide duplekset som dannes som produkt av hybridiseringen mellom prøven og polynukleotidene, for derved å

unngå kjemisk merking og immobilisering av prøve eller probe polynukleotider, har generelt ikke virket tilfredsstillende. Forsøk på å generene antistoffer som selektivt vil binde det dobbeltkjedede DNA * DNA hybridet fremfor enkeltkjedet DNA, har feilet

(Parker og Halloran, "Nucleic Acids in Immunology", red. Plescia og Braun, Springer-Verlag, NY (1969) s. 18 et seq). En viss fremgang er oppnådd ved generering av antistoffer som binder DNA•RNA blandede hybrider eller RNA*RNA hybrider og som har lav affinitet for de enkeltkjedede polynukleotidene (se f.eks. Rudkin og Stollar, Nature 265:472 (1977)). Rudkin og Stollar, festet hele celler på objektglass, og eksponerte DNA i kjernen. Det ble hybridisert med en RNA-

probe og hybridet ble detektert ved fluorescens ved mikroskopi med fluorescein-merket antistoff til DNA'RNA. Imidlertid krever disse fremgangsmåtene som er beskrevet, som i tilfellet med hybridiseringsteknikkene som er diskutert ovenfor, hvor det anvendes merkede prober, immobilisering ai prøvenukleinsyrene. Immobilisering av cellulært DNA for in situ hybridisering er spesielt vanskelig fordi DNA må forbli festet til ømfindtlige celleresiduer under hybridiseringen og de immuno-kjemiske deteksjonstrinn. Resultatene som observeres ved fluorescensmikroskopi gir ikke kvantitative data angående mengden av hybrid som er dannet.

Følgelig foreligger det et behov for en nukleinsyrehybridiseringsanalyse som ikke krever immobilisering eller merking av prøvenukleinsyrer, og som ikke krever duale prober. Videre bør en slik teknikk tillate anvendelsen av en rekke merker, spesielt av!den ikke-jradioisotope typen. En fremgangsmåte for nukleinsyrehybridiseringsanalyse og et reagenssystem som har disse og andre fordeler, er hovedformålene ved foreliggende oppfinnelse.

Man har nå kommet fram til en fremgangsmåte, for nukleinsyrehybridiseringsanalyse som eliminerer behovet for å immobilisere eller merke prøvenukleinsyrer og som krever bare et enkelt probeelement.

Ved foreliggende oppfinnelse ti 1veiebringes;et reagens-

i

system for detektering av en spesiell polynukleotidsekvens i et forsøksmedium ved nukleinsyrehybridisering, innbefattende at forsøksmediet kombineres med en polynukleotid- . probe som omfatter minst en enkeltkjedet basesekvens som idet vesentlige er komplementær med sekvensen som skal bestemmes, under betingelser som fremmer hybridisering mellom sekvensen som skal bestemmes og den komplementære probesekvensen, idet den komplementære probesekvensen (i) idet vesentlige består av RNA når sekvensen som skal bestemmes er RNA eller DNA, eller (ii) idet vesentlige består av DNA eller RNA, når sekvensen som skal bestemmes er RNA, og hybridisert probe detekteres ved! tilsats av en antistoffreagens som er istand til å bindes til DNA-RNA duplekser som er dannet.mellom sekvensen som skal bestemmes og den komplementære probesekvensen og bestemmelse av ant i stoff reagensen som blir bundet til slike duplekser.

Reagenssystemet er kjennetegnet ved at proben foreligger

i en immobilisert form eller innbefatter et' bindende sete for et spesifikt bindende stoff, og når sistnevnte er tilfelle omfatter reagenssystemet videre en immobilisert form av et spesifikt bindende stoff.

Foreliggende oppfinnelse omfatter videre anvendelsen av reagenssystemet for detektering av en spesiell polynukleotidsekvens ved nukleinsyrehybridisering.

De resulterende hybridene kan så detekteres, etter,

eller samtidig med, immobilisering av proben der hvor denne ble kombinert med forsøksmediet på en immobilisert form, med tilsats av en antistoffreagens som er istand til å bindes til DNA * RNA eller RNA * RNA dupleksene som er dannet, og bestemmelse av antistoffreagensen som bindes til slike duplekser. En rekke fremgangsmåter og kombinasjoner av reagenser kan anvendes for å gjennomføre prinsippene ifølge foreliggende fremgangsmåte. Viktige trekk ved foreliggende oppfinnelse er at prøvenukleinsyrene ikke immobiliseres eller må merkes før de bringes i kontakt med proben.

Antistoffreagensen er nøkkelen til spesifikk og følsom detektering av hybridisering mellom proben og prøvenukleinsyrene. Naturligvis kan hele antistoffer eller egnede fragmenter og polyfunksjonelle former derav benyttes slik de beskrives nærmere nedenfor, og det bør bemerkes at når betegnelsen antistoffreagens benyttes i foreliggende beskrivelse og krav, betyr den både hele antistoffer og deres polyfunksjonelle og fragmenterte former, med mindre annet er angitt.

Bestemmelse av binding mellom antistoffreagens

og hybridiseringsduplekser kan oppnås på en hvilken som helst hensiktsmessig måte. Det foretrekkes at antistoffreagensen er merket med en detekterbar kjemisk gruppe som f.eks. en enzymatisk aktiv gruppe, en fluorescerende gruppe,en kromoforerende gruppe, en luminiscerende gruppe.en spesifikt bindbar ligand,

eller en radioisotop, ikke-radioisotope merker er spesielt foretrukket. Den merkede antistoffreagensen som bindes til resulterende immobiliserte hybridduplekser kan lett separeres fra antistoff som ikke bindes, og den detekterbare kjemiske gruppen eller merket måles i en av de separate fraksjonene, vanligvis i den førstnevnte .

Ved å eliminere behovet for å immobilisere eller

merke prøvenukleinsyrene, tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en meget fordelaktig hybridiseringsteknikk for analyse. Det kreves ikke en høy grad av tekniske ferdigheter av personen som utfører analysen, videre spares den tiden som ville vært påkrevet for å utføre immobilisering- eller merkefremgangsmåtene. Videre elimineres muligheten for interferens mellom prøven og immobiliseringsfremgangsmåten fullstendig. Forsøkspakken som tilveiebringes for den kliniske brukeren innbefatter proben på allerede immobilisert, eller på en lett immobiliserbar, form, som f.eks. ved binding til en immobilisert bindende partner.

I de tidligere kjente systemene kan interferens

fra fremmedproteiner og andre materialer i prøven være et alvorlig problem, enten prøvenukleinsyrene-som skal immobiliseres er RNA eller DNA.

Ved de tidligere kjente fremgangsmåtene oppnås immobilisering ved absorbsjon på en mikroporøs membran, som f.eks. nitrocellulose, eller ved kovalent binding til reaktive posisjoner ,på en fast bærer. I det første tilfellet kan proteiner, fra prøven dekke overflaten og blokkere absorbsjonen av nukleinsyrer. Videre krever mange fremgangsmåter oppvarming til forhøyede temperaturer, vanligvis høyere enn 80°C, i vakuum, for å feste absorberte nukleinsyrer til bæreren. Dersom slim eller andre materialer som er endogene i prøven er tilstede, kan de bli tørket på bæreren slik at det dannes en film som kan absorbere den merkede proben under hybridiseringen og øke bakgrunnssignalet og følgelig nedsette følsom-heten. Dersom videre et enzym eller annet protein er involvert i denne seksjonen av merket kan det ofte bindes ikke-spesifikt til filmen og bidra ytterligere til problemet med bakgrunnssignal. Dersom kovalent immobilisering benyttes, kan proteiner og andre materialer fra prøven ventes å ha tilgjengelige reaktive grupper som vil ta del i koblingsreaksjonen og nøytralisere koblingen av de ønskede nukleinsyrene.

Siden foreliggende oppfinnelse tilveiebringer proben

i foretrukne utførelser på en allerede immobilisert form, eller på en form som lett kan immobiliseres med binding til en immobilisert bindende partner, overvinnes ulempene som er knyttet til de tidligere kjente immobiliseringsfremgangsmåtene og følgelig opprettholdes deteksjonsgrensene for analysen.

En ytterligere forder er at ikke-spesifikk binding

av prøve RNA eller DNA til den faste bæreren, ikke vil gjenkjennes av antistoffreagensen. Følgelig vil bakgrunnssignalet være lavt og deteksjonsgrensen vil forbedres tilsvarende. I den duale hybridiseringsfremgangsmåten som benytter både en merket probe og en immobilisert probe, kan det merkede nukleotidet bindes ikke-spesifikt til den faste bæreren, og bidra til bakgrunnssignalet. Dette er ikke mulig ved foreliggende fremgangsmåte siden det ikke benyttes noen merkeprobe.

Figurene er skjematiske fremstillinger av.foretrukne fremgangsmåter for utførelse av foreliggende fremgangsmåte. Anvendelse av nukleinsyrehybridisering som et analyttisk verktøy, er basert fundamentalt på den dobbeltkjedede, duplekse strukturen av DNA. Hydrogenbindingene mellom purin- og pyrimidin-

basene i de respektive kjedene i dobbeltkjedet DNA

kan brytes reversibelt. De to komplementære enkeltkjedene av DNA som oppstår ved denne smeltingen eller denatureringen av DNA vil assosieres (også referert til som rekombinasjon eller hybridisering) slik at dupleksstrukturen gjendannes. Det er nå velkjent at dersom man bringer i kontakt en første enkeltkjedet nukleinsyre, enten DNA eller RNA, som innbefatter en basesekvens som er tilstrekkelig komplementær til

en andre enkeltkjedet nukleinsyre under egnede oppløsningsbetingelser, så vil det resultere i dannelsen av DNA*DNA, DNA•RNA, eller RNA*RNA hybrider, avhengig av hva sem foreligger.

I den utførelsen som er gjengitt i figur 1, bringes

de enkeltkjedede probenukleinsyrene i kontakt med den immobiliserte proben under fordelaktige hybridiseringsbetingelser. De resulterende immobiliserte, hybridiserte dupleksene bringes, eventuelt etter separering av dupleksene fra resten av reaksjonsblandingen, i kontakt med en merket form av antistoffer som er spesifikke for DNA'RNA eller RNA"RNA dupleksene.

Etter vasking for å fjerne ubundet merket antistoff,

måles merket som er tilstede på den faste bæreren.

I utførelsen som er gjengitt i figur 2 av tegningene, bringes de enkeltkjedede prøvenukleinsyrene 'i kontakt med en oppløselig form av proben som er kjemisk modifisert slik at den innbefatter bindbare biotin-deler. Til de resulterende oppløselige hybridene som dannes tilsettes det en immobilisert form av avidin, en bindende partner for biotin, dette resulterer i dannelsen av immobiliserte hybrider. Dupleksene som er immobilisert på denne måten bringes, eventuelt etter at de er separert fra resten av reaksjonsblandingen,

i kontakt med merkede anti-hybridantistofferlf og etter vasking måles merket som er tilstede på den faste bæreren på samme måte som ovenfor.

Proben innbefatter minst en enkeltkjedet basesekvens

som i det vesentlige er komplementær til sekvensen som skal detekteres. En slik basesekvens behøver imidlertid ikke å være et enkelt kontinuerlig poly-nukleotidsegment, men kan bestå av to eller ;flere individuelle segmenter som er avbrutt av ikke-komplementære sekvenser. Disse ikke-hybridiserbare sekvensene kan være lineære, eller de kan være

(

selvkomplementære og danne hårnålssløyfer. I tillegg kan det komplementære området av proben være flankert ved 3'- og 5'-terminalene av ikke-hybridiserbare sekvenser, som f.eks. de som innbefatter DNA eller RNA

av en vektor hvori den komplementære sekvensen var innført for utbredelse.

I ethvert tilfelle vil proben, slik som den foreligger, som en analytisk reagens, vise detekterbar hybridisering på ett eller flere punkter med prøvenuklein-syrer av interesse. Lineære eller sirkulære enkeltkjedede polynukleotider kan benyttes som probeelement, med større eller mindre deler som er dupleksdannet med en komplementær polynukleotid kjede eller kjeder, forutsatt at det kritiske homologe segmentet eller segmentene er i enkeltkjedet form og tilgjengelige for hybridisering med prøve DNA eller RNA, og forutsatt at antistoffreagensen som velges for benyttelse med proben ikke i betydelig gradkryssreagerer med de dobbeltkjedede onrådene i proben (dvs. der hvor antistoffreagensen er spesifikk for DNA*RNA hybridene og proben innbefatter RNA•RNA dobbeltkjedede områder, eller vice versa). Den komplementære probesekvensen kan være av en hvilken som helst hensiktsmessig eller ønsket lengde, varierende fra så få som et dusin til så mange som 10.000 baser, og innbefattet oligonukleo-tider som har mindre enn 50 baser.

RNA- eller DNA-proben kan oppnås på en rekke konvensjonelle måter. Når det f.eks. gjelder RNA prober kan RNA isoleres som naturproduktet

fra celler, som f.eks. 5s, 16s, og 23s ribosomale RNA'er fra bakterier eller cellulære tRNA'er. Det

er også praktisk å isolere spesifikke mRNA'er fra celler som er spesialisert i produksjon av store mengder av et protein som mRNA koder for.

In vitro syntese av RNA prober kan oppnås med en

vektor som inneholder den meget aktive Salmonella typhimurium bakteriofag SP6 transkipsjonspromoteren (Green et al. (1983) Cell 32:681). En vektor med multiple restriksjonsendonuklease seter nær promotoren er tilgjengelig fra Promega Biotec,

Madison, WI. En DNA probe klones inn i vektoren som

så dyrkes i en bakteriell vert. Multiple RNA kopier av den klonede DNA proben kan syntetiseres in vitro ved å benytte DNA-avhengig RNA polymerase fra bakteriofag SP6.

DNA prober kan fremstilles fra en rekke kilder.

Et helt bakterieltgenom kan immobiliseres for en hybridiseringsanalyse som er utformet for å detektere bakterier i en typisk steril prøve. Analysene vil være i stand til å detektere store mengder bakterielle RNA'er som f.eks. ribosomale RNA'er og tRNA'er. Alternativt kan spesifikke DNA sekvenser komplementære til cellulære RNA'er klones inn i velkjente plasmider aller virus-vektorer og benyttes som hybridiseringspr<p>ber.

Det bør bemerkes at ved benyttelsen av uttrykkene

"RNA probe" og "DNA probe", antydes det ikke at alle nukleotidene som innbefattes i proben må være ribonukleotider eller 2'-deoksyribonukleotider.

Det fundamentale trekket ved RNA- eller DNA-probe

for formålene ved foreliggende oppfinnelse, er at den er av en slik karakter at den muliggjør stimuleringen

av antistoffer til DNA * RNA eller RNA'RNA hybrider innbefattende en RNA- eller DNA-probe som ikke kryssreagerer i analyttisk betydelig grad med de individuelle enkeltkjedene som utgjør slike hybrider.

Derfor kan en eller flere av 2<*->posisjonene på

nukleotidene som innbefattes i prøven, være kjemisk modifisert, forutsatt at antistoffbindingsegenskapene som er nødvendige for foreliggende analyse opprett-

holdes i vesentlig grad. På samme måte kan en probe i tillegg eller alternativt til slik begrenset 2'-deoksymodifikasjon generelt ha en hvilken som helst annen modifikasjon langs ribosefosfatryggraden forutsatt at det ikke foreligger vesentlig interferens med spesifisiteten for antistoffet for det dobbeltkjedede hybridiseringsproduktet, sammenliknet med dets individuelle enkeltkjeder.

Der hvor slik modifikasjon eksisterer i en RNA- eller DNA-probe, bør immunogenet som benyttes for å dyrke antistoffreagensen fortrinnsvis innbefatte en kjede som har i det vesentlige tilsvarende modifikasjon og en annen kjede som i det vesentlige er umodifisert RNA eller DNA, avhengig av om prøve RNA eller -DNA

skal detekteres. Fortrinnsvis bør den modifiserte kjeden i immunogenet være identisk med den modifiserte kjeden i en RNA- eller DNA-probe. Et eksempel på

et immunogen er hybridet

poly(2'-O-metyladenyl-

syre)*poly(2'-deoksytymidylsyre). Et annet eksempel er poly(2<1->O-etylinosinsyre)"poly(ribocytidylsyre). Følgende er ytterligere eksempler på modifiserte nukleotider som kan innbefattes i en modifisert probe:

2'-O-metylribonukleotid,

2'-O-etylribonukleotid,

2'-azidodeoksyribonukleotid,

2<1->klorodeoksyribonukleotid,

2'-O-acetylribonukleotid, og

fcsfortiolatene eller metylfosfonatene av ribonukleotider eller deoksyribonukleotider. Modifiserte nukleotider

kan komme tilsyne i prober som et resultat av innføring, under enzymatisk syntese, av proben fra et templat. F.eks. er adenosin 5'-0-(1-tiotrifosfat) (ATPaS) og dATPaS substrater for henholdsvis DNA-avhengige RNA polymeraser og DNA polymeraser. Alternativt

kan den kjemiske modifiseringen innføres etter at proben er fremstilt. F.eks. kan en RNA probe 2'-O-acetyleres med eddiksyreanhydrid under milde

betingelser i et vandig oppløsningsmiddel (Steward,

D.L. et al., (1972) Biochim. Biophys. Acta 262:227).

Den kritiske egenskapen for en RNA- eller DNA-probe

som her skal benyttes, er at antistoffer som er dyrket mot proben dupleksdannet med en komplementær RNA eller DNA kjede, om ønsket, må ha bindingsegenskaper som

er forskjellige for den dupleksdannede formen av proben og enkeltkjedede nukleinsyrer. Det er denne egenskapen som muliggjør detektering av hybridisert probe i analyseblandingen uten betydelig bakgrunnsbinding til den uhybridiserte enkeltkjedede formen av proben eller eventuelle ikke-spesifikt bundne enkeltkjedede prøve-nukleinsyrer. Som beskrevet ovenfor kan visse modifikasjoner langs ribonukleotid- eller deoksy-ribonukleotidkjeden tolereres uten tap av antistoffets evne til å skille dupleksformen fra enkeltkjeder,likevel er det generelt foretrukket å anvende RNA-prober som består utelukkende av ribonukleotider når prøve-nukleotidet er en RNA eller DNA. DNA prober kan med fordel benyttes når prøven er RNA.

Som beskrevet ovenfor, vil proben bringes til hybridisering med prøvenukleinsyrer enten på

immobilisert, eller en immobiliserbar, form.

En immobil i sert form av proben vil være en hvor proben hensiktsmessig kan gjøres immobil etter hybridiserings-reaksjonen. Fremgangsmåten hvorved proben til slutt immobiliseres er ikke kritisk ved foreliggende oppfinnelse, og en hvilken som helst tilgjengelig fremgangsmåte kan anvendes, så lenge som det

hybridet som dannes mellom proben og sekvensen av interesse gjøres immobilt ved en egenskap for proben. Følgelig blir prøvenukleinsyrer ikke underkastet

direkte immobilisering.

Når den er tilstede i en hybridiseringsreaksjon på

en immobiliset form, kan proben være i en hvilken som helst egnet form som muliggjør at proben, og eventuelle komponenter av reaksjonsblandingen som er blitt assosiert med denne, ved hybridisering og/

eller ved binding av anti-hybridreagensen, deretter kan isoleres eller separeres fra resten av blandingen som f.eks. ved sentrifugering, filtrering, kromatografi, eller dekantering. En rekke sammensetninger og konfigurasjoner for en immobilisert prøve, vil følgelig være innlysende og tilgjengelig for fagmannen. Tilnærmet en hvilken som helst form av proben som er uoppløselig i reaksjonsblandingen, kan anvendes. F.eks. kan proben være aggregert eller på annen måte utfelt, forbundet med et uoppløselig materiale, polymer, eller bærer, eller befinne seg i en gel som f.eks. agarose eller polyakrylamid (se Meth.

Enzymol. 12B:635(1968) og PNAS 67:807(1970)).

Det er spesielt foretrukket å anvende en fast bærer hvortil proben er forbundet eller festet med kovalente-eller ikke-kovalente bindinger, de sistnevnte innbefatter absorbsjonsfremgangsmåter som tilveiebringer en egnet stabil og sterk forbindelse. Den faste bæreren kan anta en rekke former og sammensetninger, innbefattet mikropartikler, perler, porøse og ugjennomtrengelige strimler og membraner, den indre overflaten av reaksjonsbeholdere som f.eks. forsøksrør og mikro-titerplater o.l. Innretninger for å feste en ønsket reaksjonspartner til en valgt fast bærer er et spørsmål om rutinemessige ferdigheter for fagmannen.

En fremgangsmåte til absorbsjon av proben på nitrocellulosemembraner innbefatter at en oppløsning av proben mettes med natriumjodid og sprøytes eller filtreres på membranen (Bresser et al. (1983) DNA 2:243). Natriumjodidet letter denatureringen av proben og bedrer absorbsjonen på membranen. Alternativt kan proben behandles med glyoksal, vanligvis ved konsentrasjoner på ca. 1 molar (M), og deretter absorberes på membranen. Proben festes ved oppvarming til ca. 80°C under vakuum, i et tidsrom i området fra 2 til 4 timer. (Thomas, P.S., (1983) Meth. in Enzymol. 100:255).

Kovalent immobilisering av RNA- eller DNA-prober kan også oppnås. En lang rekke bærermaterialer og koblingsteknikker kan anvendes. F.eks. kan proben kobles til fosforcellulose, gjennom fosfatgrupper som er aktivert med karbodiimid eller karbonyl-imidazol (Bautz, E.K.F., og Hall, B.D., (1962) Proe. Nat'1. Acad. Sei. USA 48:400-408; Shih, T.Y., og Martin, M.A., (1974) Biochem. 13:3411-3418),.

Videre kan diazo-grupper på m-diazobenzoyloksymetyl-cellulose omsettes med quanin- og tymidin-residuer på polynukleotidet (Noyes, B.E., og Stark, G.R.,

(1975) Cell 5:301-310; Reiser, J., et al., (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 85:1104-1112). Polysakkaridbærere kan også benyttes med kobling gjennom fosfordiesterkjeder dannet mellom det terminale fosfatet på polynukleotidet og bærerhydroksyl-gruppene ved vann-oppløselig karbodiimidaktivering (Richwood, D., (1972) Biochim. Biophys. Acta 269:47-50; Gilham, P.T., (1968) Biochem. 7:2809-2813), eller ved kobling av nukleofile posisjoner på polynukleotidet med en cyanogenbromid-aktivert bærer (Arndt-Jovin, D.J., et al., (1975) Eur.

J. Biochem. 54:411-418; Linberg, U., og Eriksson, S.,

(1971) Eur. J. Biochem. 18:474-479).

Videre kan 3 *-hydroksylterminalen av proben oksyderes med periodat og kobles ved Shiff-basedannelse med bærere som inneholder amin-eller hydrazidgrupper (Gilham, P.T., (1971) Method. Enzymol. 21:191-197; Hansske, H.D., et al.., (1979) Method. Enzymol. 59:172-181). Bærere som har nukleofile posisjoner kan omsettes med cyanurklorid og deretter med polynukleotidet (Hunger, H.D.m et al., (1981)

Biochim. Biophys. Acta 653:344-349).

Generelt kan en hvilken som helst fremgangsmåte anvendes for immobilisering av proben, forutsatt at den komplementære enkeltkjedede sekvensen er tilgjengelig for hydrolysering til prøvenukleinsyre. Spesielle fremgangsmåter eller materialer er ikke kritiske i den foreliggende oppfinnelse.

Et spesielt fordelaktig alternativ til å anvende direkte immobilisert probe er å benytte en immobiliserbar form av proben som tillater hybridiseringen å forløpe i oppløsning hvor kinetikken er raskere. Normalt vil man i en slik utførelse anvende en probe som innbefatter en reaktiv posisjon som er istand til å danne en stabil kovalent eller ikke-kovalent binding med en reaksjonspartner og oppnå immobilisering ved eksponering mot en immobilisert form av en slik reaksjonspartner. Fortrinnsvis er en slik reaktiv posisjon av proben

en bindende posisjon som f.eks. en biotin- eller hapten-del som er i stand til spesifikk ikke-kovalent-binding med et bindende stoff, som f.eks. avidin eller et antistoff som tjener som reaksjonspartner.

Tilnærmet et hvilket som helst par av stoffer kan

utgjøre paret reaktiv posisjon/reaktiv partner som viser en egnet affinitet f or vekselvirkning slik at det dannes en stabil binding, dvs. en forbindelse eller kobling mellom de to som forblir i det vesentlige intakt under de etterfølgende analysetrinnene, hovedsakelig separasjons- og deteksjonstrinnene. Bindingen som dannes kan være en kovalent binding eller en ikke-kovalent vekselvirkning, sistnevnte er foretrukket spesielt når den er kjennetegnet ved en grad av selektivitet eller spesifisitet. I tilfelle med slik foretrukket bindingsdannelse vil den reaktive posisjonen på

proben bli referert til som en bindingsposisjon og reaksjonspartneren som et bindende stoff hvormed den danner en ikke-kovalent, vanligvis spesifikk,

binding eller sammenhekting.

I en slik foretrukket utførelse kan bindingsposisjonen være tilstede i en enkeltkjede hybridiserbar del eller i en enkel- eller dobbelt-kjedet ikke-

hybridiserbar del av proben, eller den kan være tilstede som et resultat av en kjemisk modifisering av proben. Eksempler på bindingsposisjoner som finnes i den polynukleotide sekvensen der hvor proben innbefatter en promotorsekvens, (f.eks. lac-promoter, trp-promoter), som er bindbar ved et promoterprotein (f.eks. bakteriofage promoter,

RNA polymerase), eller innbefatter en operator-

sekvens (f.eks. lac operater) som er bindbar ved et

repressor protein (f.eks. lac repressor), eller som innbefatter sjeldne, antigeniske nukleotider eller sekvenser (f.eks. 5-bromo- eller 5-iododeoksyuridin, Z-DNA) som er bindbare ved spesifikke antistoffer

(se også britisk patent nr. 2.125.964). Bindings-posis joner som er innført ved kjemisk modifisering av polynukleotidet som innbefattes i proben er spesielt nyttige og innbefatter normalt at en del av et spesifikt bindende par knyttes til probe nukleinsyren. Nyttige bindende par som man kan velge blant, innbefatter biotin/avidin (innbefattet eggehvite avidin og streptavidin), haptener og antigener/ antistoffer, karbohydrater/lectiner, enzymer/inhibitorer, o.l. Der hvor det bindende paret består av en proteinholdig del og en ikke-proteinholdig del er det normalt foretrukket å knytte den ikke-proteinholdige delen til proben, siden den proteinholdige delen kan være ustabil under denatureringsbetingelsene for hybridisering av proben. Foretrukne systemer innbefatter kobling av proben til biotin eller et hapten og anvendelse av henholdsvis immobilisert avidin eller anti-hapten antistoffreagens.

Der hvor proben bringes til hybridisering med

sekvensen av interesse på en immobiliserbar form kan de etterfølgende trinnene med immobilisering av de dannede dupleksene ved en egenskap for proben og tilsats av anti-hybridantistoffreagensen foregå

i en hvilken som helst rekkefølge. Immobilisering og anti-hybridsats kan utføres ved samtidig tilsats av de innbefattede reagenser og materialer, eller det ene kan følge etter det andre, med eller uten vaske- eller separeringstrinn mellom hovedtrinnene, i en hvilken som helst rekkefølge. Når man benytter

trinnvis tilsats vil man selvfølgeligvis ta hensyn til konsentrasjonene av de tilsatte reagensene slik at man ikke overmetter de dannede hybridene og inhiberer deres vekselvirkning med de deretter tilsatte materialene.

Selv om immobiliserte prober eller immobiliserbare prober som bindes til faste bærere ved spesifikke bindingsprosesser beskrevet ovenfor er foretrukket,

kan de immobiliserbare prober bindes til bærere ved prosesser med relativt lav spesifisitet.

I dette tilfellet vil bæreren binde den hybridiserte proben, men ikke den uhybridiserte formen. Deretter kan mengden av hybridet måles med antistoffreagensen.

Et eksempel på en bærer av denne typen er hydroksy-apititt som binder DNA * RNA og RNA•RNA duplekser,

men ikke enkeltkjedede species (Brenner og Falkow,

Adv. in Genet., 16:81(1973)).

Videre kan en kjemisk aktiv, eller aktiverbar,

gruppe innføres i proben og få reagere med den faste bæreren etter hybridiseringen. Dette systemet vil gi en kovalent immobilisert probe og mengden av hybrid koblet til bæreren kan bestemmes ved antistoffreagensen.

Antistoffreagensen som anvendes ved foreliggende oppfinnelse er hovedsakelig kjennetegnet ved sin evne til å

bindes til DNA<*>RNA eller RNA<*>RNA hybridene, som er dannet mellom proben og de komplementære prøvenukleinsyrene, i det vesentlige under utelukkelse av enkeltkjedede polynukleotider. Som angitt ovenfor, kan antistoffreagensen bestå av hele antistoffer, antistoffragmenter, polyfunksjonelle antistoffaggregater, eller generelt et hvilket som helst stoff som innbefatter en eller

flere spesifikke bindingsposisjoner for et anti-

stoff for RNA*RNA eller DNA*RNA, avhengig av det enkelte tilfellet. Når det foreligger som helt antistoff kan det tilhøre en hvilken som helst av klassene og underklassene av kjente immunoglobuliner, f.eks. IgG, IgM, osv. Et hvilket som helst fragment av et hvilket som helst slikt antistoff som beholder den spesifikke bindingsaffiniteten for den hybridiserte proben kan også benyttes, f.eks. fragmentene av IgG, konvensjonelt kjent som Fabr F(ab'), og

F(ab')2" I tillegg kan aggregater, polymerer,

derivater og konjugater av immunoglobuliner eller deres fragmenter benyttes der hvor det er hensiktsmessig.

Immunoglobulinkilden for antistoffreagensen kan

oppnås på en hvilken som helst tilgjengelig måte,som f.eks. konvensjonelle antiserum- eller monoklonale teknikker. Antiserum kan oppnås ved veletablerte teknikker som innbefatter immunisering av et dyr,

f.eks. en mus, kanin, marsvin eller geit, med et egnet immunogen. Immunoglobulinene kan også oppnås ved somatiske cellehybridiseringsteknikker, dette resulterer i det man vanligvis betegner som monoklonale antistoffer, og også dette innbefatter anvendelse av et egnet immunogen.

Immunogener for stimulering av antistoffer som er spesifikke for DNA*RNA hybrider kan innbefatte homopolymerer eller heteropolymere polynukleotid-duplekser. Blant de mulige homopolymere dupleksene foretrekkes spesielt poly(rA)*poly(dT) (Kitagawa og Stollar (1982) Mol. Immunol. 19:413).

Generelt foretrekkes det imidlertid å benytte heteropolymere duplekser, og disse kan fremstilles på en

rekke måter, innbefattet transkripsjon av <f>X174

virion DNA med RNA polymerase (Nakazato (1980) Biochem. 19:2835). De valgte RNA * DNA dupleksene absorberes på et metylert protein, eller bindes på annen måte til et konvensjonelt immunogentbærermateriale, slik som f.eks. bovintserum albumin, og injiseres i det ønskede vertsdyret (se også Stollar (1980) Keth.

Enzymol. 70:70).

Antistoffer til RNA^RNA duplekser kan dyrkes mot

dobbeltkjedede RNA'er fra viruser som f.eks. reovirus eller Fiji sykdomsvirus som infiserer sukkerrør,

bl.a. Videre kan homopolymere duplekser, som f.eks.

poly (ri) • poly(rC) eller poly(rA) • poly(rU),

bl.a., benyttes for immunisering som ovenfor.

Bindingen av antistoffreagensen til den hybridiserte probedupleksen i forbindelse med foreliggende oppfinnelse kan detekteres ved en hvilken som helst konvensjonell teknikk. Antistoffreagensen kan selv med fordel være merket med en detekterbar kjemisk gruppe.

En slik detekterbar kjemisk gruppe kan være et hvilket

som helst materiale, som har en detekterbar fysisk eller kjemisk egenskap. Slike materialer er velutviklet; innen feltet immunoanalyser, og generelt kan de aller fleste merker som er nyttige ved slike fremgangsmåter, anvendes ved foreliggende oppfinnelse. Spesielt nyttige er enzymatisk aktive grupper, slik som enzymer (se Clin. Chem. (1976), 22:1243, U.S. gjenopptatt

patent nr. 31.006 og UK patent nr. 2.019,408),

enzymsubstrater (se US patent nr. 4.492.751),

kofaktorer (se US patent nr. 4.230.797 og 4.238.565),

og enzyminhibitorer (se US patent nr. 4.134.792): fluorescerende stoff (se Clin. Chem. (1979)25:353); kromoforerende stoff;luminiscerende stoff som f.eks.

i

kjemiluminiscerende stoff og bioluminiscerende stoff

(se US patent nr. 4.380.580); spesifikt bindbare ligander som f.eks. biotin (se europeisk patent nr. 63-879) eller et hapten (se PCT Publ. 83-2286); og radioisotoper som f.eks. <3>H, <35>S, 32p, 125i og <14>C. Slike merker og merkepar detekteres på basis av

de fysiske egenskapene (f.eks. fluorescerende stoff, kromoforerende stoff og radioisotoper) eller sine reaktive- eller bindingsegenskaper (f.eks. enzymer, substrater, kofaktorer og inhibitorer). F.eks.

kan et kofaktor-merket antistoff detekteres ved tilsats av enzymet for hvilket merket er en kofaktor,

og et substrat for enzymet. En hapten eller et ligand (f.eks., biotin) -merket antistoff, kan detekteres

ved tilsats av et antistoff for haptenet eller et protein (f.eks. avidin) som binder liganden,

hvor det er påhektet et detekterbart molekyl.

Et slikt detekterbart molekyl kan være et molekyl med en målbar fysisk egenskap (f.eks. fluorescens eller absorbans) eller en deltager i en enzymreaksjon

(f.eks. se listen ovenfor). F.eks. kan man benytte

et enzym som virker på et substrat for å generere et produkt med en målbar fysisk egenskap. Eksempler på sistnevnte innbefatter, men er ikke begrenset til, 3-galaktosidase, .alkaliskfosfatase og peroksydase.

Andre merkefremgangsmåter vil være innlysende for fagmannen.

Alternativt kan antistoffreagensen detekteres

på grunnlag av en iboende egenskap som f.eks.

sin egen antigenisitet. Et merket anti-(antistoff) antistoff vil bindes til den primære antistoffreagensen hvor merket for det andre antistoffet er et konvensjonelt merke som ovenfor. Videre kan antistoff detekteres ved komplementfiksering eller anvendelse av merket

protein A, så vel som andre fremgangsmåter som er kjent innen teknikken for deteksjon av antistoffer.

Der hvor antistoffreagensen er merket, hvilket er foretrukket, er merkedelen og antistoffreagensen assosiert eller bundet til hverandre ved direkte kjemisk binding som f.eks. innbefatter kovalente bindinger, eller ved indirekte binding som f.eks.

ved inkorporering av merket i en mikrokapsel eller liposom som i sin tur er bundet til antistoffet. Merketeknikker er velkjente innen faget, og

en hvilken som helst hensiktsmessig fremgangsmåte kan benyttes ved foreliggende oppfinnelse.

Prøven som skal analyseres kan være et hvilket

som helst medium av interesse, og vil vanligvis være en flytende prøve av medisinsk, veterinær-medisinsk, miljømessig, ernæringsmessig, eller industriell betydning. Prøver fra mennesker og dyr,

og spesielt kroppsvæsker, kan analyseres ved den omtalte fremgangsmåte, innbefattet urin, blod, (serum eller plasma), melk, cerebrospinalvæske, spytt, ekskrementer, lungeaspirater< halsavstrykninger, genitalavstrykninger, og eksudater, rektalavstrykninger, og nasofarnygal aspirater. Der hvor prøven som er tatt fra pasienten eller en annen kilde for undersøkelse, inneholder hovedsakelig dobbeltkjedede nukleinsyrer, slik som de finnes i celler, behandles prøven for å denaturere nukleinsyrer, og om nødvendig, først å frigjøre nukleinsyrer fra cellene. Denaturering av nukleinsyrer oppnås fortrinnsvis ved oppvarming i kokende vann eller alkalibehandling (f.eks. 0,1N natriumhydroksyd), som, om ønsket, samtidig kan benyttes til å lysere celler. Videre kan frigjøring av

av nukleinsyrer, f.eks., oppnås ved mekanisk nedbrytning (nedfrysning/opptining, abrasjon, ultralyd-behandling), fysisk/kjemisk nedbrytning (vaskemidler for f.eks. "Triton", "Tween", natrium dodecylsulfat, alkalibehandling, osmotisk sjokk, eller varme), eller enzymatisk lysering (lysozym, proteinase,K, pepsin).

Det resulterende forsøksmediet vil inneholde nukleinsyrer på enkeltkjedet form som deretter kan analyseres ved den omtalte hybridiseringsfremgangsmåten.

Som kjent kan forskjellige hybridiseringsbetingelser benyttes ved analysen. Typisk vil hybridiseringen foregå ved svakt forhøyede temperaturer, f.eks.

mellom 35°C og 75°C, og vanligvis rundt 65°C,

i en oppløsning som innbefatter buffer ved pH

mellom 6 og 8, og med egnet ionestyrke (f.eks.

2XSSC hvor 1XSSC = 0,15M natriumklorid og 0,015M natriumcitrat, pH 7,0), protein som f.eks. bovintserum albumin, "Ficoll" (et varemerke som betegner en kopolymer av sukrose og epiklorohydrin solgt av Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NY), polyvinylpyrrolidon, og et denaturert fremmed DNA

(som f.eks. fra kalvetymus eller laksesperma).

Graden av komplementaritet mellom prøven og probekjedene som kreves for at hybridisering skal finne sted, av-henger av stringensen for betingelsene. Omfanget og spesifisiteten av hybridiseringen påvirkes av følgende hovedbetingelser:

1. Renheten av nukleinsyrepreparatet.

2. Basesammensetningen av proben - G-C basepar viser større termisk stabilitet enn A-T eller A-U basepar. Følgelig vil hybridiseringer som innbefatter høyere G-C innhold være svært stabile ved

høyere temperaturer.

3. Lengden av homologe basesekvenser -

En hvilken som helst kort sekvens av

baser (f.eks. mindre enn 6 baser),

har en høy sannsynlighet for å være tilstede i mange nukleinsyrer.

Følgelig kan liten eller ingen spesifisitet oppnås ved hybridiseringer som innbefatter slike korte sekvenser. Foreliggende homologe probesekvens vil være minst 10 baser, vanligvis 20 baser eller

mer, og fortrinnsvis mer enn 100 baser.

Fra et praktisk synspunkt, vil den

homologe probesekvensen ofte være mellom 300 og 1000 nukleotider.

4. Ionestyrke - Hastigheten for rekombinasjon øker når ionestyrken av inkuberingsoppløsningen øker. Den termiske stabiliteten av hybridene øker også. 5. Inkuberingstemperatur - Optimal rekombinasjon finner sted ved en temperatur ca. 25-30°C under smeltepunktet for en gitt dupleks. Inkubering ved temperaturer som ligger betydelig under den optimale verdien tillater færre basesekvenser å hybridisere. 6. Nukleinsyrekonsentrasjon og inkuberingstid - For å drive reaksjonen mot hybridisering er normalt enten den hybridiserte prøvenuklein-syren eller probenukleinsyren tilstede i overskudd, vanligvis et overskudd på 100 ganger eller større. 7. Denatureringsreagenser - Nærværet av midler som bryter hydrogenbindinger som f.eks. formamid og urea, øker stringensen for hybridisering. 8. Inkuberingstiden - Jo lenger inkuberingstiden er, jo mer fullstendig vil hybridiseringen være. 9. Volumutelukkende midler - Nærværet av disse midlene, eksemplifisert ved dextran og dextransulfat, antas å øke de effektive konsentrasjonene av hybridiserings-elementene og øker derved hastigheten for den resulterende hybridiseringen.

Normalt vil temperaturbetingelsene som velges for hybridiseringen være kompatible med bindingen av antistoffreagensen til dannede hybrider og deteksjon av merkeresponsen. Følgelig vil bindingstrinnet for antistoffreagensen og merkedeteksjonstrinnet forløpe etter at hybridiseringstrinnet er fullført. Reaksjonsblandingen bringes normalt til en temperatur i området fra 3°C til 40°C, og bindings- og deteksjonstrinnene utføres så. Fortynning av hybridiserings-blandingen før tilsats av antistoffreagens, er ønskelig når salt-og/eller formamidkonsentras joner er høye nok til å interferere i betydelig grad med antistoff-bindingsreaksjonen.

Det kan i spesielle analysesituasjoner hvor man benytter RNA probe forekomme at proben undergår delvis nedbrytning ved alkalisk hydrolyse av fosfor-

diesterbindingene, eller ved nærværet av ribonuklease.

I det første tilfellet, kan hydrolysen kontrolleres

ved å unngå at proben utsettes for en pH høyere enn 10. Ribonuklease kan effektivt inhiberes ved nærværet av slike forbindelser som natriumdodecyl-

sulfat, aurintrikarboksylsyre, ribonukleosidvanadyl-komplekser, heparin, dietylpyrokarbonat, og proteinholdige inhibitorer isolert fra pattedyr-kilder.

Reagenssystemet foreligger i en kommersielt forpakket form, som en sammensetning eller blanding der hvor kompatibiliteten av reagensene tillater dette,

i en forsøksinnretningskonfigurasjon, eller vanligvis som en forsøkspakke, dvs. en forpakket kombinasjon av en eller flere beholdere, innretninger, eller liknende, som inneholder de nødvendige reagensene, og vanligvis en skrevet bruksanvisning for utførelse av analysene. Reagenssystemer ifølge foreliggende oppfinnelse innbefatter alle konfigurasjoner og sammensetninger for utførelse av de forskjellige hybridiseringsfremgangsmåtene som her er beskrevet.

I alle tilfeller vil reagenssystemet innbefatte

(1) en immobilisert eller immobiliserbar probe som beskrevet ovenfor, og (2) antistoffreagensen, fortrinnsvis merket med en detekterbar kjemisk gruppe.

En forsøkspakke av systemet kan i tillegg inn- ,

befatte hjelpekjemikalier som f.eks. komponentene av hybridiseringsoppløsningen og denatureringsmidlet som er istand til å omvandle dobbelkjedede nukleinsyrer i en prøve til enkeltkjedet form. Fortrinnsvis innbefattes det et kjemisk lyserings- eller denaturerings-middel, f.eks. alkali, for behandling av prøven slik

at enkeltkjedede nukleinsyrer frigjøres.

Foreliggende oppfinnelse skal belyses nærmere ved henvisning til de følgende eksemplene.

Eksempel 1:

Hybridiseringsanalyse for detektering av bakteriuri

ved å benytte en immobilisert RNA probe.

A. Fremstilling av RNA proben.

Et 800 baseparfragment av tuf A genet som koder for proteinet EF-Tu i Escherichia coli avledes fra bakteriofagen M13-10(ATCC 39403-131). Fragmentet klones mellom Hind III og Eco RI restriksjonsendonuklease posisjonene på M13mp9 (New England Biolabs, Beverly, MA). Dette plasmidet - yrkes i en E. coli vert JM103 (Alac,

pro), supE, thi, strA, sbcB15, hsdR4, F'traD36, proABlak IgZM15. Fragmentet tuf A kuttes fra M13-10 og klones inne i Hind III og Eco RI posisjonene på pSP64 plasmid-vektoren som er tilgjengelig fra Promega Biotec, Madison, WI. 15 ml av en kultur som har stått over natten og som inneholder E. coli JM103 og som bærer pSP64-plasmidet som inneholder tuf A fragmentet inokuleres i en liter av 2xYT buljong på to liters flaske. Kulturen inkuberes ved 37°C i 3 timer og cellene høstes. De lyseres deretter og DNA isoleres ved fenol/kloroform ekstraksjoner. Det lukkede sirkulære plasmidet DNA'et renses ved sentrifugering i en cesiumklorid-etidium bromid gradient.

(Maniatis, T., Fritsch, E.F. og Sambrook, J.,

"Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory,

Cold Spring Harbor, NY (1982)).

Det rensede plasmidet, kromatograferes på "Sephadex G-50"

(Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ) i 10 mM

tris-hydrogenkloridbuffer, pH 7,5, som inneholder 0,1 M NaCl og 1 mM EDTA. Effluenten inneholder DNA og samles og DNA'et utfelles med kald etanol. Bunnfallet tas opp

i 10 mM NaCl, 10 mM MgCl2 og 1 mM ditiothreitol og nedbrytes i 1 time med en enhet EcoRI pr. mikrogram

(ug) DNA. Deretter ekstraheres reaksjonsblandingen

en gang med fenol/kloroform og en gang med kloroform,

og DNA utfelles med kald etanol. Bunnfallet oppløses i 10 mM tris-hydroklorid buffer, pH 7,4, for å

få 500 yg DNA/mL.

En 500 mikroliter (uL) reaksjonsblanding fremstilles

med følgende sammensetning:

50 yg av EcoRI nedbrytningselementet? 40 mM tris-hydrogenkloridbuf fer , pH 7,5; 6 mM MgC^; 2 mM spermin;

0,5 mM ATP, CTP, UTP og GTP; 10 mM ditiotreitol;

500 enheter RNasin (Promega Biotec) og 50 enheter av RNA polymerase fra bakteriofag SP6 (Promega Biotec). Reaksjonen får stå en time ved romtemperatur og ;

deretter tilsettes ytterligere 50 enheter RNA poly-

merase og reaksjonen får forløpet i nok en time.

DNA i reaksjonen nedbrytes i 10 minutter ved 37°C

ved 10 yg av RNase-fri DNase. Reaksjonsblandingen ekstraheres med fenol/kloroform og kromatograferes på "Sephadex G.50" i 10 mM tris-hydrogenklorid buffer,

pH 7,4, 0,1 M NaCl. RNA'et samles og utfelles med kald etanol. Bunnfallet oppløses i 50 mM natriumacetatbuffer, pH 5,0, som inneholder 1 mM EDTA.

RNA proben beskrevet ovenfor immobiliseres på akryl-

perler med reaktive epoksydgrupper tilgjengelig under handelsnavnet "Eupergit C" fra Accurate Chemical and Scientific Corp., Westbury, NY. Tre milliliter

i

(3 ml) av 50 mM natriumacetatbuffer, pH 4,5,

som inneholder 250 yg av RNA probe ristes ved romtemperatur i 10 timer med 200 mg "Eupergit C". Bufferen fjernes og analyseres for RNA for å bestemme omfanget av den immobilisering som har funnet sted.

Harpiksen vaskes deretter ved kort risting med 1 ml 0,1 M natriumfosfat buffer, pH 6,5, som inneholder 1,2 M NaCl, 0,5% (vekt/volum) natriumdodecylsulfat, 1 mg polyvinylpyrrolidon/ml, og 5 mg boyint serum albumin/ml. Denne hybridiseringsoppløsningen fjernes og erstattes av 1 ml ny hybridiseringsoppløsning og suspensjonen inkuberes ved 65°C i 1 time for å fjerne RNA proben som ikke er kovalent bundet . Oppløsningen fjernes og harpiks-RNA-probekonjugatet suspenderes i 50 ml av hybridiseringsoppløsningen.

B. Fremstilling av metylert tyroglobulin.

Ett hundre milligram avbovint. tyroglobulin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), blandes med 10 ml vannfri metanol og 400 yl av 2,55 M HCl i metanol. Denne blandingen omrøres på en rotasjonsblander ved romtemperatur i 5 dager. Bunnfallet samles ved sentrifugering og vaskes to ganger med metanol og to ganger med etanol. Deretter tørkes det under vakuum over natten. Man får ca. 82 mg tørt pulver. C. Fremstilling av antistoff til DNA"RNA hybrid.

Et DNA<*>RNA hybrid fremstilles ved transkripsjon av 4>X174 virion DNA med RNA polymerase som beskrevet

I

av Nakazato (Biochem. 19:2835(1980)).

Ett hundæ cg femti (150) mikrogram (ug) av hybridet i

250 yl av 20 mM tris-hydrogenkloridbuffer, pH 7,4,

1 mM EDTA blandes med 150 ug metylert tyroglobulin i 250 ul vann. Et bunnfall dannes og suspenderes i tris-buffer. Blandingen emulgeres med ett like stort volum av Freunds adjuvans. Mus immuniseres med 0,5 ml hver av suspensjonen, og når serum antistofftitere

i

til RNA<*>DNA utvikles, fremstilles hybridomer og undersøkes med henblikk på monoklonalt antistoff som er spesifikt for RNA * DNA (Stuart et al (1981) Proe.

Nati. Acad. Sei. USA 78, 3751, Galfre og Milstein,

(1981) Meth. in Enzymol. 73, 1).

De klonede hybridomene formeres i bukhulen hos mus,

slik at det genereres en stor mengde antistoff. Bukvæsken plasseres i en kolonne av "Affigel-Blue" harpiks (Bio-Rad Laboratories, Richmond, VA)

som er bragt i likevekt med 10 mM tris-hydrogenklorid-buf f er, pH 8,0, 0,15 M NaCl. Denne typen kromatografi fjerner albumin og det utvaskede proteinet som inneholder antistoffet kromatograferes på "DEAE-Sepharose" (Pharmacia Fine Chemicals). Kromatografien utvikles med en

lineær gradient av 10 mM tris-hydrogenklorid, pH 8,0,

til 10 mM tris-hydrogenklorid, pH 8,0, 200 mM NaCl. Hovedtoppen for det utvaskede proteinet inneholdet

det monoklonale antistoffet fritt for transferrin og albumin. D. Fremstilling av B-galaktosidase-antistoff-konjugat.

Sulfhydryl residuer på B-galaktosidase eksponeres ved reduksjon med ditiotreitol. B-galaktosidase

(30.000 enheter, kvalitet VIII, Sigma Chemical

Co., St. Louis, MO) i 2 ml 0,1 M N-2-hydroksyetyl-piperazin-N'2-etan sulfonat (HEPES), pH 7,0,

0,09 M NaCl, blandes med 3,5 umol ditiotreitol og får stå ved romtemperatur i 4 timer. Ditiotreitol fjernes ved kromatografi på en 2,5 x 80 cm kolonne av "Sepharose 6B Cl" (Pharmacia Fine Chemicals)

i bufferen som er beskrevet ovenfor. Fraksjoner som inneholder protein samles i en beholder. Antall mol av sulfhydryl-grupper pr. mol enzym måles ved fremgangsmåten angitt av Ellman (Ellman (1959) Arch. Biochem. Biophys. 82, 70).

Succinimidyl-4-(N-maleimidometyl)cykloheksan-1-karboksylat (SMCC) (Pierce Chemical Co., Rockford, IL), 5,3 mg, o<p>pløses i 250 yl vannfritt N,N-dimetylformamid og en porsjon på 40 yl tilsettes til 3 ml av 0,1 M HEPES buffer, pH 7,0, 0,15 M NaCl. En porsjon på 25 yl av denne vandige oppløsningen tilsettes til 825 yl HEPES/NaCl buffer og 100 yl 1 mM glutation. Når denne reaksjonsblandingen har stått ved romtemperatur i 15 minutter, bestemmes mengden av ureagert glutation ved Ellmans fremgangsmåte .

Monoklonalt antistoff til DNA * RNA blandes med

400 ymol av SMCC i et endelig volum på 533 yl HEPES/0,15 M NaCl buffer og får reagere i 1 time

ved 30°C. Denne reaksjonsblandingen kromatograferes på en 1 x 24 cm kolonne av "Biogel P-2" harpiks (Bio- Rad Laboratories, Rickmond, CA) og elueres med HEPES/0,15 M NaCl buffer. Effluent som inneholder protein samles, og proteinkonsentrasjonen bestemmes ved fremgangsmåten angitt av Sedmack og Grossberg (Anal. Biochem. 79, 544(1977)) og antallet maleimid-

grupper bestemmes ved titrering med glutation som beskrevet ovenfor.

i

En 2,8 mg porsjon av antistoff-maleimid addisjons-

produktet blandes med 10 mg ditiotreitol-behandlet 6-galaktosidase og får reagere i 4 timer ved rom-

temperatur. Reaksjonsblandingen kromatograferes i ved 4°C på en 2,5 x 80 cm kolonne av "Sepharose 6B iCl"

i HEPES/0,15 M NaCl ved 4°C. Strømningshastigheten settes til 4 ml/timen og fraksjoner på 3 ml samles. Fraksjonene analyseres for £-galaktosidase aktivitet

og antistoff-bindingsaktivitet. Fraksjoner som har begge aktivitetene samles.

E. Hybridiseringsanalyse.

Prøver på ti milliliter av urin fra pasienter med mulig urinveisinfeksjon, sentrifugeres ved 10.000 x g i 10 minutter og supernatantene dekanteres av og kastes. Sedimentene suspenderes i 50 yl 10 mM tris-hydrogenklorid buffer, pH 8,0, som inneholder<:>20 mg eggehvite lysozym/ml (Sigma Chemical Co., St.

Louis, MO), 0,1 M NaCl, og 5 mM EDTA. Reaksjonen

får stå i romtemperatur i 30 minutter og deretter tilsettes 10 yl av 1 M NaOH. Denne alkaliske blandingen får stå i romtemperatur i 10 minutter for å denaturere DNA fra eventuelle bakterier i den opprinnelige prøven. Reaksjonsblandingen nøytraliseres med tilsats av 250 yl av den bufrede suspensjonen av harpiks-RNA konjugat, som er beskrevet ovenfor.

Dette hybridiseringssystemet inkluderes ved ca. 65°C

i 15 timer med forsiktig risting.

Harpiks-RNA probe konjugatet får sedimentere og væsken dektanteres av. Harpiksen vaskes toganger ved suspensjon i 0,5 ml hver gang av 0,1 M natriumfpsfatbuffer, pH^ 7,4, 5 mgbovint serum albumin/ml. Harpksen kombineres med 300 yl 0,1 M natriumfpsfatbuffer, pH 7,4, som inneholder 10 mM MgCl2, 5 mgbovint serum albumin (ml, og 0,4 yg f5-galaktosidase-antistoff/ml (anti-DNA*RNA). Blandingen ristes forsiktig i 1 time ved romtemperatur, og harpiksen vaskes toganger, hver gang i 1 minutt, med 5 ml 0,1 M natriumfpsfatbuffer, pH 7,4, som inneholder 0,1% . "Tween 20" vaskemiddel. Den vaskede harpiksen ristes forsiktig i 30 minutter ved romtemperatur, i 1,0 al 0,1 M natriumfosfatbuffer, pH< 7,4, som inneholder 800 yM 7-|3-galaktosyl-3-(6-aminoheksylkarboksamid) - kumarin (Worah et al (1981) Clin. Chem. 27:673).

Ved avslutning av denne inkuberingen registreres fluorescensen av oppløsningen ved å benytte 400 nanometer (nm) eksitering og 450 nm emisjon.

Fluorescenssignaler som utvikles med urinprøver

som inneholder mer enn 100.000 bakterier pr. ml

. vil være betydelig høyere enn de for prøver som inneholder mindre enn 5.000 bakterier pr. ml.

Denne metoden kan benyttes som en kvalitativ påvisning av bakteriuri.

Eksempel 2:

Hybridiseringsanalyse for E. coli 23s ribosomal

RNA ved å benytte en immobilisert DNA probe.

A. DNA probe for 23s RNA.

DNA-proben er et EcoRI/Bglll fragment fra rrnD operonet som koder for 23s RNA i E.coli (Jinks-Robertson et al (1983) Cell. 33:865).

Proben innbefatter ca. 2/3 av 23s RNA sekvensen fra 3'-hydroksyl og er klonet inn i en Ml 3 virus vektor slik at man får enkeltkjedet virion DNA

som er komplementært til cellulær ribosomal RNA. M13 viruset gros i e. coli stammen JM103 og isoleres fra kulturmediet ved utfelling med polyetylen glykol. Virion DNA'et renses for viruspartikler ved fenolekstraksjon (Maniatis, et al, supra).

Det rensede DNA gjøres 0,3 M i NaOH og inkuberes ved 37°C i 4 timer for å nedbryte forurensende RNA. Blandingen nøytraliseres ved tilsats av 30% eddiksyre og DNA<*>et utfelles med kald etanol.

B. Antistoff til DNA-RNA.

Mus immuniseres med DNA•RNA hybrid som beskrevet

i eksempel 1, og miltceller smeltes sammen med SP 2/0-Ag14 myelom. celler (tilgjengelig fra American Type Culture Collection. Rockville, MD). Hybridom-utskillende antistoffer som er spesifikke for DNA'RNA identifiseres som angitt ovenfor. Det mest foretrukne

hybridom er det som er deponert hos American Type Culture Collection, Rockville, MD som ATCC HB 8730.

Antistoffene renses for.bukvæske ved HPLC ved å

benytte en "LDC/Milton Roy" væskekromatograf utstyrt med CI - 10 integrator. Bukvæsken dialyseres mot 0,01 M kaliumfosfatbuffer, pH 6,8, sentrifugeres for å fjerne partikkelformet stoff, og føres gjennom et 0,22 ym nitrocellulosefilter. En til to milliliter av behandlet bukvæske plasseres i en 10 x 250 mm anion-bytterkolonne, som er bragt i likevekt med 0,01 M kaliumfosfat, pH 6,84P Kromatografieh utvikles med en 60 min lineær gradient fra 0,01 M kalium-fosfatbuf fer , pH 6,84, til 0,085 M kaliumfosfat,

pH 6,40, ved en strømningshastighet på 1 ml/min.

Toppen som inneholder IgG konsentreres, dialyseres

mot fosfatbuffret saltvannsoppløsning, pH 7,4, sentrifugeres for å fjerne eventuelt denaturert protein, og IgG konsentrasjonen bestemmes på basis av absorbansen ved 280 nm ved benytte e] ^/ ml = 1,40.

C. Immobilisering av DNA-proben.

Meta-nitrofenyl grupper innføres på cellulose-

pulver og omvandles deretter til diazoniumsaltet for kovalent immobilisering av DNA .

1-((m-nitrobenzyloksy)metyl)pyridinium klorid (690 mg, 2,46 mmol) (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI)

blandes med 128 mg natriumacetat i 7,7 ml vann.

To gram av "Sigmacell, type 20", cellulose, (Sigma Chemical Co.) tilsettes og blandes i ca. 15 minutter

i et begerglass neddykket i et vannbad ved 60°C.

Cellulosen blir tilnærmet tørr og den plasseres i

en ovn ved 135- 140°C i 45 minutter. God inkorporering av .• m-nitrofenyl residuer er avhengig av at temperaturen i dette tidsrommet holdes så høy som mulig. Dersom temperaturen er for høy, vil cellulosen karamelli seres.

Etter varmebehandlingstrinnet, suspenderes cellulosen

i vann og klumper brytes opp ved at cellulosen i vann gnis inntil partiklene går gjennom en 150 ym nettsikt. Cellulosen vaskes tre ganger med 120 ml vann hver gang, og deretter to ganger med 50 ml etanol. Deretter tørkes den over natten i vakuum.

Nitrofenylgrupper på cellulosen reduseres ved at den inkuberes ved 65°C i 1 time, i 10 ml av 0,1 M Na2C03 som inneholder 2,0 g natrium ditionitt. Deretter vaskes cellulosen flere ganger med vann på en sintret glasstrakt, og en gang med 30% eddiksyre. Til sist vaskes den ytterligere 3 ganger med vann og tørkes i vakuum ved 40 til 50°C over natten.

To hundre og femti milligram av den reduserte cellulosen tilsettes til 5,0 ml 1,2 M HCl ved 0°C

og 13 yl av 100 mg NaNC^/ml tilsettes. Denne blandingen får stå i 1,0 timer, og i løpet av dette tidsrommet undersøkes blandingen med henblikk på tilstedeværelse av NaN02 med stivelses-jodid papir. Dersom resultatet er svakt eller negativt, tilsettes 20 yl NaNC^.

Ved slutten av denne reaksjonsperioden vaskes cellulosen suksessivt med 30 til 50 ml kaldt (0°C)

vann på en kald sintret glasstrakt, med 10 til 15 ml kald 10 mM urea, med mer kaldt vann og til slutt med ca.

10 ml kald 0,2 M natriumacetatbuffer, pH 4,0. Cellulosen overføres raskt til en flaske som inneholder 0,92 ml av kald 0,2 M natriumacetatbuffer, pH 4,0, som inneholder 69 ug av DNA-proben. Blandingen ristes ved 0-4°C i 15 timer, og vaskes deretter med 1 x SSPE (20 mM natriumfosfatbuffer, pH 7,8, 0,18 M NaCl, 1 mM EDTA), 0,1% natriumdodecylsulfat, (SDS), på en sintret glasstrakt. Cellulosen inkuberes ved 55°C i 4 timer i en hybridiserings-oppløsning som består av:

Før bruk inkuberes laksesperma DNA ved 37°C i 17 timer, i 0,3 M NaOH, nøytraliseres med 30% eddiksyre og samles ved utfelling med kald (-15°C) etanol.

Etter inkuberingen ved 55°C, vaskes cellulosen

to ganger, hver gang med ca. 10 ml av 1 x SSPE,

0,1% SDS. Cellulosen resuspenderes i 5,0 ml av hybridiseringsoppløsningen og 0,2 ml porsjoner av oppslemmingen plasseres i reagensrør for hybridisering.

D. Fremstilling av 23s ribosomal RNA.

Ribosomal RNA fremstilles fra E.coli og 23s kompo-nenten isoleres ved sukrose-tetthetsgradient-sentrifugering (Takanami, M., (1967) Meth.

Enzymol., 12A:491; McConkey, E.H. (1967) Meth. Enzymol., 12A:620).

E. Hybridiseringsanalyse for 23s RNA.

Hybridiseringsoppløsningen suges opp fra reagensrør som inneholder cellulosen med den immobiliserte DNA proben. Deretter tilsettes 100 ul hybridi-seringsoppløsning som inneholder 10 ng 23s RNA/ml til hvert rør og de inkuberes ved 55°C i angitte tidsrom. Ved avslutningene av inkuberingene fjernes hybridiseringsoppløsningene og cellulosen vaskes med 0,5 ml 1 x SSPE, 0,1% SDS, inkuberes med 55°C

i 30 minutter i 0,5 ml 1 x SSPE, 0,1% SDS, og vaskes en gang med 0,5 ml 1 x SSPE, 0,1% SDS.

Mengdene av DNA"RNA som er dannet måles med immunoanalyse. Cellulosen i hvert rør ristes ved romtemperatur i 30 minutter ved 50 ul 20 mM natriumfosfatbuffer, pH 7,4, som inneholder 0,15 M NaCl, 1 mM EDTA, 0,5% (volum/volum) "Tween 20" og 5,0 mg BSA/ml. Deretter tilsettes 100 yl av denne oppløsningen som inneholder 1,0 yg antistoff til DNA<*>RNA til hvert rør og ristingen fortsettes i 30 minutter. Væsken fjernes ved avsuging og cellulosen vaskes fire ganger, hver gang med 0,5 ml av 0,1 M tris-hydrogenkloridbuffer, pH 8,0, som inneholder 5 mM MgCl2, 0,5% "Tween 20" og 5,0 mg bovintalbumin/ml Ctris/MgCl2/"T2een,7BSA). Deretter tilsettes 150 yl alkalisk fosfatase-merket antimus IgG (Sigma Chemical Co.) fortynnet 200-ganger i tris/MgCl2/"Tween"/BSA

til hvert rør, og det ristes ved romtemperatur i 1,0 time.

Cellulosen fra hver analyse vaskes to ganger med 0,5 ml tris/MgCl2/"Tween"/BSA hver gang, som inneholder 0,5 M NaCl og deretter overføres cellulosen til rene forsøksrør ved å benytte 1,5 - 2,0 ml av denne buffer-oppløsningen. Bufferen fjernes og det alkaliske fosfatasemerket som er bundet til cellulosen måles.

For dette formålet, tilsettes 200 yl 1,0 M dietanolamin-hydrogenkloridbuffer, pH 9,8, som inneholder 1 mM MgCl2 og 1 mg

p-nitrofenylfosfat/ml og blandingen inkuberes ved 25°C i 30 minutter. Deretter slukkes den enzym-katalyserte reaksjonen ved tilsats av 1,5 ml 0,1 M Na-jPO^ og absorbansene ved 405 nm registreres. Resultatene er som følger:

Absorbansene øker med hybridiseringstiden hvilket indikerer at økende; mengde DNA*RNA hybrid er dannet.

Eksempel 3;

Hybridiseringsanalyse for 23s ribosomal RNA

ved benyttelse av immobiliserbar DNA probe.

Prøven RNA hybridiseres med en oppløselig DNA probe med påhengte biotinresiduer. Deretter bindes den hybridiserte og uhybridiserte DNA-proben til en fast bærer med det immobiliserte streptavidin. Mengden av DNA"RNA på bæreren måles ved en immunoanalyse ved benyttelse av enzym-merket antistoff til DNA*RNA.

A. Biotinylert probe DNA.

M-13 viruset beskrevet ovenfor i eksempel 2, med innskuddet komplementært til 23s RNA formeres; i E.coli stamme JM103 og bakteriecellene ristes for isolering av den replikative formen av viruset DNA. Denne dobbeltkjedede DNA renses ved cesiumklorid etidiumbromid' tetthetsgradient sentrifugering (Maniatis, et al., supra).

Biotinresiduer innføres i denne dobbeltkjedede

DNA ved nick-translasjon ved å benytte biotinylert dUTP tilgjengelig fra Enzo Biochem. Inc., NY (Langer,

P.R. et al (1981) Proe. Nati. Acad. Sei., 78:6633; Leary, J.J. et al (1983) Proe. Nati. Acad. Sei., 80:4045). Forurensende RNA nedbrytes ved behandling med alkali som beskrevet i eksempel 2. Straks før bruk denatu-reres den biotinylerte proben ved at oppløsningen plasseres på et kokende vannbad i 4 minutter.

B. Immobilisering av streptavidin.

Streptavidin (Calbiochem-Behring Corp., La

Jolla, CA) immobiliseres på "Act- Ultrogel AcA 22"

(tilgjengelig fra LKB Instruments, Inc., Gaithers-burg, MD) som er en akrylamid-agarosebærer aktivert med glutaraldehyd (Doley, S.G. et al (1976) FEBS Letters, 65:87). Immobiliseringen utføres etter fabrikantens instruksjoner slik at man får ca.

0,5 ug streptavidin pr. 10 yl sammenpakket "Act-Ultrogel AcA 22".

C. Hybridiseringsanalyse.

To milliliters prøver av urin, mistenkt for å inneholde bakteriell infeksjon,sentrifugeres ved 3000 x g for å sedimentere bakteriene, og over-væsken dekanteres av. Nitti mikroliter av hybridi-seringsoppløsningen beskrevet i eksempel 2 tilsettes til hver pellet og 5 yl av den biotinylerte proben (ved en konsentrasjon på 0,5 yg/ml i 20 mM natriumfosfatbuffer, pH 7,0, 0,5 mM EDTA) tilsettes. Blandingene ristes for å suspendere pelletten (dersom disse er tilstede) og de inkuberes ved 55°C

i 4 timer.

Deretter tilsettes 700 yl 20 mM natriumfosfatbuffer, pH 7,4, som inneholder 5,0 mg bovintalbumin og 50 yl av "Ultrogel" med immobilisert streptavidin til hver blanding for å fortynne hybridiseringsoppløsningen og immobilisere den biotinylerte proben.

Blandingene ristes ved romtemperatur i to timer og væsken fjernes fra bæreren.

Mengden av DNA<*>RNA hybrid som er assosiert med "Ultrogel" bæreren måles ved immunoanalyse som beskrevet i eksempel 2 for cellulosebæreren.

For sammenlikning, undersøkes ubehandlede urinprøver for bakterier ved en mikroliter-kulturfremgangsmåten ved å benytte MacConkey og blod-agarplater.

Platene inkuberes ved 37°C i 36 timer og koloniene telles.

Urinprøver med høyt nivå av bakterier ved kulturfremgangsmåten gir høye absorbanser ved hybridi-seringsanalysen.

Claims (4)

1. Reagenssystem for detektering av en spesiell polynukleotidsekvens i et forsøksmedium ved nukleinsyrehybridisering, innbefattende en polynukleotidprobe som innbefatter minst en enkeltkjedet basesekvens som i det vesentlige er komplementær med sekvenser som skal bestemmes, idet den komplementære probesekvensen (i) i det vesengtlige består av RNA når sekvensen som skal bestemmes er RNA eller DNA, eller (ii) i det vesentlige består av DNA eller RNA når sekvensen som skal bestemmes er RNA; og en antistoffreagens som er istand til og bindes til DNA*RNA eller RNA"RNA duplekser, som dannes mellom sekvensen som skal bestemmes og den komplementære probesekvensen, karakterisert ved at proben foreligger i en immobilisert form eller innbefatter et bindende sete for et spesifikt bindende stoff, og når sistnevnte er tilfelle omfatter reagenssystemet videre en immobilisert form av et slikt spesifikt bindende stoff.

2. Reagenssystemet ifølge krav 1, karakterisert ved at proben er immobilisert ved at den er festet til en fast bærer.

3. Reagenssystemet ifølge krav 1, karakterisert ved at proben er immobiliserbar og innbefatter en spesifikk bindingsposisjon, og hvor reagenssystemet i tillegg innbefatter en immobilisert form av en bindende partner for bindingsposisjonen på proben.

4. Anvendelse av et reagenssystem ifølge kravene 1-3 for detektering av en spesiell polynukleotidsekvens ved nukleinsyrehybridisering .